Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.
Abstract
כבעל חוליות, דג הזברה נמצא בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה, המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות. מחקר תפקוד גנים מבוסס על זיהוי דפוסי ביטוי גנים. למרות שאימונוהיסטוכימיה מציעה דרך רבת עוצמה להעריך ביטוי חלבונים, המספר המוגבל של נוגדנים זמינים מסחרית בדגי זברה מגביל את היישום של costaining. הכלאה באתרו נמצאת בשימוש נרחב בעוברים של דגי זברה כדי לזהות ביטוי mRNA. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה עבור קטעי עוברים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. אימונוהיסטוכימיה והדמיה של קריוסקציה יחידה בוצעו לאחר הכלאה באתר . הפרוטוקול עוזר לפענח את דפוס הביטוי של שני גנים, תחילה על ידי זיהוי תעתיק באתרו ולאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה כנגד חלבון באותו קטע.
Introduction
דג הזברה הוא מודל רב עוצמה של בעלי חוליות לחקר התפתחות וגנטיקה 1,2. דגי זברה ובני אדם חולקים הומולוגיה גנטית גבוהה (70% מהגנים משותפים עם הגנום האנושי), המאפשרת את השימוש בה כמודל למחלות אנושיות3. בדגי זברה שכיח למדי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים ואת הקשר המרחבי ביניהם. אימונוהיסטוכימיה שימשה לראשונה בשנת 1941 לזיהוי פתוגנים ברקמות נגועות על ידי יישום נוגדנים המסומנים בתווית FITC4. חלבון המטרה באזור הרקמה מסומן תחילה בנוגדן ראשוני, ולאחר מכן החלק מסומן בנוגדן משני כנגד המין המארח של הנוגדן הראשוני, אימונוגלובולין. צביעת נוגדנים היא גישה חזקה לזיהוי לוקליזציה של חלבונים, המציעה רזולוציה אופטית גבוהה ברמה התוך תאית. עם זאת, מספר הנוגדנים הזמינים מוגבל מאוד בדגי זברה. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי כ -112,000 נוגדנים זמינים באופן מסחרי עבור עכברים; עם זאת, מעט מאוד נוגדנים הוכחו כאמינים בדגי זברה5.
במקום זאת, בדגי זברה, הכלאה באתרה יושמה באופן נרחב לניתוח דפוסי ביטוי גנים. שיטה זו שימשה לראשונה להערכת ביטוי גנים בעוברי דרוזופילה בשנות ה-80 6,7, ומאז טכנולוגיה זו פותחה ושוכללה ללא הרף. בתחילה, בדיקות DNA מסומנות רדיו שימשו כדי לזהות תעתיקי mRNA; עם זאת, הרזולוציה המרחבית הייתה נמוכה יחסית, והיו סיכונים בריאותיים פוטנציאליים שנגרמו על ידי הרדיואקטיביות. לאחר מכן, הכלאה באתרה מסתמכת על בדיקות RNA המסומנות עם digoxigenin (DIG) או fluorescein (Fluo), אשר מצומדות לפוספטאז אלקליין (AP) או מזוהות על ידי הגברת אות טירמיד פלואורסצנטי (TSA)8,9. למרות שנעשה שימוש ב-TSA כדי לזהות שניים או שלושה גנים, תיוג DIG של בדיקות RNA ונוגדנים מצומדים של antiDIG AP הם עדיין גישות רגישות מאוד, יציבות ובשימוש נרחב להכלאה באתר. לכן, נוגדנים ממוסחרים בשילוב עם בדיקות באתרן המסומנות ב-DIG שימושיים למתן תובנה לגבי לוקליזציה של חלבונים וביטוי של גן אחד.
עוברים שלמים אינם יכולים לחשוף את הקשר המרחבי בין גנים בשל הרזולוציה האופטית הנמוכה, למרות שעוברים של דגי זברה קטנים ושקופים10. לפיכך, חתך יש צורך לנתח את דפוסי הביטוי של גנים ברמה התאית. Cryosectioning כבר בשימוש נרחב בדגי זברה כפי שהוא קל לבצע יכול ביעילות לשמר את האנטיגן. לכן, הכלאה באתרו בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בקריוסקציות של דגי זברה מציעה דרך רבת עוצמה לניתוח דפוסי הביטוי של שני גנים. שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה יושם על דגי זברה11. עם זאת, טיפול בפרוטאינאז K שימש לשיפור חדירת הבדיקה על חשבון שלמות האנטיגן. כדי להתגבר על מגבלה זו, פרוטוקול זה משתמש בחימום כדי לגרום לשליפת אנטיגן. פרוטוקול זה חל לא רק על עוברים בשלבים שונים וחלקי רקמות בעוביים שונים (קטעי ראש של 14 מיקרומטר וחלקי חוט שדרה של 20 מיקרומטר), אלא הוא אומת גם באמצעות גנים המבוטאים בשני איברים, כולל הראש וחוט השדרה.
