Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إكس فيفو إطلاق الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين من نظام الأوعية الدموية الثلاثية في القوارض

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63723
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Danish Headache Center, Department of Neurology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail), Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology, University of Copenhagen

Summary

يصف البروتوكول الحالي نموذج إطلاق الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين خارج الجسم الحي (CGRP) واستراتيجية تحديد تأثير العوامل الدوائية على كمية CGRP المنبعثة من نظام الأوعية الدموية ثلاثية التوائم في القوارض.

Abstract

تم اكتشاف الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) لأول مرة في 1980s كمتغير لصق من جين الكالسيتونين. منذ اكتشافه ، تم تأسيس دوره في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي ، أولا من خلال خصائصه القوية في موسع الأوعية الدموية وبعد ذلك من خلال وجوده ووظيفته كناقل عصبي في الجهاز الحسي ثلاثي التوائم. أعطت قدرة CGRP المثيرة للصداع النصفي الدعم لصناعة الأدوية لتطوير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومضادات تثبيط تأثير CGRP. أثبت نموذج علاجي جديد فعاليته في العلاج الوقائي للصداع النصفي. واحدة من الأدوات المفيدة لفهم آليات الصداع النصفي بشكل أكبر هي نموذج خارج الجسم الحي لإطلاق CGRP من نظام الأوعية الدموية الثلاثية التوائم. إنها طريقة بسيطة نسبيا يمكن استخدامها مع أدوات دوائية مختلفة لتحقيق المعرفة لتطوير علاجات جديدة فعالة للصداع النصفي. يصف البروتوكول الحالي نموذج إطلاق CGRP وتقنية تحديد تأثير العوامل الدوائية على كمية CGRP المنبعثة من نظام الأوعية الدموية الثلاثية في القوارض. يتم توفير إجراء يصف النهج التجريبي من القتل الرحيم لقياس مستويات البروتين. يتم وصف العزلة الأساسية للعقدة الثلاثية التوائم والنواة الذيلية ثلاثية التوائم من كل من الفئران والجرذان وإعداد الأم الجافية للفئران بالتفصيل. علاوة على ذلك ، يتم تقديم نتائج تمثيلية من كلا النوعين (الجرذان والفئران). هذه التقنية هي أداة رئيسية للتحقيق في الآليات الجزيئية المشاركة في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي باستخدام مركبات دوائية مختلفة معدلة وراثيا.

Introduction

الصداع النصفي هو اضطراب عصبي ، وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، يقدر أنه يؤثر على أكثر من مليار شخص وهو أحد الأسباب الرئيسية للإعاقة في جميع أنحاء العالم1. وبالتالي ، فإن الصداع النصفي له تأثير كبير على كل من المرضى والمجتمع. على الرغم من النجاح السريري الأخير للعقاقير المعادية CGRP ، فإن نسبة كبيرة من المرضى يحتاجون إلى خيارات علاج محسنة2،3،4،5. مطلوب توضيح الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي مما يؤدي إلى علاجات فعالة جديدة. تعد الإشارات داخل نظام الأوعية الدموية الثلاثية التي تتكون من السحايا والعقد ثلاثية التوائم (TG) والنواة الذيلية ثلاثية التوائم (TNC) أمرا أساسيا في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي 6,7.

تم اكتشاف الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين 37 من الأحماض الأمينية (CGRP) لأول مرة في أوائل 1980s عندما أظهر Amara وزملاؤه أنه يمكن معالجة نسخة RNA الأولية لجين الكالسيتونين لإعطاء ترميز mRNA ل CGRP بالإضافة إلى الكالسيتونين 8,9. اقترح البحث اللاحق وجود صلة بالفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي10. CGRP هو ناقل عصبي ذو خصائص توسع أوعية قوية 11،12،13،14،15،16،17 ، ويتم توزيعه على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي 13،14،18،19،20،21،22 . تم التأكيد على تورط CGRP في الصداع النصفي مع اكتشاف زيادة مستويات CGRP في الدورة الدموية خارج الدماغ أثناء نوبات الصداع النصفي لدى البشر23 ، وأن ضخ CGRP يسبب ألما يشبه الصداع النصفي لدى المرضى24. بعد ذلك بعامين ، تم نشر أول دراسة لإثبات المفهوم لفعالية مضادات CGRP olcegepant في علاج الصداع النصفي25.

CGRP وفيرة في نظام الأوعية الدموية الثلاثية كما هو موضح في TG 21،26 ، والألياف العصبية الحسية التي تعصب الأم الجافية27،28،29 ، و TNC30. في نظام الأوعية الدموية الثلاثية التوائم ، تم العثور على CGRP في الخلايا العصبية الصغيرة والمتوسطة الحجم في TG ، في ألياف C غير الميالينية ، ويتم التعبير عنها في ما يقرب من 50 ٪ من السكان العصبية في TG. يتم التعبير عن مستقبلات CGRP بشكل رئيسي في الخلايا العصبية الأكبر حجما وتوجد في ألياف Aδ الميالينية31,32. يتم إطلاق CGRP من الخلايا العصبية عند التحفيز الكيميائي أو الكهربائي33،34. تعد دراسات المسارات المؤدية إلى إطلاق CGRP وموقع هذا التنشيط أمرا بالغ الأهمية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي. على مدار العقود ال 5 الماضية ، ساهمت الدراسات قبل السريرية في اكتساب معرفة واسعة حول الإشارات المتعلقة بالصداع النصفي وساهمت في تطوير علاجات جديدة35. تم تعديل العديد من الطرق التي تراعي المشاركة الوعائية والعصبية وتطبيقها في أبحاث الصداع النصفي. في الجسم الحي وفي النماذج المختبرية للاستجابات الشريانية للمركبات البيولوجية أو العلاجات الدوائية17،36،37 ، والتحفيز الكهربائي للأعصاب38،39 يمكن ذكرها. علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف الخلايا العصبية المنشطة في TNC بواسطة تعبير c-Fos40،41،42 والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في هذا المجال43،44. تقيس كلتا الطريقتين إشارات مسبب للألم تنتقل إلى الدماغ من الرأس ، على سبيل المثال ، الأم الجافية. لا يقدم استخدام نموذج واحد فقط قبل السريرية الصورة الكاملة للفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي. لذلك ، من المهم الجمع بين نماذج مختلفة تغطي أكبر عدد ممكن من جوانب الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي. سيغطي التطوير المستمر لنماذج جديدة جوانب مختلفة من آليات الصداع النصفي ، وفي الوقت المناسب سيتم الكشف عن لغز الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لطريقة إطلاق CGRP ، التي يتم إجراؤها خارج الجسم الحي في TG و TNC المعزولة من الفئران بعد التحفيز الكيميائي. يمكن أيضا دراسة إطلاق CGRP في الأم الجافية من الفئران. وهكذا ، في البروتوكول التجريبي للفئران ، يتم وصف الأم الجافية مع TG و TNC. تم وصف أساس طريقة إطلاق CGRP لأول مرة في عام 1999 ، حيث أجرى Ebersberger وزملاؤه بحثا رائدا ووجدوا أن CGRP تم إطلاقه من الأم الجافية بعد التحفيز الكيميائي والكهربائي للوارد الجافية في الفئران45. في وقت لاحق ، تم توسيع هذا النهج ليشمل إصدار CGRP من TG46 و TNC47. بعد ذلك ، تم تعديل الطريقة لتطبيقها على TG و TNC في الفئران. حتى الآن ، كان إطلاق CGRP من الأم الجافية يمثل تحديا في الفئران.

Protocol

تم تنفيذ جميع إجراءات رعاية الحيوانات والإجراءات التجريبية وفقا لدليل الجماعة الأوروبية لرعاية الحيوانات واستخدامها (2010/63 / UE). تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6JBomTac ، التي تتراوح أعمارها بين 10 أسابيع ، وذكور فئران Sprague Dawley ، التي تتراوح أعمارها بين 10 أسابيع ، لإثبات هذا البروتوكول.

1. تحضير السائل الخلالي الاصطناعي

  1. تحضير السائل الخلالي الاصطناعي (SIF) وفقا للوصفة التالية: 108 مليمتر كلوريد الصوديوم، 3.48 مليمتر KCl، 3.50 مليمتر MgSO 4، 26 مليمتر NaHCO3، 11.70 مليمتر هيدروكسيد الصوديوم 2 PO4، 1.50 مليمتر كلوريد الكربون2، 9.60 مليمول Na-gluconate، 5.50 مليمول الجلوكوز و7.60 مليمتر سكروز (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن أن يختلف SIF اعتمادا على هدف التحفيز ، على سبيل المثال ، يمكن استخدام محلول خال من الكالسيوم عند دراسة قنوات الكالسيوم.
  2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 وثبت الرقم الهيدروجيني عن طريق غاز الكاربوجين (5٪ CO 2 و 95٪ O2)46.

2. القتل الرحيم

  1. تخدير الفئران والجرذان البالغة بمزيج من 70٪ CO 2 و 30٪ O2. قطع رأس الفئران باستخدام زوج من المقصات والجرذان باستخدام المقصلة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: استخدم سلالة وعمرا يناسب هدف البحث. يمكن استخدام كل من الذكور والإناث في هذا النموذج.
  2. افصل الرأس عن الجسم عند مستوى C3-C4 من الحبل الشوكي.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء القتل الرحيم بحقن بنتوباربيتال داخل الصفاق (100-150 مجم / كجم).

3. تشريح

  1. تحضير أنسجة الفئران باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بإزالة الجلد والعضلات حول الرأس والرقبة باستخدام مقص (الشكل 1 أ).
    2. استخدم أداة تشذيب العظام ومقصا لفصل الفكين السفليين عن الرأس (الشكل 1B-C).
    3. افتح الحبل الشوكي عن طريق إدخال أداة تشذيب العظام ذيليا في الجزء الظهري للفقرات وإزالة الجزء الظهري من الفقرات لكشف الحبل الشوكي وجذع الدماغ (الشكل 1 د).
    4. قطع الجزء الذيلي من الجمجمة من حدود العظام القذالية وعظام ما بين الجدري لإزالة هذه الهياكل العظمية التي تكشف المخيخ (الشكل 1E).
      ملاحظة: من المهم عدم إتلاف جذع الدماغ والحبل الشوكي أثناء قطع الفقرات وإزالتها.
    5. اعزل TNC (Sp5C) الذي يعمل ذيليا حوالي 13-16 مم من البريغما على كل جانب عن طريق قطع الجزء الظهري الجانبي من جذع الدماغ بمقص زنبركي. اغمر الجانب الأيسر والأيمن TNC في SIF (الشكل 1E-I).
      ملاحظة: الوصف يتوافق مع الفئران البالغة.
    6. قطع الرأس في منتصف السهمي لتقسيم الجمجمة إلى قسمين باستخدام منشار (الشكل 1J-L).
    7. قم بإزالة الدماغ بعناية دون لمس الأم الجافية المتصلة بالجمجمة باستخدام ملعقة وقطع العصب الثلاثي التوائم حيث يدخل جذع الدماغ (الشكل 1M-P).
    8. لعزل TG ، قم بقصه ، بما في ذلك فروعه حول الحدود المرئية. قطع فرع الفك السفلي حيث يدخل الثقبة البيضاوية. قطع فروع العيون والفك العلوي التي تدخل الجمجمة لأنها غير مقسمة بشكل مجهري. أثناء تشريح TG ، قم بإزالة الأم الجافية التي تغطي TG (الشكل 1Q-T).
    9. اغمر نصفي الجمجمة و TGs في SIF.
  2. قم بإعداد مناديل الماوس باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بإزالة الجلد والعضلات حول الرأس والرقبة باستخدام مقص صغير (الشكل 2 أ - ب).
    2. افتح الحبل الشوكي عن طريق إدخال مقص صغير ذيليا في الجزء الظهري للفقرات وإزالة الجزء الظهري من الفقرات لكشف الحبل الشوكي وجذع الدماغ (الشكل 2 ج).
      ملاحظة: من المهم عدم إتلاف الحبل الشوكي أثناء قطع وإزالة الفقرات.
    3. قطع الجمجمة من حدود العظام القذالية والقذالية لإزالة هذه الهياكل العظمية التي تعرض المخيخ (الشكل 2D-F).
    4. بعد ذلك ، قم بقطع العظم الجداري في منتصف السهمي وإزالة العظم لفضح المخ (الشكل 2G-I).
    5. قم بإزالة المخيخ بعناية باستخدام ملعقة لكشف جذع الدماغ (الشكل 2J).
    6. اعزل الجزء المحتوي على TNC من جذع الدماغ باستخدام مقص زنبركي (الشكل 2K-N). اغمر جذع الدماغ مع TNC في SIF (الشكل 2O).
    7. إزالة الدماغ وقطع العصب الثلاثي التوائم حيث يدخل جذع الدماغ (الشكل 2P-Q).
    8. لعزل TG ، قم بقصه ، بما في ذلك فروعه حول الحدود المرئية. قطع فرع الفك السفلي حيث يدخل الثقبة البيضاوية. قطع فروع العيون والفك العلوي التي تدخل الجمجمة لأنها غير مقسمة بشكل مجهري. أثناء تشريح TG ، قم بإزالة الأم الجافية التي تغطي TG (الشكل 2R-S).
    9. اغمر TGs في SIF (الشكل 2T).

4. الغسيل

  1. اغسل أنصاف الجمجمة والشركات عبر الوطنية و TGs في SIF لمدة 30 دقيقة أثناء استبدال SIF كل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ خطوات الغسيل مع الاحتفاظ بالأنسجة في عبوات بلاستيكية بغطاء من التول لتمكين التبادل السهل SIF (الشكل 3 أ - ب).
  2. تحضير أنسجة الفئران باتباع الخطوات أدناه.
    1. نقل أنصاف TNC لفصل أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع 350 ميكرولتر من SIF (الشكل 3C).
    2. انقل TGs إلى أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة - TG واحد لكل غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق مع 350 ميكرولتر من SIF (الشكل 3C).
    3. ضع نصفي الجمجمة على منصات مصنوعة من الطين أو صفيحة استزراع من 6 آبار واملأ الجمجمة ب 400 ميكرولتر من SIF (الشكل 3C).
  3. قم بإعداد مناديل الماوس باتباع الخطوات أدناه.
    1. انقل جذع الدماغ باستخدام TNC إلى غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق مع 250 ميكرولتر من SIF (الشكل 3D).
    2. انقل TGs إلى غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق مع 250 ميكرولتر من SIF (الشكل 3D).
      ملاحظة: ضع اثنين من TGs لكل غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق عند استخدام الأنسجة من الفئران.
  4. ضع جماجم الفئران وأغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع أنسجة الفئران والفئران في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية. استبدل SIF باستخدام ماصة كل 5 دقائق لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: من المهم عدم لمس المنديل عند إضافة وإزالة SIF.

5. اختبار المخدرات

  1. تحديد مستويات إطلاق CGRP القاعدية.
    1. بعد الغسيل الأخير ، أضف 250 ميكرولتر من SIF إلى الماوس TG و TNC. أضف 350 ميكرولتر إلى الجرذ TG و TNC و 400 ميكرولتر إلى كل جمجمة فئران.
    2. بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x EIA (متوفر مع مجموعة المقايسة المناعية لإنزيم CGRP ، انظر جدول المواد) للسماح بقياس إطلاق CGRP القاعدي (الخطوة 6). تخلص من السائل المتبقي.
      ملاحظة: يجب أن يكون وقت الحضانة هو نفسه لجميع العينات.
    3. على الفور ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
    4. بعد أخذ عينات من مستويات إطلاق CGRP القاعدية ، اتبع إحدى الطرق الثلاث: (أ) التحفيز الفردي (الخطوة 5.2) ؛ (ب) تحفيز التركيز والاستجابة (الخطوة 5-3)؛ (ج) تثبيط التحفيز (الخطوة 4.5) (الشكل 4).
      ملاحظة: يعتمد مركب الاختبار والتركيزات المستخدمة على هدف الدراسة.
  2. قم بإجراء تحفيز فردي باتباع الخطوات أدناه.
    1. أضف مركب اختبار أو مركبة إلى الأنسجة واتركها لمدة 10 دقائق (الحجم: 250 ميكرولتر للفأر TG و TNC ، و 350 ميكرولتر للفئران TG و TNC ، و 400 ميكرولتر لكل جمجمة فئران).
    2. بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق مع 50 ميكرولتر من 10x EIA عازلة. تخلص من السائل المتبقي وقم بتخزين العينات على الفور عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب أن يكون وقت الحضانة هو نفسه لجميع العينات.
  3. قم بإجراء تحفيز التركيز والاستجابة باتباع الخطوات أدناه.
    1. تمييع مركب الاختبار أو السيارة إلى التركيزات المطلوبة. أضف مركب الاختبار بتركيزات متزايدة بدءا من أقل تركيز.
      ملاحظة: يعتمد مركب الاختبار والتركيزات المستخدمة على هدف الدراسة. على سبيل المثال ، تم استخدام 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر سوبر سينامالدهيد في هذه الدراسة.
    2. أضف أقل تركيز (1 ميكرومتر للدراسة الحالية) لمركب الاختبار والمركبة المقابلة لمستحضرين متماثلين للأنسجة واحتضان لمدة 10 دقائق (الحجم: 250 ميكرولتر لأنسجة الفأر ، و 350 ميكرولتر للفئران TG و TNC ، و 400 ميكرولتر لكل جمجمة فئران).
    3. بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق مع 50 ميكرولتر من 10x EIA عازلة.
    4. تخلص من السائل المتبقي وأضف ثاني أقل تركيز (10 ميكرومتر للدراسة الحالية) إلى الأنسجة.
    5. على الفور ، قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
    6. كرر هذا الإجراء مع التركيزات المتبقية (100 ميكرومتر للدراسة الحالية).
  4. أداء تثبيط التحفيز باتباع الخطوات أدناه.
    1. أضف مانع أو مركبة إلى الأنسجة واحتضانها لمدة 10 دقائق (الحجم: 250 ميكرولتر لأنسجة الفأر ، 350 ميكرولتر للفئران TG و TNC ، و 400 ميكرولتر لكل جمجمة فئران).
      ملاحظة: يعتمد مانع وتركيز المستخدم على الهدف من الدراسة. على سبيل المثال ، تم استخدام 3 μM glibenclamide للنتيجة التمثيلية في الشكل 5.
    2. بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع عينة 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مع 50 ميكرولتر من 10x EIA عازلة. تخلص من السائل المتبقي وقم بتخزين العينات على الفور عند -20 درجة مئوية.
    3. أضف الناهض أو الناهض + مانع (انظر جدول المواد) إلى الأنسجة واحتضانه لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يعتمد الناهض والمانع والتركيزات المستخدمة على هدف الدراسة. في الدراسة الحالية ، تم استخدام 3 ميكرومتر من غليبينكلاميد و 1 ميكرومتر من كبخاخات ، الشكل 5.
    4. بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع عينة 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مع 50 ميكرولتر من 10x EIA عازلة. تخلص من السائل المتبقي وقم بتخزين العينات على الفور عند -20 درجة مئوية.
  5. قم بإجراء تحكم إيجابي للتجربة.
    1. عند الاقتضاء ، أضف عنصر تحكم إيجابي (على سبيل المثال ، 1-10 ميكرومتر من كبخاخات ، انظر جدول المواد) إلى الأنسجة في نهاية البروتوكول وجمع عينة 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مع 50 ميكرولتر من 10x EIA عازلة بعد فترة حضانة مدتها 10 دقائق.
      ملاحظة: من المفيد تضمين عنصر تحكم إيجابي لضمان عمل الإعداد والأنسجة. كبخاخات48،49،50 أو محفز إزالة الاستقطاب من البوتاسيوم (40-60 mM من KCl) 46،47،49 تستخدم بشكل روتيني للتسبب في إطلاق CGRP من نظام الأوعية الدموية الثلاثية. يتم تحضير 40-60 mM من KCl SIF ك SIF ، باستثناء استبدال كلوريد الصوديوم ب KCl على أساس متساوي المول.

6. تحليل تركيزات CGRP

  1. قم بقياس كمية CGRP التي تم إطلاقها باستخدام مجموعة المقايسة المناعية للإنزيم (EIA) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 410 نانومتر باستخدام مقياس ضوئي للوحة. إذا تم استخدام مجموعة CGRP EIA مختلفة ، فقم بقياس الكثافة الضوئية عند الطول الموجي المنصوص عليه في بروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يجب تخفيف العينات لتتناسب مع المنحنى القياسي.
  3. إجراء تحليل البيانات.
    1. قدم البيانات إما كتركيزات مطلقة أو تطبيع إلى إطلاق CGRP القاعدي من الأنسجة المحددة.

Representative Results

هذه التقنية هي أداة للتحقيق في الآليات الجزيئية المرتبطة ب CGRP المشاركة في الصداع النصفي. لديها ميزة تقييم إطلاق CGRP من مستويات مختلفة من نظام الأوعية الدموية الثلاثية ويمكن تطبيقها على كل من الفئران والجرذان من النوع البري والمعدلة وراثيا بالاشتراك مع المركبات الدوائية المختلفة. هنا ، يتم تقديم تجارب الاستجابة للتركيز والحجب من الفئران ونتائج استجابة التركيز من الفئران البرية والمعدلة وراثيا.

تم استخدام طريقة إطلاق CGRP لدراسة تأثير مثبط قناة KATP غليبينكلاميد على إطلاق CGRP من TG والأم الجافية في إناث الفئران الخيفية ثلاثية التوائم العفوية (STA). أولا ، تم العثور على التركيز الأمثل للكابسيسين باستخدام تصميم دراسة التركيز والاستجابة. تسبب التعرض للكبخاخات في إطلاق CGRP كبير من الأم الجافية و TG مقارنة بالسيارة (الشكل 5). في الأم الجافية ، تم العثور على الحد الأقصى لإطلاق CGRP عند 1 ميكرومتر من كبخاخات ، وفي TG ، تم العثور على الحد الأقصى لإطلاق CGRP عند 10 ميكرومتر من كبخاخات (الشكل 5A-B). بناء على تجارب التركيز والاستجابة ، تم استخدام 1 ميكرومتر من كبخاخات و 3 ميكرومتر من غليبينكلاميد لحجب التجارب. لم يظهر Glibenclamide أي تأثير على إطلاق CGRP القاعدي من الأم الجافية (P = 0.441) و TG (P = 0.881) عند تحليله باستخدام ANOVA51 أحادي الاتجاه. قلل Glibenclamide بشكل كبير من إطلاق CGRP الناجم عن الكابسيسين في الأم الجافية بنسبة 40٪ (P = 0.031) و TG بنسبة 39٪ (P = 0.003) مقارنة بالكابسيسين مع السيارة عند تحليلها باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (الشكل 5C-D)51.

في الفئران ، تم استخدام البروتوكول لفحص تورط قناة أيون الأنكيرين 1 (TRPA1) المحتملة للمستقبلات العابرة في نموذج فأر GTN للصداع النصفي ، حيث كان فرط الحساسية الناجم عن GTN يعتمد بشكل كامل على قنوات TRPA1. تم العثور على ناهض TRPA1 supercinnamaldehyde (SCA) لإطلاق CGRP بطريقة تعتمد على الجرعة من TG مع 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر من SCA ، مما أدى إلى زيادة 9٪ (P = 0.23) و 51٪ (P = 0.011) و 69٪ (P = 0.0097) من CGRP مقارنة بالمركبة ، على التوالي عند تحليلها باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. كان هذا الإطلاق غائبا في TG من الفئران الفارغة Trpa1 حيث أدى التعرض ل 1 μM و 10 μM و 100 μM من SCA إلى 11٪ (P > 0.99) و -13٪ (P > 0.99) و 9٪ (P = 0.97) في المائة في إطلاق CGRP مقارنة بالمركبة ، على التوالي عند تحليلها باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. يظهر التحفيز اللاحق باستخدام 10 ميكرومتر من الكابسيسين (التحكم الإيجابي) أن جميع عينات الأنسجة يمكن أن تطلق CGRP (الشكل 6)50.

Figure 1
الشكل 1: تشريح الأنسجة خطوة بخطوة من الفئران. يتم توفير تفاصيل (A-T) في قسم البروتوكول (الخطوة 3.1). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تشريح الأنسجة خطوة بخطوة من الفئران. يتم توفير تفاصيل (A-T) في قسم البروتوكول (الخطوة 3.2). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: غسل وحضانة أنسجة القوارض. (أ-ب) الأنسجة المعزولة حديثا في عبوات بلاستيكية مع SIF. الحاويات مغطاة بالتول لتمكين التغيير السهل ل SIF. (ج) أنسجة الفئران - نصفان من الجمجمة مع الأم الجافية التي تغطي البطانات الداخلية للجمجمة الموضوعة على صفيحة مزرعة مكونة من 6 آبار. النواة الذيلية مثلث التوائم اليمنى واليسرى في أغطية أنبوب الطرد المركزي الدقيق المنفصلة (الصف العلوي من الأغطية). العقدتان الثلاثية التوائم في أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية (الصف السفلي من الأغطية). (د) نسيج الفأر - الجزء الذي يحتوي على نواة مثلث التوائم الذيلية من جذع الدماغ في غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل (أعلى). توجد عقدتان من مثلثات التوائم للفأر في غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق واحد (أسفل). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: دراسة التصاميم لإطلاق CGRP. ثلاثة بروتوكولات مختلفة لإجراء تجارب إطلاق CGRP. يجب تخفيف الأدوية في السائل الخلالي الاصطناعي (SIF). أ: التحفيز الفردي. ب: تحفيز التركيز والاستجابة. ج: تثبيط التحفيز. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: يثبط غليبينكلاميد إطلاق CGRP الناجم عن الكابسيسين من الأم الجافية للفئران والعقدة ثلاثية التوائم. تم قياس مستويات CGRP من العقدة ثلاثية التوائم والأم الجافية المعزولة من إناث الفئران الخيفية ثلاثية التوائم العفوية (STA) (215-318 جم) التي تم الحصول عليها في الأصل من جامعة توماس جيفرسون52 باستخدام مجموعات CGRP EIA البشرية التجارية. (أ-ب) إطلاق CGRP من (A) الأم الجافية و (B) العقدة ثلاثية التوائم بعد زيادة تركيزات الكابسيسين (10 نانومتر ، 100 نانومتر ، 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر) (ن = 4). يتم تقديم البيانات كنقاط فردية وتم تحليلها باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. p < 0.0001 (C-D) مستويات CGRP المنبعثة من (C) الأم الجافية و (D) العقدة ثلاثية التوائم بعد التعرض لمدة 10 دقائق للمركبة ، 3 ميكرومتر غليبينكلاميد (جليب) ، 1 ميكرومتر كبخاخات و 1 ميكرومتر كبخاخات + 3 ميكرومتر جليب (ن = 6-11). يتم تقديم البيانات كنقاط فردية وقيم متوسطة وتم تحليلها باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. *مقارنة بالسيارة. #كبخاخات مقارنة مع كبخاخات + جليب. # P < 0.05 ، ** و # # P < 0.01 ، ****P < 0.0001. تمت متابعة التحليلات مع اختبار المقارنة المتعددة لبونفيروني. تم استخدام مستوى كبير من α = 0.05 لجميع الاختبارات. تم تعديل هذا الرقم من كريستنسن وآخرون. 51. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: يؤدي التعرض ل SCA إلى إطلاق CGRP المعتمد على TRPA1 من العقدة ثلاثية التوائم للفأر. تم قياس مستويات CGRP المنبعثة من العقدة ثلاثية التوائم المعزولة من WT و Trpa1 null (Trpa1tm1 / Dpc) 53 من ذكور الفئران (8-10 أسابيع) باستخدام مجموعات CGRP EIA للفئران بعد التعرض ل supercinnamaldehyde (SCA) عند 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر وكبخاخات عند 10 ميكرومتر كعنصر تحكم إيجابي (ن = 6). يتم تقديم البيانات من كل ماوس كنقاط فردية ، وتشير الأشرطة إلى القيم المتوسطة. الإحصاءات: أجريت مقارنة بين SCA والمركبة عند كل تركيز وبين التحكم القاعدي والإيجابي باستخدام ANOVA المتكرر ثنائي الاتجاه. مستوى كبير من α = 0.05. * P < 0.05 ، ** P < 0.01. تم تعديل هذا الرقم من كريستنسن وآخرون. 50. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم تطوير الطريقة الموصوفة بعد دراسات تظهر أهمية CGRP في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي. إنه مناسب تماما للتحقيق في الآليات التي ينطوي عليها إطلاق CGRP من نظام الأوعية الدموية الثلاثية التوائم ، وهو أمر بالغ الأهمية لإشارات الألم في منطقة الرأس. تقيس كمية CGRP التي تم الحصول عليها في هذا النموذج بشكل مباشر إطلاق CGRP من الأعصاب ثلاثية التوائم التي تعصب الأم الجافية و TG و TNC. كمية إطلاق CGRP أكبر كميا 45,54 من الإطلاق المقاس في البلازما بعد التخثير الحراري في البشر ، والتحفيز الثلاثي التوائم في القط39،55،56 ، وأثناء نوبات الصداع النصفي23. يمكن أن يكون أحد التفسيرات هو أن CGRP مخفف ويتحلل في الدم54. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن التحفيز المباشر بالمواد الكيميائية قد يكون أفضل من التنشيط الفيزيولوجي المرضي. المزايا الأخرى هي أنه من الممكن تحديد موقع الإطلاق من ثلاثة مواقع مختلفة داخل نظام الأوعية الدموية الثلاثية وأنه يمكن استخدامه مع التلاعب الدوائي وفي الأنسجة من القوارض المعدلة وراثيا.

في الآونة الأخيرة ، تركز العديد من نماذج القوارض قبل السريرية على الإدارة الجهازية للمواد والألم اللاحق أو القراءات المرتبطة بالصداع النصفي باستخدام اختبار فون فراي57،58 ، التجهم59،60،61 أو النفور من الضوء 62،63،64. هذه الطرق مفيدة في فهم الخصائص المسببة للألم وتخفيف الألم للمواد المختلفة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لا تعطي أي معلومات عن الأنسجة المستهدفة المحددة المعنية. في الطريقة الحالية ، ينقسم نظام الأوعية الدموية الثلاثية إلى ثلاثة هياكل: الأم الجافية ، TG ، و TNC. وهذا يتيح التعرض المحلي لكل هيكل وتقييم موقع عمل مادة معينة. تم استخدام هذا في دراسة من عام 2011 ، حيث تم استكشاف دور قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي في الفئران ، ووجد أن تثبيط هذه القنوات مختلف في الهياكل الثلاثة للمسار الوعائي الثلاثي التوائم47. عند تشريح هياكل الجهاز العصبي ، لا مفر من بضع الأكسب. لقد ثبت أن Axotomy يغير نسخ الجينات المختلفة65. هذه التغييرات في النسخ بطيئة جدا بحيث لا تؤثر على نتائج هذه الطريقة ، ولكن لا يمكن استبعاد التغييرات في الفسفرة عند مقارنتها بالمواقف في الجسم الحي 46. على الرغم من أن الببتيدات العصبية مثل CGRP تتشكل في سوما الخلية ، إلا أن إطلاق وعمل الببتيدات العصبية عادة ما يكون في المحطات العصبية المركزية أو الطرفية. وبالتالي ، فإن دراسات الخلايا العصبية السليمة ، بما في ذلك المحطات ، مثيرة للاهتمام عند دراسة إطلاق الببتيد العصبي. لذلك ، تم إنشاء طرق لدراسة ثقافات الخلايا العصبية من العقد المعزولة لتكون بمثابة نموذج للمحطات. ومع ذلك ، فإن مزارع الخلايا العصبية تخضع للعديد من المشكلات لأن التفكك الميكانيكي يمكن أن يدمر الخلايا العصبية في الثقافة46. الإطار الزمني الأطول المرتبط بزراعة الخلايا يترك هذه الطريقة حساسة للتغيرات النسخية بسبب بضع الفغر وظروف الثقافة65. علاوة على ذلك ، أدت إضافة عوامل النمو والزراعة على الطلاءات السطحية إلى تغيير الخصائص العصبية كتعبير عن المرسل والمستقبل66،67،68،69. يتم تجنب هذه المشاكل عند دراسة العقد السليمة المعزولة حديثا بدلا من مزارع الخلايا العصبية.

يتمثل أحد التحديات في طريقة إطلاق CGRP خارج الجسم الحي في التشريح الدقيق للأنسجة المطلوبة للحصول على نتائج قابلة للتكرار. يمثل التشريح الدقيق بشكل خاص للشركات عبر الوطنية تحديا لأن هذا هيكل داخل جذع الدماغ بدون حدود مرئية. علاوة على ذلك ، فإن الأم الجافية هشة ، ويجب إجراء إزالة الدماغ بعناية لضمان بنية سليمة. يمكن أن تؤدي هذه العقبات إلى اختلاف حجم الأنسجة ، وبالتالي ، مستويات CGRP القاعدية والتحفيزية. ومع ذلك ، يمكن تفسير هذا الاختلاف عن طريق التطبيع إلى إصدار CGRP القاعدي. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه عند عزل TNC عن الفئران ، يتم عزل الجزء السفلي بأكمله من جذع الدماغ وليس الجزء الأكثر تحديدا المحتوي على TNC كما يحدث في الفئران. بشكل عام ، يمكن أن يكون من المفيد استخدام أنسجة الفئران ، لأن هذا يسمح بقياس إطلاق CGRP من الأم الجافية وتشريح أكثر دقة لل TNC. وعلاوة على ذلك، فإن حجم النسيج يمكن أيضا من استخدام الجرذ كعنصر تحكم في مركبته، حيث ينتج عن فأر واحد نصفين من الجمجمة، واثنين من TGs، واثنين من الشركات عبر الوطنية حيث يتم استخدام قطعة واحدة من الأنسجة لتحفيز المواد والأخرى للمركبة. عند استخدام الفئران ، هناك حاجة إلى حيوانين لتجربة واحدة حيث يتم تجميع كل من TGs في عينة واحدة ، ويتم تشريح الشركات عبر الوطنية كجذع دماغ واحد. لذلك ، يتم استخدام اثنين من TGs وجذع دماغ واحد لتحفيز المواد ، ويتم استخدام اثنين من TGs وجذع دماغ واحد من فأر آخر للتحكم في السيارة. ينتج عن هذا استخدام ضعف عدد الفئران مقارنة بالفئران للحصول على نفس العدد من النسخ المتماثلة. لتقليل عدد الفئران المستخدمة ، تم اقتراح طريقة لقياس إطلاق CGRP من شرائح جذع الدماغ49. إنها ميزة أنه تم تعديل الطريقة لتمكين استخدام الفئران. وهذا يسمح باستخدام العديد من سلالات الفئران المعدلة وراثيا المتاحة بالفعل ، وهي أداة مفيدة للدراسة ، على سبيل المثال ، مسارات الإشارة. يجب تضمين عنصر تحكم إيجابي في نهاية التجربة للتأكد من أن الأنسجة المستخدمة في التجربة يمكنها إطلاق CGRP. يمكن أن يكون التحكم الإيجابي هو ناهض TRPV1 كبخاخات أو بوتاسيوم التحفيز المزيل للاستقطاب (KCl) ، والذي وجد أنه يطلق CGRP من نظام الأوعية الدموية الثلاثية في كل من الفئران والجرذان46،47،48،49،50. علاوة على ذلك ، تم تكييف الطريقة أيضا لقياس إطلاق الببتيدات الأخرى ذات الصلة مثل الببتيد المنشط للإنزيم النخامي (PACAP) - وهو ببتيد آخر ذو أهمية كبيرة في أبحاث الصداع النصفي70.

توفر هذه الطريقة أداة مفيدة للتحقيق في إطلاق CGRP من أنسجة مستهدفة محددة في الجرذان والفئران. إنها طريقة سريعة نسبيا تتجنب المشاكل المرتبطة بزراعة الخلايا العصبية. يمكن بسهولة تعديل بروتوكول الطريقة لدراسة علاقة التركيز والاستجابة أو تثبيط الاستجابة بواسطة المركبات الدوائية المختلفة. طريقة إطلاق CGRP خارج الجسم الحي هي واحدة من العديد من الطرق قبل السريرية المفيدة لدراسة دور CGRP والآليات الأخرى المتعلقة بإطلاق CGRP في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة Candys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well culture plate NUNC 140675
Calcium chloride dihydrate Merck 1.02382.1000 For SIF buffer
Caps for plastic containers ThermoFisher Scientific 536617
Capsaicin Merck M2028
CGRP kits AH Diagnostics A05482.96
CO2 Strandmøllen 4.6 For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer Fine Science Tools 16109-14
Glibenclamide Tocris 911
Glucose Merck G7021 For SIF buffer
Guillotine for rats Scandidact NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate Merck M5921 For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps VWR 700-5239
Mini Hacksaw BAHCO 208
O2 Strandmøllen 4.5 For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital Glostrup pharmacy NA Magistral formula
Plastic containers ThermoFisher Scientific 536455
Plate photometer - Infinite M200 Tecan NA Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan.
Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride Merck P9333 For SIF buffer
Scissor Allgaier Instruments 307-156-170
Small scissor Allgaier Instruments 04-520-115
Sodium bicarbonate Merck S6014 For SIF buffer
Sodium chloride Merck S9888 For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 1.06346.1000 For SIF buffer
Sodium gluconate Merck S2054 For SIF buffer
Spatula Bochem Lab Supply 3018
Spring scissor Fine Science Tools 15024-10
Sucrose Merck 84097 For SIF buffer
Supercinnamaldehyde Merck S3322
Tulle (fabrics) NA NA Bought in the local fabrics store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 183 ،
<em>إكس فيفو</em> إطلاق الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين من نظام الأوعية الدموية الثلاثية في القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., … More

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., Kristensen, D. M., Christensen, S. L. Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents. J. Vis. Exp. (183), e63723, doi:10.3791/63723 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter