Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex vivo Frigivelse af calcitonin genrelateret peptid fra det trigeminovaskulære system hos gnavere

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63723
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Danish Headache Center, Department of Neurology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail), Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology, University of Copenhagen

Summary

Denne protokol beskriver ex vivo calcitonin genrelateret peptid (CGRP) frigivelsesmodel og strategien til kvantificering af virkningen af farmakologiske midler på mængden af CGRP frigivet fra det trigeminovaskulære system hos gnavere.

Abstract

Calcitonin genrelateret peptid (CGRP) blev først opdaget i 1980'erne som en splejsningsvariant fra calcitonin genet. Siden dets opdagelse er dets rolle i migrænepatofysiologi blevet veletableret, først ved dets potente vasodilatoregenskaber og derefter ved dets tilstedeværelse og funktion som neurotransmitter i det sensoriske trigeminovaskulære system. CGRP's migræneprovokerende evne gav støtte til medicinalindustrien til at udvikle monoklonale antistoffer og antagonister, der hæmmer effekten af CGRP. Et nyt behandlingsparadigme har vist sig effektivt i den profylaktiske behandling af migræne. Et af de nyttige værktøjer til yderligere at forstå migrænemekanismer er ex vivo-modellen for CGRP-frigivelse fra det trigeminovaskulære system. Det er en relativt simpel metode, der kan bruges med forskellige farmakologiske værktøjer til at opnå knowhow til at videreudvikle nye effektive migrænebehandlinger. Denne protokol beskriver en CGRP-frigivelsesmodel og teknikken til kvantificering af virkningen af farmakologiske midler på mængden af CGRP frigivet fra det trigeminovaskulære system hos gnavere. Der gives en procedure, der beskriver den eksperimentelle tilgang fra eutanasi til måling af proteinniveauer. Den væsentlige isolering af trigeminusganglionen og trigeminuskernen caudalis fra både mus og rotter og fremstillingen af rottedura mater beskrives detaljeret. Desuden præsenteres repræsentative resultater fra begge arter (rotter og mus). Teknikken er et centralt redskab til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i migrænepatofysiologi ved hjælp af forskellige farmakologiske forbindelser og genetisk modificerede dyr.

Introduction

Migræne er en neurologisk lidelse, der ifølge WHO anslås at påvirke mere end 1 milliard mennesker og er en af de førende årsager til handicap på verdensplan1. Således har migræne en betydelig indvirkning på både patienter og samfund. På trods af den nylige kliniske succes med CGRP-antagoniserende lægemidler har en stor del af patienterne brug for forbedrede behandlingsmuligheder 2,3,4,5. Elucidation af migrænepatofysiologi, der fører til nye effektive behandlinger, er påkrævet. Signalering i det trigeminovaskulære system bestående af meninges, trigeminusganglier (TG) og trigeminuskerne caudalis (TNC) er central for migrænepatofysiologi 6,7.

Det 37 aminosyre-neuropeptid calcitonin-genrelaterede peptid (CGRP) blev først opdaget i begyndelsen af 1980'erne, da Amara og kolleger demonstrerede, at det primære RNA-transkript af calcitonin-genet kunne behandles for at give mRNA-kodning for CGRP ud over calcitonin 8,9. Den efterfølgende forskning foreslog et link til migrænepatofysiologi10. CGRP er en neurotransmitter med potente vasodilaterende egenskaber 11,12,13,14,15,16,1 7, og det er bredt fordelt i det centrale og perifere nervesystem 13,14,18,19,20,21,22 . Involveringen af CGRP i migræne blev understreget med opdagelsen af øgede CGRP-niveauer i det ekstracerebrale kredsløb under migræneanfald hos mennesker23, og at infusion af CGRP forårsager migrænelignende smerter hos patienter24. To år senere blev den første proof-of-concept-undersøgelse af effektiviteten af CGRP-antagonisten olcegepant til behandling af migræne offentliggjort25.

CGRP er rigeligt i det trigeminovaskulære system som demonstreret i TG21,26, sensoriske nervefibre, der inderverer dura mater27,28,29 og TNC30. I det trigeminovaskulære system findes CGRP i de små til mellemstore neuroner i TG, i umyelinerede C-fibre og udtrykkes i næsten 50% af den neuronale population af TG. CGRP-receptoren udtrykkes hovedsageligt i større neuroner og findes i myelinerede Aδ-fibre31,32. CGRP frigives fra neuroner ved kemisk eller elektrisk stimulering33,34. Undersøgelser af veje, der fører til frigivelse af CGRP og placeringen af denne aktivering, er afgørende for at forstå migrænepatofysiologi. Gennem de sidste 5 årtier har prækliniske studier bidraget til at opnå omfattende viden om migrænerelateret signalering og har bidraget til udvikling af nye behandlinger35. Mange metoder i betragtning af vaskulær og neurogen involvering er blevet ændret og anvendt i migræneforskning. In vivo og in vitro modeller af arterielle reaktioner på biologiske forbindelser eller farmakologiske behandlinger17,36,37 og elektrisk nervestimulering38,39 kan nævnes. Desuden kan aktiverede neuroner i TNC detekteres ved c-Fos-ekspression 40,41,42 og elektrofysiologiske optagelser i dette område 43,44. Begge metoder måler nociceptive signaler, der overføres til hjernen fra hovedet, fx dura mater. Brugen af kun én præklinisk model giver ikke det fulde billede af migrænepatofysiologi. Derfor er det vigtigt at kombinere forskellige modeller, der dækker så mange aspekter af migrænepatofysiologi som muligt. Den fortsatte udvikling af nye modeller vil dække forskellige aspekter af migrænemekanismer, og med tiden vil mysteriet om migrænepatofysiologi blive afdækket.

Her præsenteres en detaljeret protokol over CGRP-frigivelsesmetoden, udført ex vivo i isoleret TG og TNC fra mus efter kemisk stimulering. CGRP-frigivelse kan også studeres i dura mater fra rotter. I forsøgsprotokollen for rotter beskrives dura mater således sammen med TG og TNC. Grundlaget for CGRP-frigivelsesmetoden blev først beskrevet i 1999, hvor Ebersberger og kolleger gennemførte banebrydende forskning og fandt ud af, at CGRP blev frigivet fra dura mater efter kemisk og elektrisk stimulering af dural afferenter hos rotter45. Senere blev denne tilgang udvidet til CGRP-frigivelse fra TG46 og TNC47. Derefter blev metoden ændret til at gælde for TG og TNC i mus. Indtil videre har CGRP-frigivelse fra dura mater været udfordrende hos mus.

Protocol

Alle dyrepasnings- og forsøgsforsøg blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs vejledning om pasning og brug af dyr (2010/63/EUE). C57BL/6JBomTac-hanmus i alderen 10 uger og hanrotter i Sprague Dawley på 10 uger blev brugt til at demonstrere denne protokol.

1. Fremstilling af den syntetiske interstitielle væske

  1. Forbered syntetisk interstitiel væske (SIF) ifølge følgende opskrift: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mMMgSO4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mMNaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-gluconat, 5,50 mM glucose og 7,60 mM saccharose (se materialetabel).
    BEMÆRK: SIF kan varieres afhængigt af stimuleringsmålet, f.eks. kan en calciumfri opløsning bruges, når man studerer calciumkanaler.
  2. pH justeres til 7,4 og pH stabiliseres ved hjælp af carbogen-gasning (5% CO 2 og 95% O2)46.

2. Aktiv dødshjælp

  1. Bedøv voksne mus og rotter med en blanding af 70% CO2 og 30%O2. Halshug mus ved hjælp af en saks og rotter ved hjælp af en guillotine (se materialetabel).
    BEMÆRK: Brug en stamme og alder, der passer til formålet med forskningen. Både mænd og kvinder kan bruges i denne model.
  2. Adskil hovedet fra kroppen på rygmarvens C3-C4-niveau.
    BEMÆRK: Eutanasi kan også udføres med en intraperitoneal injektion af pentobarbital (100-150 mg / kg).

