Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man opnår billeder ved at kombinere in situ hybridisering og immunhistokemi af zebrafiskens embryonale sektioner. In situ hybridisering blev udført før kryosektion, efterfulgt af antistoffarvning. Det er nyttigt at detektere ekspressionsmønstre af to gener i zebrafisk, hvis der er mangel på antistoffer.
Abstract
Som hvirveldyr har zebrafisken været meget udbredt i biologiske undersøgelser. Zebrafisk og mennesker deler høj genetisk homologi, hvilket gør det muligt at bruge det som model for menneskelige sygdomme. Genfunktionsundersøgelse er baseret på påvisning af genekspressionsmønstre. Selvom immunhistokemi tilbyder en effektiv måde at analysere proteinekspression på, begrænser det begrænsede antal kommercielt tilgængelige antistoffer i zebrafisk anvendelsen af costaining. In situ hybridisering anvendes i vid udstrækning i zebrafiskembryoner til at detektere mRNA-ekspression. Denne protokol beskriver, hvordan man opnår billeder ved at kombinere in situ hybridisering og immunhistokemi for zebrafiskembryosektioner. In situ hybridisering blev udført før kryosektion, efterfulgt af antistoffarvning. Immunhistokemi og billeddannelse af en enkelt kryosektion blev udført efter in situ hybridisering. Protokollen er nyttig til at optrævle ekspressionsmønsteret for to gener, først ved in situ transkriptdetektion og derefter ved immunhistokemi mod et protein i samme afsnit.
Introduction
Zebrafisken er en stærk hvirveldyrmodel til studier af udvikling og genetik 1,2. Zebrafisk og mennesker deler høj genetisk homologi (70% af generne deles med det menneskelige genom), hvilket gør det muligt at bruge det som model for menneskelige sygdomme3. Hos zebrafisk er det ret almindeligt at detektere ekspressionsmønstre for to gener og deres rumlige forhold. Immunohistokemi blev først brugt i 1941 til at detektere patogener i inficerede væv ved at anvende FITC-mærkede antistoffer4. Målproteinet i vævssektionen mærkes først med et primært antistof, og sektionen mærkes derefter med et sekundært antistof mod det primære antistofs værtsart immunoglobulin. Antistoffarvning er en robust tilgang til at detektere lokalisering af proteiner, som tilbyder høj optisk opløsning på intracellulært niveau. Antallet af tilgængelige antistoffer er dog meget begrænset hos zebrafisk. En nylig undersøgelse viser, at ca. 112.000 antistoffer er kommercielt tilgængelige for mus; Imidlertid har meget få antistoffer vist sig at være pålidelige i zebrafisk5.
I stedet er in situ-hybridisering i zebrafisk blevet anvendt bredt til analyse af genekspressionsmønstre. Denne metode blev først brugt til at vurdere genekspression i Drosophila-embryoner i 1980'erne6,7, og siden da er denne teknologi løbende blevet udviklet og forbedret. Oprindeligt blev radioaktivt mærkede DNA-sonder brugt til at detektere mRNA-transkripter; Den rumlige opløsning var imidlertid relativt lav, og der var potentielle sundhedsrisici forårsaget af radioaktiviteten. Derefter er in situ-hybridisering afhængig af RNA-sonderne mærket med digoxigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), som konjugeres til alkalisk fosfatase (AP) eller detekteres ved fluorescerende tyramidsignalforstærkning (TSA)8,9. Selvom TSA er blevet brugt til at detektere to eller tre gener, er DIG-mærkning af RNA-sonder og antiDIG AP-konjugeret antistof stadig meget følsomme, stabile og udbredte tilgange til in situ-hybridisering. Derfor er kommercialiserede antistoffer kombineret med DIG-mærkede in situ-sonder nyttige til at give indsigt i proteinlokalisering og ekspression af et gen.
