Summary
Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.
Abstract
Bir omurgalı olarak, zebra balığı biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı ve insanlar, insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin veren yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar. Gen fonksiyon çalışması, gen ekspresyon paternlerinin tespitine dayanmaktadır. İmmünohistokimya, protein ekspresyonunu test etmek için güçlü bir yol sunsa da, zebra balığında ticari olarak temin edilebilen sınırlı sayıda antikor, costaining uygulamasını kısıtlamaktadır. In situ hibridizasyon, zebra balığı embriyolarında mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, zebra balığı embriyo kesitleri için in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. İmmünohistokimya ve tek kriyokesimin görüntülenmesi in situ hibridizasyon sonrası yapıldı. Protokol, iki genin ekspresyon paternini, önce in situ transkript tespiti ve daha sonra aynı bölümdeki bir proteine karşı immünohistokimya ile çözmeye yardımcı olur.
Introduction
Zebra balığı, gelişim ve genetik çalışmaları için güçlü bir omurgalı modelidir 1,2. Zebra balığı ve insanlar yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar (genlerin% 70'i insan genomu ile paylaşılır), bu da insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin verir3. Zebra balığında, iki genin ekspresyon kalıplarını ve mekansal ilişkilerini tespit etmek oldukça yaygındır. İmmünohistokimya ilk olarak 1941'de FITC etiketli antikorlar4 uygulayarak enfekte dokulardaki patojenleri tespit etmek için kullanılmıştır. Doku bölümündeki hedef protein ilk önce birincil bir antikor ile etiketlenir ve bölüm daha sonra birincil antikorun konakçı türü immünoglobuline karşı ikincil bir antikor ile etiketlenir. Antikor boyama, hücre içi düzeyde yüksek optik çözünürlük sunan proteinlerin lokalizasyonunu tespit etmek için sağlam bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, zebra balıklarında mevcut antikorların sayısı çok sınırlıdır. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, fareler için yaklaşık 112.000 antikorun ticari olarak mevcut olduğunu göstermektedir; Bununla birlikte, zebra balığı5'te çok az antikorun güvenilir olduğu gösterilmiştir.
Bunun yerine, zebra balıklarında, in situ hibridizasyon, gen ekspresyon paterni analizi için yaygın olarak uygulanmıştır. Bu yöntem ilk olarak 1980'lerde Drosophila embriyolarında gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır 6,7 ve o zamandan beri bu teknoloji sürekli olarak geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Başlangıçta, mRNA transkriptlerini tespit etmek için radyoaktif işaretli DNA probları kullanıldı; Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük nispeten düşüktü ve radyoaktivitenin neden olduğu potansiyel sağlık riskleri vardı. Daha sonra, in situ hibridizasyon, alkali fosfataza (AP) konjuge edilen veya floresan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) ile tespit edilen digoxigenin (DIG) veya floresein (Fluo) ile etiketlenmiş RNA problarına dayanır8,9. TSA, iki veya üç geni tespit etmek için kullanılmasına rağmen, RNA problarının DIG etiketlemesi ve antiDIG AP-konjuge antikor, in situ hibridizasyon için hala oldukça hassas, kararlı ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır. Bu nedenle, DIG etiketli in situ problarla birleştirilen ticarileştirilmiş antikorlar, protein lokalizasyonu ve bir genin ekspresyonu hakkında fikir vermek için yararlıdır.
Tam montajlı embriyolar, zebra balığı embriyoları küçük ve şeffaf10 olmasına rağmen, düşük optik çözünürlük nedeniyle genler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkaramazlar. Bu nedenle, hücre içi düzeyde genlerin ekspresyon kalıplarını analiz etmek için kesitleme gereklidir. Kriyoseksiyon, zebra balıklarında yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü gerçekleştirilmesi kolaydır ve antijeni etkili bir şekilde koruyabilir. Bu nedenle, zebra balığı kriyoseksiyonlarında immünohistokimya ile kombine edilen in situ hibridizasyon, iki genin ekspresyon modellerini analiz etmek için güçlü bir yol sunar. Zebra balığı11'e in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonu uygulanmıştır. Bununla birlikte, proteinaz K tedavisi, antijen bütünlüğü pahasına prob penetrasyonunu arttırmak için kullanılmıştır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol antijen alımını indüklemek için ısıtma kullanır. Bu protokol sadece farklı aşamalardaki embriyolara ve çeşitli kalınlıklardaki doku kesitlerine (14 μm kafa bölümleri ve 20 μm omurilik bölümleri) uygulanamaz, aynı zamanda baş ve omurilik de dahil olmak üzere iki organda eksprese edilen genler kullanılarak doğrulanmıştır.
Bu makalede, zebra balığı embriyolarında kriyoseksiyonlarda in situ hibridizasyon ve antikor boyamanın nasıl birleştirileceği anlatılacaktır. Bu protokolün çok yönlülüğü, iki farklı nöron için in situ hibridizasyon probları da dahil olmak üzere bir dizi in situ hibridizasyon-immünohistokimya kombinasyonu kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, farklı bölgelerdeki mRNA ve proteini ve farklı yaşlardaki embriyoları ve ayrıca iki genin ekspresyon modellerini tespit etmek için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (No. S20191210-402).
1. Zebra balığı embriyolarının toplanması
- Yumurtaların toplanmasından önceki gece üreme tanklarında bir çift zebra balığı kurun, biri transgenik zebra balığı ve diğeri AB vahşi tip zebra balığı (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB vahşi tip veya Tg (hb9: egfp) X AB vahşi tipi) (Malzeme Tablosuna bakınız). Fiziksel erişimi engellemek için erkek ve dişiyi ayırmak için çapraz bir plastik bölücü kullanın. Ertesi gün, üreme tankının üst kısmını tatlı suyla dolu temiz bir alt kısma yerleştirin ve üreme tankının bölücüsünü çıkarın. Balıkların 10-20 dakika çiftleşmesine izin verin ve üreme tankının dibine battıktan sonra yumurtaları toplayın.
- 28.5 °C'de metilen mavisi (1 L E3 embriyo ortamında 1 mL% 0.05 metilen mavisi) içeren E3 embriyo ortamındaki embriyoları kültürleyin ( Materyaller Tablosuna bakınız).
- Pigment oluşumunu önlemek için embriyoları döllenmeden (hpf) 24 saat sonra feniltiyoüre (PTU, Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.
NOT: Deneylerde her iki cinsiyetten hayvanlar kullanılır.
2. In situ hibridizasyon
NOT: Adım 2.1-2.11 için kullanılan su, dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış sudur ( Malzemeler Tablosuna bakınız).
- 0.5-1 mL taze% 4 paraformaldehit (PFA, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren ~ 10 embriyoyu, 12-14 saat boyunca gece boyunca 4 ° C'de 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde sabitleyin.
NOT: In situ hibridizasyon protokolü daha önce yayınlanmış literatür12'den biraz değiştirilmiştir. PFA, kullanımdan sonraki bir hafta içinde 4 ° C'de veya -20 ° C'de bir ay boyunca taze olarak hazırlanmalı ve saklanmalıdır. İn situ hibridizasyonda aşağıdaki tüm adımlar 1.5 mL mikrofüj tüpler kullanılarak gerçekleştirildi. - Sadece 48 hpf'den eski embriyoların derisini çıkarmak için cımbız kullanın.
NOT: RNA problarının 48 hpf'den eski embriyoların gövde bölgesine nüfuz etmesini kolaylaştırmak için deri çıkarılır. - Embriyoları, oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca% 0.1 Ara-20 içeren 1x fosfat tamponlu salin içinde% 25,% 50 ve% 75 metanol ile yıkayarak kademeli olarak dehidrate edin (PBST, Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, embriyoları oda sıcaklığında% 100 metanol içinde 5 dakika yıkayın. Embriyoları -20 ° C'de% 100 metanol içinde en az 12-14 saat boyunca en az bir gece boyunca inkübe edin.
NOT: Susuz bırakılan embriyolar 6 ay boyunca -20 °C'de %100 metanol içinde saklanabilir. - PBST'de her biri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca art arda %75, %50 ve %25 metanol ile yıkayarak embriyoları kademeli olarak yeniden sulandırın. Embriyoyu PBST ile üç kez oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
- Embriyoları PBST'de oda sıcaklığında 10 μg / mL proteinaz K ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile sindirin (bakınız Tablo 1).