מאמר זה יתאר כיצד לשלב הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בעוברים של דגי זברה בהקפאה. הרבגוניות של פרוטוקול זה מודגמת על ידי שימוש במספר שילובים של הכלאה באתרו-אימונוהיסטוכימיה, כולל בדיקות הכלאה באתרן עבור שני נוירונים שונים. שיטה זו מתאימה לאיתור mRNA וחלבון באזורים שונים ובעוברים בגילאים שונים, וכן לדפוסי ביטוי של שני גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ננטונג (מס 'S20191210-402).
1. אוסף עוברים של דגי זברה
- הציבו זוג דגי זברה במכלי רבייה בלילה שלפני איסוף הביצים, האחד דג זברה מהונדס והשני דג זברה מסוג AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type או Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (ראו טבלת חומרים). השתמש במחיצת פלסטיק אלכסונית כדי להפריד בין הזכר לנקבה כדי למנוע גישה פיזית. למחרת, הכניסו את החלק העליון של מיכל הרבייה לחלק תחתון נקי מלא במים מתוקים, והסירו את המחיצה של מיכל הרבייה. אפשרו לדגים להזדווג במשך 10-20 דקות, ואספו את הביצים לאחר ששקעו לתחתית מיכל הרבייה.
- תרבית את העוברים בתווך עובר E3 (ראה טבלת חומרים) המכיל מתילן כחול (1 מ"ל של 0.05% מתילן כחול ב 1 ליטר של תווך עובר E3) ב 28.5 ° C.
- טפל בעוברים 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) עם phenylthiourea (PTU, ראה את טבלת החומרים) כדי למנוע היווצרות פיגמנט.
הערה: בעלי חיים משני המינים משמשים בניסויים.
2. הכלאה באתרו
הערה: המים המשמשים לשלבים 2.1-2.11 הם מים מטופלים דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) (ראה טבלת חומרים).
- תקן ~ 10 עוברים עם 0.5-1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד טרי (PFA, ראה טבלת חומרים) בצינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ב 4 ° C למשך לילה במשך 12-14 שעות.
הערה: הפרוטוקול להכלאה באתרו שונה מעט מספרות12 שפורסמה בעבר. PFA חייב להיות מוכן טרי ומאוחסן ב 4 ° C בתוך שבוע אחד של שימוש או במשך חודש אחד ב -20 ° C. כל השלבים הבאים בהכלאה באתרם בוצעו באמצעות צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל. - השתמש פינצטה כדי להסיר את העור של עוברים בלבד מעל 48 hpf.
הערה: העור מוסר כדי להקל על חדירת בדיקות RNA לאזור תא המטען של עוברים מעל 48 hpf. - יש לייבש בהדרגה את העוברים על ידי שטיפה עם 25%, 50% ו-75% מתנול במי מלח חוצצי פוספט 1x המכילים 0.1% Tween-20 ברציפות (PBST, ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים במשך 5 דקות ב 100% מתנול בטמפרטורת החדר. לדגור על העוברים ב 100% מתנול ב -20 ° C לפחות לילה במשך 12-14 שעות.
הערה: עוברים מיובשים ניתן לאחסן 100% מתנול ב -20 ° C במשך 6 חודשים. - יש להחזיר בהדרגה לחות לעוברים על ידי שטיפה עם 75%, 50% ו-25% מתנול ב-PBST ברציפות למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. שטפו את העובר שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.
- לעכל את העוברים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל פרוטאינאז K (ראה טבלת חומרים) ב PBST בטמפרטורת החדר (ראה טבלה 1).
- שטפו את העוברים עם PBST במשך 5 דקות. בצעו את שלב השטיפה שלוש פעמים.