Helmonterede embryoner kan ikke afsløre det rumlige forhold mellem gener på grund af den lave optiske opløsning, selvom zebrafiskembryoner er små og gennemsigtige10. Derfor er sektionering nødvendig for at analysere ekspressionsmønstre af gener på intracellulært niveau. Kryosektionering har været meget udbredt i zebrafisk, da det er let at udføre og effektivt kan bevare antigenet. Derfor tilbyder in situ-hybridisering kombineret med immunhistokemi i zebrafiskkryosektioner en kraftfuld måde at analysere ekspressionsmønstre for to gener. En kombination af in situ hybridisering og immunhistokemi er blevet anvendt på zebrafisk11. Imidlertid blev proteinase K-behandling brugt til at forbedre sondepenetration på bekostning af antigenintegritet. For at overvinde denne begrænsning bruger denne protokol opvarmning til at inducere antigenhentning. Denne protokol gælder ikke kun for embryoner i forskellige stadier og vævssektioner af forskellig tykkelse (14 μm hovedsektioner og 20 μm rygmarvssektioner), men den er også blevet verificeret ved hjælp af gener udtrykt i to organer, herunder hoved og rygmarv.
Denne artikel vil beskrive, hvordan man kombinerer in situ hybridisering og antistoffarvning i zebrafiskembryoner i kryosektioner. Alsidigheden af denne protokol demonstreres ved anvendelse af en række in situ hybridiserings-immunohistokemiske kombinationer, herunder in situ hybridiseringssonder til to forskellige neuroner. Denne metode er egnet til påvisning af mRNA og protein i forskellige regioner og embryoner i forskellige aldre samt ekspressionsmønstre for to gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Indsamling af zebrafiskembryoner
- Sæt et par zebrafisk op i avlstanke natten før æggene skal indsamles, den ene en transgen zebrafisk og den anden en AB vildtype zebrafisk (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB vildtype eller Tg (hb9:egfp) X AB vildtype) (se materialeoversigten). Brug en diagonal plastdeler til at adskille mand og kvinde for at forhindre fysisk adgang. Den følgende dag skal du montere den øverste del af avlstanken i en ren nedre del fyldt med ferskvand og fjerne skillevæggen i avlstanken. Lad fiskene parre sig i 10-20 min, og saml æggene efter de er sunket til bunds i yngletanken.
- Embryonerne dyrkes i E3-embryomedium (se materialetabellen) indeholdende methylenblåt (1 ml 0,05 % methylenblåt i 1 liter E3-embryomedium) ved 28,5 °C.
- Behandl embryonerne 24 timer efter befrugtning (hpf) med phenylthiourea (PTU, se materialetabellen) for at forhindre pigmentdannelse.
BEMÆRK: Dyr af begge køn anvendes i forsøg.
2. In situ hybridisering
BEMÆRK: Det vand, der anvendes til trin 2.1-2.11, er diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet vand (se materialetabellen).
- Fastgør ~10 embryoner med 0,5-1 ml frisk 4% paraformaldehyd (PFA, se materialetabellen) i et 1,5 ml mikrofugerør ved 4 °C natten over i 12-14 timer.
BEMÆRK: Protokollen for in situ-hybridisering er ændret en smule i forhold til tidligere publiceret litteratur12. PFA skal frisktilberedes og opbevares ved 4 °C inden for en uge efter brug eller i en måned ved -20 °C. Alle de følgende trin i in situ hybridisering blev udført ved hjælp af 1,5 ml mikrofuge rør. - Brug pincet til at fjerne huden på kun embryoner, der er ældre end 48 hpf.
BEMÆRK: Huden fjernes for at lette penetrationen af RNA-sonder i bagagerummet af embryoner ældre end 48 hpf. - Embryonerne dehydreres gradvist ved vask med 25%, 50% og 75% methanol i 1x fosfatbufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 successivt (PBST, se materialetabellen) i 5 minutter hver ved stuetemperatur. Derefter vaskes embryonerne i 5 min i 100% methanol ved stuetemperatur. Embryonerne inkuberes i 100% methanol ved -20 °C i mindst natten over i 12-14 timer.
BEMÆRK: Dehydrerede embryoner kan opbevares i 100% methanol ved -20 °C i 6 måneder. - Embryonerne rehydreres gradvist ved at vaske med 75%, 50% og 25% methanol i PBST successivt i 5 minutter hver ved stuetemperatur. Embryoet vaskes tre gange med PBST i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
- Embryonerne fordøjes med 10 μg/ml proteinase K (se materialetabellen) i PBST ved stuetemperatur (se tabel 1).
- Vask embryonerne med PBST i 5 min. Udfør dette vasketrin tre gange.
- De vaskede embryoner genfikseres i 4% PFA i 15 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Dette trin stopper fordøjelsen, fordi PFA inaktiverer proteinase K. Sørg for, at prøven blandes forsigtigt for at udsætte alle embryonerne for PFA; Rørene kan placeres på deres sider for jævnt at fordele embryonerne i opløsningen. Denne PFA behøver ikke at være frisk (den kan nedkøles i op til 2 uger). - Embryoet vaskes tre gange med PBST og inkuberes i 5 minutter under hver vask.
- Der udføres præhybridisering af embryonerne ved inkubation med præhybridiseringsopløsning (preHYB, se materialetabellen) ved 65 °C i 5 min. Udskift preHYB med hybridiseringsopløsning (HYB, se materialetabellen) og præhybridiser i mindst 4 timer i HYB.
BEMÆRK: Før du fortsætter med præhybridisering, forvarmes opløsningerne til 65 °C. Formamid (se materialetabellen) bruges til at opretholde vævets form og struktur. Formamid forhindrer også binding af ikke-homologe fragmenter ved lave temperaturer. - Sonden (Insm1a eller 5-HT2C) opvarmes i HYB i 5 minutter ved 95 °C, før den tilsættes embryonerne. Sonden anvendes ved 1 μg/ml HYB. Fjern så meget preHYB som muligt uden at lade embryonerne komme i kontakt med luften, og tilsæt forvarmet sonde i HYB til røret med embryonerne.
BEMÆRK: En mærket RNA-sonde kan bruges til at hybridisere med en mål-mRNA-sekvens i embryonerne. Derfor kan sonden bruges til at detektere ekspressionen af et gen af interesse og placeringen af mRNA. - Sonden lader sonden hybridisere natten over (12-14 timer) ved 50-70 °C.
BEMÆRK: Hybridiseringstemperaturen er forskellig for forskellige sonder. - Næste dag aspireres sondeopløsningen med en pipette og opbevares i et rør ved -20 °C, så den kan genbruges mange gange.
- Vask embryonerne som følger:
- Embryonerne vaskes i 15 min med 100% HYB ved 65 °C.
- Embryonerne vaskes sekventielt med 75%, 50% og 25% HYB i 2x standard saltvandscitrat indeholdende 0,1% Tween-20 (SSCT, se materialetabellen) i 15 minutter hver ved 65 °C.
- Embryonerne vaskes i 15 min i 2x SSCT ved 65 °C.
- Embryonerne vaskes i 15 minutter i 0,2x SSCT ved 65 °C.
- Vask embryonerne to gange i 10 min i maleinsyrebuffer indeholdende 0,02% Tween-20 (MABT, se materialetabellen) ved stuetemperatur.
- Bloker de hybridiserede og vaskede embryoner i mindst 2 timer ved stuetemperatur med 2% blokerende opløsning-1 (se materialetabellen).
- Den blokerende opløsning-1 erstattes med antidigoxigenin AP (1:4.000 fortynding, se materialetabellen) i en frisk 2% blokerende opløsning-1 og omrystes natten over i 12-14 timer ved 4 °C.
- Vask embryonerne fire gange i 30 min i MABT ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Fjern BM lilla (se materialetabellen) fra køleskabet under den tredje vask og ryst den lejlighedsvis under de efterfølgende vaske. - Embryonerne vaskes to gange i 10 minutter i NTMT (0,1 M Tris-HCI, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, se materialetabellen).