- Embriyoları PBST ile 5 dakika yıkayın. Bu yıkama adımını üç kez gerçekleştirin.
- Yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitleyin.
NOT: Bu adım sindirimi durdurur, çünkü PFA proteinaz K'yı inaktive eder. Tüpler, embriyoları çözelti içinde eşit olarak dağıtmak için yanlarına yerleştirilebilir. Bu PFA'nın taze olması gerekmez (2 haftaya kadar soğutulabilir). - Embriyoyu PBST ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 5 dakika inkübe edin.
- Prehibridizasyon çözeltisi (preHYB, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe ederek embriyoların prehibridizasyonunu gerçekleştirin. PreHYB'yi hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin (HYB, Malzeme Tablosuna bakın) ve HYB'de en az 4 saat prehibridize edin.
NOT: Prehibridizasyona geçmeden önce, çözeltileri önceden 65 ° C'ye ısıtın. Formamid ( Malzeme Tablosuna bakınız) dokunun şeklini ve yapısını korumak için kullanılır. Formamid ayrıca homolog olmayan parçaların düşük sıcaklıklarda bağlanmasını önler. - Probu (Insm1a veya 5-HT2C) embriyolara eklemeden önce 95 ° C'de 5 dakika boyunca HYB'de ısıtın. Probu 1 μg/mL HYB'de kullanın. Embriyoların hava ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla preHYB çıkarın ve embriyoları içeren tüpe HYB'de önceden ısıtılmış prob ekleyin.
NOT: Embriyolarda hedef mRNA dizisi ile hibridize etmek için etiketli bir RNA probu kullanılabilir. Bu nedenle, prob, ilgilenilen bir genin ekspresyonunu ve mRNA'nın yerini tespit etmek için kullanılabilir. - Probun gece boyunca (12-14 saat) 50-70 ° C'de melezleşmesine izin verin.
NOT: Hibridizasyon sıcaklığı farklı problar için farklılık gösterir. - Ertesi gün, prob çözeltisini bir pipetle aspire edin ve -20 ° C'de bir tüpte saklayın, böylece birçok kez tekrar kullanılabilir.
- Embriyoları aşağıdaki gibi yıkayın:
- Embriyoları 65 °C'de %100 HYB ile 15 dakika yıkayın.
- Embriyoları, her biri 65 ° C'de 15 dakika boyunca% 0.1 Ara-20 (SSCT, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren 2x standart salin sitrat içinde% 75,% 50 ve% 25 HYB ile sırayla yıkayın.
- Embriyoları 65 ° C'de 2x SSCT'de 15 dakika boyunca yıkayın.
- Embriyoları 65 ° C'de 0.2x SSCT'de 15 dakika boyunca yıkayın.
- Embriyoları oda sıcaklığında% 0.02 Tween-20 (MABT, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren maleik asit tamponunda 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Hibridize edilmiş ve yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca %2 bloke edici çözelti-1 ile bloke edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Blokaj çözeltisi-1'i antidigoxigenin AP (1:4.000 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) ile %2'lik yeni bir bloke edici çözelti-1 içinde değiştirin ve 4 °C'de 12-14 saat boyunca gece boyunca çalkalayın.
- Embriyoları oda sıcaklığında MABT'de 30 dakika boyunca dört kez yıkayın.
NOT: Üçüncü yıkama sırasında BM morunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) buzdolabından çıkarın ve sonraki yıkamalarda ara sıra çalkalayın. - Embriyoları NTMT'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl,% 1 Ara-20, Malzeme Tablosuna bakınız).
- Embriyolardan mümkün olduğunca fazla NTMT'yi çıkarmak için bir pipet kullanın. BM mor AP substratı ile değiştirin ve embriyoları karanlıkta oda sıcaklığında boyayın. Boyama derecesini kontrol etmek için her 30 dakikada bir renk değişikliklerini izleyin.
