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Developmental Biology

ड्रोसोफिला ओजेनेसिस के दौरान ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और बेसमेंट मेम्ब्रेन प्रोटीन के स्राव के कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63778
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

Summary

विकास के दौरान ऊतक और अंग आकृतिजनन के लिए तहखाने की झिल्ली आवश्यक है। इस संरचना के उचित प्लेसमेंट के लिए अग्रणी तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं में तहखाने झिल्ली प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर तस्करी और स्राव की कल्पना और लक्षण वर्णन करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

तहखाने झिल्ली (बीएम) - उपकला कोशिकाओं के बेसल पक्ष में मौजूद बाह्य मैट्रिक्स की एक विशेष शीट - उपकला ऊतक आकृति विज्ञान और अंग आकृति जनन की स्थापना और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएम ऊतक मॉडलिंग के लिए आवश्यक है, एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा करता है, और ऊतकों और अंगों को आकार देने के लिए बाहरी बल प्रदान करता है। सामान्य विकास और रोग स्थितियों के दौरान बीएम द्वारा निभाई जाने वाली कई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के बावजूद, बीएम युक्त पुटिकाओं के इंट्रासेल्युलर तस्करी को नियंत्रित करने वाले जैविक मार्ग और बेसल स्राव बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत जमाव की ओर कैसे जाता है, खराब समझा जाता है। ड्रोसोफिला अंडाशय का कूपिक उपकला बीएम झिल्ली प्रोटीन के बेसल जमाव का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है, क्योंकि यह बीएम के सभी प्रमुख घटकों का उत्पादन और स्राव करता है निश्चित ऊतकों में छवि प्रसंस्करण के साथ संयुक्त कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग विशेष रूप से बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और जमाव में शामिल सेलुलर कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। यह लेख धुंधला और इमेजिंग बीएम युक्त पुटिकाओं के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और ड्रोसोफिला अंडाशय के कूपिक उपकला में अंतर्जात टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करके बीएम जमा करता है। इस प्रोटोकॉल को गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों प्रश्नों को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है और इसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को समायोजित करने के लिए विकसित किया गया था, जिससे ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और उपकला ऊतक विकास के दौरान पुटिकाओं के स्राव में शामिल कारकों की तेजी से और कुशल पहचान की अनुमति मिलती है।

Introduction

तहखाने झिल्ली (बीएम) स्तरित सेल-अनुयायी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की एक पतली शीट है जो उपकला संरचना और मॉर्फोजेनेसिस1 के लिए महत्वपूर्ण है। इसमें ~ 50 प्रोटीन शामिल हैं और उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाओं को सर्वव्यापी रूप से अंतर्निहित पाया जाता है, और कंकाल, चिकनी और हृदय की मांसपेशियों की कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स 1,2,3 को शामिल करता है। उपकला कोशिकाओं के बेसल पक्ष पर बीएम के तीन मुख्य घटक कोलेजन चतुर्थ, पेर्लेकन और लैमिनिन हैं। बीएम उपकला कोशिकाओं को रेखांकित करता है और ऊतक पृथक्करण और बाधा, विकास और समर्थन, और सेल ध्रुवीकरण 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 सहित कई कार्यों के लिए जिम्मेदार है . सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में इसकी भूमिका 3,13,14 के विकास के दौरान उपकला कोशिकाओं और ऊतकों की आकृति विज्ञान और भेदभाव को नियंत्रित करती है। इसके अलावा, बीएम का गलत विनियमन और / या इसकी अखंडता में उल्लंघन ट्यूमर मेटास्टेसिस 2,15,16 सहित कई रोग स्थितियों के प्राथमिक कारण हैं। ऊतक और अंग मॉर्फोजेनेसिस के दौरान बीएम द्वारा किए गए आवश्यक कार्यों के बावजूद, ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और बीएम प्रोटीन के स्राव के लिए समर्पित जैविक मार्ग (ओं) के घटक अस्पष्ट रूप से ज्ञात हैं।

बीएम युक्त पुटिकाओं के इंट्रासेल्युलर तस्करी और उपकला कोशिकाओं द्वारा बीएम प्रोटीन के स्राव का अध्ययन करने के लिए, ड्रोसोफिला अंडाशय का कूपिक उपकला (एफई) एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली (चित्रा 1) है। एक ड्रोसोफिला अंडाशय में 16-20 लंबी, ट्यूब जैसी संरचनाएं होती हैं, जिन्हें अंडाशय (चित्रा 1 ए, बी) 17,18,19 कहा जाता है। प्रत्येक अंडाशय को अंडे की असेंबली लाइन के रूप में सोचा जा सकता है, अंडे के कक्षों की उम्र की प्रगति के साथ (जो प्रत्येक एक अंडे को जन्म देता है) जो पूर्वकाल के अंत में शुरू होता है और पीछे की ओर बढ़ता है, जब तक कि परिपक्व अंडा डिंबवाहिनी के माध्यम से बाहर नहीं निकलता। प्रत्येक अंडे के कक्ष को एफई द्वारा समझाया जाता है, जो दैहिक कूप कोशिकाओं (एफसी) का एक मोनोलेयर है, जो केंद्रीय जर्मलाइन कोशिकाओं (जीसी) को घेरता है। एफई को एक अलग एपिकल-बेसल ध्रुवीयता के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत किया जाता है जहां एपिकल डोमेन जर्मलाइन का सामना करता है, और बीएम प्रोटीन बेसली18,19 स्रावित होते हैं। एफसी सक्रिय रूप से बीएम के सभी प्रमुख घटकों का स्राव करते हैं, जिसमें कोलेजन चतुर्थ, पेर्लेकन और लैमिनिन20,21 शामिल हैं। एफसी जैसे उपकला कोशिकाओं में, बीएम घटकों का उत्पादन किया जाता है और बाह्य रूप से उनके जमाव के लिए एक विशेष ध्रुवीकृत स्राव मार्ग की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, बीएम, कोलेजन चतुर्थ (कॉल चतुर्थ) के सबसे प्रचुर मात्रा में घटक के मामले में, इसके ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और स्राव के आसपास के विवरण इसके उत्पादन और जमाव के बावजूद अस्पष्ट हैं जो कई अध्ययनों का ध्यान केंद्रित करते हैं। कोल चतुर्थ का अनुवाद एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में किया गया है, जहां प्रत्येक फाइब्रिल - तीन पॉलीपेप्टाइड्स (दो α1 श्रृंखला और एक α2 श्रृंखला) से बना है - एक ट्रिपल हेलिक्स22 में इकट्ठा किया जाता है। उचित कोल चतुर्थ तह और फ़ंक्शन के लिए ईआर चैपरोन और एंजाइमों की आवश्यकता होती है, जिसमें लाइसिल और प्रोलिल-हाइड्रॉक्सिलेज जैसे प्लोड और पीएच 4αईएफबी 20,22,23,24,25,26 शामिल हैं। ये पोस्टट्रांसलेशनल एंजाइम कोल चतुर्थ के ईआर सॉर्टिंग को विनियमित करते हैं, क्योंकि प्रत्येक के नुकसान से कोल चतुर्थ बेसल ईआर 20,23,24,25,26 में फंस जाता है। फिर, नव संश्लेषित कोल चतुर्थ सीओपीआईआई-लेपित पुटिकाओं में गोल्गी के लिए ईआर से बाहर निकलता है। कार्गो रिसेप्टर टैंगो 1 कोलेजन को बड़े गोल्गी-बाध्य पुटिकाओं में पैकेजिंग में सहायता करता है जो बड़े मल्टीमेरिक प्रोटीन20,27 को समायोजित कर सकता है। एक बार कोल चतुर्थ को इंट्रासेल्युलर एक्सोसाइटिक पुटिकाओं में पैक किया जाता है, तो यह विशेष रूप से उपकला कोशिकाओं से बेसली स्रावित होता है। बेसल पक्ष में बीएम जमाव को निर्देशित करने के लिए, उपकला कोशिकाओं को विशेष रूप से ध्रुवीकृत बीएम स्राव के लिए समर्पित कारकों के एक और सेट की आवश्यकता होती है। ड्रोसोफिला अंडाशय के एफई का उपयोग करते हुए, इस उपन्यास सेलुलर प्रक्रिया के कुछ घटकों की विशेषता है, जिसमें न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर (जीईएफ) क्रैग और स्ट्रेटम, जीटीपीस रब 8 और रब 10, साथ ही फॉस्फोइनोसाइटाइड पीआई (4,5) पी 2, और किनेसिन 1 और 3 मोटर प्रोटीन 20,28,29,30,31 के स्तर शामिल हैं। . बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत वितरण को सुनिश्चित करने में ये घटक महत्वपूर्ण हैं।

एफई में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण की निगरानी के लिए, अंतर्जात रूप से टैग किए गए तहखाने झिल्ली प्रोटीन (प्रोटीन जाल), जैसे वाइकिंग-जीएफपी (वीकेजी-जीएफपी या α2 कोल चतुर्थ-जीएफपी) और पेर्लेकन-जीएफपी (पीसीएन-जीएफपी) का उपयोग32,33 किया जा सकता है। इन प्रोटीन ट्रैप लाइनों को बीएम प्रोटीन के अंतर्जात वितरण को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने और पुटिका तस्करी28,30 के अधिक संवेदनशील पता लगाने की अनुमति देने के लिए दिखाया गया है। एफई में बीएम के ध्रुवीकृत जमाव में शामिल घटकों को पहले वीकेजी-जीएफपी और पीसीएएन-जीएफपी20,28,29,30 के लिए प्रोटीन ट्रैप लाइनों का उपयोग करके विशेषता दी गई थी। प्रोटीन जाल का उपयोग विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में किया जा सकता है, जिसमें म्यूटेंट और गैल 4 लाइनें34 शामिल हैं। इसके अलावा, प्रोटीन जाल का उपयोग फ्लोरोसेंट रंगों और / या प्रतिदीप्ति इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संयोजन में किया जा सकता है, जिससे जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती स्थितियों की तुलना करते समय बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण के सटीक लक्षण वर्णन की अनुमति मिलती है।

बीएम प्रोटीन युक्त पुटिकाओं के वितरण और स्थानीयकरण का सटीक और कुशलतापूर्वक आकलन करने के लिए, कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीक अन्य इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करती है। ये दृष्टिकोण उपयोग की सापेक्ष आसानी के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को जोड़ते हैं। सीएलएसएम एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो गैल्वेनोमीटर का उपयोग करके रेखापुंज स्कैन तरीके से लेजर के साथ नमूने को स्कैन करके एक बेहतर ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती है। पिनहोल एपर्चर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का एक मुख्य घटक है। फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे से आने वाले आउट-ऑफ-फोकस सिग्नल को अवरुद्ध करके, पिनहोल एपर्चर के परिणामस्वरूप जेड-अक्ष 36 में अत्यधिक बेहतर रिज़ॉल्यूशनहोता है। यह जेड-प्लेन में छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करना भी संभव बनाता है, जिसे जेड-स्टैक कहा जाता है, जो ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला के अनुरूप है। जेड-स्टैक बाद में इमेजिंग सॉफ्टवेयर की सहायता से 3 डी पुनर्निर्माण के माध्यम से नमूने की 3 डी छवि बनाते हैं। कंफोकल माइक्रोस्कोप के विपरीत पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस (वाइडफील्ड) माइक्रोस्कोप, आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को छवि गुणवत्ता में योगदान करने, छवि रिज़ॉल्यूशन को कम करने और36,37 के विपरीत करने की अनुमति देते हैं। यह प्रोटीन स्थानीयकरण या कोलोकलाइजेशन का अध्ययन करते समय एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को कम आकर्षक उम्मीदवार बनाता है।

यद्यपि सीएलएसएम विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण है, जिसमें इमेजिंग और बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग के लक्षण वर्णन शामिल हैं, फिर भी यह एक मुद्दा प्रस्तुत करता है जब इमेजिंग नमूने प्रकाश की अब्बे की विवर्तन सीमा (200-250 एनएम) से नीचे होते हैं। ऐसे नमूनों की इमेजिंग करते समय, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, खासकर जब एक तेल उद्देश्य का उपयोग करते हैं, तो उच्च रिज़ॉल्यूशन हो सकता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सीमा को पार करती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी प्राप्त करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण हैं, प्रत्येक विशिष्ट रिज़ॉल्यूशन सीमा के साथ, और प्रत्येक विभिन्न विश्लेषणों के लिए उपयुक्त है। इन दृष्टिकोणों में फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम) या स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (एसटीईडी), संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), और एयरिस्कैन (सुपर-रिज़ॉल्यूशन) माइक्रोस्कोपी 38,39,40,41,42,43,44,45,46 शामिल हैं . हालांकि एयरिस्कैन में पाम / स्टॉर्म, एसटीईडी और सिम की तुलना में एक मोटा रिज़ॉल्यूशन है, फिर भी यह ~ 120 एनएम (सीएलएसएम के रिज़ॉल्यूशन से लगभग दोगुना) तक का रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, इस सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण को सिम और अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों पर लाभ दिखाया गया है जब कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात47,48 के साथ मोटे नमूने और नमूने इमेजिंग करते हैं।

एयरिस्कैन एक अपेक्षाकृत नई सुपर-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक46 है। पारंपरिक सीएलएसएम के विपरीत, जो आउट-ऑफ-फोकस लाइट को अस्वीकार करने के लिए पिनहोल और सिंगल पॉइंट डिटेक्टरों का उपयोग करते हैं, यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोण 32-चैनल गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फाइड (जीएएएसपी) फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब एरिया डिटेक्टर का उपयोग करता है जो हर स्कैन स्थिति45 पर सभी प्रकाश एकत्र करता है। 32 डिटेक्टरों में से प्रत्येक एक छोटे पिनहोल के रूप में काम करता है, जो पारंपरिक 1.0 एयरी यूनिट (एयू) से पिनहोल आकार को एक बढ़ाया 0.2 एयू तक कम करता है, जिससे 1.25 एयू व्यास45 की दक्षता बनाए रखते हुए, एक और भी उच्च रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-शोर अनुपात सक्षम होता है। इसके अलावा, एयरिस्कैन द्वारा उपयोग किए जाने वाले रैखिक विघटन के परिणामस्वरूप रिज़ॉल्यूशन45 में 2x की वृद्धि होती है। इसे ध्यान में रखते हुए, सीएलएसएम, और विशेष रूप से सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, बीएम प्रोटीन और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं जो बीएम प्रोटीन के बेसल जमाव को विनियमित करते हैं, क्योंकि वे स्थानीयकरण और कोलोकलाइजेशन अध्ययनों के लिए बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, जिससे इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले स्थानिक, लौकिक और आणविक घटनाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जिसका उपयोग स्थानीयकरण प्रयोगों को करने के लिए किया जा सकता है, वह छवि विघटन है। चूंकि वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी डिटेक्टरों तक पहुंचने के लिए आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश की अनुमति देता है, गणितीय और कम्प्यूटेशनल डिकॉन्वोल्यूशन एल्गोरिदम को वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त छवियों से आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को हटाने या पुन: असाइन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिससे छवि49 के रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट में सुधार होता है। विघटन एल्गोरिदम को रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट को और बढ़ाने के लिए कॉन्फोकल छवियों पर भी लागू किया जा सकता है, जिससे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी50 की तुलना में अंतिम छवियां उत्पन्न होती हैं। एयरिस्कैन शेपर्ड के पिक्सेल रीअसाइनमेंट के साथ वीनर फिल्टर-आधारित डिकंवोल्यूशन का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में, इस सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीक 45,51 का उपयोग करते समय सभी तीन स्थानिक आयामों (एक्स और वाई में 120 एनएम, और जेड में350 एनएम) में रिज़ॉल्यूशन में 2 एक्स की वृद्धि देखी जाती है।

यह पांडुलिपि कंफोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित मॉडल सिस्टम के रूप में ड्रोसोफिला अंडाशय के एफई का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और जमाव को दागने, प्राप्त करने और कल्पना करने के लिए विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करती है। अंतर्जात रूप से टैग किए गए तहखाने झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ड्रोसोफिला लाइनें, उदाहरण के लिए, वीकेजी-जीएफपी और पीसीएन-जीएफपी, बीएम प्रोटीन तस्करी और स्राव की कल्पना करने के लिए कुशल और सटीक उपकरण हैं। इसके अलावा, उन्हें विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसमें उत्परिवर्ती और गैल 4 / यद्यपि अंतर्जात रूप से टैग किए गए तहखाने झिल्ली प्रोटीन की सिफारिश की जाती है, विशिष्ट बीएम प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग भी वर्णित प्रोटोकॉल के साथ संगत है। ये प्रोटोकॉल उन वैज्ञानिकों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं जो इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उपयोग करके बरकरार उपकला ऊतक में बीएम प्रोटीन के स्राव का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं। इसके अलावा, ड्रोसोफिला आनुवंशिकी के विशाल उपकरणों के साथ उपकला ऊतक विश्लेषण को संयोजित करने की क्षमता इस दृष्टिकोण को विशेष रूप से शक्तिशाली बनाती है। अंत में, इन प्रोटोकॉल को आसानी से वेसिकुलर ट्रैफिकिंग और ब्याज के अन्य प्रोटीनों की छंटाई का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. अंडाशय विच्छेदन के लिए मक्खी तैयारी

  1. वांछित जीनोटाइप के 10-15 ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मादा मक्खियों (1-2 दिन पुराना) को एक संकीर्ण शीशी में रखें जिसमें ~ 8 एमएल ड्रोसोफिला फ्लाई मीडियम होता है जो 25 डिग्री सेल्सियस पर विच्छेदन से 2-3 दिन पहले दानेदार बेकर के खमीर की एक छोटी मात्रा के साथ छिड़का जाता है। शीशी में कुछ पुरुषों को जोड़ने से अंडे के कक्ष की उपज को बढ़ावा मिल सकता है। हालांकि, सुनिश्चित करें कि मक्खियों की कुल संख्या 20 से अधिक नहीं है क्योंकि यह अंडाशय के विकास को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है।
    नोट: ड्रोसोफिला पुरुषों और महिलाओं का विवरण, और पूर्व ड्रोसोफिला अनुभव के बिना वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी सुझाव और सलाह उद्धृत लेख34,52 में पाई जा सकती है। खमीर जोड़ने से अंडे के उत्पादन को उत्तेजित किया जाएगा और विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करने के साथ अंडाशय उत्पन्न होंगे। इसके अलावा, यह अंडाशय को मोटा कर देगा और उन्हें उत्पाद शुल्क देना आसान बना देगा। दानेदार खमीर के बजाय गीले खमीर का भी उपयोग किया जा सकता है, हालांकि, कमजोर स्टॉक के लिए, मक्खियां फंस सकती हैं और मर सकती हैं।

2. अंडाशय विच्छेदन और निर्धारण

नोट: अंडाशय विच्छेदन और धुंधला पर अतिरिक्त संसाधनों के लिए, पाठकों को उद्धृत प्रोटोकॉल 53,54,55 के लिए निर्देशित कर रहे हैं।

  1. विच्छेदन के दिन, 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पीएफए स्टॉक समाधान को पतला करके 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की अंतिम एकाग्रता के साथ ताजा निर्धारण समाधान तैयार करें।
  2. सीओ2 का उपयोग कर मक्खियों को संवेदनाहारी करें और उन्हें फ्लाई पैड पर रखें। विच्छेदन तक मक्खियों को संवेदनाहारी रखें। मक्खियों को ठीक से संवेदनाहारी पर विचार करें एक बार उनके आंदोलनों को बंद कर दिया जाता है, जो आमतौर पर 10-20 एस लेता है।
    नोट: हालांकि सीओ2 का उपयोग एक सुरक्षित और तेज विकल्प के रूप में अनुशंसित है, मक्खियों को बर्फ का उपयोग करके संवेदनाहारी किया जा सकता है।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत उथले अवसाद कुओं के साथ एक गिलास अवतल स्लाइड या धुंधला पकवान रखें और कुओं को 1x पीबीएस के साथ भरें।
  4. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर निचले वक्ष पर एक मादा मक्खी को पकड़ो। पेट के पीछे के छोर पर पुरुष जननांग की अनुपस्थिति और एक माध्यमिक विशेषता52 के रूप में उनके अग्रभागों पर सेक्स कंघी की अनुपस्थिति से मक्खियों के लिंग को सुनिश्चित करें। विच्छेदन व्यक्तिगत रूप से संदंश (चरण 2.5) की एक और जोड़ी का उपयोग कर मक्खियों विच्छेदन जबकि उन्हें विदारक माइक्रोस्कोप के तहत 1x पीबीएस से भरा कुओं में डूब (20x आवर्धन की सिफारिश की है)।
  5. विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते समय, मक्खी पेट के पीछे के हिस्से पर टग करने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें, जिससे आंतरिक अंग (जैसे, अंडाशय, आंत) दिखाई देते हैं।
  6. अंडाशय को पेट से बाहर निकालने के लिए धीरे-धीरे मक्खी पेट के पूर्वकाल भाग (टूथपेस्ट की एक ट्यूब के साथ) निचोड़ें। इस विधि से अंडाशय को अक्षुण्ण रखना चाहिए। अलग करें और ध्यान से अन्य अंगों को हटा दें और मलबे को उड़ाएं।
  7. संदंश या विदारक सुइयों का उपयोग करके, समग्र अंडाशय संरचना को बरकरार रखते हुए अंडाशय के अंडाशय को अलग करें। इस चरण का उद्देश्य अंडाशय को कवर करने वाली मांसपेशियों के म्यान को तोड़ना और अधिक कुशल और समरूप धुंधला होने की अनुमति देना है।
  8. जल्दी से अंडाशय को 1एक्स पीबीएस युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें जब तक कि सभी मक्खियों को विच्छेदित न किया जाए। ट्यूब को बर्फ पर न रखें यदि सूक्ष्मनलिकाएं या माइक्रोफिलामेंट्स (या इन साइटोस्केलेटल घटकों द्वारा तस्करी की गई पुटिकाओं) की कल्पना की जानी है क्योंकि इससे डिपोलिमराइजेशन हो सकता है।
  9. एक बार जब सभी अंडाशय विच्छेदित हो जाते हैं और एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित हो जाते हैं, तो उन्हें ट्यूब के नीचे डूबने की अनुमति दें और पीबीएस के ~ 50 μL को छोड़ दें। 4% पीएफए के 1 एमएल जोड़ें और 15 मिनट के लिए एक नुटिंग प्लेटफ़ॉर्म घुमाव पर रखें। महत्वपूर्ण बात यह है कि जांचें कि क्या अंडाशय उचित निर्धारण की अनुमति देने के लिए निर्धारण समाधान में आगे और पीछे जा रहे हैं क्योंकि अधूरा निर्धारण धुंधला और इमेजिंग मुद्दों को जन्म दे सकता है।
    नोट: नटेटर की गति महत्वपूर्ण नहीं है। जबकि कुछ नटेटर में गति नियंत्रण होता है, अन्य पूर्व निर्धारित गति के साथ आते हैं। प्रीसेट गति पर्याप्त है, और यदि समायोज्य है, तो 40-50 आरपीएम पर सेट करें।
  10. निर्धारण समाधान निकालें (चरण 2.9 के रूप में), और फिर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को धीरे-धीरे 5-6 बार उलटकर, 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 (1 एक्स पीबीएसटी) युक्त 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो त्वरित वॉश करें। फिर, 1 एक्स पीबीएसटी (40-60 मिनट कुल) के 1 एमएल के साथ चार 10-15 मिनट धोने (लंबे धोने) के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: धोने के लिए 1 एक्स पीबीएस + 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि डिटर्जेंट के प्रतिशत में वृद्धि के परिणामस्वरूप जीएफपी विकृतीकरण हो सकता है, जिससे प्रतिदीप्ति में कमी और जीएफपी-टैग किए गए बीएम प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है।
  11. डाई धुंधला के लिए, उदाहरण के लिए, डीएनए और एफ-एक्टिन धुंधला, चरण 3 पर आगे बढ़ें। इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, चरण 4 पर आगे बढ़ें। अंडाशय को आगे बढ़ने से पहले 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएसटी में संग्रहीत किया जा सकता है।

3. मानक डीएनए /एफ-एक्टिन धुंधला हो जाना

  1. निर्धारण और धोने के बाद, पीबीएसटी को हटा दें। डीएनए और एफ-एक्टिन धुंधला समाधान के 500 μL जोड़ें। डीएनए /एफ-एक्टिन समाधान तैयार करने के लिए, पीबीएसटी के 500 μL में होचस्ट (डीएनए दाग; 1:1000 कमजोर पड़ने 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान) और फ्लोरोफोर-टैग किए गए फालोइडिन (एफ-एक्टिन दाग; एलेक्सा फ्लोर 546 के लिए 1: 500 कमजोर पड़ने या एलेक्सा फ्लोर 647 के लिए 1: 100 कमजोर पड़ने, 66 μM स्टॉक समाधान में से प्रत्येक) मिलाएं।
  2. कुशल इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति बनाए रखने के लिए अंधेरे में अंडाशय और रंगों को रखने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें और 15 मिनट के लिए एक नुटिंग प्लेटफॉर्म घुमाव पर सेते हैं।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, डीएनए / एफ-एक्टिन समाधान (चरण 2.9 के रूप में) को हटा दें। चरण 2.10 में वर्णित 1x PBST में दो त्वरित धोने और तीन लंबे (10-15 मिनट) धोने प्रदर्शन करें। चरण 5 में वर्णित के रूप में बढ़ते करने के लिए आगे बढ़ें।

4. प्रतिदीप्ति इम्यूनोस्टेनिंग

नोट: यह फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए एक मानक इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल है और अधिकांश प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ संगत है।

  1. अवरुद्ध और प्राथमिक एंटीबॉडी इम्यूनोस्टेनिंग (दिन 1)
    1. निर्धारण और धोने के बाद, चरण 2.9 में वर्णित के रूप में पीबीएसटी को हटा दें। अवरुद्ध समाधान (पीबीएस + 5% बीएसए) के 1 एमएल जोड़ें और 1 घंटे न्यूनतम के लिए एक नुटिंग प्लेटफ़ॉर्म घुमाव पर अंडाशय को अवरुद्ध करें।
      नोट: बीएसए के अलावा, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) या सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) को अवरुद्ध समाधान में जोड़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, अंडाशय को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नुटिंग प्लेटफ़ॉर्म रॉकर पर रात भर अवरुद्ध किया जा सकता है।
    2. चरण 2.9 के रूप में अवरुद्ध समाधान निकालें और अवरुद्ध समाधान में उनके उपयुक्त सांद्रता (उपयोग किए गए एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट) पर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 300 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक नटिंग प्लेटफ़ॉर्म घुमाव पर रात भर सेते हैं। अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और माध्यमिक एंटीबॉडी इम्यूनोस्टेनिंग के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: कुछ प्राथमिक एंटीबॉडी को बचाया और पुन: उपयोग किया जा सकता है। कुछ उदाहरणों में, पुन: उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी पृष्ठभूमि धुंधला को कम कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बेहतर इमेजिंग होती है। हालांकि, दक्षता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए पुन: उपयोग का परीक्षण किया जाना चाहिए।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी इम्यूनोस्टेनिंग (दिन 2)
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटाने के बाद, चरण 2.10 के रूप में दो त्वरित वॉश और चार लंबे (10-15 मिनट) वॉश करें। ताजा 1x पीबीएसटी का उपयोग करके सावधानीपूर्वक दोहराए जाने वाले धोने से गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि कम हो जाएगी और इष्टतम इमेजिंग होगी।
    2. चरण 2.9 के रूप में पीबीएसटी निकालें और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 500 μL जोड़ें जो उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाएगा। प्रतिदीप्ति के इष्टतम संरक्षण के लिए इस बिंदु से एल्यूमीनियम पन्नी में इसे कवर करके ट्यूब को प्रकाश से बचाएं, जो छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है।
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में फ्लोरोफोरस के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी होना चाहिए जो अंतर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन के साथ ओवरलैप नहीं होते हैं। उदाहरण के लिए, यदि जीएफपी-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करते हैं, तो लाल या दूर-लाल तरंग दैर्ध्य पर एलेक्सा फ्लोर माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए, 546, 568, या 647 एनएम)। फ्लोरोसेंट रंग, जैसे कि होचस्ट और एलेक्सा फ्लोर 546 या 647 संयुग्मित फालोइडिन, माध्यमिक समाधान में जोड़ा जा सकता है। ये दाग समग्र कोशिका संरचना (यानी, नाभिक और एफ-एक्टिन) को चिह्नित करने में सहायक हो सकते हैं। सांद्रता के लिए चरण 3.1 देखें।
    3. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक नुटिंग प्लेटफ़ॉर्म घुमाव पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में अंडाशय सेते हैं। चरण 2.10 के रूप में 1x PBST में दो त्वरित धोने और चार लंबे (10-15 मिनट) धोने प्रदर्शन करें। चरण 5 के रूप में बढ़ते करने के लिए आगे बढ़ें।

5. दाग वाले अंडाशय की बढ़ते

नोट: यह विधि बहुत अच्छी तरह से काम करती है यदि अंडाशय अच्छी तरह से विकसित और प्रचुर मात्रा में हैं। स्लाइड पर अंडाशय के सावधान बढ़ते इष्टतम इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. पिछले धोने के बाद, अंडे कक्षों को अलग करने के लिए ट्यूब में अंडाशय को ऊपर और नीचे धीरे-धीरे पिपेट करने के लिए एक पी 1000 पिपेट का उपयोग करें। 5-10 मिनट के लिए एक ईमानदार स्थिति में ट्यूब रखकर अंडे कक्षों को नीचे तक डूबने दें। इष्टतम छवि अधिग्रहण प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत अंडे कक्षों का सावधानीपूर्वक पृथक्करण महत्वपूर्ण है।
  2. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पीबीएसटी निकालें, ~ 50 μL छोड़कर एक p200 विंदुक का उपयोग कर संभव के रूप में शेष PBST के रूप में ज्यादा निकालें। बढ़ते माध्यम की दो बूंदें जोड़ें, जो 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप पर समान रूप से फैलाने के लिए पर्याप्त है। अंडाशय को बढ़ते से पहले 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में बढ़ते माध्यम में संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: कई अलग-अलग बढ़ते मीडिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; हार्ड-सेटिंग माउंटेंट का उपयोग करना, जैसे कि एक्वा-पॉली / माउंट या प्रोलॉन्ग ग्लास एंटीफेड माउंटेंट, इष्टतम इमेजिंग स्थितियों को प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। बढ़ते माध्यम के रूप में ग्लिसरॉल का उपयोग हतोत्साहित किया जाता है क्योंकि इससे खराब इमेजिंग स्थितियां हो सकती हैं (उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोर अस्थिरता)। बढ़ते मीडिया के लिए जो पोलीमराइज़ नहीं करते हैं, इसे सुरक्षित करने के लिए कवरस्लिप सीलेंट / नेल पॉलिश का उपयोग करके कवरस्लिप को सील करें।
  3. एक ग्लास स्लाइड लेबल करें और धूल और उंगलियों के निशान को हटाने के लिए इसे नरम, धूल मुक्त कागज से पोंछ लें। माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब से स्लाइड करने के लिए चिपचिपा बढ़ते माध्यम के आसान हस्तांतरण की अनुमति देने के लिए एक पी 200 विंदुक टिप के अंत में कटौती करें। अगला, धीरे-धीरे बढ़ते माध्यम में सभी अंडे कक्षों को ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करें कि बुलबुले न बनाएं।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, धीरे-धीरे बढ़ते माध्यम को फैलाएं और कवरस्लिप के आकार के लगभग एक क्षेत्र को कवर करने के लिए एक नए पी 200 टिप या संदंश का उपयोग करके अंडे के कक्षों को अलग करें।
  5. संदंश का उपयोग करते हुए, सावधानी से बुलबुले से बचने के लिए एक कोण पर अंडे कक्षों पर कवरस्लिप (धूल मुक्त कागज के साथ साफ) जगह।
  6. बहुलक बनाने के लिए 2 दिनों के लिए अंधेरे में एक सपाट सतह पर कमरे के तापमान पर स्लाइड स्टोर करें। एक बार बढ़ते मीडिया ठीक हो जाने के बाद, स्लाइड इमेजिंग के लिए कुछ हफ्तों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: इमेजिंग से पहले पोलीमराइज़ करने के लिए हार्ड सेटिंग बढ़ते माध्यम के लिए यह महत्वपूर्ण है। यदि माध्यम अभी तक पॉलीमराइज्ड नहीं हुआ है, तो अंडाशय कवरस्लिप के नीचे तैरेंगे, जिससे छवि अधिग्रहण प्रभावित होगा। इसके अलावा, बढ़ते मीडिया का इष्टतम चिंतनशील सूचकांक केवल पूरी तरह से सेट होने के बाद प्राप्त किया जाता है (विवरण के लिए निर्माता की जानकारी देखें)।
  7. वैकल्पिक बढ़ते विधि: यदि अंडाशय प्रचुर मात्रा में नहीं हैं तो ऊतक हानि को कम करने के लिए इस विधि की सिफारिश की जाती है। इस विधि में (नीचे वर्णित), बढ़ते समय स्लाइड पर अंडाशय और अंडे के कक्षों को अलग करें, बजाय उन्हें चरण 5.1 में वर्णित पाइपिंग द्वारा माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में अलग करने के बजाय।
    1. अंतिम धोने के बाद, धोने के समाधान के ~ 100 μL को छोड़कर सभी को हटा दें। एक पाश्चर पिपेट या पी 1000 पिपेट का उपयोग करके, स्लाइड में पीबीएस में बरकरार अंडाशय को स्थानांतरित करें। एक p200 पिपेट का उपयोग कर, ध्यान से संभव के रूप में स्लाइड से ज्यादा पीबीएसटी हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो पीबीएसटी को पोंछने के लिए धूल मुक्त पेपर का उपयोग करें। अंडाशय को न छुएं।
    2. बढ़ते मीडिया की दो बूंदें जोड़ें। सावधानी से संदंश या विदारक सुइयों का उपयोग कर अंडाशय और अंडे कक्षों को अलग करें। बाहरी ऊतक को निकालें और त्यागें, और फिर बढ़ते माध्यम में अंडे के कक्षों और अंडाशय को फैलाएं। चरण 5.5-5.6 पर आगे बढ़ें।

6. कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण

नोट: यह अनुभाग किसी भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग करके इष्टतम छवि अधिग्रहण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रदान करता है।

  1. माइक्रोस्कोप सेट करें और नीचे वर्णित के रूप में नमूना का पता लगाएं।
    1. इमेजिंग से पहले, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के आईपीस का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का पता लगाना महत्वपूर्ण है। कम आवर्धन उद्देश्य (20x) या छवि अधिग्रहण (यानी, 40x या 63x) के लिए उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य का उपयोग करें। छवि के लिए एक अंडा कक्ष का चयन करें।
      नोट: छवि अधिग्रहण के लिए, 40x या 63x जैसे उच्च आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (6.2.1 देखें)।
    2. एक बार आरओआई का चयन हो जाने के बाद, छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें; कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए चरण 6.2 पर आगे बढ़ें, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए चरण 7।
  2. नीचे वर्णित इष्टतम छवि अधिग्रहण के लिए प्रमुख मापदंडों का चयन करें (प्रतिनिधि छवियों के लिए प्रमुख मापदंडों के उदाहरण तालिका 1 में दिए गए हैं)।
    1. एक उद्देश्य का चयन करना: एफई में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव के कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण के लिए, 40x या 63x उद्देश्य का उपयोग करें।
      नोट: सर्वोत्तम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ प्लान-एपोक्रोमैट उद्देश्यों का उपयोग, जो उच्चतम अक्रोमैटिक सुधार प्रदान करता है, अत्यधिक अनुशंसित है।
    2. ट्रैक के लिए लेजर का चयन: जीएफपी के लिए, लेजर 488 एनएम का उपयोग करें; डीएपीआई या होचस्ट के लिए, लेजर 405 एनएम का उपयोग करें; एलेक्सा फ्लोर 546 या 568 के लिए, लेजर 561 एनएम का उपयोग करें; और एलेक्सा फ्लोर 647 के लिए, लेजर 640 एनएम का उपयोग करें।
      नोट: प्रत्येक लेजर चयन एक अलग चैनल/ट्रैक गठन में परिणाम होगा। यहां, चैनल शब्द प्रत्येक चैनल की विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर चयनित आरओआई के लिए उत्साहित फ्लोरोफोरस के लिए रिकॉर्ड की गई तीव्रता वितरण द्वारा बनाई गई छवि को संदर्भित करता है।
    3. पिनहोल सेटिंग: छवि अधिग्रहण के दौरान आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को कम करने के लिए, प्रत्येक चैनल के लिए पिनहोल को 1 एयू पर सेट करें।
    4. लेजर तीव्रता और डिटेक्टर लाभ सेटिंग्स: छवि संवेदनशीलता को ठीक करने के लिए, डिटेक्टर मास्टर लाभ और लेजर पावर दोनों का उपयोग करें। छवि संवेदनशीलता को ठीक से सेट करने के लिए, एक सीमा संकेतक की सिफारिश की जाती है। मास्टर लाभ और लेजर शक्ति दोनों को उचित संवेदनशीलता के लिए सेट करें जहां डिटेक्टर संतृप्ति से परहेज करते हुए ब्याज की संरचनाएं (जैसे, बीएम युक्त पुटिकाएं) स्पष्ट रूप से दिखाई देती हैं।
      नोट: फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए, आवश्यक न्यूनतम लेजर शक्ति का उपयोग करें। सबसे कम लेजर शक्ति का उपयोग करते समय डिटेक्टर लाभ को पहले बढ़ाने की सिफारिश की जाती है। यदि डिटेक्टर लाभ की वृद्धि वांछित तीव्रता प्राप्त नहीं कर सकती है, तो लेजर शक्ति बढ़ाएं। 0.5% -1.2% के बीच लेजर शक्ति तीव्रता की सिफारिश की जाती है।
    5. फ्रेम आकार: अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित इष्टतम छवि आकार का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, 1024 x 1024 का अधिकतम रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करें। उच्च रिज़ॉल्यूशन अधिग्रहण समय में काफी वृद्धि करेगा।
    6. स्कैन गति: 6-9 के बीच एक स्कैन गति का उपयोग करें, जो अधिकांश नमूनों के लिए सुरक्षित है। यदि नमूना शोर है, तो सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार के लिए धीमी स्कैन गति का उपयोग करें। हालांकि, कम स्कैन गति फोटोब्लीचिंग और अधिग्रहण समय को बढ़ाती है।
    7. औसत तीव्रता औसत: छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, समान सेटिंग्स के साथ क्रमिक स्कैन के माध्यम से औसत तीव्रता का उपयोग करें। ज्यादातर मामलों के लिए, नमूना फोटोब्लीचिंग के बिना सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के लिए दो के औसत का उपयोग करें।
    8. ज़ूम: ज़ूम फ़ंक्शन का उपयोग करके स्कैन क्षेत्र समायोजित करें। एफई में बीएम युक्त पुटिकाओं को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए सबसे प्रभावी मूल्य के रूप में 40x और 63x उद्देश्यों दोनों के साथ 2x-4x के बीच ज़ूम का उपयोग करें। अधिग्रहण समय को कम करने के लिए सावधानीपूर्वक न्यूनतम आरओआई का चयन करें।
  3. ज़ीस ज़ेन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित जेड-सेक्शनिंग पैरामीटर का उपयोग करें और उन्हें नीचे वर्णित के रूप में सेट करें।
    नोट: पुटिकाएं और बीएम प्रोटीन युक्त अन्य इंट्रासेल्युलर संरचनाएं 3-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं। एफई के माध्यम से जेड-स्टैक प्राप्त करने से छवि की गुणवत्ता और रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार होगा। आमतौर पर, ऊतक की मोटाई /गहराई तक फैली एक सीमा इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण को कुशलतापूर्वक कल्पना करने के लिए पर्याप्त है। इष्टतम 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित इष्टतम अंतराल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। 40x और 63x उद्देश्यों के लिए, इष्टतम 3 डी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक जेड-सेक्शन के बीच 0.5 μm से अधिक अंतराल से बचें।
    1. अधिग्रहण टैब के तहत मुख्य क्षेत्र में जेड-स्टैक चेकबॉक्स पर क्लिक करें। जेड-स्टैक के लिए स्लाइस स्कैनिंग मोड प्रति सभी ट्रैक का चयन करें। इसके परिणामस्वरूप प्रत्येक जेड-स्थिति स्लाइस के लिए चैनल ट्रैक में बदलाव होगा।
    2. नमूने का निरीक्षण करने के लिए वांछित चैनल का चयन करें और लाइव स्कैन शुरू करने के लिए लाइव पर क्लिक करें। जीएफपी-टैग किए गए बीएम प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक चैनल के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
    3. वर्णित के रूप में जेड-स्टैक के लिए एक सीमा सेट करें। माइक्रोस्कोप पर ठीक समायोजन घुंडी का उपयोग करके, नमूने के एक छोर के लिए जेड-स्थान ढूंढें, और सेट फर्स्ट पर क्लिक करें। इसी तरह, नमूने के दूसरे छोर के लिए जेड-स्थान ढूंढें और सेट लास्ट पर क्लिक करें।
    4. जेड-स्टैक में प्रत्येक स्थान के लिए, चयनित रेंज संकेतक के साथ प्रत्येक चैनल पर अलग से क्लिक करें, और लेजर की तीव्रता और आवश्यकतानुसार मास्टर लाभ को समायोजित करें, जैसा कि चरण 6.2.4 में वर्णित है।
    5. चरण 6.3 के नीचे नोट में अनुशंसित चरण आकार असाइन करने के लिए z-स्टैक के लिए अंतराल सेट करें। जेड-स्टैक अधिग्रहण शुरू करने के लिए स्टार्ट एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें।

7. सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि अधिग्रहण

  1. एक एयरिस्कैन संगत उद्देश्य का चयन करें। बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए, 63x तेल उद्देश्य का उपयोग इष्टतम (चित्रा 3) है। उद्देश्य को 63x पर सेट करें और धीरे-धीरे अपने लेंस पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें। नमूना का पता लगाने के उद्देश्य का सामना करना पड़ कवरस्लिप के साथ उद्देश्य पर स्लाइड की स्थिति।
  2. फ्लोरोफोर के लिए छवि के लिए उपयुक्त सेटिंग्स के साथ एक कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. एक नया प्रयोग कॉन्फ़िगर करने के लिए अधिग्रहण टैब में स्मार्ट सेटअप बटन पर क्लिक करें। एयरिस्कैन (सुपर-रिज़ॉल्यूशन) का चयन करें; जब यह चुना जाता है, तो रिज़ॉल्यूशन (एयरिस्कैन एसआर), एसएनआर / संवेदनशीलता (एयरिस्कैन कॉन्फोकल), और स्पीड (मल्टीप्लेक्स एसआर -2 वाई) के बीच एक और चयन की आवश्यकता होगी। निश्चित ऊतक के लिए, संकल्प का चयन करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सबसे अच्छा अधिग्रहण होगा।
    2. चैनल जोड़ने के लिए अपने प्रयोग को कॉन्फ़िगर करें बॉक्स में + पर क्लिक करें। डाई डेटाबेस से विशिष्ट रंगों के लिए पटरियों का चयन करें। एक मल्टी-चैनल प्रयोग के लिए, उपयुक्त रंगों का चयन करके आवश्यकतानुसार प्रत्येक ट्रैक जोड़ें।
    3. सभी पटरियों को जोड़ने के बाद, सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए प्रयोग प्रस्तावों में से एक का चयन करें। इस प्रयोग के लिए, सर्वश्रेष्ठ सिग्नल का उपयोग करें, जैसे कि गति सबसे स्मार्ट (लाइन) प्रस्ताव की तुलना में थोड़ी धीमी होगी, यह प्रत्येक डाई के लिए सबसे अच्छी हार्डवेयर सेटिंग्स बनाएगी, जिसके परिणामस्वरूप अधिकतम सिग्नल लाभ और न्यूनतम उत्सर्जन क्रॉसस्टॉक होगा। एक बार प्रयोग सेट और लोड हो जाने के बाद, यह अधिग्रहण टैब में इमेजिंग सेटअप विंडो में दिखाई देगा।
    4. एक बार स्मार्ट सेटअप का चयन हो जाने के बाद, डिटेक्टर जीएएएसपी-पीएमटी के लिए तरंग दैर्ध्य की सीमा स्वचालित रूप से चुनी जाएगी। सीमा को बढ़ाने या घटाने के लिए नीचे स्क्रॉल पट्टी को स्थानांतरित करके श्रेणी समायोजित करें या आवश्यकतानुसार श्रेणी को पूरी तरह से किसी अन्य क्षेत्र में ले जाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए इसका उपयोग करें कि क्रॉसस्टॉक से बचने के लिए दो अलग-अलग चैनलों की श्रेणियां ओवरलैप न हों। भविष्य में पुन: उपयोग करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन सहेजें।
  3. एक बार कॉन्फ़िगरेशन सेट हो जाने के बाद, चरण 6.2.8 के रूप में ज़ूम और स्कैन क्षेत्र को समायोजित करने के लिए आगे बढ़ें। स्कैन समय और भंडारण स्थान को कम करने के लिए ब्याज के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए स्कैन क्षेत्र का अनुकूलन करें। छवियों को प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें।
  4. प्रत्येक व्यक्तिगत चैनल के लिए, चैनल के तहत एक ट्रैक का चयन करें और लाइव पर क्लिक करें। चरण 6.2.4 में वर्णित रेंज संकेतक उपकरण का उपयोग करके मास्टर लाभ और लेजर पावर समायोजित करें और संतृप्त पिक्सेल से बचने के लिए वर्णित सभी दिशानिर्देशों का पालन करें। पुष्टि करें कि हेक्सागोनल डिटेक्टर दृश्य एयरिस्कैन डिटेक्टर व्यू बटन पर क्लिक करके केंद्रित और संरेखित है। ज्यादातर मामलों में, हेक्सागोनल डिटेक्टर दृश्य स्वचालित रूप से केंद्रित और संरेखित होता है। अतिरिक्त चैनलों के लिए दोहराएँ।
  5. अधिग्रहण मोड टॉगल विंडो में, छवि आकार के तहत, डिटेक्टर की क्षमताओं को अधिकतम करने के लिए एसआर (सुपर-रिज़ॉल्यूशन-सीमित पिक्सेल गिनती) पर क्लिक करें। यह स्वचालित रूप से फ्रेम आकार को समायोजित करेगा।
  6. औसत को कोई नहीं रखें क्योंकि यह आमतौर पर आवश्यक नहीं है, और इससे स्कैन समय कम हो जाएगा। कुछ मामलों में, 2x का औसत सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार कर सकता है।
  7. 8-बिट डेटा गहराई के साथ कच्चे डेटा एकत्र करें। एक छवि प्राप्त करने के लिए स्नैप पर क्लिक करें। एक z-स्टैक प्राप्त करने के लिए, चरण 6.3 का पालन करें।
  8. नीचे वर्णित के रूप में छवि प्रसंस्करण करें। यह एक 16-बिट छवि का उत्पादन करेगा।
    1. एक बार छवि या जेड-स्टैक प्राप्त हो जाने के बाद, प्रोसेसिंग > विधि पर क्लिक करें और एयरिस्कैन प्रोसेसिंग का चयन करें।
    2. के साथ शुरू करने के लिए ऑटो फ़िल्टर निष्पादित करें और नमूना के लिए सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए SR मान परिवर्तित करके आगे मैन्युअल प्रसंस्करण करें। एक बार इष्टतम एसआर मान निर्धारित हो जाने के बाद, संसाधित छवि उत्पन्न करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें। जेड-स्टैक छवियों के मामले में, या तो एक जेड-स्लाइस (वर्तमान छवि [2 डी]) के रूप में या 3 डी प्रोसेसिंग बॉक्स पर क्लिक करके पूरे जेड-स्टैक के रूप में संसाधित करें।

8. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण (ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण, 3 डी पुनर्निर्माण और तीव्रता प्रोफ़ाइल)

नोट: इस पद्धति के लिए, ऑर्थोगोनल अनुमानों, 3 डी पुनर्निर्माण और तीव्रता प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चरणों को ज़ेन सॉफ़्टवेयर के लिए वर्णित किया गया है (सामग्री की तालिका देखें)। इमेजजे सॉफ्टवेयर56 के साथ भी इसी तरह के डेटा विश्लेषण किए जा सकते हैं।

  1. नीचे वर्णित के रूप में ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण प्रदर्शन (चित्रा 4)।
    1. एक बार जब कॉन्फोकल या सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जेड-स्टैक प्राप्त किया जाता है, तो 2 डी दृश्य (3 डी पुनर्निर्माण की तुलना में) में सेल के जेड-अक्ष में पुटिकाओं को देखने के लिए एक ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण उत्पन्न करें। ऐसा करने के लिए, प्रोसेसिंग > विधि पर क्लिक करें और ऑर्थोगोनल प्रोजेक्शन का चयन करें।
    2. मापदंडों के तहत, आवश्यक प्रक्षेपण विमान का चयन करें। जेड-अक्ष (जेड-स्टैक) के प्रक्षेपण के लिए, ललाट (एक्सवाई) विमान का चयन करें। विधि के तहत, उच्चतम गुणवत्ता प्रक्षेपण में परिणाम करने के लिए अधिकतम का चयन करें।
    3. अगला, प्रारंभिक स्थिति (जेड-स्लाइस शुरू करना) का चयन करके प्रक्षेपण की मोटाई निर्धारित करें, और प्रक्षेपण में मोटाई (जेड-स्लाइस की कुल संख्या) निर्धारित करें। जेड-अक्ष में एक सेल के बराबर मोटाई का चयन करना आदर्श है।
    4. एक बार पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, एक्सवाई प्लेन तरीके से जेड-स्टैक के प्रक्षेपण को बनाने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।
      नोट: ब्याज की किसी विशेष वस्तु की मात्रा की तुलना करने के लिए कई जेड-स्टैक के ऑर्थोगोनल अनुमान बनाते समय, डेटा सटीकता के लिए प्रक्षेपण की मोटाई को समान (या जितना संभव हो उतना करीब) रखना अनिवार्य है।
  2. नीचे वर्णित के रूप में 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शन (चित्रा 5)।
    1. संरचनाओं के स्थानीयकरण और आकार का निरीक्षण करने के लिए जेड-स्टैक के 3 डी पुनर्निर्माण बनाएं। कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोण का उपयोग करके अधिग्रहित जेड-स्टैक के लिए ऐसा करें। 3 डी पुनर्निर्माण के लिए चरण 7.8 के रूप में 3 डी प्रसंस्करण का उपयोग करके पहले सुपर-रिज़ॉल्यूशन जेड-स्टैक को संसाधित करें।
    2. 3 डी छवि उत्पन्न करने के लिए, पूर्वावलोकन विंडो में 3 डी आइकन पर क्लिक करें। एक बार क्लिक करने के बाद, स्क्रीन के निचले आधे हिस्से में डिस्प्ले कंट्रोल सेक्शन में एक 3 डी टैब दिखाई देगा। पारदर्शिता, वॉल्यूम, अधिकतम, सतह और मिश्रित जैसे 3 डी दृश्य दिखाई देंगे। पुटिकाओं की संरचना (बेहतर) को देखते समय सतह या मिश्रित दृश्यों का उपयोग करें।
    3. उच्चतम गुणवत्ता वाली छवि के लिए, सटीक सेटिंग का चयन करें, क्योंकि सबसे तेज़ सेटिंग कम सटीक होगी और खराब 3 डी प्रतिपादन का कारण बनेगी।
    4. एक बार छवि उत्पन्न हो जाने के बाद, ब्याज की वस्तुओं को देखने के लिए पसंदीदा स्थान पर ध्यान केंद्रित करने के लिए घूर्णन और ज़ूम करके इसे हेरफेर करें। प्रकटन टैब के तहत 3 डी छवि में हेरफेर करें।
    5. एक बार संतोषजनक दृश्य प्राप्त हो जाने के बाद, 3 डी टैब के तहत, प्रदर्शित रिज़ॉल्यूशन का चयन करें, और फिर छवि बनाएं पर क्लिक करें। यह उसी अभिविन्यास में छवि का स्नैपशॉट बनाएगा जैसा कि इसे देखा गया था और इसे विभिन्न फ़ाइल प्रारूपों में सहेजा और निर्यात किया जा सकता है।
  3. नीचे वर्णित के रूप में एक तीव्रता प्रोफ़ाइल उत्पन्न (चित्रा 7)।
    नोट: विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों से जुड़े पिक्सेल के वितरण और तीव्रता प्रोफाइल को उनके कोलोकलाइजेशन को निर्धारित करने के लिए ओवरले छवि के रूप में देखा जा सकता है।
    1. एक बार कंफोकल या सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के माध्यम से एक इष्टतम छवि प्राप्त हो जाने के बाद, पूर्वावलोकन विंडो के व्यू पैनल में, प्रोफ़ाइल पर क्लिक करें। पूर्वावलोकन विंडो में, दूरी के एक समारोह के रूप में तीव्रता प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करने वाला एक हिस्टोग्राम दिखाई देगा, साथ ही दूरी और तीव्रता मूल्यों को दिखाने वाली एक तालिका भी दिखाई देगी।
    2. स्क्रीन के निचले भाग में प्रदर्शन नियंत्रण क्षेत्र में, प्रोफ़ाइल परिभाषा टैब में तीर उपकरण पर क्लिक करें। ऑब्जेक्ट की लंबाई के साथ एक तीर खींचें जिसके लिए विभिन्न पिक्सेल की तीव्रता प्रोफ़ाइल का आकलन करने की आवश्यकता है। तीर आरेखित करने के लिए, छवि पर ज़ूम इन करें.
    3. तीव्रता प्रोफ़ाइल छवि पूर्वावलोकन के बाईं ओर दिखाई देगी, जहां तीर के पथ के साथ दूरी और संबंधित चोटियों को प्रदर्शित किया जाएगा। छवि पर प्रदर्शित हिस्टोग्राम को निकालने के लिए, ग्राफ़िक्स में प्रोफ़ाइल दिखाएँ बॉक्स को अनचेक करें.
    4. प्रदर्शन नियंत्रण क्षेत्र में आयाम टैब में, तीव्रता प्रोफ़ाइल में शामिल नहीं किए जाने वाले किसी भी चैनल का चयन रद्द करें।
    5. ग्राफिक्स टैब में, प्रारूप ग्राफिकल तत्व पॉप-अप बॉक्स खोलने के लिए एनोटेशन/मापन बॉक्स के तहत दिखाए गए प्रोफ़ाइल पर डबल-क्लिक करें। तीर के रंग के साथ-साथ इसकी शैली और स्ट्रोक मोटाई को बदलने के लिए इसका उपयोग करें। वांछित सेटिंग्स का चयन करने के बाद बॉक्स बंद करें।
    6. प्रोफ़ाइल दृश्य टैब पर क्लिक करें। नए छवि अनुभाग में, वर्तमान दृश्य पर क्लिक करें और फिर फ़ाइल को सहेजने के लिए इस रूप में सहेजें पर क्लिक करें। डेटा संपीड़न और हानि से बचने के लिए फ़ाइल को .tif फ़ाइल के रूप में सहेजने की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

यहां वर्णित विधियों का उपयोग कुशलतापूर्वक और सटीक रूप से छवि बनाने और ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि ड्रोसोफिला अंडाशय का एफई। अगला, हम वर्णित विधियों का उपयोग करके प्राप्त प्रत्याशित परिणाम प्रदान करते हैं, साथ ही उपयोगी सलाह और संभावित नुकसान भी प्रदान करते हैं। ऐसा करने के लिए, वीकेजी-जीएफपी, एक अंतर्जात रूप से टैग किए गए वीकेजी (ड्रोसोफिला कर्नल चतुर्थ) का उपयोग किया जाता है। हालांकि, वही परिणाम अन्य अंतर्जात रूप से टैग किए गए बीएम प्रोटीन जैसे कि पीसीएन-जीएफपी के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं।

इष्टतम अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना (चित्रा 2)
उपकला कोशिकाओं में वीकेजी और पीसीएएन जैसे बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव को सटीक रूप से चिह्नित करने के लिए, प्रदान की गई विधियों में वर्णित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण मापदंडों को ठीक से सेट करना महत्वपूर्ण है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, वीकेजी-जीएफपी के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण को एफई (चित्रा 2 ए) में स्रावित और जमा करने से पहले पता लगाया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि ईआर में अनुवाद के बाद, कोल चतुर्थ को इंट्रासेल्युलर एक्सोसाइटिक पुटिकाओं में पैक करने से पहले गोल्गी में ले जाया जाता है। इस इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम देखते हैं कि वीकेजी-जीएफपी विभिन्न आकृतियों के साथ इंट्रासेल्युलर डिब्बों में जमा होता है, संभावित रूप से विभिन्न ऑर्गेनेल, एंडोसोमल डिब्बों और पुटिका प्रकारों (चित्रा 2 ए, तीर) का प्रतिनिधित्व करता है। एक्सोसाइटिक पुटिकाओं में, कॉल चतुर्थ को पहले से ही तीन पॉलीपेप्टाइड्स से बने फाइब्रिल में इकट्ठा किया जाता है: दो α1 श्रृंखला और एक α2 श्रृंखला ( ड्रोसोफिला में वीकेजी), जिससे फैले पुटिकाओं का निर्माण होता है जिसे कॉन्फोकल इमेजिंग (चित्रा 2 ए, तीर) का उपयोग करके भी कल्पना की जा सकती है। फिर, कोल चतुर्थ को विशेष रूप से उपकला कोशिकाओं से बेसल रूप से स्रावित किया जाता है जहां यह बीएम (चित्रा 2, एरोहेड्स) में जमा होता है।

यदि अधिग्रहण मापदंडों को ठीक से सेट नहीं किया गया है, तो बीएम प्रोटीन (चित्रा 2 बी, सी) के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग के दौरान विभिन्न आकृति विज्ञान और पदों का ठीक से निरीक्षण करना संभव नहीं है। उदाहरण के लिए, यदि अधिग्रहण मापदंडों को बाह्य बीएम की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जाता है और इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को नहीं, तो बीएम प्रोटीन युक्त एंडोसोमल डिब्बे और पुटिकाएं (यहां वीकेजी-जीएफपी द्वारा चिह्नित) मंद दिखाई देती हैं या दिखाई नहीं देती हैं (चित्रा 2 बी)। इसके विपरीत, यदि डिटेक्टरों को अत्यधिक संतृप्त किया जाता है, तो वीकेजी-जीएफपी के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण को इष्टतम स्थिति (चित्रा 2 ए और चित्रा 2 सी की तुलना) के रूप में पता लगाया जा सकता है, लेकिन पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति शोर में वृद्धि बीएम प्रोटीन स्थानीयकरण की व्याख्या को और अधिक कठिन बनादेती है, खासकर कोलोकलाइजेशन प्रयोगों के लिए (चित्रा 7 देखें) ). कुल मिलाकर, ये डेटा उपकला में बीएम प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण को प्राप्त करने के लिए उचित अधिग्रहण मापदंडों के महत्व को दर्शाते हैं।

इष्टतम सुपर-रिज़ॉल्यूशन और डिकोन्वोल्यूशन पैरामीटर सेट करना (चित्रा 3)
जैसा कि कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण के लिए सचित्र है, अंडर-या ओवर-संतृप्ति से बचने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते समय अधिग्रहण मापदंडों को ठीक से सेट करना भी महत्वपूर्ण है। इस सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दृष्टिकोण में सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग (चित्रा 3) प्राप्त करने के लिए डिकॉन्वोल्यूशन पैरामीटर का सावधानीपूर्वक कॉन्फ़िगरेशन भी शामिल है। जब विघटन प्रसंस्करण को बेहतर ढंग से कॉन्फ़िगर किया जाता है, तो सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग बीएम प्रोटीन (चित्रा 3 ए, तीर) युक्त इंट्रासेल्युलर संरचनाओं के रिज़ॉल्यूशन को काफी बढ़ाता है, जैसे पुटिकाएं या गोल्गी संरचनाएं (चित्रा 3 ए और चित्रा 7 सी), बीएम स्वयं (चित्रा 3 ए, एरोहेड्स), और सिग्नल-टू-शोर अनुपात45 को बढ़ाता है . सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में सभी तीन स्थानिक आयामों में रिज़ॉल्यूशन में ~ 2x वृद्धि की ओर जाता है। रिज़ॉल्यूशन में यह वृद्धि स्पष्ट रूप से बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग की बेहतर परिभाषित छवियों द्वारा सचित्र है और मानक सीएसएलएम ( चित्रा 2 ए और चित्रा 3 ए की तुलना करें) की तुलना में सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उपयोग करके लिया गया बीएम।

यदि डीकॉन्वोल्यूशन पैरामीटर ठीक से सेट नहीं किए जाते हैं, तो सुपर-रिज़ॉल्यूशन बेहतर रूप से प्राप्त नहीं होता है, और रिज़ॉल्यूशन में वृद्धि खो जाती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों के अंडर-प्रोसेसिंग से धुंधली छवियां होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप बीएम प्रोटीन का इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण मंद दिखाई देता है और इष्टतम परिस्थितियों में अच्छी तरह से परिभाषित नहीं होता है ( चित्रा 3 ए के साथ चित्रा 3 बी की तुलना करें)। इसके विपरीत, छवियों के अति-प्रसंस्करण दानेदार छवियों की ओर जाता है, जहां बीएम प्रोटीन का इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण पिक्सेलेटेड (चित्रा 3 सी) दिखाई देता है। ये डेटा सार्थक और प्रतिनिधि छवियों को प्राप्त करने के लिए उचित डिकंवोल्यूशन मापदंडों का उपयोग करने के महत्व को उजागर करते हैं जो बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर वितरण को दर्शाते हैं।

कुल मिलाकर, ये डेटा स्पष्ट रूप से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेज प्रोसेसिंग का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग के बेहतर रिज़ॉल्यूशन को दिखाते हैं और हाइलाइट करते हैं। विशेष रूप से, यह दृष्टिकोण शामिल इंट्रासेल्युलर संरचनाओं के संकल्प को बढ़ाकर बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है। यह एफई में बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत जमाव में शामिल नए कारकों को बेहतर ढंग से पहचानने और चिह्नित करने के लिए संरचनाओं के विभिन्न आकारों और आकृतियों की तुलना की अनुमति देता है।

ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण और बीएम प्रोटीन (चित्रा 4 और चित्रा 5) के इंट्रासेल्युलर वितरण के दृश्य को बढ़ाने के लिए एफई के माध्यम से ऑप्टिकल जेड-सेक्शन (जेड-स्टैक) के 3 डी पुनर्निर्माण
चूंकि बीएम प्रोटीन का इंट्रासेल्युलर वितरण पूरे एफई में 3 डी (एक्स-, वाई-, और जेड-अक्ष) में मौजूद है, इसलिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एफई के माध्यम से ऑप्टिकल जेड-सेक्शन के ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण और / या 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके, स्थानीयकरण और जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती कोशिकाओं के अंदर बीएम प्रोटीन के वितरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 4 और चित्रा 5 में)।

ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण अधिग्रहित सभी जेड-वर्गों को एक ही विमान में प्रक्षेपित करने की अनुमति देता है। यह विधि कॉन्फोकल (चित्रा 4 ए) या सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 4 बी) इमेजिंग का उपयोग करके एक ही छवि में बीएम प्रोटीन युक्त पुटिकाओं और डिब्बों के समग्र वितरण को दिखाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। हालांकि, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ( चित्रा 4 बी और चित्रा 4 ए की तुलना करें) की तुलना में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते समय काफी बेहतर रिज़ॉल्यूशन और कम पृष्ठभूमि शोर परिणाम।

बीएम युक्त डिब्बों और पुटिकाओं के समग्र वितरण की कल्पना करने के लिए एक और दृष्टिकोण कॉन्फोकल (चित्रा 5 ए) या सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 5 बी) इमेजिंग द्वारा लिए गए ऑप्टिकल जेड-वर्गों के ढेर को इकट्ठा करके 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करना है। यह दृष्टिकोण इंट्रासेल्युलर बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण और वितरण और वीकेजी-जीएफपी युक्त डिब्बों और पुटिकाओं के आकार का आकलन करने के लिए भी बहुत कुशल हो सकता है, खासकर सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) का उपयोग करते समय। सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 5 बी) की तुलना में पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5 ए) के परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि शोर होता है, जो 3 डी रेंडरिंग में जिम्मेदार होने पर कलाकृतियों में परिणाम हो सकता है। इसके अलावा, कॉन्फोकल के निचले रिज़ॉल्यूशन के परिणामस्वरूप सुपर-रिज़ॉल्यूशन ( चित्रा 5 ए और चित्रा 5 बी की तुलना करें) द्वारा उत्पन्न लोगों की तुलना में कम चिकनी और परिभाषित छवियां बनाई जाती हैं।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग (चित्रा 6) का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत स्राव में शामिल घटकों के नुकसान से जुड़े फेनोटाइप की विशेषता
जैसा कि अब तक दिखाया गया है (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5), सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण का उपयोग ड्रोसोफिला अंडाशय के वाइल्डटाइप एफई में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण और वितरण का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग उत्परिवर्ती या नॉकडाउन स्थितियों में बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण को निर्धारित करने और तुलना करने के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रकार, यह ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी, स्राव और बीएम प्रोटीन के जमाव के लिए समर्पित नए पहचाने गए घटकों की भूमिका (ओं) को चिह्नित करने का एक कुशल तरीका है।

जीटीपेज एक्सचेंज फैक्टर (जीईएफ) क्रैग को बीएम प्रोटीन28 के ध्रुवीकृत जमाव के लिए समर्पित जैविक मार्ग में एक प्रमुख घटक दिखाया गया है। क्रैग नॉकडाउन एफसी में, बीएम प्रोटीन एपिक और बेसली दोनों जमा होते हैं, यह दर्शाता है कि क्रैग बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत स्राव को नियंत्रित करता है जैसे कि वीकेजी-जीएफपी (चित्रा 6)। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग क्रैग के नुकसान के परिणामस्वरूप फेनोटाइप के बेहतर लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, बीएम प्रोटीन का एक मजबूत एपिकल संचय, साथ ही एक्टोपिक एपिकल बीएम का संगठन, क्रैग-नॉकडाउन एफसी (चित्रा 6 बी, एरोहेड्स) में मनाया जाता है। इसके अलावा, जब फेनोटाइप कम विचलित होता है, तो एफसी में छोटे पैच में एपिक रूप से जमा होने वाली बीएम झिल्ली का पता लगाया जाता है (चित्रा 6 बी, तीर)। कुल मिलाकर, ये डेटा बताते हैं कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग बीएम के ध्रुवीकृत जमाव में शामिल घटकों की भूमिकाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए उत्परिवर्ती फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।

एंटीबॉडी का उपयोग करके कोलोकलाइजेशन प्रयोग और अंतर्जात रूप से टैग किए गए बीएम प्रोटीन को कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 7) का उपयोग करके चित्रित किया गया है
अंत में, विशिष्ट इंट्रासेल्युलर मार्करों या अंतर्जात रूप से टैग किए गए बीएम प्रोटीन के साथ संयुक्त नए पहचाने गए घटकों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग ध्रुवीकृत उपकला में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव को बेहतर ढंग से चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। जीएम -130, एक सीआईएस-गोल्गी मार्कर, इस बिंदु को चित्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है। स्राव पुटिकाओं में पैक किए जाने से पहले, कोल चतुर्थ को गोल्गी में ले जाया जाता है। जब वीकेजी-जीएफपी के उपकोशिकीय वितरण का मूल्यांकन कॉन्फोकल (चित्रा 7 ए, बी) या सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 7 सी, डी) इमेजिंग का उपयोग करके किया जाता है, तो दोनों दृष्टिकोण बताते हैं कि वीकेजी-जीएफपी आंशिक रूप से जीएम -130 के साथ सह-स्थानीयकरण करता है, यह पुष्टि करते हुए कि कोल चतुर्थ को स्राव से पहले गोल्गी में क्रमबद्ध किया जाता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग (चित्रा 7 सी के साथ चित्रा 7 ए की तुलना करें) का उपयोग करते समय सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि और वीकेजी-जीएफपी और जीएम 130 के बीच कोलोकलाइजेशन का बेहतर रिज़ॉल्यूशन मनाया जाता है।

इसके अलावा, जब स्थानिक वितरण और हरे (वीकेजी-जीएफपी) और लाल (जीएम -130) पिक्सेल के स्तर को कॉन्फोकल (चित्रा 7 बी) और सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 7 डी) माइक्रोस्कोपी के साथ लिए गए एफसी के माध्यम से एक ऑप्टिकल अनुभाग की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापकर निर्धारित किया जाता है, तो वीकेजी-जीएफपी और जीएम -130 का कोलोकलाइजेशन मनाया जाता है। वीकेजी-जीएफपी और जीएम -130 पिक्सल का वितरण हिस्टोग्राम में प्लॉट किया गया है जिसमें वीकेजी-जीएफपी और जीएम -130 चोटियों के ओवरलैप उनके कोलोकलाइजेशन (चित्रा 7 बी ', डी') का संकेत देते हैं। इस प्रकार, इस छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके, विशिष्ट इंट्रासेल्युलर डिब्बों में वीकेजी-जीएफपी का स्थान ठीक से निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 7 डी ') छवियों के साथ कॉन्फोकल छवियों (चित्रा 7 बी ') से उत्पन्न हिस्टोग्राम की तुलना इस बात की पुष्टि करती है कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी बेहतर परिणाम उत्पन्न करती है, जैसा कि चोटियों की उच्च तीव्रता और छोटी चोटियों की कमी से दर्शाए गए कम पृष्ठभूमि शोर द्वारा देखा जा सकता है (चित्रा 7 बी 'और चित्रा 7 डी की तुलना करें' ) सुपर-रिज़ॉल्यूशन-जेनरेट किए गए हिस्टोग्राम से जुड़ा हुआ है। कुल मिलाकर, ये डेटा इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि यद्यपि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोलोकलाइजेशन को मापने के लिए किया जा सकता है, सुपर-रिज़ॉल्यूशन एक अधिक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, जिससे स्थानीयकरण का अधिक कुशल और सटीक परिमाणीकरण होता है।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला अंडाशय के कूपिक उपकला (एफई): तहखाने झिल्ली (बीएम) प्रोटीन के ध्रुवीकृत जमाव का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली। (ए) प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ लिया विच्छेदन और छांटना के बाद बरकरार अंडाशय की छवि। अंडाशय एक अंतर्जात जीएफपी-टैग बीएम प्रोटीन (वीकेजी-जीएफपी) व्यक्त कर रहे हैं। स्केल बार = 1 मिमी (ए') एक मादा मक्खी के दो अंडाशय अंडाशय डिंबवाहिनी पर संलग्न होते हैं। प्रत्येक अंडाशय में 16-20 अंडाशय होते हैं। एक एकल अंडाशय उल्लिखित है (आयत)। स्केल बार = 1 मिमी (बी) अनुदैर्ध्य अनुभाग, एक कंफोकल माइक्रोस्कोप के साथ लिया जाता है, वीकेजी-जीएफपी व्यक्त करने वाले अंडाशय के माध्यम से और डीएनए (नीला) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग दिया जाता है। अंडाशय में विभिन्न चरणों में अंडे के कक्ष होते हैं। अंडे के कक्ष एक मोनोलेयर कूपिक उपकला (एफई) से बने होते हैं जो जर्मलाइन कोशिकाओं (जीसी) को घेरते हैं। एफई संश्लेषित करता है और बेसली बीएम प्रोटीन (जैसे, पीसीएन और वीकेजी) को स्रावित करता है। स्केल बार = 100 μm. (सी) एफई की योजनाबद्ध। एफई एक अलग एपिकल-बेसल ध्रुवीयता के साथ एक क्लासिक उपकला है जहां एपिकल डोमेन जर्मलाइन कोशिकाओं का सामना करता है, और बेसल डोमेन बीएम (हरा) का सामना करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग की इमेजिंग( ए-सी) वीकेजी-जीएफपी (हरा) व्यक्त करने वाले अंडे के कक्ष के माध्यम से अनुदैर्ध्य अनुभाग और डीएनए (नीला) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग। (ए'-सी') इंट्रासेल्युलर डिब्बों और पुटिकाओं में वीकेजी-जीएफपी (तीर), और बेसली और बाह्य रूप से जमा बीएम (एरोहेड्स) को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दिखाया गया है। (ए) इष्टतम रूप से अधिग्रहित छवि जिसके लिए वीकेजी-जीएफपी की इंट्रासेल्युलर तस्करी दिखाई देती है। (ए') वीकेजी-जीएफपी विभिन्न सेलुलर डिब्बों (जैसे, गोल्गी) और पुटिकाओं में एफसी के साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत है। कोलेजन चतुर्थ के फाइब्रिल संगठन के कारण, वीकेजी-जीएफपी युक्त पुटिकाएं लम्बी (तीर) दिखाई देती हैं। (बी) अंडरएक्सपोज्ड छवि जिसके लिए अधिग्रहण मापदंडों को बाह्य बीएम की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जाता है न कि बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर वितरण की कल्पना करने के लिए। वीकेजी-जीएफपी (हरा) पूरे साइटोप्लाज्म (बी') में मंद दिखाई देता है, जिसके परिणामस्वरूप (ए) की तुलना में अज्ञात वीकेजी-जीएफपी युक्त पुटिकाएं होती हैं। (सी) ओवरएक्सपोज्ड छवि जिसके लिए जीएफपी डिटेक्टर संतृप्त है, जिसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है। यद्यपि वीकेजी-जीएफपी (हरा) के इंट्रासेल्युलर वितरण को एफसी (तीर) के साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत देखा जा सकता है, ओवरएक्सपोजर के परिणामस्वरूप इमेजिंग कलाकृतियां होती हैं जहां इंट्रासेल्युलर संरचनाएं उनकी तुलना में बड़ी दिखाई देती हैं, जैसे (ए-ए')। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और प्रसंस्करण का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग की इमेजिंग। (ए-सी) वीकेजी-जीएफपी (हरा) व्यक्त करने वाले अंडे के कक्ष के माध्यम से अनुदैर्ध्य अनुभाग और डीएनए (नीला) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग। (ए) इष्टतम रूप से संसाधित सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि, जिसमें वीकेजी-जीएफपी की इंट्रासेल्युलर तस्करी स्पष्ट रूप से देखी जाती है। (ए') वीकेजी-जीएफपी विभिन्न सेलुलर डिब्बों (जैसे, गोल्गी) और पुटिकाओं (तीर) और बीएम (तीरहेड्स) में एफसी के साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत है। (बी) अंडर-प्रोसेस्ड छवि जिसके परिणामस्वरूप (ए) की तुलना में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति होती है। वीकेजी-जीएफपी (हरा) का इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण मंद और कम परिभाषित दिखाई देता है (ए के साथ बी की तुलना करें)। (सी) ओवर-प्रोसेस्ड छवि जिसके परिणामस्वरूप एक छवि होती है जहां वीकेजी-जीएफपी का इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण पिक्सेलेटेड और दानेदार दिखाई देता है। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग करके अधिग्रहित और संसाधित जेड-स्टैक का ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण( ए-बी) वीकेजी-जीएफपी (हरा) व्यक्त करने वाले अंडे के कक्ष के माध्यम से ऑप्टिकल जेड-सेक्शन का ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण और कॉन्फोकल (ए) या सुपर-रिज़ॉल्यूशन (बी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डीएनए (नीला) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग। (ए) इष्टतम कॉन्फोकल मापदंडों का उपयोग करके अधिग्रहित जेड-स्टैक का प्रक्षेपण। वीसीजी-जीएफपी का इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण एफसी (ए', तीर) में जेड-अक्ष में देखा जा सकता है। बीएम भी दिखाई देता है और बहुत उज्ज्वल (ए', एरोहेड्स) दिखाई देता है। (बी) इष्टतम सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रोसेसिंग का उपयोग करके अधिग्रहित जेड-स्टैक का प्रक्षेपण। अच्छी तरह से परिभाषित इंट्रासेल्युलर डिब्बों और पुटिकाओं में वीकेजी-जीएफपी एफसी (बी', तीर) में जेड-अक्ष में देखा जा सकता है। बीएम भी बहुत अच्छी तरह से परिभाषित है (बी ', एरोहेड्स)। मानक कॉन्फोकल इमेजिंग और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के बीच का अंतर स्पष्ट है, क्योंकि मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में सुपर-रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करते समय वीकेजी-जीएफपी और बीएम के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण को काफी अधिक परिभाषित किया जाता है। इसके अलावा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा ली गई छवि में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक जेड-स्टैक का 3 डी पुनर्निर्माण कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग करके अधिग्रहित और संसाधित किया गया है( ए-बी) वीकेजी-जीएफपी (हरा) व्यक्त करने वाले अंडे कक्षों के जेड-स्टैक (मिश्रित दृश्य) का 3 डी प्रतिपादन और डीएनए (नीला) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग। (ए) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अधिग्रहित जेड-स्टैक का 3 डी प्रतिपादन। वीकेजी-जीएफपी युक्त डिब्बों और पुटिकाओं का स्थान और आकार पूरे कोशिकाओं (ए') में देखा जा सकता है। (बी) इष्टतम सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रोसेसिंग के माध्यम से अधिग्रहित जेड-स्टैक का 3 डी प्रतिपादन। वीकेजी-जीएफपी युक्त डिब्बों और पुटिकाओं का स्थान और आकार देखा जा सकता है (बी')। पुटिकाओं के आकार, साथ ही साथ बीएम और नाभिक, सुचारू रूप से परिभाषित किए जाते हैं, और संकल्प कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (बी 'और ए' की तुलना में) की तुलना में अधिक है। वीकेजी-जीएफपी युक्त डिब्बों और पुटिकाओं के आकार और आकार को सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (बी 'और ए' की तुलना में) का उपयोग करके बेहतर ढंग से निर्धारित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: क्रैग में वीकेजी-जीएफपी स्थानीयकरण की विशेषता ने एफसी को खटखटाया। (ए-बी) वीकेजी-जीएफपी (हरा) व्यक्त करने वाले अंडे के कक्ष के माध्यम से अनुदैर्ध्य अनुभाग, डीएनए (नीला) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग और इष्टतम सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रसंस्करण के माध्यम से अधिग्रहित किया गया। (ए) वाइल्डटाइप क्रैग को व्यक्त करने वाली नियंत्रण रेखा, उचित बीएम जमाव के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन। एफई विशिष्ट बीएम प्रोटीन स्थानीयकरण दिखाता है, जिसमें वीकेजी-जीएफपी इंट्रासेल्युलर रूप से वितरित किया जाता है और एफई (ए ') में बेसली जमा किया जाता है। (बी) ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइन एफई में क्रैग के लिए आरएनएआई को व्यक्त करती है, जिसके परिणामस्वरूप क्रैग नॉकडाउन होता है। क्रैग के नुकसान से एफई (बी', तीर और तीरहेड्स) में बीएम प्रोटीन (जैसे, वीकेजी-जीएफपी) के मिसलोकलाइजेशन की ओर जाता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि का उपयोग क्रैग के नुकसान से जुड़े बीएम मिसलोकलाइजेशन फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। विशेष रूप से, कुछ क्रैग आरएनएआई एफसी, बीएम प्रोटीन (बी ', एरोहेड्स) का एक मजबूत एपिकल मिसलोकलाइजेशन दिखाते हैं, जबकि अन्य क्रैग आरएनएआई एफसी एक कमजोर एपिकल मिसलोकलाइजेशन (बी ', तीर) पेश करते हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग स्पष्ट रूप से क्रैग (बी', एरोहेड्स बनाम तीर) के नुकसान से जुड़े फेनोटाइप को प्रकट करती है। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग करके वीकेजी-जीएफपी और जीएम -130 (गोल्गी मार्कर) का कोलोकलाइजेशन( ए-डी) वीकेजी-जीएफपी व्यक्त करने वाले अंडे कक्षों के माध्यम से अनुदैर्ध्य वर्गों और सीआईएस-गोल्गी मार्कर (जीएम -130, लाल) के लिए इम्यूनोस्टेन, कॉन्फोकल (ए, बी) या सुपर-रिज़ॉल्यूशन (सी, डी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेज किया गया। (ए, बी) कॉन्फोकल इमेजिंग से पता चलता है कि इंट्रासेल्युलर वीकेजी-जीएफपी आंशिक रूप से सीआईएस-गोल्गी मार्कर (ए, एरोहेड) के साथ कोलोकलाइज़ करता है। (बी) (ए) का ज़ूम-इन क्षेत्र। सफेद तीर के साथ हरे (वीकेजी-जीएफपी) और लाल (जीएम -130) पिक्सेल के वितरण को हिस्टोग्राम (बी') में प्लॉट किया गया है। हिस्टोग्राम का एक्स-अक्ष तीर के साथ दूरी (μm) का प्रतिनिधित्व करता है जबकि y-अक्ष पिक्सेल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। अतिव्यापी हरे और लाल चोटियों (*) से पता चलता है कि वीकेजी-जीएफपी और जीएम -130 कोलोकलाइज़ कहां हैं। (सी, डी) सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग से यह भी पता चलता है कि इंट्रासेल्युलर वीकेजी-जीएफपी आंशिक रूप से सीआईएस-गोल्गी मार्कर (सी, एरोहेड) के साथ कोलोकलाइज़ करता है। (डी) (सी) का ज़ूम-इन क्षेत्र। सफेद तीर के साथ हरे (वीकेजी-जीएफपी) और लाल (जीएम -130) पिक्सेल के वितरण को हिस्टोग्राम (डी') में प्लॉट किया गया है। हिस्टोग्राम का एक्स-अक्ष तीर के साथ दूरी (μm) का प्रतिनिधित्व करता है जबकि y-अक्ष पिक्सेल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। अतिव्यापी हरे और लाल चोटियों (*) से पता चलता है कि वीकेजी-जीएफपी और जीएम -130 कोलोकलाइज़ कहां हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग कोलोकलाइज़ेशन को चिह्नित करने और मापने के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग की तुलना में अधिक कुशल और सटीक दृष्टिकोण है। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: प्रतिनिधि छवियों के लिए कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण और प्रसंस्करण पैरामीटर। सभी मुख्य इमेजिंग पैरामीटर प्रदान की गई प्रतिनिधि छवियों के लिए संकलित किए गए हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

बीएम भ्रूण और अंग मॉर्फोजेनेसिस, और वयस्क शारीरिक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएम उपकला ध्रुवीयता की स्थापना और रखरखाव के लिए एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में कार्य करता है और ऊतकों को समर्थनप्रदान करता है 2. फिर भी, बीएम प्रोटीन के उचित प्लेसमेंट को विनियमित करने वाले तंत्र को खराब समझा जाता है। बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और ध्रुवीकृत स्राव के लिए समर्पित जैविक मार्गों की बेहतर समझ के लिए इन मार्गों के घटकों और बीएम प्रसंस्करण में उनकी भूमिकाओं के सावधानीपूर्वक विश्लेषण की आवश्यकता होती है। इसे प्राप्त करने का एक तरीका कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उपयोग करना है। यहां, हमने कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एफई में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव को कुशलतापूर्वक चित्रित करने के लिए ड्रोसोफिला अंडाशय की तैयारी और धुंधला या इम्यूनोस्टेनिंग के तरीकों का वर्णन किया है।

जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती स्थितियों में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर तस्करी और स्राव की कल्पना करने के लिए प्रोटीन जाल और अंतर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन के फायदे
प्रदान किया गया प्रोटोकॉल प्रोटीन जाल का पूरा लाभ उठाता है और अंतर्जात रूप से टैग किए गए बीएम प्रोटीन (जैसे, वीकेजी-जीएफपी और पीसीएन-जीएफपी) को छवि और जंगली प्रकार (नियंत्रण) और उत्परिवर्ती स्थितियों में एफई में बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण और वितरण का आकलन करने के लिए। बीएम प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के उपयोग पर इन लाइनों के महत्वपूर्ण फायदे हैं। सबसे पहले, ब्याज के विशिष्ट प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी अक्सर दुर्लभ और कम बहुतायत में होते हैं। इसके अलावा, एंटीबॉडी से जुड़े ऊतक प्रवेश के साथ अक्सर समस्याएं होती हैं जो ब्याज के प्रोटीन के गलत अवलोकन और मूल्यांकन का कारण बन सकती हैं। इसके अलावा, प्रोटीन ट्रैप लाइनों को विभिन्न आनुवंशिकी पृष्ठभूमि में डाला जा सकता है जिसका उपयोग बीएम के उचित जमाव के लिए आवश्यक कारकों के कार्यों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है जैसे (i) जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के तरीके (जैसे, यूएएस / अंत में, इन प्रोटीन जाल का उपयोग लाइव इमेजिंग57 का उपयोग करके बीएम के स्थानीयकरण और कार्य की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।

हालांकि, ब्याज के प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट टैग का संलयन इसके स्थानीयकरण और कार्यों में हस्तक्षेप कर सकता है। इस प्रकार, प्रोटीन पर टैग के किसी भी विचलित प्रभाव का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करने का एक तरीका है कि फ्लोरोसेंट टैग के अलावा बीएम प्रोटीन के कार्य और स्थानीयकरण में हस्तक्षेप नहीं करता है, यह निर्धारित करना है कि ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइन समरूप व्यवहार्य है या नहीं। यहां और पहले वर्णित विभिन्न प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली वीकेजी-जीएफपी और पीसीएन-जीएफपी लाइनें दोनों समरूप व्यवहार्य हैं, यह दर्शाता है कि जीएफपी टैग के अलावा इन आवश्यक प्रोटीन29,30 के कार्य में हस्तक्षेप नहीं करता है।

इमेजिंग के लिए ऊतक तैयारी, निर्धारण और धुंधला का महत्व
एफई को कुशलतापूर्वक और सटीक रूप से छवि देने के लिए, डिम्बग्रंथि ऊतक को ठीक से तैयार करना, ठीक करना और दागना महत्वपूर्ण है जैसा कि इस विधि में निर्देशित किया गया है। सबसे पहले, विच्छेदन के बाद, निर्धारण से पहले अन्य सभी अंगों को सावधानीपूर्वक हटा दें और मलबे को उड़ाएं। ऊतक को ठीक करने के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह उज्ज्वल जीएफपी प्रतिदीप्ति की ओर जाता है और अधिकांश एंटीबॉडी के साथ संगत है। हालांकि, पीएफए सभी एंटीबॉडी के साथ संगत नहीं हो सकता है; कुछ को ग्लूटाराल्डिहाइड या मेथनॉल निर्धारण की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, प्राथमिक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन के कारण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से बचने के लिए, डिम्बग्रंथि ऊतक को अवरुद्ध समाधान में कम से कम 1 घंटे के लिए एक नुटिंग प्लेटफ़ॉर्म घुमाव पर ऊष्मायन किया जाना चाहिए, और प्रोटोकॉल में वर्णित प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद बड़े पैमाने पर कई बार धोया जाना चाहिए। अंत में, डिम्बग्रंथि ऊतक के उचित बढ़ते इष्टतम इमेजिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसके लिए एक दूसरे के ऊपर उनके स्टैकिंग से बचने के लिए व्यक्तिगत अंडे कक्षों के सावधानीपूर्वक पृथक्करण की आवश्यकता होती है। कवरस्लिप के नीचे ऊतक के तैरने से बचने के लिए इमेजिंग से पहले बढ़ते माध्यम को पूरी तरह से पोलीमराइज़ करना भी महत्वपूर्ण है। यह आगे बढ़ते मीडिया को अपने इष्टतम चिंतनशील सूचकांक तक पहुंचने की अनुमति देता है, जो सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। ऐसा करने में विफल रहने से छवि की गुणवत्ता प्रभावित होगी। इसके अलावा, तैयार स्लाइड्स को प्रतिदीप्ति बुझाने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अलावा, डिम्बग्रंथि विच्छेदन और धुंधला53,54,55 के लिए कई अन्य प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं।

उचित अधिग्रहण और प्रसंस्करण मापदंडों का उपयोग इष्टतम इमेजिंग के लिए और कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है
जैसा कि पहले वर्णित है, नमूने की इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अधिग्रहण मापदंडों को ठीक से सेट करना महत्वपूर्ण है। छवि अधिग्रहण के लिए, आरओआई को ज़ूम फ़ंक्शन का उपयोग करके सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए, और फिर फ्रेम आकार और अधिग्रहण गति को बेहतर ढंग से सेट करना चाहिए। इसके अलावा, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, डिटेक्टरों को संतृप्त किए बिना इंट्रासेल्युलर तस्करी की कल्पना करने के लिए लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ को उचित रूप से समायोजित करना महत्वपूर्ण है। इन मापदंडों को अंडरएक्सपोज्ड या ओवरएक्सपोज्ड छवियों (चित्रा 2) से बचने के लिए बहुत सावधानी से सेट किया जाना चाहिए। अंडरएक्सपोज्ड छवियों के परिणामस्वरूप कम रिज़ॉल्यूशन छवियां होंगी, जिसमें इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को कल्पना करना और चिह्नित करना मुश्किल होगा (चित्रा 2 बी)। डिटेक्टर की संतृप्ति के कारण अतिरंजित छवियां डेटा गलत व्याख्या, और कोलोकलाइजेशन कलाकृतियों (चित्रा 2 सी) की ओर ले जाती हैं। यदि उद्देश्य अंतर्जात रूप से टैग किए गए बीएम प्रोटीन के पुटिका स्थानीयकरण को निर्धारित करना है, तो बेसल बीएम में जीएफपी-टैग किए गए प्रोटीन (जैसे, वीकेजी-जीएफपी और पीसीएएन-जीएफपी) से प्रतिदीप्ति डिटेक्टर को जल्दी से संतृप्त करती है। हालांकि, कम जीएफपी-टैग किए गए बीएम प्रोटीन वाले पुटिकाएं मंद दिखाई देंगी। इसलिए, बीएम युक्त इंट्रासेल्युलर संरचनाओं (जैसे, पुटिकाओं) का उपयोग करके छवि संवेदनशीलता सेट करना महत्वपूर्ण है, न कि बीएम (चित्रा 2) पर। पिनहोल आकार का चयन करना भी बहुत महत्वपूर्ण है। आदर्श रूप से, प्रत्येक चैनल के लिए 1 एयू का एक पिनहोल आकार सर्वोत्तम गुणवत्ता वाली छवियों के लिए चुना जाना चाहिए, खासकर जब जेड-अक्ष में रिज़ॉल्यूशन महत्वपूर्ण हो। छोटे पिनहोल आकार पतले ऑप्टिकल वर्गों के लिए इष्टतम है। हालांकि, जब इष्टतम जेड-अक्ष रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता नहीं होती है या जेड-स्टैक पर कब्जा नहीं किया जा रहा है, तो फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए पिनहोल आकार बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, बहुत मंद संकेतों के लिए, पिनहोल आकार को बढ़ाने से उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और अधिक फोटॉनों पर कब्जा करने में मदद मिल सकती है, जिससे डेटा व्याख्या में सहायता मिल सकती है।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए, अंडर-या ओवर-प्रोसेस्ड छवियों को उत्पन्न करने से बचने के लिए डिकॉन्वोल्यूशन प्रोसेसिंग के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए जो खराब रूप से हल किए गए हैं, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। अंत में, एक इष्टतम 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए, सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित सर्वोत्तम अंतराल निर्धारित करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। जेड-सेक्शन (यानी, 0.5 μm से अधिक) के बीच एक अंतराल बहुत बड़ा है, जिससे खराब 3 डी रेंडरिंग होगी और फेनोटाइप के बाद के विश्लेषण को प्रभावित करेगा।

बीएम इंट्रासेल्युलर तस्करी इमेजिंग करते समय पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर सुपर-रिज़ॉल्यूशन का लाभ
जैसा कि परिणाम अनुभाग में सचित्र है, हालांकि बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण और वितरण का कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके सटीक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, वर्णित सुपर-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोण बीएम प्रोटीन युक्त इंट्रासेल्युलर संरचनाओं के संकल्प में महत्वपूर्ण वृद्धि के साथ-साथ एक बढ़ाया सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ अधिक सटीक इमेजिंग डेटा उत्पन्न करता है। इसके अलावा, यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीक उपयोग करने में अपेक्षाकृत आसान है। चूंकि सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में रिज़ॉल्यूशन को काफी बढ़ाता है, एक्स- और वाई-अक्ष में 120 एनएम और जेड-अक्ष में 350 एनएम तक, यह दृष्टिकोण एफसी जैसे उपकला कोशिकाओं में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और स्राव को अधिक सटीक रूप से चिह्नित करके बीएम के ध्रुवीकृत जमाव की हमारी समझ को बहुत प्रभावित करेगा।

इसके अलावा, एक और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दृष्टिकोण (संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी, सिम) और पॉइंट-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (यानी, निकॉन के बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन सॉफ़्टवेयर मॉड्यूल) के लिए डिज़ाइन किए गए डिकॉन्वोल्यूशन एल्गोरिदम का उपयोग पहले बीएम जमाव29 में शामिल कारकों की भूमिका को चिह्नित करने के लिए किया गया है। इन तकनीकों से जुड़े बढ़े हुए संकल्प ने बीएम प्रोटीन की इंट्रासेल्युलर तस्करी और बीएम के संगठन की हमारी समझ में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, ये दृष्टिकोण एयरिस्कैन माइक्रोस्कोपी की तुलना में कुछ सीमाएं पेश करते हैं। उदाहरण के लिए, सिम ऊतक में गहरे ऑप्टिकल जेड-सेक्शन प्राप्त करते समय इष्टतम छवियों को प्राप्त करने में बहुत कुशल नहीं है। यह बीएम बयान में शामिल नए घटकों के लिए स्क्रीनिंग करते समय सिम का उपयोग करना मुश्किल बनाता है। इसके अलावा, कॉन्फोकल छवियों पर लागू डिकॉन्वोल्यूशन एल्गोरिदम का उपयोग सुपर-रिज़ॉल्यूशन के समान स्तर को प्राप्त नहीं करता है। कुल मिलाकर, निश्चित ऊतक पर एयरिस्कैन सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग बीएम इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और बयान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और बेहतर दृष्टिकोण है।

हालांकि, किसी भी अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ, कुछ असुविधाएं भी इस दृष्टिकोण से जुड़ी हुई हैं, और इमेजिंग करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, सुपर-रिज़ॉल्यूशन मोड को आमतौर पर कॉन्फोकल मोड की तुलना में नमूने के लंबे अधिग्रहण समय की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, अधिग्रहण मापदंडों और ब्याज के क्षेत्र को नमूने को फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए सावधानीपूर्वक सेट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पन्न छवि फ़ाइलें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पन्न फ़ाइलों की तुलना में बहुत बड़ी हैं और छवि प्रसंस्करण और भंडारण के लिए विशेष कंप्यूटर या सर्वर की आवश्यकता हो सकती है।

अंत में, ड्रोसोफिला ओजेनेसिस के दौरान बीएम प्रोटीन की लाइव इमेजिंग का उपयोग बीएम ध्रुवीयता57 में शामिल नए कारकों को चिह्नित करने के लिए किया गया है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाएं हैं, विशेष रूप से बीएम प्रोटीन तस्करी के दौरान इंट्रासेल्युलर संरचनाओं के संकल्प में। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत जमाव में पहचाने गए कारकों की भूमिकाओं को ठीक से निर्धारित करने के लिए लाइव इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है।

अंतर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उपयोग करके वेसिकुलर ट्रैफिकिंग के लिए समर्पित इंट्रासेल्युलर घटकों के स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति के अन्य अनुप्रयोग
विकास के दौरान और एक वयस्क जीव में ऊतकों और अंगों की स्थापना और रखरखाव सेल-टू-सेल सिग्नलिंग और सेलुलर तनाव और आसंजन पर निर्भर करता है। ये प्रक्रियाएं इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग, एंडोसाइटोसिस, एक्सोसाइटोसिस और विशिष्ट प्रोटीन के स्राव पर निर्भर करती हैं। इस प्रकार, अंतर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन और कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बीएम के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग को समझने के लिए यहां वर्णित विधियों को प्रत्येक प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, अंतर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता आनुवंशिक संपादन के उपयोग में आसानी इस दृष्टिकोण को और भी बहुमुखी और शक्तिशालीबनाती है 58।

अंत में, हमने कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ड्रोसोफिला अंडाशय के एफई में बीएम प्रोटीन की तैयारी और इमेजिंग के तरीकों का वर्णन किया है। इन प्रोटोकॉल को बीएम प्रोटीन के उचित प्लेसमेंट के लिए समर्पित नए घटकों की पहचान करने के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है। अंत में, इस पद्धति के रोजगार में हमारी समझ में महत्वपूर्ण योगदान देने की क्षमता है कि उपकला कोशिकाएं बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत स्राव को कैसे नियंत्रित करती हैं, उपकला वास्तुकला की स्थापना और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

पांडुलिपि पर उनकी उपयोगी टिप्पणियों के लिए लेखक जूली मर्कल के आभारी हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान आर 15 जीएम 137236 से ओडी द्वारा समर्थित किया गया था। कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को एयरिस्कैन 2 के साथ ज़ीस एलएसएम 900 का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था, जिसे एनएसएफ एमआरआई अनुदान 2018748 के साथ खरीदा गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

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References

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Shah, H. P., Devergne, O. Confocal… More

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

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