- יש לתקן את העוברים שטופים ב-4% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: שלב זה עוצר את העיכול מכיוון ש- PFA משבית פרוטאינאז K. ודא שהדגימה מעורבבת בעדינות כדי לחשוף את כל העוברים ל- PFA; ניתן להניח את הצינורות על צידיהם כדי לפזר באופן שווה את העוברים בתמיסה. PFA זה לא חייב להיות טרי (זה יכול להיות בקירור עד 2 שבועות). - יש לשטוף את העובר שלוש פעמים עם PBST, תוך דגירה במשך 5 דקות במהלך כל שטיפה.
- בצע קדם-הכלאה של העוברים על ידי דגירה עם תמיסת קדם-הכלאה (preHYB, ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות. החלף את preHYB בתמיסת הכלאה (HYB, ראה טבלת חומרים) וקדם הכלאה במשך 4 שעות לפחות ב- HYB.
הערה: לפני שתמשיך עם prehybridization, לחמם מראש את התמיסות ל 65 ° C. פורממיד (ראו טבלת חומרים) משמש לשמירה על הצורה והמבנה של הרקמה. פורממיד גם מונע קשירה של שברים לא הומולוגיים בטמפרטורות נמוכות. - חממו את הבדיקה (Insm1a או 5-HT2C) ב-HYB במשך 5 דקות ב-95°C לפני הוספתכם לעוברים. השתמש בבדיקה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל HYB. הסר כמה שיותר preHYB מבלי לתת לעוברים לבוא במגע עם האוויר, והוסף בדיקה שחוממה מראש ב- HYB לצינור המכיל את העוברים.
הערה: ניתן להשתמש בבדיקת RNA מסומנת כדי לבצע הכלאה עם רצף mRNA מטרה בעוברים. לכן, הבדיקה יכולה לשמש כדי לזהות את הביטוי של גן של עניין ואת המיקום של mRNA. - אפשרו לגשושית לבצע הכלאה במהלך הלילה (12-14 שעות) בטמפרטורה של 50-70 מעלות צלזיוס.
הערה: טמפרטורת ההכלאה שונה עבור בדיקות שונות. - למחרת, שאפו את תמיסת הבדיקה עם פיפטה ואחסנו אותה בצינור ב -20 מעלות צלזיוס, כך שניתן יהיה לעשות בה שימוש חוזר פעמים רבות.
- לשטוף את העוברים כדלקמן:
- שטפו את העוברים במשך 15 דקות עם 100% HYB ב-65°C.
- שטפו את העוברים ברצף עם 75%, 50% ו-25% HYB ב-2x ציטראט מי מלח סטנדרטיים המכילים 0.1% Tween-20 (SSCT, ראו טבלת חומרים) במשך 15 דקות כל אחד ב-65°C.
- שטפו את העוברים במשך 15 דקות ב-2x SSCT ב-65°C.
- שטפו את העוברים במשך 15 דקות ב-0.2x SSCT ב-65°C.
- שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות במאגר חומצה זכרית המכיל 0.02% Tween-20 (MABT, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.
- חסום את העוברים ההיברידיים והשטופים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר עם 2% תמיסה חוסמת-1 (ראה טבלת חומרים).
- החלף את תמיסת החסימה-1 באנטידיגוקסיגנין AP (דילול בקנ"מ 1:4,000, ראה טבלת חומרים) בתמיסת חסימה טרייה של 2%-1 ונער למשך הלילה במשך 12-14 שעות בטמפרטורה של 4°C.
- שטפו את העוברים ארבע פעמים במשך 30 דקות ב-MABT בטמפרטורת החדר.
הערה: הוציאו את הסגול BM (ראו טבלת חומרים) מהמקרר במהלך הכביסה השלישית ונערו אותו מדי פעם במהלך השטיפות הבאות. - שטפו את העוברים פעמיים במשך 10 דקות ב-NTMT (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1% Tween-20, ראו טבלת חומרים).
- השתמש פיפטה כדי להסיר כמה שיותר NTMT מן העוברים. יש להחליף במצע AP סגול BM ולהכתים את העוברים בטמפרטורת החדר בחושך. עקוב אחר שינויי הצבע כל 30 דקות כדי לשלוט במידת הצביעה.
הערה: זמן הצביעה הספציפי שונה ויש להתאים אותו בהתאם לכל בדיקה. דגירה על העוברים ב 37 מעלות צלזיוס יכולה להאיץ את התגובה. דגירה על העוברים ב 4 מעלות צלזיוס יכולה להגדיל את זמן התגובה וניתן לעשות זאת בן לילה. - ברגע שהוא מפותח במידה הרצויה, להפסיק את התגובה על ידי שטיפה קצרה עם NTMT פעמיים. לאחר הכלאה באתר , שטפו את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 20 דקות.
3. הטבעה
- לטבול את העוברים 5% סוכרוז ב 1x PBS (ראה את טבלת החומרים) למשך 12-14 שעות ב 4 ° C.
- שנה את התמיסה המכסה את העוברים ל 15% סוכרוז ב 1x PBS ודגור לילה במשך 12-16 שעות ב 4 ° C.
- שנה את התמיסה המכסה את העוברים ל -30% סוכרוז ב 1x PBS ודגור במשך 1-2 ימים ב 4 ° C.
הערה: יש לדגור בתמיסה זו עד שהעוברים שוקעים לתחתית הצינור. - מלאו קריומולד בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינונית (ראו טבלת חומרים). מעבירים את העוברים ב-30% סוכרוז לקריומולד עם מדיום OCT. מערבבים אותם כדי להסיר את הסוכרוז מהעוברים.
- מעבירים את העוברים לקריאומולד חדש לרקמה וממלאים אותו בעדינות במדיום OCT, תוך הימנעות מהיווצרות בועות.
- טבלו כל עובר, דחפו אותו לתחתית הקריומולד, והניחו כל עובר בכיוון הרצוי (גבי-גחוני או רוחבי). שמור את העוברים בקו ישר.
הערה: מומלץ מאוד להניח עובר אחד בלבד בכל הקפאה (ראה טבלת חומרים). - הניחו את העוברים המשובצים בקריומולדים באמבט אתנול קרח יבש.
- יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לפחות למשך הלילה למשך 12-14 שעות.
הערה: ניתן לשמור את הקריומולדים בטמפרטורה של -80°C למשך חודש אחד לפחות.
4. Cryosectioning
- הגדר את ההקפאה באמצעות קריוסטט ל -20 ° C.
- הסר את בלוק הדגימה מהקריומולד והנח אותו בהקפאה. מניחים את מדיום OCT על בסיס הצ'אק המצונן ומניחים את הבלוק מלמעלה.
- ודא שגוש הדגימה מקביל לסכין הגילוח. יש לחתוך בזהירות עודפי OCT סביב הדגימה.
- חותכים למקטעים בעובי 12-20 מיקרומטר באמצעות הקפאה. העבר במהירות את המקטעים לשקופיות זכוכית כך שבכל שקופית יהיו 3-4 מקטעים. אפשרו לדגימות להגיע לטמפרטורת החדר, ואחסנו את המקטעים בקופסת שקופיות אטומה בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
5. Immunostaining
הערה: צביעת GFP מבוצעת על הסעיפים.
- שטפו את השקופיות המכילות את הקטעים עם PBS למשך 5 דקות.
- מחממים ציטראט לרתיחה במיקרוגל.
- מניחים את המגלשות במאגר וממשיכים לחמם כדי לשמור על התמיסה קרובה לרתיחה למשך כ-20 דקות.
הערה: שלב זה מסייע בשליפת אנטיגן. הרקמה נשארת שלמה גם בטמפרטורות גבוהות, מה שמשפר את איכות הצביעה על ידי מניעת קיפול, נזק או ניתוק של הרקמות. - תנו לדגימות להתקרר באיטיות לטמפרטורת החדר לפני השלב הבא. מסננים את התמיסה העודפת, מייבשים בזהירות את האזור סביב כל קטע עם פיסת רקמה, ומציירים עיגול סביב הקטע בעזרת עט דוחה מים (ראו טבלת חומרים) ליצירת מחסום הידרופובי. היזהרו לא לייבש את חלקי הרקמות.
- שטפו את המגלשות פעמיים עם PBS, תוך דגירה במשך 10 דקות במהלך כל כביסה.
- חוסמים למשך שעתיים בתמיסת חסימה-2 (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.
- תמיסת נוגדנים ראשונית פיפטה (עכבר חד-שבטי α-GFP, 1:250, ראה טבלת חומרים) לכל שקופית ודגרה על המגלשות בקופסה רטובה אימונוהיסטוכימית בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
- שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS, תוך דגירה במשך 10 דקות במהלך כל כביסה.
- מסננים עודפי PBS. דגרו על השקפים עם הנוגדן המשני המתאים (1:400, ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב-PBS.
- שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS, תוך דגירה במשך 10 דקות במהלך כל כביסה.
- סננו את עודפי ה-PBS, העבירו את מצע ההרכבה למגלשה והרכיבו באמצעות כיסוי החלקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון בו זמנית את דפוס הביטוי של mRNA אחד וחלבון אחד. איור 1 מראה את זרימת העבודה הניסיונית. קולטן 5-HT2C הוא תת-סוג של קולטן 5-HT הקשור על ידי המוליך העצבי סרוטונין (5-hydroxytryptamine, 5-HT). הוא מופץ באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית (CNS) ויכול לווסת באופן משמעותי מגוון תפקודי מוח, כולל תיאבון, מצב רוח, חרדה והתנהגות רבייה13. הביטוי של 5-HT2C במערכת העצבים המרכזית זוהה על ידי הקו המהונדס Tg (foxp2:egfp-caax), שבו נוירונים foxP2 מסומנים על ידי חלבון פלואורסצאין ירוק פלואורסצנטי (GFP). GFP לא בא לידי ביטוי בדגי זברה מסוג בר אלא רק בקו המהונדס. זיהוי סימולטני של ביטוי רנ"א (5-HT2C, הגשושית עבור htr2c, איור 2A) וחלבון (GFP, antiGFP, איור 2B) יכול לשמש לניתוח קולוקליזציה של חלבונים ו-mRNA.
Insulinoma-associated 1a (insm1a), גורם שעתוק אצבע אבץ, זוהה לראשונה מספריית הפחתת הגידול ומילא מספר תפקידים בהיווצרות והתמיינות של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של בעלי החוליות והמערכת הנוירואנדוקרינית. מחקרים אחרונים הראו כי insm1a הוא וסת חשוב של התפתחות נוירונים מוטוריים. הביטוי של insm1a בחוט השדרה ובתאי העצב המוטוריים של דגי הזברה זוהה על ידי הקו המהונדס Tg (hb9:egfp), שבו נוירונים hb9 מסומנים על ידי פלואורסצאין GFP. GFP לא בא לידי ביטוי בדגי זברה מסוג בר אלא רק בקו המהונדס. זיהוי סימולטני של ביטוי רנ"א (insm1a, הגשושית עבור insm1a, איור 3A) וחלבון (GFP, antiGFP, איור 3B) יכול לשמש לניתוח לוקליזציה של חלבונים ו-mRNA. פרוטוקול זה יושם בהצלחה כדי לזהות את הקולוקליזציה של חלבון ורנ"א כדי להבין את היחסים המרחביים ביניהם.
איור 1: מתווה השיטה. תרשים זרימה זה מציג זרימת עבודה ניסיונית. ניתן להשלים את זרימת העבודה תוך 9 ימים לפחות (עיין במספר הימים בפינה השמאלית העליונה של כל שלב בזרימת העבודה), אם כי ניתן להשלים שלבים מסוימים בפרק זמן ארוך יותר, כמתואר בפרוטוקול. קיצורים: PFA = paraformaldehyde; O/N = לילה; RT = טמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עוברים שלמים מוכתמים בבדיקה 5-HT2C ובנוגדן GFP ב-Tg (foxP2:egfp-caax). שדה בהיר (A), פלואורסצנטי (B) ותמונות ממוזגות (C) מראים ביטוי 5-HT2C (הגשושית עבור htr2c, A) ו-GFP (antiGFP, B) בתאי עצב foxP2 ובדרכי אקסונים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עוברים שלמים מוכתמים בבדיקת insm1a ובנוגדן GFP ב-Tg (hb9:egfp). שדה בהיר (A), פלואורסצנטי (B) ותמונות ממוזגות (C) מראים ביטוי insm1a (הגשושית עבור insm1a, A) ו-GFP (anti-GFP, B) בתאי עצב מסוג hb9. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| עוברים | זמן |
| 24 כ"ס | 2 דקות |
| 30 HPF | 3 דקות |
| 36 כ"ס | 5 דקות |
| 48 HPF | 10 דק' |
| 72 כ"ס | 15 דק' |
| 96 כ"ס | 45 דק' |
| 4-5 DPF | 60 דק' |