NOT: Özel boyama süresi farklıdır ve her bir proba göre ayarlanması gerekir. Embriyoların 37 ° C'de inkübe edilmesi reaksiyonu hızlandırabilir. Embriyoların 4 ° C'de inkübe edilmesi reaksiyon süresini artırabilir ve gece boyunca yapılabilir. - İstenilen ölçüde geliştirildikten sonra, NTMT ile iki kez kısa bir süre durulayarak reaksiyonu durdurun. In situ hibridizasyondan sonra, embriyoları PBST ile 20 dakika boyunca üç kez durulayın.
3. Gömme
- Embriyoları, 4 ° C'de 12-14 saat boyunca gece boyunca% 5 sakkaroza 1x PBS'ye ( Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın.
- Embriyoları kapsayan çözeltiyi 1x PBS'de% 15 sakkaroz olarak değiştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
- Embriyoları kaplayan çözeltiyi 1x PBS'de% 30 sakkaroz olarak değiştirin ve 4 ° C'de 1-2 gün inkübe edin.
NOT: Embriyolar tüpün dibine batana kadar bu çözeltide inkübe edin. - Bir kriyomoldu optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamıyla doldurun ( Malzeme Tablosuna bakın). Embriyoları% 30 sakkaroz içinde OCT ortamı ile kriyomusta aktarın. Sakkarozu embriyolardan çıkarmak için onları karıştırın.
- Embriyoları doku için yeni bir kriyomusta aktarın ve kabarcık oluşumunu önleyerek OCT ortamıyla yavaşça doldurun.
- Her embriyoyu batırın, kriyomoldun dibine itin ve her embriyoyu istenen yöne (dorsal-ventral veya lateral) yerleştirin. Embriyoları düz bir çizgide tutun.
NOT: Her kriyomold içine sadece bir embriyo yerleştirilmesi şiddetle tavsiye edilir ( Malzeme Tablosuna bakınız). - Gömülü embriyoları kuru bir buz etanol banyosunda kriyomoldlara yerleştirin.
- -80 ° C'de en az bir gece boyunca 12-14 saat saklayın.
NOT: Kriyomoldlar en az bir ay boyunca -80 °C'de tutulabilir.
4. Kriyokesim
- Bir kriyostat kullanarak kriyokesitleri -20 ° C'ye ayarlayın.
- Numune bloğunu kriyomusttan çıkarın ve kriyostata yerleştirin. OCT ortamını soğutulmuş aynanın tabanına yerleştirin ve bloğu üstüne yerleştirin.
- Numune bloğunun tıraş bıçağına paralel olduğundan emin olun. Numunenin etrafındaki fazla OCT ortamını dikkatlice kesin.
- Bir kriyostat kullanarak 12-20 μm kalınlığında kesitler halinde kesin. Her slaytta 3-4 bölüm olması için bölümleri hızlı bir şekilde cam slaytlara aktarın. Numunelerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve bölümleri daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de kapalı bir sürgü kutusunda saklayın.
5. İmmün boyama
NOT: Kesitlerde GFP boyama işlemi yapılır.
- Bölümleri içeren slaytları PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
- Sitrat tamponunu mikrodalgada kaynatmak için ısıtın.
- Slaytları tampona yerleştirin ve çözeltiyi yaklaşık 20 dakika kaynamaya yakın tutmak için ısıtmaya devam edin.
NOT: Bu adım antijen alımına yardımcı olur. Doku, yüksek sıcaklıklarda bile bozulmadan kalır, bu da dokuların katlanmasını, hasar görmesini veya ayrılmasını önleyerek lekelenme kalitesini artırır. - Bir sonraki adımdan önce numunelerin yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Fazla çözeltiyi boşaltın, her bölümün etrafındaki alanı bir parça doku ile dikkatlice kurutun ve hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bölümün etrafına su itici bir kalemle ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir daire çizin. Doku bölümlerini kurutmamaya dikkat edin.
- Slaytları PBS ile iki kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.
- Oda sıcaklığında blokaj çözeltisi-2'de 2 saat boyunca bloke edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Slayt başına pipet birincil antikor çözeltisi (fare monoklonal α-GFP, 1:250, Malzeme Tablosuna bakınız) ve slaytları gece boyunca 4 °C'de immünohistokimyasal ıslak bir kutuda inkübe edin.
- Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.
- Fazla PBS'yi boşaltın. Slaytları PBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun ikincil antikorla (1:400, Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
- Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.
- Fazla PBS'yi boşaltın, montaj ortamını slaytın üzerine pipet edin ve bir sürgü kapak kayması ile monte edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bir mRNA ve bir proteinin ekspresyon paternini aynı anda incelemek için kullanılabilir. Şekil 1'de deneysel iş akışı gösterilmektedir. 5-HT2C reseptörü, nörotransmitter serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) tarafından bağlanan 5-HT reseptörünün bir alt tipidir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) yaygın olarak dağılmıştır ve iştah, ruh hali, anksiyete ve üreme davranışı dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyonlarını önemli ölçüde düzenleyebilir13. CNS'deki 5-HT2C ekspresyonu, foxP2 nöronlarının floresein yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlendiği transgenik hat Tg (foxp2: egfp-caax) tarafından tespit edildi. GFP, vahşi tip zebra balıklarında değil, sadece transgenik çizgide ifade edildi. RNA (5-HT2C, htr2c probu, Şekil 2A) ve protein (GFP, antiGFP, Şekil 2B) ekspresyonunun eşzamanlı tespiti, protein ve mRNA kolokalizasyon analizi için kullanılabilir.
Bir çinko-parmak transkripsiyon faktörü olan insülinoma ile ilişkili 1a (insm1a), ilk olarak tümör redüksiyon kütüphanesinden tanımlanmış ve omurgalı santral ve periferik sinir sistemi ile nöroendokrin sistemin oluşumunda ve farklılaşmasında çeşitli işlevler oynamıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, insm1a'nın motor nöron gelişiminin önemli bir düzenleyicisi olduğunu göstermiştir. Zebra balığı omuriliğinde ve motor nöronlarında insm1a ekspresyonu, hb9 nöronlarının floresein GFP ile etiketlendiği transgenik çizgi Tg (hb9: egfp) tarafından tespit edildi. GFP, vahşi tip zebra balıklarında değil, sadece transgenik çizgide ifade edildi. RNA (insm1a, insm1a probu, Şekil 3A) ve protein (GFP, antiGFP, Şekil 3B) ekspresyonunun eşzamanlı tespiti, protein ve mRNA kolokalizasyon analizi için kullanılabilir. Bu protokol, uzamsal ilişkilerini anlamak için protein ve RNA'nın kolokalizasyonunu tespit etmek için başarıyla uygulandı.
Şekil 1: Yöntemin ana hatları. Bu akış şeması deneysel bir iş akışını gösterir. İş akışı en az 9 gün içinde tamamlanabilir (iş akışındaki her aşamanın sağ üst köşesindeki gün sayısına bakın), ancak bazı adımlar protokolde açıklandığı gibi daha uzun bir sürede tamamlanabilir. Kısaltmalar: PFA = paraformaldehit; O / N = bir gecede; RT = oda sıcaklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tg'de 5-HT2C probu ve GFP antikoru (foxP2:egfp-caax) ile boyanmış tam montajlı embriyolar. Parlak alan (A), floresan (B) ve birleştirilmiş görüntüler (C), foxP2 nöronlarında ve akson yollarında 5-HT2C (htr2c, A probu) ve GFP (antiGFP, B) ekspresyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tg (hb9:egfp) cinsinden insm1a probu ve GFP antikoru ile boyanmış tam montajlı embriyolar. Parlak alan (A), floresan (B) ve birleştirilmiş görüntüler (C), hb9 nöronlarında insm1a (insm1a, A probu) ve GFP (anti-GFP, B) ekspresyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Embriyo | Saat |
| 24 bgf | 2 dk |
| 30 bgf | 3 dk |
| 36 bgf | 5 dk |
| 48 bgf | 10 dk |
| 72 bgf | 15 dk |
| 96 bgf | 45 dk |
| 4-5 DPF | 60 dk |
Tablo 1: Zebra balığı embriyoları için proteinaz K sindirim süresi. Kısaltmalar: hpf = döllenmeden sonraki saatler; dpf = döllenmeden sonraki günler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, zebra balığı embriyoları üzerindeki kolokalizasyon deneylerinde önemli bir adım olan in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu önermektedir. Bu yöntem, bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve antikor boyama yapıldı. Daha önce14,15,16 yayınlanan çeşitli protokollerin aksine, protein ekspresyonunu araştırmak için immünofloresan ve immünohistokimya kullanılmıştır. Birkaç zebra balığına özgü antikor, bölüm17'de kullanım için uygun şekilde doğrulanmıştır. Önceki çalışmalar sadece bir teknik kullanmıştır: immünofloresan, immünohistokimya veya in situ hibridizasyon. RNA ve proteini analiz etmek için in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirmek, herhangi bir tekniğin sınırlamalarının üstesinden gelir. İlk adım, mRNA'yı bozulmadan büyük ölçüde koruyan in situ hibridizasyondu. İmmünohistokimyasal boyama sırasında antikor bağlanmasının proteinaz K tedavisi ile bozulmasını önlemek için ısıtma ile antijen alımı indüklendi. Bu yaklaşımın tüm antijenler için işe yarayıp yaramadığı daha fazla test gerektirecektir. Kesitlerin görüntüleri, 5-HT2C reseptörünün foxP2 nöronlarında birlikte eksprese edildiğini ve insm1a reseptörünün hb9 nöronlarında birlikte eksprese edildiğini gösterdi.
Tam montajlı yerinde hibridizasyon, numunelerin bütünlüğünü büyük ölçüde korur. In situ hibridizasyon ve ardından kesitleme, antikor boyaması için inkübasyon süresini azaltabilir. Ek olarak, in situ hibridizasyondan sonra antikor boyaması, floresan söndürmeyi önlemeye yardımcı olabilir.
Aşağıdaki özel adımlar, denemenin başarısı için gereklidir. İlk kritik adım, embriyoyu% 4 PFA'da yeniden sabitlemektir. Bu adım proteinaz K reaksiyonunu durdurur, çünkü PFA proteinaz K'yı inaktive eder. Tüm embriyoları PFA'ya maruz bırakmak için numuneler nazikçe karıştırılmalıdır; Tüp ayrıca yan tarafına da yerleştirilebilir, böylece embriyolar çözelti içinde eşit olarak dağıtılır. İkinci kritik adım, OCT implantasyonu sırasında embriyonun tedavisidir. Embriyolar belirli bir yönde (dorsal-ventral veya lateral) düzenlenmeli, tüm embriyolar için kabaca aynı bölgeden bölümlere ayrılabilmeleri için düz tutulmalıdır. Embriyoyu bulmak ve kabarcıkları çıkarmak için viskoz OCT ortamında küçük, bilinçli hareketler yapmak için küçük bir iğne kullanılır.
Açıklanan senaryoya uygulanabilecek birkaç olası değişiklik vardır. Proteinaz K'nın in situ hibridizasyonun sindirim süresi, zebra balığı embriyolarının farklı gelişim aşamalarına göre belirlenebilir (Tablo 1). Ek olarak, kriyokesimlerin kalınlığı çok esnektir ve deneysel gereksinimlere göre belirlenebilir. Bu yaklaşımın çok çeşitli deneyler için uygun olacağı tahmin edilmekle birlikte, bazı potansiyel sınırlamaları vardır. Bu prosedürün başarılı bir şekilde yürütülmesi, birbirini izleyen iki deneyle tam bir numunenin korunmasına bağlıdır. Bu protokolde birden çok olası duraklama noktası vardır. Susuz kalan embriyolar -20 °C'de %30 sakkaroz çözeltisinde birkaç ay saklanabilir14. Benzer şekilde, hazırlanan slaytlar -20 ° C'de bir slayt kutusunda 1 yıldan fazla14 saklanabilir. Dondurulmuş bloklar üç ay boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
İmmünohistokimya ile kombine edilen in situ hibridizasyon için bu protokolün, zebra balığı embriyolarında 5-HT2C ve insm1a ekspresyonunu tespit etmede başarılı olduğu ve farklı gelişim aşamalarında çeşitli dokulara kolayca uygulanabildiği gösterilmiştir. Ek olarak, bu protokol nöronlara veya glial hücrelere uygulanabilir ve sinirbilimciler için sağlam bir araştırma yaklaşımı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (MS12019011), Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (JC2021058) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Vakfı (21KJB180009) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
