Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo Frigjøring av kalsitonin-genrelatert peptid fra det trigeminovaskulære systemet hos gnagere

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63723
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Danish Headache Center, Department of Neurology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail), Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology, University of Copenhagen

Summary

Denne protokollen beskriver ex vivo kalsitonin-genrelatert peptid (CGRP) frigjøringsmodell og strategien for å kvantifisere effekten av farmakologiske midler på mengden CGRP frigjort fra det trigeminovaskulære systemet hos gnagere.

Abstract

Kalsitonin-genrelatert peptid (CGRP) ble først oppdaget på 1980-tallet som en spleisevariant fra kalsitoningenet. Siden oppdagelsen har dens rolle i migrenepatofysiologi blitt godt etablert, først ved sine potente vasodilatoregenskaper og deretter ved sin tilstedeværelse og funksjon som en nevrotransmitter i det sensoriske trigeminovaskulære systemet. CGRPs migreneprovoserende evne ga støtte til legemiddelindustrien til å utvikle monoklonale antistoffer og antagonister som hemmet effekten av CGRP. Et nytt behandlingsparadigme har vist seg å være effektivt i den profylaktiske behandlingen av migrene. Et av de nyttige verktøyene for å forstå migrenemekanismer ytterligere er ex vivo-modellen for CGRP-frigjøring fra det trigeminovaskulære systemet. Det er en relativt enkel metode som kan brukes med ulike farmakologiske verktøy for å oppnå kunnskap for å videreutvikle nye effektive migrenebehandlinger. Denne protokollen beskriver en CGRP-frisettingsmodell og teknikken for å kvantifisere effekten av farmakologiske midler på mengden CGRP frigjort fra det trigeminovaskulære systemet hos gnagere. En prosedyre som beskriver den eksperimentelle tilnærmingen fra eutanasi til måling av proteinnivåer er gitt. Den essensielle isolasjonen av trigeminal ganglion og trigeminuskjernen caudalis fra både mus og rotter og fremstilling av rotte dura mater er beskrevet i detalj. Videre presenteres representative resultater fra begge artene (rotter og mus). Teknikken er et sentralt verktøy for å undersøke de molekylære mekanismene som er involvert i migrenepatofysiologi ved å bruke ulike farmakologiske forbindelser og genmodifiserte dyr.

Introduction

Migrene er en nevrologisk lidelse som ifølge WHO anslås å påvirke mer enn 1 milliard mennesker og er en av de viktigste årsakene tilfunksjonshemming over hele verden. Dermed har migrene en betydelig innvirkning på både pasienter og samfunn. Til tross for den nylige kliniske suksessen til CGRP-antagoniserende legemidler, trenger en stor andel pasienter forbedrede behandlingsalternativer 2,3,4,5. Belysning av migrene patofysiologi som fører til nye effektive behandlinger er nødvendig. Signalering i det trigeminovaskulære systemet bestående av hjernehinnene, trigeminale ganglier (TG) og trigeminuskjernen caudalis (TNC) er sentralt for migrenepatofysiologi 6,7.

Det 37 aminosyre-neuropeptidet kalsitonin-genrelatert peptid (CGRP) ble først oppdaget tidlig på 1980-tallet da Amara og medarbeidere demonstrerte at den primære RNA-transkripsjonen av kalsitoningenet kunne behandles for å gi mRNA-koding for CGRP i tillegg til kalsitonin 8,9. Den påfølgende forskningen foreslo en kobling til migrenepatofysiologi10. CGRP er en nevrotransmitter med potente vasodilaterende egenskaper 11,12,13,14,15,16,1 7, og den er utbredt i det sentrale og perifere nervesystemet 13,14,18,19,20,21,22 . Involvering av CGRP i migrene ble understreket med oppdagelsen av økte CGRP-nivåer i den ekstracerebrale sirkulasjonen under migreneanfall hos mennesker23, og at infusjon av CGRP gir migrenelignende smerter hos pasienter24. To år senere ble den første proof-of-concept-studien av effektiviteten til CGRP-antagonisten olcegepant i behandling av migrene publisert25.

CGRP er rikelig i det trigeminovaskulære systemet som vist i TG21,26, sensoriske nervefibre som innerverer dura mater27,28,29 og TNC30. I det trigeminovaskulære systemet finnes CGRP i små til mellomstore nevroner i TG, i umyeliniserte C-fibre, og uttrykkes i nesten 50% av nevronpopulasjonen i TG. CGRP-reseptoren uttrykkes hovedsakelig i større nevroner og finnes i myeliniserte Aδ-fibre31,32. CGRP frigjøres fra nevroner ved kjemisk eller elektrisk stimulering33,34. Studier av veier som fører til frigjøring av CGRP og plasseringen av denne aktiveringen er avgjørende for å forstå patofysiologien ved migrene. Gjennom de siste 5 tiårene har prekliniske studier bidratt til å få omfattende kunnskap om migrenerelatert signalering og har bidratt til utvikling av nye behandlinger35. Mange metoder som vurderer vaskulær og nevrogen involvering har blitt modifisert og anvendt i migreneforskning. In vivo og in vitro modeller av arterielle responser på biologiske forbindelser eller farmakologiske behandlinger17,36,37, og elektrisk nervestimulering38,39 kan nevnes. Videre kan aktiverte nevroner i TNC detekteres ved c-Fos-ekspresjon 40,41,42 og elektrofysiologiske opptak i dette området 43,44. Begge metodene måler nociceptive signaler som overføres til hjernen fra hodet, for eksempel dura mater. Bruk av kun én preklinisk modell gir ikke det fulle bildet av patofysiologien ved migrene. Derfor er det viktig å kombinere ulike modeller som dekker så mange aspekter av migrenepatofysiologi som mulig. Den fortsatte utviklingen av nye modeller vil dekke ulike aspekter av migrenemekanismer, og med tiden vil mysteriet med migrenepatofysiologi bli avdekket.

Her presenteres en detaljert protokoll for CGRP-frigjøringsmetoden, utført ex vivo i isolert TG og TNC fra mus etter kjemisk stimulering. CGRP-frigjøring kan også studeres i dura mater fra rotter. I den eksperimentelle protokollen for rotter er dura mater beskrevet sammen med TG og TNC. Grunnlaget for CGRP-frigjøringsmetoden ble først beskrevet i 1999, hvor Ebersberger og medarbeidere gjennomførte banebrytende forskning og fant at CGRP ble frigjort fra dura mater etter kjemisk og elektrisk stimulering av dural afferenter hos rotter45. Senere ble denne tilnærmingen utvidet til CGRP-frigjøring fra TG46 og TNC47. Deretter ble metoden modifisert til å gjelde TG og TNC hos mus. Så langt har CGRP-frigjøring fra dura mater vært utfordrende hos mus.

Protocol

Alle dyrepleie- og forsøksprosedyrer ble utført i samsvar med EUs veiledning for stell og bruk av dyr (2010/63/UE). Mannlige C57BL / 6JBomTac-mus, i alderen 10 uker, og mannlige Sprague Dawley-rotter, i alderen 10 uker, ble brukt til å demonstrere denne protokollen.

1. Fremstilling av syntetisk interstitialvæske

  1. Forbered syntetisk interstitiell væske (SIF) i henhold til følgende oppskrift: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mM NaH 2 PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-glukonat, 5,50 mM glukose og 7,60 mM sukrose (se Tabell over materialer).
    MERK: SIF kan varieres avhengig av stimuleringsmålet, for eksempel kan en kalsiumfri løsning brukes når man studerer kalsiumkanaler.
  2. Juster pH til 7,4 og stabiliser pH ved karbogengassing (5% CO 2 og 95% O2)46.

2. Eutanasi

  1. Bedøv voksne mus og rotter med en blanding av 70% CO 2 og 30% O2. Halshugg mus ved hjelp av en saks og rotter ved hjelp av en giljotin (se Materialtabell).
    MERK: Bruk en stamme og alder som passer til målet med forskningen. Både menn og kvinner kan brukes i denne modellen.
  2. Separat hodet fra kroppen på C3-C4-nivået i ryggmargen.
    MERK: Eutanasi kan også utføres med en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (100-150 mg / kg).

3. Disseksjon

  1. Forbered rottevevet ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Fjern huden og muskelen rundt hodet og halsen med en saks (figur 1A).
    2. Bruk en bentrimmer og saks for å skille underkjevene fra hodet (figur 1B-C).
    3. Åpne ryggmargen ved å stikke en bentrimmer kaudalt inn i ryggvirvlenes ryggdel, og fjern ryggvirvlenes ryggdel for å eksponere ryggmargen og hjernestammen (figur 1D).
    4. Skjær den kaudale delen av kraniet ved kantene av oksipitale og interparietale bein for å fjerne disse beinstrukturene som eksponerer lillehjernen (figur 1E).
      MERK: Det er viktig å ikke skade hjernestammen og ryggmargen mens du kutter og fjerner ryggvirvlene.
    5. Isoler TNC (Sp5C) som løper kaudalt ca. 13-16 mm fra bregma på hver side ved å kutte den dorsolaterale delen av hjernestammen med vårsaks. Senk venstre og høyre TNC ned i SIF (figur 1E-I).
      MERK: Beskrivelsen tilsvarer voksne rotter.
    6. Klipp hodet midt i sagitalt for å dele kraniet i to ved hjelp av en sag (figur 1J-L).
    7. Fjern hjernen forsiktig uten å berøre dura materen som er festet til kraniet ved hjelp av en slikkepott og kutte trigeminusnerven der den kommer inn i hjernestammen (figur 1M-P).
    8. For å isolere TG, klipp den, inkludert grenene rundt de visuelle grensene. Klipp den mandibulære grenen der den kommer inn i foramen ovale. Klipp oftalmiske og maksillære grener som kommer inn i skallen, da de ikke er delt makroskopisk. Mens du dissekerer TG, fjern dura materen som dekker TG (figur 1Q-T).
    9. Senk kraniehalvdelene og TG-ene i SIF.
  2. Forbered musevevet ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Fjern hud og muskler rundt hode og nakke med små sakser (figur 2A-B).
    2. Åpne ryggmargen ved å stikke en liten saks kaudalt inn i ryggvirvlenes ryggdel, og fjern ryggvirvlenes ryggsøyledel for å eksponere ryggmargen og hjernestammen (figur 2C).
      MERK: Det er viktig å ikke skade ryggmargen mens du kutter og fjerner ryggvirvlene.
    3. Klipp kraniet ved kantene av occipital og interparietal bein for å fjerne disse beinstrukturene som utsetter lillehjernen (figur 2D-F).
    4. Skjær deretter parietalbenet midt-sagitalt og fjern beinet for å eksponere storhjernen (figur 2G-I).
    5. Fjern lillehjernen forsiktig med en slikkepott for å eksponere hjernestammen (figur 2J).
    6. Isoler den TNC-holdige delen av hjernestammen ved hjelp av vårsaks (figur 2K-N). Senk hjernestammen med TNC i SIF (figur 2O).
    7. Fjern hjernen og kutt trigeminusnerven der den kommer inn i hjernestammen (figur 2P-Q).
    8. For å isolere TG, klipp den, inkludert grenene rundt de visuelle grensene. Klipp den mandibulære grenen der den kommer inn i foramen ovale. Klipp oftalmiske og maksillære grener som kommer inn i skallen, da de ikke er delt makroskopisk. Mens du dissekerer TG, fjern dura materen som dekker TG (figur 2R-S).
    9. Fordyp TGs i SIF (figur 2T).

4. Vasking

  1. Vask skallehalvdeler, TNC og TG i SIF i 30 minutter mens du bytter SIF hvert 5. minutt ved romtemperatur.
    MERK: Vasketrinnene kan utføres mens du holder vevet i plastbeholdere med et tylllokk for å muliggjøre enkel SIF-utveksling (figur 3A-B).
  2. Forbered rottevevet ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Overfør TNC-halvdeler til separate mikrosentrifugerørhetter med 350 μL SIF (figur 3C).
    2. Overfør TG-ene til mikrocentrifuge rørhetter - en TG per mikrosentrifuge rørhette med 350 μL SIF (figur 3C).
    3. Plasser skallehalvdelene på plattformer laget av leire eller en 6-brønns kulturplate og fyll skallen med 400 μL SIF (figur 3C).
  3. Forbered musevevet ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Overfør hjernestammen med TNC til en mikrosentrifugerørhette med 250 μL SIF (figur 3D).
    2. Overfør de to TG-ene til en mikrosentrifugerørhette med 250 μL SIF (figur 3D).
      MERK: Plasser to TGs per mikrosentrifuge rørhette når du bruker vev fra mus.
  4. Plasser rotteskaller og mikrosentrifugerrørhetter med rotte- og musevev i en fuktet inkubator ved 37 °C. Bytt SIF med en pipette hvert 5. minutt i 20 minutter.
    MERK: Det er viktig å ikke berøre vevet når du legger til og fjerner SIF.

5. Narkotika testing

  1. Bestem de basale CGRP-frigjøringsnivåene.
    1. Etter siste vask, tilsett 250 μL SIF til mus TG og TNC. Tilsett 350 μL til rotte TG og TNC og 400 μL til hver rotteskalle .
    2. Etter 10 minutters inkubasjon, samle 200 μL av prøven i et mikrosentrifugerør og tilsett 50 μL 10x EIA-buffer (forsynt med CGRP-enzymimmunoassay-settet, se materialtabell) for å tillate måling av basal CGRP-frigjøring (trinn 6). Kast den gjenværende væsken.
      MERK: Inkubasjonstiden må være den samme for alle prøver.
    3. Oppbevar prøvene umiddelbart ved -20 °C.
    4. Etter prøvetaking av basale CGRP-frisettingsnivåer, følg en av de tre metodene: (A) Enkel stimulering (trinn 5.2); (B) Konsentrasjon-respons stimulering (trinn 5.3); og (C) Hemming av stimulering (trinn 5.4) (figur 4).
      MERK: Testforbindelsen og konsentrasjonene som brukes, avhenger av målet med studien.
  2. Utfør enkeltstimulering ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Tilsett testforbindelse eller kjøretøy i vevet og la det stå i 10 minutter (volum: 250 μL for mus TG og TNC, 350 μL for rotte TG og TNC, og 400 μL for hver rotteskalle).
    2. Etter 10 minutters inkubasjon, samle 200 μL av prøven i et mikrosentrifugerrør med 50 μL 10x EIA-buffer. Kast den gjenværende væsken og oppbevar prøvene umiddelbart ved -20 °C.
      MERK: Inkubasjonstiden må være den samme for alle prøver.
  3. Utfør konsentrasjon-respons stimulering ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Fortynn testforbindelsen eller kjøretøyet til de ønskede konsentrasjonene. Tilsett testforbindelsen i økende konsentrasjoner som starter med den laveste konsentrasjonen.
      MERK: Testforbindelsen og konsentrasjonene som brukes, avhenger av målet med studien. For eksempel ble 1 μM, 10 μM og 100 μM supercinnamaldehyd brukt til denne studien.
    2. Tilsett den laveste konsentrasjonen (1 μM for denne studien) av testforbindelsen og tilsvarende kjøretøy til to identiske vevspreparater og inkuber i 10 minutter (volum: 250 μL for musevev, 350 μL for rotte TG og TNC, og 400 μL for hver rotteskalle).
    3. Etter 10 minutters inkubasjon, samle 200 μL av prøven i et mikrosentrifugerrør med 50 μL 10x EIA-buffer.
    4. Kast den gjenværende væsken og tilsett den nest laveste konsentrasjonen (10 μM for denne studien) til vevet.
    5. Oppbevar prøvene umiddelbart ved -20 °C.
    6. Gjenta denne prosedyren med de resterende konsentrasjonene (100 μM for denne studien).
  4. Utfør hemming av stimulering ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Legg blokkeringen eller kjøretøyet til vevet og inkuber i 10 minutter (volum: 250 μL for musevev, 350 μL for rotte TG og TNC, og 400 μL for hver rotteskalle).
      MERK: Blokkeringen og konsentrasjonen som brukes, avhenger av målet med studien. For eksempel ble 3 μM glibenklamid brukt for det representative resultatet i figur 5.
    2. Etter 10 minutters inkubasjon, samle en 200 μL prøve i et mikrocentrifugerør med 50 μL 10x EIA-buffer. Kast den gjenværende væsken og oppbevar prøvene umiddelbart ved -20 °C.
    3. Tilsett agonisten eller agonisten + blokkeringen (se materialtabell) i vevet og inkuber i 10 minutter.
      MERK: Agonisten, blokkeringen og konsentrasjonene som brukes, avhenger av målet med studien. I denne studien ble det brukt 3 μM glibenklamid og 1 μM capsaicin, figur 5.
    4. Etter 10 minutters inkubasjon, samle en 200 μL prøve i et mikrocentrifugerør med 50 μL 10x EIA-buffer. Kast den gjenværende væsken og oppbevar prøvene umiddelbart ved -20 °C.
  5. Utfør en positiv kontroll for eksperimentet.
    1. Når det er hensiktsmessig, legg til en positiv kontroll (f.eks. 1-10 μM capsaicin, se materialtabell) til vevet på slutten av protokollen og samle en 200 μL-prøve i et mikrosentrifugerrør med 50 μL 10x EIA-buffer etter en inkubasjonsperiode på 10 minutter.
      MERK: Det er fordelaktig å inkludere en positiv kontroll for å sikre at oppsettet og vevet fungerer. Capsaicin 48,49,50 eller den depolariserende stimulansen av kalium (40-60 mM KCl)46,47,49 brukes rutinemessig til å forårsake frigjøring av CGRP fra det trigeminovaskulære systemet. 40-60 mM KCl SIF er fremstilt som SIF, bortsett fra at NaCl byttes ut med KCl på lik basis.

6. Analyse av CGRP-konsentrasjoner

  1. Mål mengden CGRP som frigjøres ved hjelp av et enzymimmunoassay (EIA)-sett etter produsentens protokoll (se materialtabell).
  2. Mål den optiske tettheten ved 410 nm ved hjelp av et platefotometer. Hvis det brukes et annet CGRP EIA-sett, måler du den optiske tettheten ved bølgelengden som er angitt i produsentens protokoll.
    MERK: Prøvene må fortynnes for å samsvare med standardkurven.
  3. Utfør dataanalyse.
    1. Presentere dataene enten som absolutte konsentrasjoner eller normalisere til basal CGRP-frigjøring fra det spesifikke vevet.

Representative Results

Denne teknikken er et verktøy for å undersøke de CGRP-relaterte molekylære mekanismene som er involvert i migrene. Det har fordelen av å vurdere CGRP-frigjøring fra forskjellige nivåer av det trigeminovaskulære systemet og kan brukes både på villtype og transgene mus og rotter i kombinasjon med forskjellige farmakologiske forbindelser. Her presenteres konsentrasjonsrespons- og blokkeringseksperimenter fra rotter og konsentrasjonsresponsresultater fra villtype og transgene mus.

CGRP-frigjøringsmetoden ble brukt til å studere effekten av K ATP-kanalhemmeren glibenklamid på CGRP-frigjøring fra TG og dura mater hos spontane trigeminale allodynrotter (STA). Først ble den optimale konsentrasjonen av capsaicin funnet ved hjelp av en konsentrasjon-respons studiedesign. Capsaicineksponering induserte en signifikant CGRP-frigjøring fra dura mater og TG sammenlignet med kjøretøyet (figur 5). I dura materen ble maksimal frigjøring av CGRP funnet ved 1 μM capsaicin, og i TG ble maksimal CGRP-frigjøring funnet ved 10 μM capsaicin (figur 5A-B). Basert på konsentrasjonsresponseksperimentene ble 1 μM capsaicin og 3 μM glibenklamid brukt til å blokkere eksperimenter. Glibenklamid viste ingen effekt på basal CGRP-frigjøring fra dura mater (P = 0,441) og TG (P = 0,881) ved analyse med enveis ANOVA51. Glibenklamid reduserte signifikant capsaicinindusert CGRP-frigjøring i dura mater med 40 % (P = 0,031) og TG med 39 % (P = 0,003) sammenlignet med capsaicin med kjøretøyet når det analyseres med en enveis ANOVA (figur 5C-D)51.

Hos mus ble protokollen brukt til å undersøke involvering av den forbigående reseptorpotensialet ankyrin 1 (TRPA1) ionkanal i en GTN-musemodell av migrene, hvor GTN-indusert overfølsomhet var helt avhengig av TRPA1-kanaler. TRPA1-agonisten supercinnamaldehyd (SCA) ble funnet å frigjøre CGRP på en doseavhengig måte fra TG med 1 μM, 10 μM og 100 μM SCA, noe som resulterte i 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) og 69% (P = 0,0097) økt frigjøring av CGRP sammenlignet med kjøretøy, henholdsvis når analysert med toveis ANOVA. Denne utgivelsen var fraværende i TG fra Trpa1 nullmus hvor eksponering for 1 μM, 10 μM og 100 μM SCA resulterte i henholdsvis 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) og 9% (P = 0,97) prosent endring i utgivelsen av CGRP sammenlignet med kjøretøy, henholdsvis når de analyseres med toveis ANOVA. Den påfølgende stimuleringen med 10 μM capsaicin (positiv kontroll) viser at alle vevsprøver kunne frigjøre CGRP (figur 6)50.

Figure 1
Figur 1: Trinnvis disseksjon av vev fra rotter. (A-T)-detaljene er gitt i protokolldelen (trinn 3.1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Trinnvis disseksjon av vev fra mus. (A-T)-detaljene er gitt i protokolldelen (trinn 3.2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vasking og inkubasjon av gnagervev. (AB) Nyisolert vev i plastbeholdere med SIF. Beholderne er dekket med tyll for å muliggjøre enkel bytte av SIF. (C) Rottevev - To skallehalvdeler med dura mater som dekker de indre foringene av skallen plassert på en 6-brønns kulturplate. Høyre og venstre trigeminale kjerne caudalis i separate mikrosentrifugerørlokk (øverste rad med lokk). De to trigeminale ganglia i individuelle mikrocentrifuge rørlokk (nederste rad av lokk). (D) Musevev - Den trigeminale kjernen caudalisholdige delen av hjernestammen i et separat mikrosentrifugerørlokk (øverst). To mus trigeminal ganglia er i en mikrocentrifuge rør lokk (nederst). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Studiedesign for CGRP-utgivelse. Tre forskjellige protokoller for å utføre CGRP-utgivelseseksperimenter. Legemidler skal fortynnes i syntetisk interstitiell væske (SIF). (A) Enkel stimulering. (B) Konsentrasjon-respons stimulering. (C) Hemming av en stimulering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Glibenklamid hemmer capsaicinindusert CGRP-frigjøring fra rotte dura mater og trigeminal ganglion. CGRP-nivåer fra trigeminal ganglion og dura mater isolert fra kvinnelige spontane trigeminale allodyniske (STA) rotter (215-318 g) opprinnelig hentet fra Thomas Jefferson University52 ble målt med kommersielle menneskelige CGRP EIA-sett. (AB) CGRP-frigjøring fra (A) dura mater og (B) trigeminal ganglion etter økende konsentrasjoner av capsaicin (10 nM, 100 nM, 1 μM og 10 μM) (n = 4). Data presenteres som enkeltpunkter og analyseres med toveis ANOVA. p < 0,0001 (C-D) Nivåer av CGRP frigjort fra (C) dura mater og (D) trigeminal ganglion etter 10 min eksponering for kjøretøy, 3 μM glibenklamid (glib), 1 μM capsaicin og 1 μM capsaicin + 3 μM glib (n = 6-11). Data presenteres som enkeltpunkter og middelverdier og analyseres med enveis ANOVA. *sammenlignet med kjøretøy. #capsaicin sammenlignet med capsaicin + glib. #P < 0,05, ** og ##P < 0,01, ****P < 0,0001. Analysene ble fulgt opp med Bonferronis multiple sammenligningstest. Et signifikant nivå på α = 0,05 ble brukt for alle testene. Dette tallet er modifisert fra Christensen m.fl. 51. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: SCA-eksponering resulterer i TRPA1-avhengig CGRP-frigjøring fra musetrigeminal ganglion. CGRP-nivåer frigjort fra trigeminal ganglion isolert fra WT og Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 hannmus (8-10 uker) ble målt med rotte CGRP EIA-sett etter eksponering for supercinnamaldehyd (SCA) ved 1 μM, 10 μM og 100 μM og capsaicin ved 10 μM som en positiv kontroll (n = 6). Data fra hver mus presenteres som individuelle punkter, og stolper angir gjennomsnittsverdiene. Statistikk: Sammenligning mellom SCA og vehikkel ved hver konsentrasjon og mellom basal og positiv kontroll ble utført med en toveis gjentatt ANOVA. Et signifikant nivå på α = 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01. Dette tallet er modifisert fra Christensen m.fl. 50. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den beskrevne metoden ble utviklet etter studier som viste betydningen av CGRP i patofysiologien ved migrene. Det er godt egnet til å undersøke mekanismene som er involvert i frigjøring av CGRP fra det trigeminovaskulære systemet, noe som er avgjørende for smertesignalering i hoderegionen. Mengden CGRP oppnådd i denne modellen måler direkte CGRP-frigjøring fra trigeminusnervene innervating dura mater, TG og TNC. Mengden CGRP-frigjøring er kvantitativt større 45,54 enn frigjøringen målt i plasma etter termokoagulering hos mennesker, trigeminal stimulering hos katt 39,55,56 og under migreneanfall 23. En forklaring kan være at CGRP fortynnes og nedbrytes i blodet54. Det skal imidlertid bemerkes at direkte stimulering med kjemikalier kan være bedre enn patofysiologisk aktivering. Ytterligere fordeler er at det er mulig å lokalisere frigivelsen fra tre forskjellige steder i det trigeminovaskulære systemet, og at den kan brukes sammen med farmakologisk manipulasjon og i vev fra genmodifiserte gnagere.

I det siste fokuserer mange prekliniske gnagermodeller på systemisk administrasjon av stoffer og påfølgende smerte- eller migrenerelaterte avlesninger ved hjelp av von Frey-testing57,58, grimasering59,60,61 eller lett aversjon62,63,64. Disse metodene er nyttige for å forstå de smertefremkallende og smertelindrende egenskapene til forskjellige stoffer. Imidlertid gir disse tilnærmingene ingen informasjon om spesifikke målvev som er involvert. I den nåværende metoden er det trigeminovaskulære systemet delt inn i tre strukturer: dura mater, TG og TNC. Dette muliggjør lokal eksponering av hver struktur og vurdering av virkningsstedet til et bestemt stoff. Dette ble brukt i en studie fra 2011, hvor rollen som spenningsstyrte kalsiumkanaler hos rotter ble utforsket, og inhiberingen av disse kanalene ble funnet å være forskjellig i de tre strukturene i den trigeminovaskulære banen47. Ved dissekering av strukturer i nervesystemet er aksotomi uunngåelig. Aksotomi har vist seg å endre transkripsjonen av forskjellige gener65. Disse transkripsjonsendringene er for langsomme til å påvirke resultatene fra denne metoden, men endringer i fosforylering kan ikke utelukkes sammenlignet med in vivo situasjoner46. Selv om nevropeptider som CGRP dannes i cellesoma, er frigjøring og virkning av neuropeptider vanligvis ved de sentrale eller perifere nerveterminalene. Dermed er studier av intakte nevroner, inkludert terminaler, interessante når man studerer frigjøring av neuropeptider. Derfor er det etablert metoder for å studere kulturer av nevroner fra isolerte ganglia for å tjene som en modell av terminalene. Imidlertid er nevroncellekulturer utsatt for flere problemer, da mekanisk dissosiasjon kan ødelegge nevroner i en kultur46. Den lengre tidsrammen forbundet med dyrking av celler etterlater denne metoden følsom for transkriptomiske endringer på grunn av akstotomi og kulturforhold65. Videre har tilsetning av vekstfaktorer og dyrking på overflatebelegg endret nevronegenskaper som sender- og reseptoruttrykk66,67,68,69. Disse problemene unngås når man studerer nyisolerte intakte ganglier i stedet for nevroncellekulturer.

En utfordring med ex vivo CGRP-frigjøringsmetoden er den nøyaktige disseksjonen av vevet som kreves for reproduserbare resultater. Spesielt nøyaktig disseksjon av TNC er utfordrende, da dette er en struktur i hjernestammen uten synlige grenser. Videre er dura mater skjøre, og fjerning av hjernen må utføres nøye for å sikre en intakt struktur. Disse hindringene kan resultere i varierende vevsstørrelse og dermed varierende basale og stimuleringsinduserte CGRP-nivåer. Denne variasjonen kan imidlertid forklares ved normalisering til basal CGRP-frigjøring. Det skal også bemerkes at når man isolerer TNC fra mus, isoleres hele den nedre delen av hjernestammen og ikke den mer spesifikke TNC-holdige delen som gjort hos rotter. Generelt kan det være en fordel å bruke rottevev, da dette tillater måling av CGRP-frigjøring fra dura mater og mer presis disseksjon av TNC. Videre muliggjør størrelsen på vevet også bruk av en rotte som kjøretøykontroll, da en rotte resulterer i to kraniumhalvdeler, to TG og to TNC-er der den ene delen av vevet brukes til stoffstimulering og den andre til kjøretøyet. Når du bruker mus, er det nødvendig med to dyr for ett eksperiment, da begge TG-ene samles i en prøve, og TNC-ene blir dissekert som en hjernestamme. Derfor brukes to TG og en hjernestamme til stoffstimulering, og to TG og en hjernestamme fra en annen mus brukes til kjøretøykontroll. Dette resulterer i å bruke dobbelt så mange mus sammenlignet med rotter for å oppnå samme antall replikasjoner. For å redusere antall mus som brukes, har en metode for å måle CGRP-frigjøring fra hjernestammeskiver blitt foreslått49. Det er en fordel at metoden er modifisert for å muliggjøre bruk av mus. Dette tillater bruk av mange allerede tilgjengelige transgene musestammer, et nyttig verktøy for å studere for eksempel signalveier. En positiv kontroll på slutten av et eksperiment bør inkluderes for å sikre at vevet som brukes i forsøket, kan frigjøre CGRP. Den positive kontrollen kan være TRPV1-agonistkapsaicin eller det depolariserende stimuluskaliumet (KCl), som har vist seg å frigjøre CGRP fra det trigeminovaskulære systemet hos både mus og rotter 46,47,48,49,50. Videre er metoden også tilpasset for å måle frigjøring av andre relevante peptider som hypofyseadenylatsyklaseaktiverende peptid (PACAP) - et annet peptid av stor interesse innen migreneforskning70.

Metoden gir et nyttig verktøy for å undersøke CGRP-frigjøring fra spesifikke målvev hos rotter og mus. Det er en relativt rask metode som unngår problemer forbundet med dyrking av nevroner. Metodeprotokollen kan enkelt modifiseres for å studere konsentrasjon-respons-forholdet eller inhiberingen av en respons av forskjellige farmakologiske forbindelser. Ex vivo CGRP-frigjøringsmetoden er en av flere prekliniske metoder som er nyttige for å studere rollen til CGRP og andre mekanismer relatert til CGRP-frigjøring i patofysiologien ved migrene.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Candys Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well culture plate NUNC 140675
Calcium chloride dihydrate Merck 1.02382.1000 For SIF buffer
Caps for plastic containers ThermoFisher Scientific 536617
Capsaicin Merck M2028
CGRP kits AH Diagnostics A05482.96
CO2 Strandmøllen 4.6 For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer Fine Science Tools 16109-14
Glibenclamide Tocris 911
Glucose Merck G7021 For SIF buffer
Guillotine for rats Scandidact NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate Merck M5921 For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps VWR 700-5239
Mini Hacksaw BAHCO 208
O2 Strandmøllen 4.5 For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital Glostrup pharmacy NA Magistral formula
Plastic containers ThermoFisher Scientific 536455
Plate photometer - Infinite M200 Tecan NA Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan.
Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride Merck P9333 For SIF buffer
Scissor Allgaier Instruments 307-156-170
Small scissor Allgaier Instruments 04-520-115
Sodium bicarbonate Merck S6014 For SIF buffer
Sodium chloride Merck S9888 For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 1.06346.1000 For SIF buffer
Sodium gluconate Merck S2054 For SIF buffer
Spatula Bochem Lab Supply 3018
Spring scissor Fine Science Tools 15024-10
Sucrose Merck 84097 For SIF buffer
Supercinnamaldehyde Merck S3322
Tulle (fabrics) NA NA Bought in the local fabrics store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Tags

Nevrovitenskap utgave 183
<em>Ex Vivo</em> Frigjøring av kalsitonin-genrelatert peptid fra det trigeminovaskulære systemet hos gnagere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., … More

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., Kristensen, D. M., Christensen, S. L. Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents. J. Vis. Exp. (183), e63723, doi:10.3791/63723 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter