Summary
Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.
Abstract
Als gewerveld dier is de zebravis veel gebruikt in biologische studies. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie, waardoor het kan worden gebruikt als een model voor menselijke ziekten. Genfunctiestudie is gebaseerd op de detectie van genexpressiepatronen. Hoewel immunohistochemie een krachtige manier biedt om eiwitexpressie te testen, beperkt het beperkte aantal commercieel beschikbare antilichamen in zebravissen de toepassing van costaining. In situ hybridisatie wordt veel gebruikt in zebravisembryo's om mRNA-expressie te detecteren. Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie te combineren voor embryosecties van zebravissen. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Immunohistochemie en de beeldvorming van een enkele cryosectie werden uitgevoerd na in situ hybridisatie. Het protocol is nuttig om het expressiepatroon van twee genen te ontrafelen, eerst door in situ transcriptdetectie en vervolgens door immunohistochemie tegen een eiwit in dezelfde sectie.
Introduction
De zebravis is een krachtig gewerveld model voor studies van ontwikkeling en genetica 1,2. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie (70% van de genen wordt gedeeld met het menselijk genoom), waardoor het kan worden gebruikt als model voor menselijke ziekten3. Bij zebravissen is het vrij gebruikelijk om de expressiepatronen van twee genen en hun ruimtelijke relatie te detecteren. Immunohistochemie werd voor het eerst gebruikt in 1941 om pathogenen in geïnfecteerde weefsels te detecteren door FITC-gelabelde antilichamen toe te passen4. Het doeleiwit in de weefselsectie wordt eerst gelabeld met een primair antilichaam en de sectie wordt vervolgens gelabeld met een secundair antilichaam tegen de gastheersoort immunoglobuline van het primaire antilichaam. Antilichaamkleuring is een robuuste aanpak om de lokalisatie van eiwitten te detecteren, die een hoge optische resolutie op intracellulair niveau biedt. Het aantal beschikbare antilichamen is echter zeer beperkt bij zebravissen. Een recente studie toont aan dat ongeveer 112.000 antilichamen commercieel beschikbaar zijn voor muizen; Er zijn echter zeer weinig antilichamen aangetoond die betrouwbaar zijn bij zebravissen5.
In plaats daarvan is in zebravissen in situ hybridisatie op grote schaal toegepast voor genexpressiepatroonanalyse. Deze methode werd voor het eerst gebruikt om genexpressie in Drosophila-embryo's te beoordelen in de jaren 19806,7, en sindsdien is deze technologie voortdurend ontwikkeld en verbeterd. Aanvankelijk werden radioactief gelabelde DNA-sondes gebruikt om mRNA-transcripten te detecteren; De ruimtelijke resolutie was echter relatief laag en er waren potentiële gezondheidsrisico's veroorzaakt door de radioactiviteit. Vervolgens is in situ hybridisatie afhankelijk van de RNA-sondes gelabeld met digoxigenine (DIG) of fluoresceïne (Fluo), die worden geconjugeerd tot alkalische fosfatase (AP) of gedetecteerd door fluorescerende tyramidesignaalversterking (TSA)8,9. Hoewel TSA is gebruikt om twee of drie genen te detecteren, zijn DIG-labeling van RNA-sondes en antiDIG AP-geconjugeerd antilichaam nog steeds zeer gevoelige, stabiele en veelgebruikte benaderingen voor in situ hybridisatie. Daarom zijn gecommercialiseerde antilichamen in combinatie met DIG-gelabelde in situ probes nuttig om inzicht te geven in eiwitlokalisatie en expressie van één gen.
Embryo's met hele mounts kunnen de ruimtelijke relatie tussen genen niet onthullen vanwege de lage optische resolutie, ook al zijn zebravisembryo's klein en transparant10. Daarom is sectionering noodzakelijk om de expressiepatronen van genen op intracellulair niveau te analyseren. Cryosectieing is veel gebruikt bij zebravissen omdat het gemakkelijk uit te voeren is en het antigeen effectief kan behouden. Daarom biedt in situ hybridisatie in combinatie met immunohistochemie in cryosecties van zebravissen een krachtige manier om de expressiepatronen van twee genen te analyseren. Een combinatie van in situ hybridisatie en immunohistochemie is toegepast op zebravissen11. Proteïnase K-behandeling werd echter gebruikt om de penetratie van de sonde te verbeteren ten koste van de antigeenintegriteit. Om deze beperking te overwinnen, gebruikt dit protocol verwarming om antigeenopvraging te induceren. Dit protocol is niet alleen van toepassing op embryo's van verschillende stadia en weefselsecties van verschillende diktes (14 μm hoofdsecties en 20 μm ruggenmergsecties), maar het is ook geverifieerd met behulp van genen die tot expressie komen in twee organen, waaronder het hoofd en het ruggenmerg.
Dit artikel beschrijft hoe in situ hybridisatie en antilichaamkleuring in zebravisembryo's in cryosecties kunnen worden gecombineerd. De veelzijdigheid van dit protocol wordt aangetoond door gebruik te maken van een aantal in situ hybridisatie-immunohistochemie combinaties, waaronder in situ hybridisatie probes voor twee verschillende neuronen. Deze methode is geschikt voor het detecteren van mRNA en eiwit in verschillende regio's en embryo's van verschillende leeftijden, evenals de expressiepatronen van twee genen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Verzameling zebravisembryo's
- Zet de avond voordat de eieren worden verzameld een paar zebravissen in kweekbakken, de ene een transgene zebravis en de andere een AB wild-type zebravis (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type of Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (zie de Tabel met Materialen). Gebruik een diagonale plastic scheidingswand om het mannetje en het vrouwtje te scheiden om fysieke toegang uit te sluiten. Plaats de volgende dag het bovenste deel van de kweektank in een schoon onderste deel gevuld met vers water en verwijder de scheidingswand van de kweektank. Laat de vis 10-20 minuten paren en verzamel de eieren nadat ze naar de bodem van de kweekbak zijn gezonken.
- Kweek de embryo's in E3-embryomedium (zie de tabel met materialen) dat methyleenblauw (1 ml 0,05% methyleenblauw in 1 l E3-embryomedium) bevat bij 28,5 °C.
- Behandel de embryo's 24 uur na de bevruchting (hpf) met fenylthioureum (PTU, zie de tabel met materialen) om pigmentvorming te voorkomen.
OPMERKING: Dieren van beide geslachten worden gebruikt in experimenten.
2. In situ hybridisatie
OPMERKING: Het water dat wordt gebruikt voor de stappen 2.1-2.11 is met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water (zie de materiaaltabel).
- Fixeer ~10 embryo's met 0,5-1 ml vers 4% paraformaldehyde (PFA, zie de tabel met materialen) in een microfugebuis van 1,5 ml bij 4 °C gedurende 12-14 uur.
OPMERKING: Het protocol voor in situ hybridisatie is enigszins gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde literatuur12. PFA moet vers worden bereid en bewaard bij 4 °C binnen één week na gebruik of gedurende één maand bij -20 °C. Alle volgende stappen in in situ hybridisatie werden uitgevoerd met behulp van 1,5 ml microfugebuizen. - Gebruik een pincet om de huid te verwijderen van alleen embryo's ouder dan 48 hpf.
OPMERKING: De huid wordt verwijderd om de penetratie van RNA-sondes in het rompgebied van embryo's ouder dan 48 hpf te vergemakkelijken. - Droog de embryo's geleidelijk uit door te wassen met 25%, 50% en 75% methanol in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 achtereenvolgens (PBST, zie de tabel met materialen) gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur. Was de embryo's vervolgens gedurende 5 minuten in 100% methanol op kamertemperatuur. Incubeer de embryo's in 100% methanol bij -20 °C gedurende ten minste een nacht gedurende 12-14 uur.
OPMERKING: Gedehydrateerde embryo's kunnen gedurende 6 maanden worden bewaard in 100% methanol bij -20 °C. - Rehydrateer de embryo's geleidelijk door te wassen met 75%, 50% en 25% methanol in PBST gedurende achtereenvolgens gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Was het embryo drie keer met PBST gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur.
- Verwerk de embryo's met 10 μg/ml proteïnase K (zie de tabel met materialen) in PBST bij kamertemperatuur (zie tabel 1).
- Was de embryo's met PBST gedurende 5 min. Voer deze wasstap drie keer uit.
- Bevestig de gewassen embryo's gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA.
OPMERKING: Deze stap stopt de spijsvertering omdat PFA proteïnase K inactiveert. Zorg ervoor dat het monster voorzichtig wordt gemengd om alle embryo's aan PFA bloot te stellen; De buizen kunnen op hun zijkanten worden geplaatst om de embryo's gelijkmatig in de oplossing te verdelen. Deze PFA hoeft niet vers te zijn (het kan tot 2 weken gekoeld worden). - Was het embryo drie keer met PBST en broed gedurende 5 minuten tijdens elke wasbeurt.
- Voer prehybridisatie van de embryo's uit door te broeden met een prehybridisatieoplossing (preHYB, zie de tabel met materialen) bij 65 °C gedurende 5 minuten. Vervang preHYB door hybridisatieoplossing (HYB, zie de materiaaltabel) en prehybridiseer gedurende ten minste 4 uur in HYB.
OPMERKING: Voordat u overgaat tot prehybridisatie, verwarmt u de oplossingen voor op 65 °C. Formamide (zie de tabel met materialen) wordt gebruikt om de vorm en structuur van het weefsel te behouden. Formamide voorkomt ook de binding van niet-homologe fragmenten bij lage temperaturen. - Verwarm de sonde (Insm1a of 5-HT2C) in HYB gedurende 5 minuten bij 95 °C voordat u deze aan de embryo's toevoegt. Gebruik de sonde met 1 μg/ml HYB. Verwijder zoveel mogelijk preHYB zonder de embryo's in contact te laten komen met de lucht en voeg voorverwarmde sonde in HYB toe aan de buis met de embryo's.
OPMERKING: Een gelabelde RNA-sonde kan worden gebruikt om te hybridiseren met een doel-mRNA-sequentie in de embryo's. Daarom kan de sonde worden gebruikt om de expressie van een interessant gen en de locatie van mRNA te detecteren. - Laat de sonde een nacht (12-14 uur) hybridiseren bij 50-70 °C.
OPMERKING: De hybridisatietemperatuur verschilt voor verschillende sondes. - Zuig de volgende dag de sondeoplossing op met een pipet en bewaar deze in een buis bij -20 °C, zodat deze vele malen kan worden hergebruikt.
- Was de embryo's als volgt:
- Was de embryo's gedurende 15 minuten met 100% HYB op 65 °C.
- Was de embryo's achtereenvolgens met 75%, 50% en 25% HYB in 2x standaard zoutcitraat met 0,1% Tween-20 (SSCT, zie de tabel met materialen) gedurende 15 minuten elk bij 65 °C.
- Was de embryo's gedurende 15 min in 2x SSCT op 65 °C.
- Was de embryo's gedurende 15 min in 0,2x SSCT op 65 °C.
- Was de embryo's twee keer gedurende 10 minuten in maleïnezuurbuffer met 0,02% Tween-20 (MABT, zie de tabel met materialen) op kamertemperatuur.
- Blokkeer de gehybridiseerde en gewassen embryo's gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur met 2% blokkerende oplossing-1 (zie de tabel met materialen).
- Vervang de blokkerende oplossing-1 door antidigoxigenine AP (1:4.000 verdunning, zie de tabel met materialen) in een verse 2% blokkerende oplossing-1 en schud gedurende 12-14 uur gedurende 12-14 uur bij 4 °C.
- Was de embryo's vier keer gedurende 30 minuten in MABT op kamertemperatuur.
OPMERKING: Haal de BM purple (zie de Tabel met materialen) uit de koelkast tijdens de derde wasbeurt en schud het af en toe tijdens de volgende wasbeurten. - Was de embryo's twee keer gedurende 10 minuten in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, zie de tabel met materialen).
- Gebruik een pipet om zoveel mogelijk NTMT uit de embryo's te verwijderen. Vervang door BM paars AP-substraat en kleur de embryo's bij kamertemperatuur in het donker. Controleer de kleurveranderingen elke 30 minuten om de mate van verven te regelen.
OPMERKING: De specifieke verftijd is anders en moet worden aangepast aan elke sonde. Het incuberen van de embryo's bij 37 °C kan de reactie versnellen. Het incuberen van de embryo's bij 4 °C kan de reactietijd verhogen en kan 's nachts worden gedaan. - Zodra het in de gewenste mate is ontwikkeld, stopt u de reactie door twee keer kort met NTMT te spoelen. Na in situ hybridisatie, spoel de embryo's driemaal met PBST gedurende 20 minuten.
3. Inbedding
- Dompel de embryo's gedurende 12-14 uur bij 4 °C onder in 5% sucrose in 1x PBS (zie de tabel met materialen).
- Vervang de oplossing die de embryo's bedekt tot 15% sucrose in 1x PBS en incubeer gedurende 12-16 uur bij 4 °C.
- Vervang de oplossing die de embryo's bedekt tot 30% sucrose in 1x PBS en incubeer gedurende 1-2 dagen bij 4 °C.
OPMERKING: Incubeer in deze oplossing totdat de embryo's naar de bodem van de buis zinken. - Vul een cryomold met een optimale snijtemperatuur (OCT) medium (zie de Tabel met materialen). Breng de embryo's in 30% sucrose over naar de cryomold met OCT-medium. Roer ze om de sucrose uit de embryo's te verwijderen.
- Breng de embryo's over naar een nieuwe cryomold voor weefsel en vul deze voorzichtig met OCT-medium, waardoor de vorming van bellen wordt vermeden.
- Dompel elk embryo onder, duw het naar de bodem van de cryomold en plaats elk embryo in de gewenste oriëntatie (dorsaal-ventraal of lateraal). Houd de embryo's in een rechte lijn.
OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om slechts één embryo in elke cryomold te plaatsen (zie de tabel met materialen). - Plaats de ingebedde embryo's in cryomolden in een droogijs ethanolbad.
- Bewaren bij -80 °C ten minste een nacht gedurende 12-14 uur.
OPMERKING: De cryomolden kunnen minstens een maand bij -80 °C worden bewaard.
4. Cryosectie
- Stel de cryosecties met behulp van een cryostaat in op -20 °C.
- Verwijder het monsterblok uit de cryomold en plaats het in de cryostaat. Plaats OCT medium op de bodem van de gekoelde klauwplaat en plaats het blok erop.
- Zorg ervoor dat het monsterblok evenwijdig is aan het scheermesje. Knip voorzichtig overtollig OCT-medium rond het monster af.
- Snijd in 12-20 μm dikke secties met behulp van een cryostaat. Breng de secties snel over naar glazen dia's, zodat elke dia 3-4 secties heeft. Laat de monsters op kamertemperatuur komen en bewaar de secties in een afgesloten schuifdoos bij -80 °C voor later gebruik.
5. Immunostaining
OPMERKING: GFP-kleuring wordt uitgevoerd op de secties.
- Was de dia's met de secties met PBS gedurende 5 minuten.
- Verwarm de citraatbuffer tot het koken in een magnetron.
- Plaats de dia's in de buffer en blijf verwarmen om de oplossing ongeveer 20 minuten aan de kook te houden.
OPMERKING: Deze stap helpt bij het ophalen van antigeen. Het weefsel blijft intact, zelfs bij hoge temperaturen, wat de kleuringskwaliteit verbetert door vouwen, beschadiging of loslating van de weefsels te voorkomen. - Laat de monsters langzaam afkoelen tot kamertemperatuur voor de volgende stap. Giet de overtollige oplossing af, droog het gebied rond elke sectie voorzichtig met een stuk weefsel en teken een cirkel rond de sectie met een waterafstotende pen (zie de tabel met materialen) om een hydrofobe barrière te vormen. Zorg ervoor dat u de weefselsecties niet droogt.
- Was de dia's twee keer met PBS en broed gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt.
- Blok gedurende 2 uur in blokkeeroplossing-2 (zie de materiaaltabel) bij kamertemperatuur.
- Pipetteer primaire antilichaamoplossing (muis monoklonaal α-GFP, 1:250, zie de Tabel met materialen) per dia en incuber de dia's in een immunohistochemische natte doos bij 4 °C gedurende een nacht.
- Was de dia's drie keer met PBS en broed gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt.
- Laat overtollige PBS aftappen. Incubeer de dia's met het juiste secundaire antilichaam (1:400, zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in PBS.
- Was de dia's drie keer met PBS en broed gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt.
- Giet de overtollige PBS af, pipetteer het montagemedium op de dia en monteer met een schuifafdekplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol kan worden gebruikt om tegelijkertijd het expressiepatroon van één mRNA en één eiwit te onderzoeken. Figuur 1 toont de experimentele workflow. De 5-HT2C-receptor is een subtype van de 5-HT-receptor gebonden door de neurotransmitter serotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT). Het is wijd verspreid in het centrale zenuwstelsel (CZS) en kan een verscheidenheid aan hersenfuncties aanzienlijk reguleren, waaronder eetlust, stemming, angst en reproductief gedrag13. De expressie van 5-HT2C in het CZS werd gedetecteerd door de transgene lijn Tg (foxp2:egfp-caax), waarin foxP2-neuronen worden gelabeld door fluoresceïnegroen fluorescerend eiwit (GFP). GFP werd niet uitgedrukt in wildtype zebravis, maar alleen in de transgene lijn. Gelijktijdige detectie van de expressie van RNA (5-HT2C, de sonde voor htr2c, figuur 2A) en eiwit (GFP, antiGFP, figuur 2B) kan worden gebruikt voor eiwit- en mRNA-colokalisatieanalyse.
Insulinoom-geassocieerd 1a (insm1a), een zinkvingertranscriptiefactor, werd voor het eerst geïdentificeerd uit de tumorreductiebibliotheek en speelde verschillende functies bij de vorming en differentiatie van het centrale en perifere zenuwstelsel van gewervelde dieren en het neuro-endocriene systeem. Recente studies hebben aangetoond dat insm1a een belangrijke regulator is van de ontwikkeling van motorneuronen. De expressie van insm1a in het ruggenmerg en motorneuronen van de zebravis werd gedetecteerd door de transgene lijn Tg (hb9:egfp), waarin hb9-neuronen worden gelabeld door fluoresceïne GFP. GFP werd niet uitgedrukt in wildtype zebravis, maar alleen in de transgene lijn. De gelijktijdige detectie van de expressie van RNA (insm1a, de sonde voor insm1a, figuur 3A) en eiwit (GFP, antiGFP, figuur 3B) kan worden gebruikt voor eiwit- en mRNA-colokalisatieanalyse. Dit protocol werd met succes toegepast om de colocalisatie van eiwit en RNA te detecteren om hun ruimtelijke relatie te begrijpen.
Figuur 1: Overzicht van de methode. Dit stroomdiagram toont een experimentele workflow. De workflow kan in minimaal 9 dagen worden voltooid (zie het aantal dagen in de rechterbovenhoek van elke fase in de workflow), hoewel sommige stappen in een langere periode kunnen worden voltooid, zoals beschreven in het protocol. Afkortingen: PFA = paraformaldehyde; O/N = 's nachts; RT = kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Whole-mount embryo's gekleurd met 5-HT2C sonde en GFP antilichaam in Tg (foxP2:egfp-caax). Bright-field (A), fluorescerend (B) en samengevoegde beelden (C) tonen 5-HT2C (de sonde voor htr2c, A) en GFP (antiGFP, B) expressie in foxP2 neuronen en axon tracts. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Whole-mount embryo's gekleurd met insm1a sonde en GFP antilichaam in Tg (hb9:egfp). Bright-field (A), fluorescerende (B) en samengevoegde beelden (C) tonen insm1a (de sonde voor insm1a, A) en GFP (anti-GFP, B) expressie in hb9 neuronen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Embryo 's | Tijd |
| 24 pk | 2 min |
| 30 pk | 3 min |
| 36 pk | 5 min |
| 48 pk | 10 min |
| 72 pk | 15 min |
| 96 pk | 45 min |
| 4-5 dpf | 60 min |
Tabel 1: Proteïnase K verteringstijd voor zebravisembryo's. Afkortingen: hpf = uren na de bevruchting; DPF = dagen na de bevruchting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol stelt een combinatie voor van in situ hybridisatie en immunohistochemie, een belangrijke stap in de colokalisatie-experimenten op zebravisembryo's. Deze methode dient als een eenvoudige en efficiënte manier om tegelijkertijd één mRNA en één eiwit te analyseren. In situ hybridisatie en antilichaamkleuring werden uitgevoerd op zebravisembryo's. In tegenstelling tot verschillende protocollen die eerder 14,15,16 werden gepubliceerd, werden immunofluorescentie en immunohistochemie gebruikt om eiwitexpressie te onderzoeken. Weinig zebravisspecifieke antilichamen zijn op de juiste manier gevalideerd voor gebruik in rubriek17. Eerdere studies hebben slechts één techniek gebruikt: immunofluorescentie, immunohistochemie of in situ hybridisatie. Het combineren van in situ hybridisatie en immunohistochemie om RNA en eiwit te analyseren, overwint de beperkingen van elke techniek. De eerste stap was in situ hybridisatie, die mRNA sterk beschermt tegen degradatie. Het ophalen van antigeen werd geïnduceerd door verhitting om de verstoring door proteïnase K-behandeling van antilichaambinding tijdens immunohistochemische kleuring te voorkomen. Of deze aanpak voor alle antigenen werkt, zal verder moeten worden getest. Afbeeldingen van de secties toonden aan dat de 5-HT2C-receptor coexpressie was in foxP2-neuronen en dat de insm1a-receptor co-expressie was in hb9-neuronen.
Whole-mount in situ hybridisatie behoudt de integriteit van monsters aanzienlijk. In situ hybridisatie gevolgd door sectie kan de incubatietijd voor antilichaamkleuring verkorten. Bovendien kan antilichaamkleuring na in situ hybridisatie helpen fluorescentie-uitdoven te voorkomen.
De volgende specifieke stappen zijn essentieel voor het succes van het experiment. De eerste cruciale stap is om het embryo te herstellen in 4% PFA. Deze stap stopt de proteïnase K-reactie omdat PFA proteïnase K inactiveert. De monsters moeten voorzichtig worden gemengd om alle embryo's aan PFA bloot te stellen; De buis kan ook op zijn kant worden geplaatst, zodat de embryo's gelijkmatig in de oplossing worden verdeeld. De tweede kritieke stap is de behandeling van het embryo tijdens OCT-implantatie. De embryo's moeten in een specifieke richting worden gerangschikt (dorsaal-ventraal of lateraal), waardoor ze recht blijven, zodat ze in secties kunnen worden gesneden vanuit ongeveer hetzelfde gebied voor alle embryo's. Een kleine naald wordt gebruikt om kleine, bewuste bewegingen te maken in het stroperige OCT-medium om het embryo te lokaliseren en bubbels te verwijderen.
Er zijn verschillende mogelijke wijzigingen die kunnen worden toegepast op het beschreven scenario. De verteringstijd van proteïnase K in in situ hybridisatie kan worden bepaald aan de hand van de verschillende ontwikkelingsstadia van de zebravisembryo's (tabel 1). Bovendien is de dikte van de cryosecties zeer flexibel en kan deze worden bepaald volgens experimentele vereisten. Hoewel wordt voorspeld dat deze aanpak geschikt zal zijn voor een breed scala aan experimenten, heeft het enkele potentiële beperkingen. De succesvolle uitvoering van deze procedure hangt af van het handhaven van een volledig monster door middel van twee opeenvolgende experimenten. Er zijn meerdere mogelijke pauzepunten in dit protocol. De gedehydrateerde embryo's kunnen gedurende enkele maanden worden bewaard in 30% sucrose-oplossing bij -20 °C14. Op dezelfde manier kunnen de voorbereide dia's langer dan 1 jaar14 in een diadoos bij -20 °C worden bewaard. De bevroren blokken kunnen drie maanden bij -80 °C worden bewaard.
Dit protocol voor in situ hybridisatie in combinatie met immunohistochemie is succesvol gebleken bij het detecteren van 5-HT2C en insm1a expressie in zebravisembryo's en kan gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid aan weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op neuronen of gliacellen, waardoor neurowetenschappers een robuuste onderzoeksaanpak krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), de Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) en de Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
