Summary
Presentert her er en beskrivelse av den enkle og relativt raske isolasjonen av Caenorhabditis elegans genomisk DNA fra ett eller noen få dyr ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig vevssett. Det resulterende gDNA-preparatet er en passende mal for PCR.
Abstract
Genomisk DNA-ekstraksjon fra en eller noen få Caenorhabditis elegans har mange nedstrøms applikasjoner, inkludert PCR for genotyping linjer, kloning og sekvensering. De tradisjonelle proteinase K-baserte metodene for genomisk DNA-ekstraksjon fra C. elegans tar flere timer. Kommersielle ekstraksjonssett som effektivt bryter opp C. elegans kutikal og ekstrakt genomisk DNA er begrenset. En enkel, raskere (~ 15 min) og kostnadseffektiv metode for å trekke ut C. elegans genomisk DNA som fungerer bra for klasserom og forskningsapplikasjoner rapporteres her. Denne DNA-ekstraksjonsmetoden er optimalisert for å bruke enkelt eller noen få senlarv (L4) eller voksne nematoder som startmateriale for å oppnå en pålitelig mal for å utføre PCR. Resultatene indikerer at DNA-kvaliteten er egnet for å forsterke genmål av forskjellige størrelser av PCR, slik at genotyping av enkelt eller noen få dyr selv ved fortynning til en femtiendedel av det genomiske DNA fra en enkelt voksen per reaksjon. De rapporterte protokollene kan brukes pålitelig til raskt å produsere DNA-mal fra en enkelt eller en liten prøve av C. elegans for PCR-baserte applikasjoner.
Introduction
Her presenteres to relaterte protokoller for lysis av Caenorhabditis elegans for å gjøre DNA tilgjengelig for PCR-baserte applikasjoner. PCR er en vanlig brukt molekylær teknikk som brukes til mange bruksområder, inkludert genotyping og forsterkning av DNA-fragmenter for kloning og sekvensering, blant andre. Den lille (1 mm), frittlevende rundorm C. elegans er et populært dyresystem for biologisk forskning. Å skaffe passende genomisk DNA fra et enkelt dyr eller noen få dyr er tilstrekkelig til å forsterke sekvensen av PCR. Sen L4 larver og voksne inneholder bare ~ 1000 somatiske celler (inkludert noen multi-nukleære, polyploide celler), kimceller, og (hvis dyret er en gravid hermafroditt) avkom i utero1. Imidlertid er disse dyrene beskyttet av en kutikel som må forstyrres for å trekke ut det genomiske DNA2. Standardmetoder for å forberede nematode genomisk DNA-mal for PCR innebærer flere trinn og tar flere timer. Dyrene fryses først i ormelysbuffer som inneholder proteinase K (−70 °C eller lavere) i minst 15-45 min (lengre anbefales av noen protokoller)3,4,5,6. Dette trinnet sprekker åpne dyrene.
Etter frysing inkuberes dyrene i 1 time ved 60-65 °C for at proteinase K skal fungere, da aktiveres enzymet i 15-30 min ved 95 °C. Proteinase K ødelegger kjernene som forringer DNA. Inaktivering av proteinase K før PCR er viktig for å forhindre at proteinase K nedbryter DNA-polymerasen. De to kit-baserte protokollene som er beskrevet her er raske, pålitelige og kostnadseffektive metoder for å trekke ut genomisk DNA fra enten et enkelt dyr eller noen få nematoder for daglig forskning og undervisning i laboratorieapplikasjoner. Settet som ble brukt ble opprinnelig optimalisert av produsenten for å trekke ut DNA fra dyrevev, spytt og hår7. Den bruker en proprietær vevsforberedelsesløsning og ekstraksjonsløsning for å lyse celler og gjøre genomisk DNA tilgjengelig. En proprietær nøytraliseringsløsning nøytraliserer deretter komponentene som kan hemme PCR (f.eks. salter, ioner og Mg2+-bindende molekyler).
Ved genotyping kan et enkelt dyr testes. Når du bestemmer om en stamme er homozygot, gir testing av seks eller flere avkom fra et enkelt dyr høy tillit til at en linje er homozygot eller ikke (det er 0,02% sjanse for tilfeldig å plukke seks homozygot mutantavkom fra en heterozygot forelder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Denne metoden 1) er grei, med færre trinn enn proteinase K-metoden, og 2) reduserer malforberedelsestiden til 15 min. Resultatene i dette arbeidet viser at den utviklede protokollen fungerer robust for å trekke ut genomisk DNA fra en eller noen få ormer, som på en pålitelig måte kan brukes til nedstrøms applikasjoner som ikke krever svært renset DNA, inkludert PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. elegans vedlikehold
MERK: N2 (wild type) og blmp-1(tm548) C. elegans stammer ble opprettholdt på standard nematode vekstmedier (NGM) plater ved 20 °C.
- Forbered NGM-plater ved å oppløse 23.005 g NGM pulver i 973 ml vann i en 2 L kolbe. Dekk kolbeåpningen med aluminiumsfolie (eller autoklaverbar hette som tillater ventilasjon) og fest dekselet med autoklavbånd. Autoklav for å oppløse pulveret og sterilisere innholdet med en steriliseringssyklus på minst 30 min.
- Avkjøl mediet til 60 °C i et vannbad.
- Til det avkjølte mediet tilsettes 25 ml steril 1 M fosfatbuffer (KH2PO4), pH 6,0; 1 ml 1 M kalsiumkloridoppløsning; og 1 ml 1 M magnesiumsulfatoppløsning.
- Rør mediet på en magnetisk røreplate for å få en homogen blanding og for å forhindre ujevn kjøling og størkning (~ 5 min). Forsikre deg om at rørestangen spinner raskt nok til å skape en virvel, men ikke så raskt at bobler blir introdusert (~ 250-300 rpm).
- Hell ~25 ml av mediet i hver 10 cm Petri plate (~40 plater totalt). Tørk platene ved romtemperatur over natten (vanligvis 16-25 °C).
- Vokse en koloni av Escherichia coli OP50 i 30-50 ml LB kjøttkraft over natten ved 37 °C.
- Frø hver plate med 500 μL E. coli OP50 kultur og la dem tørke ved romtemperatur før bruk (vanligvis 16-25 °C)8. Oppbevar platene ved 4 °C i opptil 3 uker.
- Overfør C. elegans til frøplater ved hjelp av en trådplukking eller annen metode og la dem vokse til L4 eller voksenstadium ved temperaturen som kreves for stammen (vanligvis 16-25 °C, 1-2 dager hvis dyrene ble belagt sultet som dauers, 3-4 dager hvis dyr ble belagt som embryoer)8.
2. DNA-ekstraksjon med én orm
MERK: Denne metoden er nyttig for å trekke ut DNA fra en enkelt orm (en orm i 1,8 μL totalt volum). En mesterblanding kan gjøres hvis flere ormer vil bli lysnet på en gang.
- Programmer en termosykler for en syklus ved 55 °C i 10 minutter etterfulgt av 95 °C i 3 minutter (lysis-program).
- Aliquot 0,8 μL av ekstraksjonsløsningen fra settet til innsiden av en 0,2 ml PCR-rør på is. Tilsett 0,2 μL av vevspreparatløsningen fra settet til dråpen av ekstraksjonsløsningen. Bland ved pipettering.
- Identifiser et L4- eller voksendyr under et dissekeringsmikroskop9. For å identifisere L4 hermafroditter, se etter en karakteristisk vulva som er synlig som en blek halvsirkel midt i dyret. Identifiser voksne hermafroditter ved å lete etter de største dyrene på tallerkenen som kan ha ovale embryoer synlige i livmoren.
- Bruk et platinatrådplukk, overfør det valgte dyret til løsningen10.
- Sentrifuger røret kort (2-3 s, ≤6,000 rpm / 2000 × g) ved romtemperatur for å samle innholdet nederst på røret.
- Plasser røret i termosykleren og kjør lysisprogrammet som er satt til trinn 2.1.
- Når programmet er fullført, sentrifugerer du kort røret og legger det på is. Tilsett 0,8 μL av nøytraliseringsløsningen fra settet til blandingen. Bland ved pipettering.
- Sentrifuger røret kort ved romtemperatur (2-3 s, ≤6,000 RPM / 2000 × g).
- Bruk lysatet direkte til PCR eller oppbevar det ved 4 °C eller −20 °C for fremtidig bruk.
MERK: Ekstrahert DNA er stabilt ved 4 °C eller −20 °C i minst 6 måneder7.
3. DNA-utvinning av noen få individer
MERK: Denne metoden er nyttig for å trekke ut DNA fra noen få ormer. En mesterblanding kan fremstilles hvis flere stammer vil bli lyset på en gang.
- Programmer termosykleren i én syklus ved 55 °C i 10 minutter etterfulgt av 95 °C i 3 minutter (lysisprogram).
- Aliquot 2,0 μL av ekstraksjonsløsningen fra settet til innsiden av en 0,2 ml PCR-rør på is. Tilsett 0,5 μL av vevspreparatløsningen fra settet til dråpen av ekstraksjonsløsning. Bland ved pipettering.
- Identifiser L4 eller voksne dyr under et dissekeringsmikroskop9. L4 hermafroditter har en karakteristisk vulva som er synlig som en blek halvsirkel midt i dyret. Voksne hermafroditter er de største dyrene på tallerkenen og kan ha ovale embryoer synlige i livmoren.
- Bruk en platinatrådplukking, overfør noen få dyr til løsningen: 9 dyr gir 1 dyreekvivalent med genomisk DNA per 0,5 μL lysat, og 16 dyr gir ~ 1 dyreekvivalent med genomisk DNA i 0,25 μL (3,5 nematoder / μL) 10.
MERK: Det er vanskelig å overføre mer enn 16 dyr til dette volumet. - Sentrifuger røret kort ved romtemperatur (2-3 s, ≤6,000 rpm / 2000 × g).
- Plasser røret i termosykleren og kjør lysisprogrammet som er stilt inn på trinn 3.1.
- Når programmet er fullført, sentrifugerer du kort røret og legger det på is. Tilsett 2 μL av nøytraliseringsløsningen fra settet til blandingen. Bland ved pipettering.
- Sentrifuger røret kort ved romtemperatur (2-3 s, ≤6,000 RPM / 2000 × g).
- Bruk lysis direkte til PCR eller oppbevar den ved 4 °C eller −20 °C for fremtidig bruk.
MERK: Ekstrahert DNA er stabilt ved 4 °C eller −20 °C i minst 6 måneder7.
4. PCR-reaksjon
MERK: En nedstrøms påføring av denne ormelysteknikken, som oppdager en slettingsmutasjon ved hjelp av en rask polymerase, er beskrevet. Effektiviteten av de to orm lysis protokollene i å produsere genomisk mal DNA for vellykket PCR ved fortynning til 1/50th av en orm per reaksjon er også demonstrert.
- Trekk ut DNA fra en enkelt orm og 16 ormer ved hjelp av villtype N2 og mutantstammer, som beskrevet ovenfor i trinn 2 og trinn 3.
- Forbered 2-, 10-, 20- og 50 ganger fortynning av enkeltorm-DNA fra ville N2-dyr.
- Konfigurer PCR-reaksjoner etter produsentens protokoll ved hjelp av primere som er spesifikke for sekvensen av interesse og hot-start PCR master mix (tabell 1 og tabell 2). Bruk 1 μL ufortynnet DNA eller 2 μL fortynnet DNA som mal i hver reaksjon.
- Bekreft PCR-produktene ved hjelp av gelelektroforese og avbildning11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomisk DNA fra en enkelt eller noen få ville voksne ble ekstrahert ved hjelp av det kommersielle settet eller tradisjonell lysisprotokoll for å sammenligne effekten av disse to metodene. Disse lysatene ble deretter brukt som maler for PCR for å forsterke enten et større mål på ~ 2100 bp (koding blmp-1) eller et mindre mål på ~ 500 bp (koding av en del av sma-10). Begge metodene ga passende PCR-produkter (figur 1A).
Deretter ble evnen til kit-ekstrahert genomisk DNA til å fungere som mal for en rekke DNA-polymeraser demonstrert. Ekstrahert genomisk DNA ble brukt som mal for å forsterke et 0,5 kb produkt ved hjelp av fire polymeraser som har forskjellige evner (inkludert hastighet, troskap og produktstørrelse). Produkter av forventede størrelser ble generert av disse polymerasene ved hjelp av mal fra en enkelt voksen lysis eller en ni-voksen lysis (figur 1B). Malsekvensen og gjengivelsen av PCR-polymerasene for å forsterke malsekvensen på riktig måte kan bekreftes ved sekvensering (supplerende figur S1). Dette resultatet viser at det genomiske DNA-et som ekstraheres fra settprotokollene, gir en passende mal for en rekke polymeraser.