3. Dissektion

  1. Forbered rottevævet ved at følge nedenstående trin.
    1. Fjern huden og musklen omkring hoved og hals med en saks (figur 1A).
    2. Brug en knogletrimmer og saks til at adskille underkæberne fra hovedet (figur 1B-C).
    3. Åbn rygmarven ved at indsætte en knogletrimmer kausalt i ryghvirvlernes dorsale del og fjern ryghvirvlernes dorsale del for at udsætte rygmarven og hjernestammen (figur 1D).
    4. Skær den kaudale del af kraniet ved grænserne af de occipitale og interparietale knogler for at fjerne disse knoglestrukturer, der udsætter cerebellum (figur 1E).
      BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at beskadige hjernestammen og rygmarven, mens du skærer og fjerner ryghvirvlerne.
    5. Isoler TNC (Sp5C), der løber kausalt ca. 13-16 mm fra bregma på hver side ved at skære den dorsolaterale del af hjernestammen med fjedersaks. Sænk venstre og højre side TNC i SIF (figur 1E-I).
      BEMÆRK: Beskrivelsen svarer til voksne rotter.
    6. Skær hovedet midt i sagitalt for at dele kraniet i to ved hjælp af en sav (figur 1J-L).
    7. Fjern forsigtigt hjernen uden at røre dura mater, der er fastgjort til kraniet, ved hjælp af en spatel og skære trigeminusnerven, hvor den kommer ind i hjernestammen (figur 1M-P).
    8. For at isolere TG skal du skære den, inklusive dens grene omkring de visuelle grænser. Skær mandibulargrenen, hvor den kommer ind i foramen ovale. Skær de oftalmiske og maksillære grene, der kommer ind i kraniet, da de ikke er opdelt makroskopisk. Mens du dissekerer TG, skal du fjerne dura mater, der dækker TG (figur 1Q-T).
    9. Nedsænk kraniehalvdelene og TG'erne i SIF.
  2. Forbered musevævet ved at følge nedenstående trin.
    1. Fjern hud og muskler omkring hoved og hals med en lille saks (figur 2A-B).
    2. Åbn rygmarven ved at indsætte en lille saks kausalt i ryghvirvlernes dorsale del og fjern ryghvirvlernes dorsale del for at udsætte rygmarven og hjernestammen (figur 2C).
      BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at beskadige rygmarven, mens du skærer og fjerner ryghvirvlerne.
    3. Skær kraniet ved grænserne af de occipitale og interparietale knogler for at fjerne disse knoglestrukturer, der udsætter lillehjernen (figur 2D-F).
    4. Skær derefter parietalbenet midt i sagitalt og fjern knoglen for at udsætte cerebrum (figur 2G-I).
    5. Fjern forsigtigt lillehjernen med en spatel for at udsætte hjernestammen (figur 2J).
    6. Isoler den TNC-holdige del af hjernestammen ved hjælp af fjedersaks (figur 2K-N). Nedsænk hjernestammen med TNC i SIF (figur 2O).
    7. Fjern hjernen og skær trigeminusnerven, hvor den kommer ind i hjernestammen (figur 2P-Q).
    8. For at isolere TG skal du skære den, inklusive dens grene omkring de visuelle grænser. Skær mandibulargrenen, hvor den kommer ind i foramen ovale. Skær de oftalmiske og maksillære grene, der kommer ind i kraniet, da de ikke er opdelt makroskopisk. Mens du dissekerer TG, fjernes dura materen, der dækker TG (figur 2R-S).
    9. Nedsænk TG'er i SIF (figur 2T).

4. Vask

  1. Vask kraniehalvdele, TNC'er og TG'er i SIF i 30 minutter, mens du udskifter SIF hvert 5. minut ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Vasketrinnene kan udføres, mens servietten opbevares i plastbeholdere med et tyllåg for at muliggøre nem SIF-udskiftning (figur 3A-B).
  2. Forbered rottevævet ved at følge nedenstående trin.
    1. TNC-halvdele overføres til separate mikrocentrifugerørhætter med 350 μL SIF (figur 3C).
    2. Overfør TG'erne til mikrocentrifugerørhætter - en TG pr. mikrocentrifugerørhætte med 350 μL SIF (figur 3C).
    3. Placer kraniehalvdelene på platforme lavet af ler eller en 6-brønds kulturplade og fyld kraniet med 400 μL SIF (figur 3C).
  3. Forbered musevævet ved at følge nedenstående trin.
    1. Overfør hjernestammen med TNC til en mikrocentrifugerørhætte med 250 μL SIF (figur 3D).
    2. Overfør de to TG'er til en mikrocentrifugerørhætte med 250 μL SIF (figur 3D).
      BEMÆRK: Anbring to TG'er pr. mikrocentrifugerørhætte, når du bruger væv fra mus.
  4. Rottekranier og mikrocentrifugerørhætter anbringes med rotte- og musevæv i en befugtet inkubator ved 37 °C. Udskift SIF med en pipette hvert 5. minut i 20 minutter.
    BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at røre ved vævet, når du tilføjer og fjerner SIF.