- Brug en pipette til at fjerne så meget NTMT som muligt fra embryonerne. Udskift med BM lilla AP-substrat og pletter embryonerne ved stuetemperatur i mørke. Overvåg farveændringerne hvert 30. minut for at kontrollere graden af farvning.
BEMÆRK: Den specifikke farvningstid er forskellig og skal justeres i henhold til hver sonde. Inkubation af embryonerne ved 37 °C kan fremskynde reaktionen. Inkubation af embryonerne ved 4 °C kan øge reaktionstiden og kan gøres natten over. - Når det er udviklet i det ønskede omfang, skal reaktionen stoppes ved kortvarigt at skylle med NTMT to gange. Efter in situ-hybridisering skylles embryonerne med PBST tre gange i 20 minutter.
3. Indlejring
- Embryonerne nedsænkes i 5% saccharose i 1x PBS (se materialetabellen) natten over i 12-14 timer ved 4 °C.
- Opløsningen af embryonerne ændres til 15% saccharose i 1x PBS og inkuberes natten over i 12-16 timer ved 4 °C.
- Opløsningen af embryonerne ændres til 30% saccharose i 1x PBS og inkuberes i 1-2 dage ved 4 °C.
BEMÆRK: Inkuber i denne opløsning, indtil embryonerne synker til bunden af røret. - Fyld en kryometal med optimalt skæretemperaturmedium (OCT) (se materialetabellen). Embryonerne overføres i 30% saccharose til cryomold med OCT-medium. Rør dem for at fjerne saccharose fra embryonerne.
- Overfør embryonerne til en ny kryomor, til væv og fyld den forsigtigt med OCT-medium, undgå dannelse af bobler.
- Nedsænk hvert embryo, skub det til bunden af cryomolden, og placer hvert embryo i den ønskede retning (enten dorsal-ventral eller lateral). Hold embryonerne i en lige linje.
BEMÆRK: Det anbefales kraftigt kun at placere et embryo i hver kryomol (se materialetabellen). - Anbring de indlejrede embryoner i kryomere i et ethanolbad med tøris.
- Opbevares ved -80 °C mindst natten over i 12-14 timer.
BEMÆRK: Kryomolerne kan opbevares ved -80 °C i mindst en måned.
4. Kryosektionering
- Kryosektionerne indstilles ved hjælp af en kryostat til -20 °C.
- Fjern prøveblokken fra cryomold og læg den i kryostaten. Placer OCT-medium på bunden af den afkølede borepatron, og læg blokken ovenpå.
- Sørg for, at prøveblokken er parallel med barberbladet. Trim forsigtigt overskydende OCT-medium af omkring prøven.
- Skær i 12-20 μm tykke sektioner ved hjælp af en kryostat. Overfør hurtigt sektionerne til glasdias, så hvert dias har 3-4 sektioner. Lad prøverne opnå stuetemperatur, og opbevar sektionerne i en forseglet diasboks ved -80 °C til senere brug.
5. Immunfarvning
BEMÆRK: GFP-farvning udføres på sektionerne.
- Vask diasene med sektionerne med PBS i 5 min.
- Varm citratbuffer til kogning i en mikrobølgeovn.
- Anbring objektglassene i bufferen, og opvarm den videre for at holde opløsningen tæt på kogning i ca. 20 minutter.
BEMÆRK: Dette trin hjælper med antigenhentning. Vævet forbliver intakt selv ved høje temperaturer, hvilket forbedrer farvningskvaliteten ved at forhindre foldning, beskadigelse eller løsrivelse af vævene. - Lad prøverne afkøle langsomt til stuetemperatur inden næste trin. Tøm den overskydende opløsning, tør forsigtigt området omkring hver sektion med et stykke væv, og tegn en cirkel rundt om sektionen med en vandafvisende pen (se materialetabellen) for at danne en hydrofob barriere. Pas på ikke at tørre vævssektionerne.
- Vask diasene to gange med PBS, inkuber i 10 minutter under hver vask.
- Bloker i 2 timer ved blokering af opløsning-2 (se materialetabellen) ved stuetemperatur.
- Pipettens primære antistofopløsning (musemonoklonal α-GFP, 1:250, se materialetabellen) pr. objektglas og inkuberer objektglassene i en immunhistokemisk vådboks ved 4 °C natten over.
- Vask lysbillederne tre gange med PBS, inkuber i 10 minutter under hver vask.
- Tøm overskydende PBS. Inkuber objektglassene med det relevante sekundære antistof (1:400, se materialetabellen) i 1 time ved stuetemperatur i PBS.
- Vask lysbillederne tre gange med PBS, inkuber i 10 minutter under hver vask.
- Tøm det overskydende PBS, pipette monteringsmediet på diaset, og monter med et glidedæksel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol kan bruges til samtidig at undersøge ekspressionsmønsteret for et mRNA og et protein. Figur 1 viser den eksperimentelle arbejdsgang. 5-HT2C-receptoren er en undertype af 5-HT-receptoren bundet af neurotransmitteren serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT). Det er bredt fordelt i centralnervesystemet (CNS) og kan betydeligt regulere en række hjernefunktioner, herunder appetit, humør, angst og reproduktiv adfærd13. Ekspressionen af 5-HT2C i CNS blev påvist af den transgene linje Tg (foxp2: egfp-caax), hvor foxP2-neuroner er mærket med fluorescein grønt fluorescerende protein (GFP). GFP blev ikke udtrykt i vildtype zebrafisk, men kun i den transgene linje. Samtidig påvisning af ekspressionen af RNA (5-HT2C, sonden for htr2c, figur 2A) og protein (GFP, antiGFP, figur 2B) kan anvendes til protein- og mRNA-colokaliseringsanalyse.
Insulinomassocieret 1a (insm1a), en zink-finger transkriptionsfaktor, blev først identificeret fra tumorreduktionsbiblioteket og spillede flere funktioner i dannelsen og differentieringen af hvirveldyrets centrale og perifere nervesystem og neuroendokrine system. Nylige undersøgelser har vist, at insm1a er en vigtig regulator af udviklingen af motorneuroner. Ekspressionen af insm1a i zebrafiskens rygmarv og motorneuroner blev påvist af den transgene linje Tg (hb9:egfp), hvor hb9-neuroner er mærket med fluorescein GFP. GFP blev ikke udtrykt i vildtype zebrafisk, men kun i den transgene linje. Samtidig påvisning af ekspressionen af RNA (insm1a, sonden for insm1a, figur 3A) og protein (GFP, antiGFP, figur 3B) kan anvendes til protein- og mRNA-colokaliseringsanalyse. Denne protokol blev med succes anvendt til at detektere colokalisering af protein og RNA for at forstå deres rumlige forhold.
Figur 1: Oversigt over metoden. Dette rutediagram viser en eksperimentel arbejdsproces. Arbejdsprocessen kan fuldføres på mindst 9 dage (se antallet af dage i øverste højre hjørne af hver fase i arbejdsprocessen), selvom nogle trin kan udføres i en længere periode, som beskrevet i protokollen. Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; O/N = natten over; RT = stuetemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Helmonterede embryoner farvet med 5-HT2C-sonde og GFP-antistof i Tg (foxP2:egfp-caax). Bright-field (A), fluorescerende (B) og fusionerede billeder (C) viser 5-HT2C (sonden for htr2c, A) og GFP (antiGFP, B) ekspression i foxP2 neuroner og axonkanaler. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Helmonterede embryoner farvet med insm1a-sonde og GFP-antistof i Tg (hb9:egfp). Bright-field (A), fluorescerende (B) og fusionerede billeder (C) viser insm1a (sonden for insm1a, A) og GFP (anti-GFP, B) ekspression i hb9 neuroner. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Embryoner | Tidspunkt |
| 24 hkf | 2 minutter |
| 30 hkf | 3 minutter |
| 36 hkf | 5 minutter |
| 48 hkf | 10 minutter |
| 72 HKF | 15 minutter |
| 96 hkf | 45 minutter |
| 4-5 dpf | 60 minutter |
Tabel 1: Proteinase K fordøjelsestid for zebrafiskembryoner. Forkortelser: hpf = timer efter befrugtning; dpf = dage efter befrugtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol foreslår en kombination af in situ hybridisering og immunhistokemi, et vigtigt skridt i colokaliseringsforsøgene på zebrafiskembryoner. Denne metode fungerer som en nem og effektiv måde at samtidig analysere et mRNA og et protein. In situ hybridisering og antistoffarvning blev udført på zebrafiskembryoner. I modsætning til flere protokoller, der tidligere er offentliggjort14,15,16, blev immunofluorescens og immunhistokemi brugt til at udforske proteinekspression. Få zebrafiskspecifikke antistoffer er blevet behørigt valideret til brug i afsnit17. Tidligere undersøgelser har kun brugt én teknik: immunofluorescens, immunhistokemi eller in situ hybridisering. Kombination af in situ-hybridisering og immunhistokemi til analyse af RNA og protein overvinder begrænsningerne ved en enkelt teknik. Det første trin var in situ hybridisering, som i høj grad beskytter mRNA mod nedbrydning. Antigenudtagning blev induceret ved opvarmning for at undgå forstyrrelse af antistofbinding ved proteinase K-behandling under immunhistokemisk farvning. Hvorvidt denne fremgangsmåde virker for alle antigener, vil kræve yderligere testning. Billeder af sektionerne viste, at 5-HT2C-receptoren var coudtrykt i foxP2-neuroner, og at insm1a-receptoren var coudtrykt i hb9-neuroner.
Helmonteret in situ-hybridisering bevarer i høj grad prøvernes integritet. In situ hybridisering efterfulgt af sektionering kan reducere inkubationstiden for antistoffarvning. Derudover kan antistoffarvning efter in situ-hybridisering hjælpe med at undgå fluorescensdæmpning.
Følgende specifikke trin er afgørende for eksperimentets succes. Det første kritiske trin er at refiksere embryoet i 4% PFA. Dette trin stopper proteinase K-reaktionen, fordi PFA inaktiverer proteinase K. Prøverne bør blandes forsigtigt for at udsætte alle embryoner for PFA; Røret kan også placeres på sin side, så embryonerne fordeles jævnt i opløsningen. Det andet kritiske trin er behandlingen af embryoet under OCT-implantation. Embryonerne skal placeres i en bestemt retning (enten dorsal-ventral eller lateral) og holde dem lige, så de kan skæres i sektioner fra omtrent samme område for alle embryoner. En lille nål bruges til at lave små, bevidste bevægelser i det tyktflydende OCT-medium for at lokalisere embryoet og fjerne bobler.
Der er flere potentielle ændringer, der kan anvendes på det beskrevne scenario. Fordøjelsestiden for proteinase K in situ hybridisering kan bestemmes i henhold til zebrafiskembryonernes forskellige udviklingsstadier (tabel 1). Derudover er tykkelsen af kryosektionerne meget fleksibel og kan bestemmes i henhold til eksperimentelle krav. Selvom det forudsiges, at denne tilgang vil være egnet til en lang række eksperimenter, har den nogle potentielle begrænsninger. Den vellykkede udførelse af denne procedure afhænger af at opretholde en komplet prøve gennem to på hinanden følgende eksperimenter. Der er flere mulige pausepunkter i denne protokol. De tørrede embryoner kan opbevares i 30% saccharoseopløsning ved -20 °C i flere måneder14. På samme måde kan de forberedte dias opbevares i en diaskasse ved -20 °C i mere end 1 år14. De frosne blokke kan opbevares ved -80 °C i tre måneder.
Denne protokol for in situ hybridisering kombineret med immunhistokemi har vist sig at være vellykket til påvisning af 5-HT2C og insm1a ekspression i zebrafiskembryoner og kan let anvendes på en række væv på forskellige udviklingsstadier. Derudover kan denne protokol anvendes på neuroner eller gliaceller, hvilket giver en robust undersøgelsesmetode til neuroforskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) og Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