PCR-effekten ble testet ved hjelp av forskjellige konsentrasjoner av det genomiske DNA-et som ble ekstrahert fra et enkelt dyr ved hjelp av det kommersielle settet. DNA ble fortynnet med 2-, 10-, 20- eller 50-fold, og tilsvarende omtrent en halv, en tiendedel, en tjuende og en femtiende av en orm per reaksjon ble brukt til PCRs. Disse DNA-malkonsentrasjonene støttet forsterkning av enten et større mål på ~ 2,1 kb eller et mindre mål på ~ 0,5 kb (figur 1C) 12. Mens et DNA-konsentrasjonsavhengig utbytte av 0,5 kb PCR-produktet ble observert, virket 2,1 kb PCR-produktutbyttet tilsvarende i alle reaksjoner.
For å demonstrere at disse protokollene produserer genomisk DNA fra C. elegans som er egnet for PCR genotyping, ble genomisk DNA hentet fra enkelt- og 16 villtype og blmp-1 tap av funksjon mutanter (blmp-1 (tm548)). Blmp-1-genet koder en transkripsjonsfaktor med viktige roller i distal tuppcellemigrasjon, kroppsstørrelse og utvikling 12,13,14,15,16. Mutanten blmp-1 har en sletting på 810 bp som fjerner deler av exon 3 og intron 315. Primere ble designet som resulterer i et 2134 bp-produkt når wild-type DNA-malen brukes og et 1324 bp-produkt hvis blmp-1(-) DNA brukes. PCR-produkter av passende størrelser ble oppdaget ved hjelp av 1 μL av enten enorm (ca. 0,5 ormer per reaksjon) eller 16-orm lysis fra L4 iscenesatte dyr (3,5 ormer per reaksjon) (figur 1D). Dette resultatet viser at kit-ekstrahert genomisk DNA ved hjelp av en av protokollene gir like effektive maler for PCR til genotype linjer.
Disse resultatene viser at C. elegans genomiske DNA-preparater ved hjelp av et kommersielt vev DNA-ekstraksjonssett fra enkeltdyr og flere dyr kan brukes pålitelig som maler for PCR.
Figur 1: DNA-preparater ved hjelp av et kommersielt sett fra enkle nematoder og flere nematoder tillater robust forsterkning av PCR. PCR-produkter ble lastet på 1% agarose gel i 1x TAE buffer (5 μL (A, B) eller 10 μL (C, D) og kjører på 90-100 V i 30 minutter til 2 t. En 2-logg DNA-stige ble brukt til alle geler. (A) Sammenligning av DNA lysis etter sett med tradisjonelle proteinase K metoder for å lage mal ved hjelp av to primer sett. Ville voksne ble lysed, og tilsvarende ett dyr ble brukt som mal for alle reaksjoner. Baner 1-4, 2.1 kb produkt. Lane 1, PCR fra single-worm lysis av proteinase K. Lane 2, PCR fra single-worm lysis ved kit-metoden. Lane 3, PCR fra ni-orm orm lysis av proteinase K. Lane 4, PCR fra ni-orm orm lysis ved kit-metoden. Baner 5-8, 0,5 kb produkt. Lane 5, PCR fra single-worm lysis av proteinase K. Lane 6, PCR fra single-worm lysis ved kit-metoden. Lane 7, PCR fra ni-orm orm lysis av proteinase K. Lane 8, PCR fra ni-orm orm lysis ved kit-metoden. (B) Kit-metoden for DNA lysis gir en passende mal for PCR av flere polymeraser. Ville voksne ble lyset ved hjelp av kit-metoden, og tilsvarende halvparten av et dyr ble brukt som PCR-mal for et 0,5 kb produkt. Se materialtabellen for polymerasedetaljer. Lane 1, PCR fra en enkeltorm lysis med en høyhastighets polymerase. Lane 2, PCR fra en ni-orm lysis med en høyhastighets polymerase. Lane 3, PCR fra en enkeltorm lysis med en Taq polymerase. Lane 4, PCR fra en ni-orm lysis med en Taq polymerase. Lane 5, PCR fra en enkeltorm lysis med en high-fidelity polymerase. Lane 6, PCR fra en ni-orm lysis med en high-fidelity polymerase. Lane 7, PCR fra en enkeltorm lysis med en høyhastighets, high-fidelity polymerase. Lane 8, PCR fra en ni-orm lysis med en høyhastighets, high-fidelity polymerase. (C) Fortynning av en wild-type L4 orm lysis gir mal for PCR. Baner 1-5, 2.1 kb produkt. Lanes 6-10, 0,5 kb mål. Lane 1 og lane 6, ufortynnet DNA. Lane 2 og lane 7, 2 ganger fortynnet DNA. Kjørefelt 3 og kjørefelt 8, 10 ganger fortynnet DNA. Lane 4 og lane 9, 20 ganger fortynnet DNA. Kjørefelt 5 og kjørefelt 10, 50 ganger fortynnet DNA. (D) Genotyping blmp-1 locus av PCR ved hjelp av 1 μL av enkelt- og 16-orm DNA-preparater som mal. Lane 1, PCR fra wild-type single-worm lysis. Lane 2, PCR fra blmp-1(-) single-worm lysis. Lane 3, PCR fra wild-type 16-orm lysis. Lane 4, PCR fra blmp-1(-) 16-orm lysis. Forkortelser: prep = forberedelsesmetode; kb = kilobase; st. = nematode stadium; dil. = fortynning av DNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mål | Primer-navn | Sekvens | ||
| blmp-1 | fremover | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| omvendt | CAGTTATTGCGGCTGTTGTTT | |||
| sma-10 | fremover | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| omvendt | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| Sekvensering | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
Tabell 1: Liste over primere.
| En. | Pol A, Pol B, Pol D | Pol E |
| PCR-hovedmiks | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Fremoverprimer | 0,2 μM (endelig konsentrasjon) | 0,5 μM (endelig konsentrasjon) |
| Omvendt primer | 0,2 μM (endelig konsentrasjon) | 0,5 μM (endelig konsentrasjon) |
| mal DNA | variabel | 1 μL |
| Nukleasefritt vann | til 25 μL | til 25 μL |
| B. | Pol C |
| PCR 5x-buffer | 2,5 μL |
| 10 mM dNTPer | 2,0 μL |
| Fremoverprimer | 0,2 μM (endelig konsentrasjon) |
| Omvendt primer | 0,2 μM (endelig konsentrasjon) |
| mal DNA | variabel |
| polymerase | 0,5 μL |
| Nukleasefritt vann | til 25 μL |
| C. PCR-program som brukes for figur 1B | ||
| temperatur | Tid | Sykluser |
| 98 °C | 2 min. | 1 |
| 98 °C | 1 min | 30 |
| 55 °C | 1 min | |
| 72 °C | 1 min | |
| 72 °C | 1 min | 1 |
| 4 °C | holde | |
| D. PCR program som brukes til supplerende figur S1 | ||
| temperatur | Tid | Sykluser |
| 98 °C | 30 s | 1 |
| 98 °C | 10 s | 30 |
| 57 °C | 20 s | |
| 72 °C | 50 s | |
| 72 °C | 2 min. | 1 |
| 4 °C | holde | |
Tabell 2: PCR-reaksjonskomponenter.
Supplerende figur S1: Sekvensering for bekreftelse av kvaliteten på genomisk DNA tilberedt med et kommersielt sett. Resultatene fra to sekvenseringsreaksjoner samsvarer fullstendig med den forventede sekvensen av over 1600 nukleotider av DNA forsterket av en høyhastighets polymerase med høy kvalitet (Pol E) fra en 16-orm lysis (tabell 1, tabell 2A og tabell 2D). Sekvensering av leseender ble trimmet for å fjerne baselesinger av lav kvalitet. Justering ble utført ved hjelp av EMBL-EBI multisekvensjusteringsverktøy MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å bestemme genotypene til C. elegans er et viktig skritt mens du utfører genetiske kryss for å skape nye C. elegans stammer. Genomisk DNA-ekstraksjon ved hjelp av en enkelt eller få C. elegans er et avgjørende skritt i genotyping C. elegans. Denne protokollen beskriver genomisk DNA-ekstraksjon fra C. elegans ved hjelp av et kommersielt sett. Denne metoden er rask og fungerer robust. Det genomiske DNA-et som ekstraheres ved hjelp av denne metoden, kan brukes til nedstrømsapplikasjoner, inkludert genotyping, sekvensering og kloning. Den beskrevne DNA-ekstraksjonsmetoden er optimalisert for genotyping C. elegans genetiske kryss ved hjelp av enkelt- og noen få L4- eller voksne dyr som startmateriale for DNA-malen. Tilsvarende en femtedel av et dyr (figur 1C) til 3,5 dyr (figur 1D) ga en passende mal for å forsterke mål-DNA-sekvenser av PCR. Denne protokollen (med fortynning) gir nok mal (ved 2 μL/reaksjon) for maksimalt 45 reaksjoner fra en enkelt orm og for 100 reaksjoner fra 16 dyr. Selv ved å bruke en orm per reaksjon, gir disse protokollene en kostnadseffektiv måte å trekke ut DNA fra C. elegans. Gitt enkelheten, robustheten og hurtigheten i protokollen, er den godt egnet for både forskning og klasseromsapplikasjoner.
Siden protokollen innebærer pipettering av små mengder reagenser, anbefales forberedelsen av en masterblanding for flere reaksjoner, god pipetteringsteknikk og bruk av godt kalibrerte pipetter for å sikre konsistens. Å bruke 0,5-1 μL ufortynnet DNA-mal fra enten enkelt- eller 9-16-dyrs lyses fungerer vanligvis for en 25 μL PCR-reaksjon ved hjelp av en hot-start PCR master mix, men optimalisering av malkonsentrasjonen kan være nødvendig. Reagensene må holdes på is så lenge eksperimentet varer. For å unngå gjentatt fryse-tining av DNA-ekstraksjonsløsningene, noe som kan redusere enzymytelsen, anbefales det at reagensene alisiteres og lagres ved -20 °C.
For nedstrømsapplikasjoner som krever PCR, reduserer bruken av en hot-start, høyhastighets PCR-masterblanding ytterligere den totale tiden sammenlignet med PCR-reaksjonsblandingen som tilbys i det kommersielle vevssettet. Høyhastighets polymeraser kan forsterke produkter på mindre enn 1 kb i 5-10 s (se tabellen over materialer og tabell 2 for polymerasebeskrivelser), mens settets PCR-reaksjonsblanding bruker en Taq DNA-polymerase med en forsterkningshastighet på ~ 1 kb / min7. Produkter fra noen PCR-er kan lastes direkte inn i en agarosegel for elektroforese, noe som reduserer trinnene og tiden ytterligere. Denne reaksjonsbufferen er også kompatibel med begrensning av enzym fordøyelse. DNA-polymeraser med høy gjengivelse fungerer også robust med DNA ekstrahert ved hjelp av denne protokollen (figur 1B). Mens polymerasene som brukes konsekvent fungerte ved hjelp av kit-ekstrahert mal, kan bruken av andre polymeraser gi bedre resultater avhengig av mal, primersettegenskaper, produktstørrelse og gjengivelse som kreves. Hvis det oppstår problemer etter PCR, for eksempel at ingen målbånd forsterkes eller flere bånd forsterkes, kan det være nødvendig med ytterligere optimalisering av de viktigste arbeidsforholdene eller DNA-malkonsentrasjonen. Det anbefales på det sterkeste at passende kontroller, inkludert wild-type DNA-mal og bruk av primere som har vist seg å fungere, bør brukes.
Denne metoden vil ikke være egnet for applikasjoner som krever svært renset eller et høyt utbytte av DNA-mal. Mens antall dyr som er forberedt og reaksjonsvolumet kan skaleres opp, er DNA-et som fremstilles ved hjelp av denne metoden ikke skilt fra organismeavfall og kan ikke være rent nok for svært følsomme applikasjoner som sekvensering av hele genomet.
De viktigste fordelene ved denne metoden i forhold til de eksisterende tradisjonelle genomiske DNA-ekstraksjonsmetodene inkluderer kortere tid og enklere, enklere trinn. I fremtiden kan denne metoden skaleres opp, tilpasses for å trekke ut C. elegans genomisk DNA for andre nedstrømsapplikasjoner, og brukes til å trekke ut DNA fra andre nematodearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
N2-stammen og E. coli OP50-bakteriene ble hentet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Blmp-1(tm548)- stammen ble hentet fra National Bioresource Project, Japan. Forfatterne takker WormBase. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01GM097591 til T.L.G., intern finansiering av Texas Woman's University til T.L.G, og TWUs Center for Student Research til M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