5. Test af lægemidler

  1. Bestem de basale CGRP-frigivelsesniveauer.
    1. Efter den sidste vask tilsættes 250 μL SIF til musens TG og TNC. Tilsæt 350 μL til rotte TG og TNC og 400 μL til hvert rottekranium.
    2. Efter 10 minutters inkubation opsamles 200 μL af prøven i et mikrocentrifugerør og tilsættes 50 μL 10x VVM-buffer (leveres med CGRP-enzymimmunoassaysættet, se materialetabel) for at muliggøre måling af frigivelsen af basal CGRP (trin 6). Kassér den resterende væske.
      BEMÆRK: Inkubationstiden skal være den samme for alle prøver.
    3. Prøverne opbevares straks ved -20 °C.
    4. Efter prøveudtagning af basal CGRP-frigivelsesniveauer skal du følge en af de tre metoder: (A) Enkelt stimulering (trin 5.2); B) stimulering af koncentrationsrespons (trin 5.3) og (C) hæmning af stimulering (trin 5.4) (figur 4).
      BEMÆRK: Det anvendte teststof og de anvendte koncentrationer afhænger af undersøgelsens formål.
  2. Udfør enkelt stimulering ved at følge nedenstående trin.
    1. Der tilsættes teststof eller vehikel til servietten, og lad det stå i 10 minutter (volumen: 250 μL for TG og TNC med mus, 350 μL for TG og TNC med rotter og 400 μL for hvert rottekranium).
    2. Efter 10 minutters inkubation opsamles 200 μL af prøven i et mikrocentrifugeglas med 50 μL 10x VVM-buffer. Den resterende væske kasseres, og prøverne opbevares straks ved -20 °C.
      BEMÆRK: Inkubationstiden skal være den samme for alle prøver.
  3. Udfør koncentrationsresponsstimulering ved at følge nedenstående trin.
    1. Teststoffet eller vehikel fortyndes til de ønskede koncentrationer. Der tilsættes teststoffet i stigende koncentrationer begyndende med den laveste koncentration.
      BEMÆRK: Det anvendte teststof og de anvendte koncentrationer afhænger af undersøgelsens formål. For eksempel blev 1 μM, 10 μM og 100 μM supercinnamaldehyd anvendt til denne undersøgelse.
    2. Den laveste koncentration (1 μM for nærværende undersøgelse) af teststoffet og det tilsvarende vehikel tilsættes til to identiske vævspræparater, og der inkuberes i 10 minutter (volumen: 250 μL for musevæv, 350 μL for rotte TG og TNC og 400 μL for hvert rottekranium).
    3. Efter 10 minutters inkubation opsamles 200 μL af prøven i et mikrocentrifugeglas med 50 μL 10x VVM-buffer.
    4. Den resterende væske kasseres, og den næstlaveste koncentration (10 μM for nærværende undersøgelse) tilsættes vævet.
    5. Prøverne opbevares straks ved -20 °C.
    6. Denne procedure gentages med de resterende koncentrationer (100 μM for nærværende undersøgelse).
  4. Udfør hæmning af stimulering ved at følge nedenstående trin.
    1. Blokatøren eller vehikel tilsættes vævet, og der inkuberes i 10 minutter (volumen: 250 μL for musevæv, 350 μL for rotte TG og TNC og 400 μL for hvert rottekranium).
      BEMÆRK: Den anvendte blokering og koncentration afhænger af undersøgelsens formål. For eksempel blev 3 μM glibenclamid anvendt til det repræsentative resultat i figur 5.
    2. Efter 10 minutters inkubation opsamles en 200 μL prøve i et mikrocentrifugerør med 50 μL 10x VVM-buffer. Den resterende væske kasseres, og prøverne opbevares straks ved -20 °C.
    3. Tilsæt agonisten eller agonisten + blokkeren (se materialetabel) til vævet og inkuber i 10 min.
      BEMÆRK: Den anvendte agonist, blokker og koncentrationer afhænger af undersøgelsens formål. I denne undersøgelse blev der anvendt 3 μM glibenclamid og 1 μM capsaicin, figur 5.
    4. Efter 10 minutters inkubation opsamles en 200 μL prøve i et mikrocentrifugerør med 50 μL 10x VVM-buffer. Den resterende væske kasseres, og prøverne opbevares straks ved -20 °C.
  5. Udfør en positiv kontrol for eksperimentet.
    1. Hvis det er relevant, tilsættes en positiv kontrol (f.eks. 1-10 μM capsaicin, se materialetabellen) til vævet i slutningen af protokollen og opsamles en prøve på 200 μL i et mikrocentrifugerør med 50 μL 10x VVM-buffer efter en inkubationsperiode på 10 min.
      BEMÆRK: Det er fordelagtigt at inkludere en positiv kontrol for at sikre, at opsætningen og vævene fungerer. Capsaicin 48,49,50 eller depolariserende stimulus af kalium (40-60 mM KCl)46,47,49 anvendes rutinemæssigt til at forårsage frigivelse af CGRP fra det trigeminovaskulære system. 40-60 mM KCl SIF fremstilles som SIF, bortset fra at NaCl udveksles med KCl på ækvimolær basis.