טבלה 1: זמן העיכול של פרוטאינאז K לעוברים של דגי זברה. קיצורים: HPF = שעות לאחר ההפריה; DPF = ימים לאחר ההפריה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציע שילוב של הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה, צעד חשוב בניסויי הקולוקליזציה בעוברים של דגי זברה. שיטה זו משמשת דרך קלה ויעילה לנתח בו זמנית mRNA אחד וחלבון אחד. הכלאה באתרו וצביעת נוגדנים בוצעו על עוברים של דגי זברה. בניגוד למספר פרוטוקולים שפורסמו בעבר14,15,16, אימונופלואורסצנטיות ואימונוהיסטוכימיה שימשו לחקר ביטוי חלבונים. מעט נוגדנים ספציפיים לדגי זברה אומתו כראוי לשימוש בסעיפים17. מחקרים קודמים השתמשו רק בטכניקה אחת: אימונופלואורסצנציה, אימונוהיסטוכימיה, או הכלאה באתר. שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה לניתוח RNA וחלבון מתגבר על המגבלות של טכניקה אחת. הצעד הראשון היה הכלאה באתר, אשר מגנה מאוד על mRNA מפני התפרקות. שליפת האנטיגן הושרה על ידי חימום כדי למנוע הפרעה על ידי טיפול בפרוטאינאז K של קשירת נוגדנים במהלך צביעה אימונוהיסטוכימית. אם גישה זו עובדת עבור כל האנטיגנים ידרוש בדיקות נוספות. תמונות של המקטעים הראו כי קולטן 5-HT2C בא לידי ביטוי בתאי עצב foxP2 וכי קולטן insm1a בא לידי ביטוי בתאי עצב hb9.
הכלאה באתרו של הרכבה שלמה שומרת מאוד על שלמות הדגימות. הכלאה באתרו ואחריה חתך יכול להפחית את זמן הדגירה עבור צביעת נוגדנים. בנוסף, צביעת נוגדנים לאחר הכלאה באתרו יכולה לסייע במניעת מרווה פלואורסצנטית.
השלבים הספציפיים הבאים חיוניים להצלחת הניסוי. הצעד הקריטי הראשון הוא לתקן את העובר ב-4% PFA. שלב זה עוצר את תגובת פרוטאינאז K מכיוון ש- PFA משבית פרוטאינאז K. יש לערבב את הדגימות בעדינות כדי לחשוף את כל העוברים ל- PFA; הצינור יכול גם להיות ממוקם על הצד שלה, כך העוברים מופצים באופן שווה בתמיסה. השלב הקריטי השני הוא הטיפול בעובר במהלך השתלת OCT. יש לסדר את העוברים בכיוון מסוים (גבי-גחוני או רוחבי), ולשמור עליהם ישרים כך שניתן יהיה לחתוך אותם למקטעים בערך מאותו אזור עבור כל העוברים. מחט קטנה משמשת לביצוע תנועות קטנות ומודעות בתווך OCT צמיגי כדי לאתר את העובר ולהסיר בועות.
ישנם מספר שינויים פוטנציאליים שניתן להחיל על התרחיש המתואר. זמן העיכול של פרוטאינאז K בהכלאה באתרו יכול להיקבע בהתאם לשלבי ההתפתחות השונים של עוברי דגי הזברה (טבלה 1). בנוסף, עובי ההקפאה גמיש מאוד וניתן לקבוע אותו על פי דרישות הניסוי. בעוד שצפוי כי גישה זו תתאים למגוון רחב של ניסויים, יש לה כמה מגבלות פוטנציאליות. ביצוע מוצלח של הליך זה תלוי בשמירה על מדגם שלם באמצעות שני ניסויים עוקבים. קיימות מספר נקודות הפסקה אפשריות בפרוטוקול זה. את העוברים המיובשים ניתן לאחסן בתמיסת 30% סוכרוז בטמפרטורה של -20°C למשך מספר חודשים14. באופן דומה, ניתן לאחסן את השקופיות המוכנות בתיבת שקופיות ב -20 ° C במשך יותר משנה14. בלוקים קפואים ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך שלושה חודשים.
פרוטוקול זה להכלאה באתרו בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה הוכח כמוצלח בזיהוי ביטוי 5-HT2C ו- insm1a בעוברים של דגי זברה וניתן ליישם אותו בקלות על מגוון רקמות בשלבי התפתחות שונים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על נוירונים או תאי גלייה, מתן גישה מחקרית חזקה עבור מדעני מוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (MS12019011), קרן המדע והטכנולוגיה של נאנטונג של סין (JC2021058), והקרן למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