6. Analyse af CGRP-koncentrationer

  1. Mål mængden af CGRP frigivet ved hjælp af et enzymimmunoassay (EIA) kit efter producentens protokol (se materialetabel).
  2. Den optiske densitet måles ved 410 nm ved hjælp af et pladefotometer. Hvis der anvendes et andet CGRP VVM-sæt, måles den optiske tæthed ved den bølgelængde, der er angivet i producentens protokol.
    BEMÆRK: Prøverne skal fortyndes for at matche standardkurven.
  3. Udfør dataanalyse.
    1. Præsenter dataene enten som absolutte koncentrationer eller normaliser til den basale CGRP-frigivelse fra det specifikke væv.

Representative Results

Denne teknik er et værktøj til at undersøge de CGRP-relaterede molekylære mekanismer, der er involveret i migræne. Det har den fordel, at det vurderer CGRP-frigivelse fra forskellige niveauer af det trigeminovaskulære system og kan anvendes både på vildtype- og transgene mus og rotter i kombination med forskellige farmakologiske forbindelser. Her præsenteres koncentrations-respons og blokerende forsøg fra rotter og koncentrationsresponsresultater fra vildtype- og transgene mus.

CGRP-frigivelsesmetoden blev brugt til at undersøge effekten af K ATP-kanalhæmmeren glibenclamid på CGRP-frigivelse fra TG og dura mater hos kvindelige spontane trigeminusallodyniske (STA) rotter. For det første blev den optimale koncentration af capsaicin fundet ved hjælp af et koncentrationsresponsundersøgelsesdesign. Capsaicineksponering inducerede en signifikant CGRP-frigivelse fra dura mater og TG sammenlignet med køretøjet (figur 5). I dura mater blev den maksimale frigivelse af CGRP fundet ved 1 μM capsaicin, og i TG blev den maksimale CGRP-frigivelse fundet ved 10 μM capsaicin (figur 5A-B). Baseret på koncentrations-respons-eksperimenterne blev 1 μM capsaicin og 3 μM glibenclamid anvendt til blokeringsforsøg. Glibenclamid viste ingen effekt på basal CGRP-frigivelse fra dura mater (P = 0,441) og TG (P = 0,881), når det blev analyseret med en envejs ANOVA51. Glibenclamid reducerede signifikant capsaicin-induceret CGRP-frigivelse i dura mater med 40% (P = 0,031) og TG med 39% (P = 0,003) sammenlignet med capsaicin med køretøjet, når det analyseres med en envejs ANOVA (figur 5C-D)51.

Hos mus blev protokollen brugt til at undersøge involveringen af den forbigående receptorpotentiale ankyrin 1 (TRPA1) ionkanal i en GTN-musemodel af migræne, hvor GTN-induceret overfølsomhed var fuldt afhængig af TRPA1-kanaler. TRPA1-agonisten supercinnamaldehyd (SCA) viste sig at frigive CGRP på en dosisafhængig måde fra TG med 1 μM, 10 μM og 100 μM SCA, hvilket resulterede i henholdsvis 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) og 69% (P = 0,0097) øget frigivelse af CGRP sammenlignet med køretøj, når det analyseres med tovejs ANOVA. Denne frigivelse var fraværende i TG fra Trpa1 null-mus, hvor eksponering for 1 μM, 10 μM og 100 μM SCA resulterede i henholdsvis 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) og 9% (P = 0,97) procentvis ændring i frigivelsen af CGRP sammenlignet med køretøj, når den blev analyseret med tovejs ANOVA. Den efterfølgende stimulering med 10 μM capsaicin (positiv kontrol) viser, at alle vævsprøver kunne frigive CGRP (figur 6)50.

Figure 1
Figur 1: Trin-for-trin dissektion af væv fra rotter. Oplysningerne om (A-T) findes i protokolafsnittet (trin 3.1). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Trin-for-trin dissektion af væv fra mus. Oplysningerne (A-T) findes i protokolafsnittet (trin 3.2). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vask og inkubation af gnavervæv. (A-B) Frisk isoleret væv i plastbeholdere med SIF. Beholderne er dækket med tyl for at muliggøre let skift af SIF. (C) Rottevæv - To kraniehalvdele med dura mater, der dækker kraniets indre foringer placeret på en 6-brønds kulturplade. Den højre og venstre trigeminuskerne caudalis i separate mikrocentrifugerørlåg (øverste række låg). De to trigeminusganglier i individuelle mikrocentrifugerørlåg (nederste række låg). (D) Musevæv - Den trigeminuskerne caudalis-holdige del af hjernestammen i et separat mikrocentrifugerørlåg (øverst). To musetrigeminusganglier er i et mikrocentrifugerørlåg (nederst). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Undersøgelsesdesign for CGRP-frigivelse. Tre forskellige protokoller til udførelse af CGRP-udgivelseseksperimenter. Narkotika skal fortyndes i syntetisk interstitiel væske (SIF). (A) Enkelt stimulering. (B) Stimulering af koncentration-respons. (C) Hæmning af en stimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Glibenclamid hæmmer capsaicin-induceret CGRP-frigivelse fra rotte dura mater og trigeminusganglion. CGRP-niveauer fra trigeminusganglion og dura mater isoleret fra kvindelige spontane trigeminusallodyniske (STA) rotter (215-318 g), der oprindeligt stammer fra Thomas Jefferson University52, blev målt med kommercielle humane CGRP VVM-sæt. (A-B) CGRP-frigivelse fra (A) dura mater og (B) trigeminusganglion efter stigende koncentrationer af capsaicin (10 nM, 100 nM, 1 μM og 10 μM) (n = 4). Data præsenteres som individuelle punkter og blev analyseret med tovejs ANOVA. p < 0,0001 (C-D) Niveauer af CGRP frigivet fra (C) dura mater og (D) trigeminusganglion efter 10 min eksponering for køretøj, 3 μM glibenclamid (glib), 1 μM capsaicin og 1 μM capsaicin + 3 μM glib (n = 6-11). Data præsenteres som individuelle punkter og middelværdier og blev analyseret med envejs ANOVA. *sammenlignet med køretøjet. #capsaicin sammenlignet med capsaicin + glib. #P < 0,05, ** og ##P < 0,01, ****P < 0,0001. Analyserne blev fulgt op med Bonferronis multiple sammenligningstest. Et signifikant niveau på α = 0,05 blev brugt til alle testene. Dette tal er modificeret fra Christensen et al. 51. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: SCA-eksponering resulterer i TRPA1-afhængig CGRP-frigivelse fra musetrigeminusganglion. CGRP-niveauer frigivet fra trigeminusganglion isoleret fra WT og Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 hanmus (8-10 uger) blev målt med rotte CGRP VVM-sæt efter eksponering for supercinnamaldehyd (SCA) ved 1 μM, 10 μM og 100 μM og capsaicin ved 10 μM som en positiv kontrol (n = 6). Data fra hver mus præsenteres som individuelle punkter, og søjler angiver middelværdierne. Statistik: Sammenligning mellem SCA og køretøj ved hver koncentration og mellem basal og positiv kontrol blev udført med en tovejs gentaget ANOVA. Et betydeligt niveau på α = 0, 05. *P < 0,05, **P < 0,01. Dette tal er modificeret fra Christensen et al. 50. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den beskrevne metode blev udviklet efter undersøgelser, der viser betydningen af CGRP i migrænepatofysiologi. Det er velegnet til at undersøge de mekanismer, der er involveret i frigivelsen af CGRP fra det trigeminovaskulære system, hvilket er afgørende for smertesignalering i hovedregionen. Mængden af CGRP opnået i denne model måler direkte CGRP-frigivelse fra trigeminusnerverne, der inderverer dura mater, TG og TNC. Mængden af CGRP-frigivelse er kvantitativt større 45,54 end frigivelsen målt i plasma efter termokoagulation hos mennesker, trigeminusstimulering hos kat 39,55,56 og under migræneanfald 23. En forklaring kan være, at CGRP fortyndes og nedbrydes i blodet54. Det skal dog bemærkes, at direkte stimulering med kemikalier kan være bedre end patofysiologisk aktivering. Yderligere fordele er, at det er muligt at lokalisere frigivelsen fra tre forskellige steder i det trigeminovaskulære system, og at det kan bruges sammen med farmakologisk manipulation og i væv fra genetisk modificerede gnavere.

På det seneste fokuserer mange prækliniske gnavermodeller på systemisk administration af stoffer og efterfølgende smerte- eller migrænerelaterede aflæsninger ved hjælp af von Frey-test57,58, grimassering59,60,61 eller let aversion62,63,64. Disse metoder er nyttige til at forstå de smertefremkaldende og smertelindrende egenskaber ved forskellige stoffer. Disse metoder giver imidlertid ingen oplysninger om specifikke målvæv, der er involveret. I den nuværende metode er det trigeminovaskulære system opdelt i tre strukturer: dura mater, TG og TNC. Dette muliggør lokal eksponering af hver struktur og vurdering af virkningsstedet for et specifikt stof. Dette blev udnyttet i en undersøgelse fra 2011, hvor rollen af spændingsstyrede calciumkanaler hos rotter blev undersøgt, og hæmningen af disse kanaler viste sig at være forskellig i de tre strukturer i den trigeminovaskulære vej47. Ved dissekering af strukturer i nervesystemet er axotomi uundgåelig. Axotomi har vist sig at ændre transkriptionen af forskellige gener65. Disse transkriptionelle ændringer er for langsomme til at påvirke resultaterne af denne metode, men ændringer i phosphorylering kan ikke udelukkes sammenlignet med in vivo-situationer 46. Selvom neuropeptider såsom CGRP dannes i cellesomaen, er frigivelsen og virkningen af neuropeptider normalt ved de centrale eller perifere nerveterminaler. Således er undersøgelser af intakte neuroner, herunder terminaler, interessante, når man studerer neuropeptidfrigivelse. Derfor er metoder til at studere kulturer af neuroner fra isolerede ganglier blevet etableret for at tjene som en model af terminalerne. Imidlertid er neuronale cellekulturer underlagt flere problemer, da mekanisk dissociation kan ødelægge neuroner i en kultur46. Den længere tidsramme, der er forbundet med dyrkning af celler, gør denne metode følsom over for transkriptomiske ændringer på grund af axotomi og dyrkningsbetingelser65. Desuden har tilsætningen af vækstfaktorer og dyrkning på overfladebelægninger ændret neuronale egenskaber som transmitter og receptorekspression66,67,68,69. Disse problemer undgås, når man studerer nyligt isolerede intakte ganglier i stedet for neuronale cellekulturer.

En udfordring med ex vivo CGRP-frigivelsesmetoden er den præcise dissektion af vævet, der kræves for reproducerbare resultater. Særligt nøjagtig dissektion af TNC er udfordrende, da dette er en struktur i hjernestammen uden synlige grænser. Desuden er dura mater skrøbelig, og fjernelse af hjernen skal udføres omhyggeligt for at sikre en intakt struktur. Disse forhindringer kan resultere i varierende vævsstørrelse og dermed varierende basale og stimuleringsinducerede CGRP-niveauer. Denne variation kan imidlertid forklares ved normalisering til den basale CGRP-frigivelse. Det skal også bemærkes, at når TNC isoleres fra mus, isoleres hele den nederste del af hjernestammen og ikke den mere specifikke TNC-holdige del som gjort hos rotter. Generelt kan det være en fordel at bruge rottevæv, da dette muliggør måling af CGRP-frigivelse fra dura mater og mere præcis dissektion af TNC. Desuden muliggør vævets størrelse også brugen af en rotte som køretøjskontrol, da en rotte resulterer i to kraniumhalvdele, to TG'er og to TNC'er, hvor det ene stykke væv bruges til stofstimulering og det andet til køretøjet. Ved brug af mus er der brug for to dyr til et eksperiment, da begge TG'er samles i en prøve, og TNC'erne dissekeres som en hjernestamme. Derfor bruges to TG'er og en hjernestamme til stofstimulering, og to TG'er og en hjernestamme fra en anden mus bruges til køretøjskontrol. Dette resulterer i at bruge dobbelt så mange mus sammenlignet med rotter for at opnå det samme antal replikater. For at reducere antallet af anvendte mus er der foreslået en metode til måling af CGRP-frigivelse fra hjernestammeskiver49. Det er en fordel, at metoden er blevet ændret, så der kan anvendes mus. Dette gør det muligt at bruge mange allerede tilgængelige transgene musestammer, et nyttigt værktøj til at studere f.eks. signalveje. Der bør medtages en positiv kontrol ved forsøgets afslutning for at sikre, at det væv, der anvendes i forsøget, kan frigive CGRP. Den positive kontrol kunne være TRPV1-agonisten capsaicin eller det depolariserende stimuluskalium (KCl), som har vist sig at frigive CGRP fra det trigeminovaskulære system hos både mus og rotter 46,47,48,49,50. Desuden er metoden også tilpasset til at måle frigivelsen af andre relevante peptider som hypofyse adenylatcyclase-aktiverende peptid (PACAP) - et andet peptid af stor interesse inden for migræneforskning70.

Metoden er et nyttigt værktøj til at undersøge CGRP-frigivelse fra specifikt målvæv hos rotter og mus. Det er en relativt hurtig metode, der undgår problemer forbundet med dyrkning af neuroner. Metodeprotokollen kan let ændres til at studere koncentration-respons-forholdet eller hæmningen af et respons af forskellige farmakologiske forbindelser. Ex vivo CGRP-frigivelsesmetoden er en af flere prækliniske metoder, der er nyttige til at studere CGRP's rolle og andre mekanismer relateret til CGRP-frigivelse i migrænepatofysiologi.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Candys Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well culture plate NUNC 140675
Calcium chloride dihydrate Merck 1.02382.1000 For SIF buffer
Caps for plastic containers ThermoFisher Scientific 536617
Capsaicin Merck M2028
CGRP kits AH Diagnostics A05482.96
CO2 Strandmøllen 4.6 For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer Fine Science Tools 16109-14
Glibenclamide Tocris 911
Glucose Merck G7021 For SIF buffer
Guillotine for rats Scandidact NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate Merck M5921 For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps VWR 700-5239
Mini Hacksaw BAHCO 208
O2 Strandmøllen 4.5 For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital Glostrup pharmacy NA Magistral formula
Plastic containers ThermoFisher Scientific 536455
Plate photometer - Infinite M200 Tecan NA Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan.
Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride Merck P9333 For SIF buffer
Scissor Allgaier Instruments 307-156-170
Small scissor Allgaier Instruments 04-520-115
Sodium bicarbonate Merck S6014 For SIF buffer
Sodium chloride Merck S9888 For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 1.06346.1000 For SIF buffer
Sodium gluconate Merck S2054 For SIF buffer
Spatula Bochem Lab Supply 3018
Spring scissor Fine Science Tools 15024-10
Sucrose Merck 84097 For SIF buffer
Supercinnamaldehyde Merck S3322
Tulle (fabrics) NA NA Bought in the local fabrics store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Tags

Neurovidenskab udgave 183
<em>Ex vivo</em> Frigivelse af calcitonin genrelateret peptid fra det trigeminovaskulære system hos gnavere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., … More

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., Kristensen, D. M., Christensen, S. L. Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents. J. Vis. Exp. (183), e63723, doi:10.3791/63723 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter