Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Summary

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Abstract

Die Basalmembran (BM) - ein spezialisiertes Blatt extrazellulärer Matrix, das auf der Basalseite von Epithelzellen vorhanden ist - ist entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Epithelgewebemorphologie und Organmorphogenese. Darüber hinaus ist das BM für die Gewebemodellierung unerlässlich, dient als Signalplattform und liefert externe Kräfte, um Gewebe und Organe zu formen. Trotz der vielen wichtigen Rollen, die die BM während der normalen Entwicklung und der pathologischen Zustände spielt, sind die biologischen Wege, die den intrazellulären Transport von BM-haltigen Vesikeln kontrollieren und wie die basale Sekretion zur polarisierten Ablagerung von BM-Proteinen führt, kaum verstanden. Das follikuläre Epithel des Drosophila-Eierstocks ist ein hervorragendes Modellsystem, um die basale Ablagerung von BM-Membranproteinen zu untersuchen, da es alle wichtigen Komponenten des BM produziert und absondert. Konfokale und hochauflösende Bildgebung in Kombination mit Bildverarbeitung in festsitzenden Geweben ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung zellulärer Faktoren, die spezifisch am intrazellulären Transport und der Ablagerung von BM-Proteinen beteiligt sind. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Färbung und Bildgebung von BM-haltigen Vesikeln und abgelagerten BM unter Verwendung von endogen markierten Proteinen im Follikeliphel des Drosophila-Eierstocks vor. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um sowohl qualitative als auch quantitative Fragen zu beantworten, und es wurde entwickelt, um Hochdurchsatz-Screening zu ermöglichen, was die schnelle und effiziente Identifizierung von Faktoren ermöglicht, die am polarisierten intrazellulären Transport und der Sekretion von Vesikeln während der Entwicklung des Epithelgewebes beteiligt sind.

Introduction

Die Basalmembran (BM) ist eine dünne Schicht aus geschichteter zelladhärenter extrazellulärer Matrix (ECM), die für die Epithelstruktur und Morphogenese 1 entscheidend^ist. Es besteht aus ~ 50 Proteinen und wird ubiquitär unter den Epithel- und Endothelzellen gefunden und umhüllt Skelett-, Glatt- und Herzmuskelzellen^und Adipozyten ^1,2,3. Die drei Hauptkomponenten des BM an der Basalseite der Epithelzellen sind Kollagen IV, Perlecan und Laminine. Das BM liegt den Epithelzellen zugrunde und ist für viele Funktionen verantwortlich, einschließlich Gewebetrennung und -barriere, Wachstum und Unterstützung sowie Zellpolarisation 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Seine Rolle als Signalplattform reguliert die Morphologie und Differenzierung von Epithelzellen und -geweben während der Entwicklung 3,13,14. Darüber hinaus sind die Fehlregulation des BM und / oder eine Verletzung seiner Integrität die Hauptursachen für viele pathologische Zustände, einschließlich Tumormetastasen ^2,15,16. Trotz der wesentlichen Funktionen, die das BM während der Gewebe- und Organmorphogenese ausführt, sind die Bestandteile der biologischen Signalwege, die dem polarisierten intrazellulären Transport und der Sekretion von BM-Proteinen gewidmet sind, vage bekannt.

Um den intrazellulären Transport von BM-haltigen Vesikeln und die Sekretion von BM-Proteinen durch Epithelzellen zu untersuchen, ist das follikuläre Epithel (FE) des Drosophila-Eierstocks ein leistungsfähiges Modellsystem (Abbildung 1). Ein Drosophila-Eierstock besteht aus 16-20 langen, röhrenartigen Strukturen, die als Ovariolen bezeichnet werden (Abbildung 1A,B)^17,18,19. Jede Eizelle kann als ein Eierfließband betrachtet werden, mit dem Altersverlauf der Eikammern (die jeweils ein Ei entstehen lassen), das am vorderen Ende beginnt und sich nach hinten bewegt, bis das reife Ei durch den Eileiter austritt. Jede Eizellkammer wird von der FE eingekapselt, einer Monoschicht aus somatischen Follikelzellen (FCs), die die zentralen Keimbahnzellen (GCs) umgibt. Die FE ist stark polarisiert mit einer ausgeprägten apikal-basalen Polarität, bei der die apikale Domäne der Keimbahn zugewandt ist und die BM-Proteine basal^18,19 sezerniert werden. Die FCs sezernieren aktiv alle Hauptkomponenten des BM, einschließlich Kollagen IV, Perlecan und Laminine^20,21. In Epithelzellen wie FCs werden die BM-Komponenten hergestellt und benötigen für ihre extrazelluläre Abscheidung einen spezialisierten polarisierten Sekretionsweg. Zum Beispiel sind im Fall der am häufigsten vorkommenden Komponente des BM, Collagen IV (Coll IV), die Details rund um seinen polarisierten intrazellulären Verkehr und seine Sekretion vage, obwohl seine Produktion und Ablagerung im Mittelpunkt vieler Studien stehen. Coll IV wird in das endoplasmatische Retikulum (ER) übersetzt, wo auch jede Fibrille - bestehend aus drei Polypeptiden (zwei α1-Ketten und einer α2-Kette) - zu einer Dreifachhelix²² zusammengesetzt ist. Die richtige Koll IV-Faltung und -Funktion erfordern ER-Chaperone und Enzyme, einschließlich Lysyl^- und Prolyl-Hydroxylasen wie Plod und PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Diese posttranslationalen Enzyme regulieren die ER-Sortierung von Coll IV, da der Verlust jedes einzelnen dazu führt, dass Coll IV im basalen ER 20,23,24,25,26 gefangen ist. Dann verlässt neu synthetisiertes Coll IV die Notaufnahme für den Golgi in COPII-beschichteten Vesikeln. Der Frachtrezeptor Tango1 hilft beim Verpacken von Kollagenen in beträchtliche Golgi-gebundene Vesikel, die große multimere Proteine aufnehmen können^20,27. Sobald Coll IV in intrazelluläre exozytäre Vesikel verpackt ist, wird es spezifisch basal aus Epithelzellen sezerniert. Um die BM-Ablagerung auf die Basalseite zu lenken, benötigen Epithelzellen einen weiteren Satz von Faktoren, die speziell für die polarisierte BM-Sekretion bestimmt sind. Unter Verwendung der FE des Drosophila-Eierstocks wurden einige Komponenten dieses neuartigen zellulären Prozesses charakterisiert, darunter die Nukleotidaustauschfaktoren (GEFs) Crag und Stratum, die GTPasen Rab8 und Rab10 sowie die Spiegel des Phosphoinositids PI(4,5)P2 und der Kinesin 1 und 3 Motorproteine 20,28,29,30,31 . Diese Komponenten sind entscheidend für die Sicherstellung der polarisierten Verteilung von BM-Proteinen.

Um die intrazelluläre Lokalisation von BM-Proteinen in der FE zu überwachen, können endogen markierte Basalmembranproteine (Proteinfallen) wie Viking-GFP (Vkg-GFP oder α2 Coll IV-GFP) und Perlecan-GFP (Pcan-GFP) verwendet^{werden 32,33}. Es wurde gezeigt, dass diese Proteinfallenlinien die endogene Verteilung von BM-Proteinen genau widerspiegeln und einen empfindlicheren Nachweis des vesikulären Verkehrs ermöglichen ^28,30. Die Komponenten, die an der polarisierten Abscheidung von BM in der FE beteiligt sind, wurden zunächst mit Hilfe von Proteinfallenlinien für Vkg-GFP und Pcan-GFP^20,28,29,30 charakterisiert. Proteinfallen können in verschiedenen genetischen Hintergründen verwendet werden, einschließlich Mutanten und Gal4-Linien ³⁴. Darüber hinaus können Proteinfallen in Kombination mit fluoreszierenden Farbstoffen und/oder Fluoreszenzimmunfärbung verwendet werden, was eine präzise Charakterisierung der Lokalisation von BM-Proteinen beim Vergleich von Wildtyp- und Mutantenbedingungen^{ermöglicht 35}.

Um die Verteilung und Lokalisation von BM-proteinhaltigen Vesikeln genau und effizient beurteilen zu können, stellen konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) und hochauflösende Bildgebungsverfahren einen wesentlichen Vorteil gegenüber anderen bildgebenden Verfahren dar. Diese Ansätze koppeln hochauflösende Bildgebung mit relativer Benutzerfreundlichkeit. CLSM ist eine Mikroskopietechnik, die eine verbesserte optische Auflösung ermöglicht, indem die Probe mit einem Laser in Rasterscan-Manier mit Galvanometern abgetastet wird. Die Lochblende ist eine Kernkomponente eines konfokalen Mikroskops. Durch das Blockieren der unscharfen Signale, die von oberhalb oder unterhalb der Brennebene kommen, führt die Lochblende zu einer sehr überlegenen Auflösung in der z-Achse³⁶. Dies ermöglicht es auch, eine Reihe von Bildern in der z-Ebene zu erhalten, die als Z-Stack bezeichnet wird und einer Reihe von optischen Schnitten entspricht. z-stacks erstellen anschließend ein 3D-Bild der Probe per 3D-Rekonstruktion mit Hilfe von Bildgebungssoftware. Herkömmliche Epifluoreszenzmikroskope (Weitfeldmikroskope) ermöglichen im Gegensatz zu konfokalen Mikroskopen, dass unscharfes Licht zur Bildqualität beiträgt und die Bildauflösung und den Kontrast verringert^36,37. Dies macht die Epifluoreszenzmikroskopie zu einem weniger attraktiven Kandidaten bei der Untersuchung der Proteinlokalisation oder -kolokalisation.

Obwohl CLSM ein geeigneter Ansatz für verschiedene Anwendungen ist, einschließlich der Bildgebung und Charakterisierung des intrazellulären Transports von BM-Proteinen, stellt es immer noch ein Problem dar, wenn Proben unterhalb der Beugungsgrenze von Abbe des Lichts (200-250 nm) abgebildet werden. Bei der Abbildung solcher Proben kann die konfokale Mikroskopie, insbesondere bei Verwendung eines Ölobjektivs, zu einer hohen Auflösung führen. Super-Resolution-Techniken überschreiten jedoch die Grenze der konfokalen Mikroskopie. Es gibt verschiedene Ansätze, um eine hochauflösende Mikroskopie zu erreichen, die jeweils spezifische Auflösungsgrenzen aufweisen und jeweils für unterschiedliche Analysen geeignet sind. Zu diesen Ansätzen gehören die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) oder die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), die stimulierte Emissionsdeplementierungsmikroskopie (STED), die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) und die Airyscan (Superauflösung) Mikroskopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Obwohl Airyscan eine gröbere Auflösung als PALM / STORM, STED und SIM hat, kann es immer noch eine Auflösung von bis zu ~ 120 nm (etwa doppelt so hoch wie CLSM) erreichen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass dieser hochauflösende Mikroskopieansatz einen Vorteil gegenüber SIM und anderen hochauflösenden Techniken hat, wenn dicke Proben und Proben mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis^47,48 abgebildet werden.

Airyscan ist eine relativ neue hochauflösende konfokale Mikroskopie-Technologie⁴⁶. Im Gegensatz zu herkömmlichen CLSMs, die die Pinhole- und Einzelpunktdetektoren verwenden, um unscharfes Licht abzulehnen, verwendet dieser superauflösende Ansatz einen 32-Kanal-Galliumarsenid-Phosphid (GaAsP) Photomultiplier-Röhrenflächendetektor, der das gesamte Licht an jeder Scanposition⁴⁵ sammelt. Jeder der 32 Detektoren arbeitet als kleines Loch und reduziert die Lochgröße von der traditionellen 1.0 Airy Unit (A.U.) auf eine verbesserte 0,2 A.U., was eine noch höhere Auflösung und ein noch höheres Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht, während die Effizienz eines Durchmessers von 1,25 A^{A 45} beibehalten wird. Darüber hinaus führt die von Airyscan verwendete lineare Dekonvolution zu einer bis zu^2-fachen Erhöhung der Auflösung 45. In Anbetracht dessen sind CLSM und insbesondere die hochauflösende Mikroskopie gut geeignet, um BM-Proteine und Proteine zu untersuchen, die die basale Ablagerung von BM-Proteinen regulieren, da sie sehr hochauflösende Bilder für Lokalisierungs- und Kolokalisierungsstudien liefern können und dadurch neue Einblicke in die räumlichen, zeitlichen und molekularen Ereignisse liefern, die diese Prozesse steuern.

Ein alternativer Ansatz für die konfokale Mikroskopie, der zur Durchführung von Lokalisierungsexperimenten verwendet werden kann, ist die Bilddekonvolution. Da die Weitfeldmikroskopie es ermöglicht, dass unscharfes Licht die Detektoren erreicht, können mathematische und rechnerische Dekonvolutionsalgorithmen angewendet werden, um unscharfes Licht aus Bildern zu entfernen oder neu zuzuweisen, die durch Weitfeldmikroskopie erhalten wurden, wodurch die Auflösung und der Kontrast des Bildes^{verbessert werden 49}. Dekonvolutionsalgorithmen können auch auf konfokale Bilder angewendet werden, um die Auflösung und den Kontrast weiter zu erhöhen, wodurch endgültige Bilder erzeugt werden, die fast mit denen der hochauflösenden Mikroskopie⁵⁰ vergleichbar sind. Airyscan nutzt die weiner-filterbasierte Dekonvolution zusammen mit Sheppards Pixelneuzuweisung, was zu einer stark verbesserten räumlichen Auflösung und einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis führt. Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie wird bei Verwendung dieser hochauflösenden Mikroskopietechnik eine Erhöhung der Auflösung um das 2-fache in allen drei räumlichen Dimensionen (120 nm in x und y und 350 nm in z) beobachtet ^45,51.

Dieses Manuskript bietet detaillierte und optimierte Protokolle zur Färbung, Erfassung und Visualisierung des intrazellulären Transports und der Ablagerung von BM-Proteinen unter Verwendung der FE des Drosophila-Eierstocks als Modellsystem in Verbindung mit konfokaler und hochauflösender Mikroskopie. Drosophila-Linien , die endogen markierte Basalmembranproteine exprimieren, z. B. Vkg-GFP und Pcan-GFP, sind effiziente und genaue Werkzeuge zur Visualisierung des BM-Proteintransports und der Sekretion. Darüber hinaus können sie problemlos in verschiedenen genetischen Hintergründen verwendet werden, einschließlich Mutanten- und Gal4 / UAS-Linien ³⁴. Obwohl endogen markierte Basalmembranproteine empfohlen werden, ist die Verwendung von Antikörpern gegen spezifische BM-Proteine auch mit den beschriebenen Protokollen kompatibel. Diese Protokolle sind besonders nützlich für Wissenschaftler, die daran interessiert sind, den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen in intaktem Epithelgewebe mittels konfokaler und hochauflösender Bildgebung zu untersuchen. Darüber hinaus macht die Fähigkeit, die epitheliale Gewebeanalyse mit den expansiven Werkzeugen der Drosophila-Genetik zu kombinieren, diesen Ansatz besonders leistungsfähig. Schließlich könnten diese Protokolle leicht angepasst werden, um den vesikulären Transport und die Sortierung anderer interessanter Proteine zu untersuchen.

Protocol

1. Fliegenvorbereitung für Eierstockdissektionen

1. Geben Sie 10-15 Drosophila melanogaster weibliche Fliegen (1-2 Tage alt) des gewünschten Genotyps in eine schmale Durchstechflasche mit ~ 8 ml Drosophila-Fliegenmedium , die 2-3 Tage vor der Dissektion bei 25 ° C mit einer kleinen Menge granulierter Bäckerhefe bestreut wurde. Das Hinzufügen einiger Männchen zur Durchstechflasche kann den Eizellenertrag steigern. Stellen Sie jedoch sicher, dass die Gesamtzahl der Fliegen 20 nicht überschreitet, da dies die Entwicklung der Eierstöcke negativ beeinflussen kann.
   HINWEIS: Eine Beschreibung der Drosophila-Männer und -Frauen sowie nützliche Tipps und Ratschläge für Wissenschaftler ohne vorherige Drosophila-Erfahrung finden Sie in den zitierten Artikeln^34,52. Die Zugabe von Hefe stimuliert die Eierproduktion und erzeugt Eierstöcke mit verschiedenen Stadien. Darüber hinaus wird es auch die Eierstöcke mästen und sie leichter ausschneiden lassen. Nasse Hefe kann auch anstelle von granulierter Hefe verwendet werden, aber für schwächere Bestände können die Fliegen stecken bleiben und sterben.

2. Eierstockdissektion und -fixierung

HINWEIS: Für zusätzliche Ressourcen zur Eierstockdissektion und -färbung werden die Leser auf die zitierten Protokolle^53,54,55 verwiesen.

1. Stellen Sie am Tag der Dissektion eine frische Fixierlösung mit einer Endkonzentration von 4% Paraformaldehyd (PFA) her, indem Sie die PFA-Stammlösung in 1x Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS) verdünnen.
2. Betäuben Sie die Fliegen mit CO 2 und legen Sie sie auf ein Fliegenpolster_. Halten Sie die Fliegen bis zur Dissektion betäubt. Betrachten Sie Fliegen als richtig betäubt, sobald ihre Bewegungen aufgehört haben, was normalerweise 10-20 s dauert.
   HINWEIS: Obwohl die Verwendung von CO₂ als sicherere und schnellere Option empfohlen wird, können Fliegen mit Eis betäubt werden.
3. Legen Sie einen konkaven Glasobjektträger oder eine Färbeschale mit flachen Vertiefungsbrunnen unter ein Seziermikroskop und füllen Sie die Vertiefungen mit 1x PBS.
4. Greifen Sie eine weibliche Fliege am unteren Thorax mit einer Pinzette. Stellen Sie das Geschlecht der Fliegen durch das Fehlen männlicher Genitalien am hinteren Ende des Abdomens und das Fehlen von Geschlechtskämmen an ihren Vorderbeinen als sekundäres Merkmal^{sicher 52}. Sezieren Sie Fliegen einzeln mit einem anderen Paar Pinzetten (Schritt 2.5), während Sie sie in Vertiefungen tauchen, die mit 1x PBS unter dem Seziermikroskop gefüllt sind (20-fache Vergrößerung wird empfohlen).
5. Während Sie durch das Seziermikroskop schauen, ziehen Sie mit einer anderen Pinzette am hinteren Teil des Fliegenabdomens und machen Sie die inneren Organe (z. B. Eierstöcke, Darm) sichtbar.
6. Drücken Sie vorsichtig den vorderen Teil des Fliegenabdomens (wie bei einer Tube Zahnpasta), um die Eierstöcke aus dem Bauch zu drücken. Diese Methode sollte die Eierstöcke intakt halten. Lösen und entfernen Sie vorsichtig andere Organe und Fliegentrümmer.
7. Trennen Sie mit einer Pinzette oder Seziernadeln die Ovariolen des Eierstocks, während die gesamte Eierstockstruktur intakt bleibt. Der Zweck dieses Schrittes ist es, die Muskelscheide, die die Eierstöcke bedeckt, zu brechen und eine effizientere und homogenere Färbung zu ermöglichen.
8. Übertragen Sie die Eierstöcke schnell auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1x PBS und halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis alle Fliegen seziert sind. Halten Sie die Röhre nicht auf Eis, wenn Mikrotubuli oder Mikrofilamente (oder Vesikel, die von diesen Zytoskelettkomponenten transportiert werden) sichtbar gemacht werden sollen, da dies zu einer Depolymerisation führen kann.
9. Sobald alle Eierstöcke seziert und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt wurden, lassen Sie sie auf den Boden des Röhrchens sinken und entfernen Sie alle bis auf ~ 50 μL des PBS. Fügen Sie 1 ml 4% PFA hinzu und legen Sie ihn 15 min auf eine nutierende Plattformwippe. Wichtig ist, dass Sie überprüfen, ob sich die Eierstöcke in der Fixationslösung hin und her bewegen, um eine ordnungsgemäße Fixierung zu ermöglichen, da eine unvollständige Fixierung zu Flecken- und Bildgebungsproblemen führen kann.
   HINWEIS: Die Geschwindigkeit des Nutators ist nicht entscheidend. Während einige Nutatoren eine Geschwindigkeitsregelung haben, kommen andere mit einer voreingestellten Geschwindigkeit. Die voreingestellte Drehzahl ist ausreichend und wird, wenn einstellbar, auf 40-50 U / min eingestellt.
10. Entfernen Sie die Fixierlösung (wie in Schritt 2.9) und führen Sie dann zwei Schnellwäschen mit 1 ml 1x PBS durch, die 0,1% Triton-X 100 (1x PBST) enthalten, indem Sie die Mikrofugenröhrchen 5-6 Mal vorsichtig umkehren. Fahren Sie dann mit vier 10-15-minütigen Wäschen (lange Wäsche) mit 1 ml 1x PBST (insgesamt 40-60 Minuten) fort.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 für Waschungen zu verwenden, da eine Erhöhung des Waschmittelanteils zu einer GFP-Denaturierung führen könnte, was zu einer verminderten Fluoreszenz und dem Nachweis von GFP-markierten BM-Proteinen führt.
11. Für die Farbstofffärbung, z. B. DNA- und F-Aktin-Färbung, fahren Sie mit Schritt 3 fort. Fahren Sie für die Immunfärbung mit Schritt 4 fort. Die Eierstöcke können in 1x PBST bei 4 °C bis zu 24 h gelagert werden, bevor sie fortfahren.

3. Standard-DNA/F-Actin-Färbung

1. Nach dem Fixieren und Waschen PBST entfernen. 500 μL DNA und F-Actin-Färbelösung hinzufügen. Zur Herstellung der DNA/F-Actin-Lösung mischen Sie Hoechst (DNA-Färbung; 1:1000-Verdünnung von 1 mg/ml Stammlösung) und Fluorophor-markiertes Phalloidin (F-Aktin-Färbung; 1:500-Verdünnung für Alexa Fluor 546 oder 1:100-Verdünnung für Alexa Fluor 647, jeweils 66 μM Stammlösung) in 500 μL PBST.
2. Decken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um die Eierstöcke und Farbstoffe im Dunkeln zu halten, um die Fluoreszenz für eine effiziente Bildgebung aufrechtzuerhalten, und inkubieren Sie sie 15 min lang auf einer nutierenden Plattformwippe.
3. Nach der Inkubation wird die DNA/F-Actin-Lösung entfernt (wie in Schritt 2.9). Führen Sie zwei Schnellwäschen und drei lange (10-15 min) Wäschen in 1x PBST durch, wie in Schritt 2.10 beschrieben. Fahren Sie mit der Montage wie in Schritt 5 beschrieben fort.

4. Fluoreszenz-Immunfärbung

HINWEIS: Dies ist ein Standard-Immunfärbungsprotokoll für die fluoreszierende Bildgebung und ist mit den meisten primären Antikörpern kompatibel.

1. Blockierung und primäre Antikörperfärbung (Tag 1)
   1. Entfernen Sie nach dem Fixieren und Waschen PBST wie in Schritt 2.9 beschrieben. Fügen Sie 1 ml Blockierlösung (PBS + 5% BSA) hinzu und blockieren Sie die Eierstöcke auf einer nutierenden Plattformwippe für mindestens 1 Stunde.
      HINWEIS: Zusätzlich zu BSA kann der blockierenden Lösung fetales Rinderserum (FBS) oder normales Ziegenserum (NGS) zugesetzt werden. Alternativ können die Eierstöcke über Nacht auf einer nutierenden Plattformwippe bei 4 °C blockiert werden.
   2. Die blockierende Lösung wird wie in Schritt 2.9 beschrieben entfernt und 300 μL primäre Antikörperlösung mit primären Antikörpern, die in den entsprechenden Konzentrationen (spezifisch für den verwendeten Antikörper) verdünnt sind, in die Blockierungslösung gegeben. Über Nacht auf einer nutierenden Plattformwippe bei 4 °C ausbrüten. Entfernen Sie am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung und fahren Sie mit der sekundären Antikörperimmunfärbung fort.
      HINWEIS: Einige primäre Antikörper können gespeichert und wiederverwendet werden. In einigen Fällen können wiederverwendete primäre Antikörper die Hintergrundfärbung reduzieren, was zu einer besseren Bildgebung führt. Die Wiederverwendung sollte jedoch für jeden Antikörper getestet werden, um die Wirksamkeit sicherzustellen.
2. Sekundäre Antikörper-Immunfärbung (Tag 2)
   1. Nachdem Sie die primäre Antikörperlösung entfernt haben, führen Sie zwei Schnellwäschen und vier lange (10-15 min) Wäschen wie in Schritt 2.10 durch. Sorgfältig durchgeführte wiederholte Wäschen mit frischem 1x PBST verringern den unspezifischen Hintergrund und führen zu einer optimalen Bildgebung.
   2. Entfernen Sie PBST wie in Schritt 2.9 und fügen Sie 500 μL sekundäre Antikörperlösung hinzu, die fluoreszierende sekundäre Antikörper enthält, die die verwendeten primären Antikörper nachweisen. Schützen Sie die Röhre vor Licht, indem Sie sie ab diesem Zeitpunkt mit Aluminiumfolie abdecken, um die Fluoreszenz, die für die Bildaufnahme und -analyse entscheidend ist, optimal zu erhalten.
      HINWEIS: Die sekundäre Antikörperlösung sollte sekundäre Antikörper enthalten, die mit Fluorophoren konjugiert sind, die sich nicht mit endogen markierten Proteinen überlappen. Wenn beispielsweise GFP-markierte Proteine verwendet werden, wird die Verwendung von Alexa Fluor-Sekundärantikörpern bei roten oder fernroten Wellenlängen empfohlen (z. B. 546, 568 oder 647 nm). Fluoreszierende Farbstoffe, wie Hoechst und Alexa Fluor 546 oder 647 konjugiertes Phalloidin, können der Sekundärlösung zugesetzt werden. Diese Färbungen könnten hilfreich sein, um die gesamte Zellstruktur (d.h. Kerne und F-Actin) zu markieren. Die Konzentrationen finden Sie in Schritt 3.1.
   3. Die Eierstöcke in der sekundären Antikörperlösung auf einer nutierenden Plattformwippe für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Führen Sie zwei Schnellwäschen und vier lange (10-15 min) Wäschen in 1x PBST wie in Schritt 2.10 durch. Fahren Sie mit der Montage wie in Schritt 5 fort.

5. Montage von gefärbten Eierstöcken

HINWEIS: Diese Methode funktioniert sehr gut, wenn die Eierstöcke gut entwickelt und reichlich vorhanden sind. Die sorgfältige Montage der Eierstöcke auf dem Objektträger ist entscheidend für eine optimale Bildgebung.

1. Verwenden Sie nach der letzten Wäsche eine p1000-Pipette, um die Eierstöcke vorsichtig im Schlauch auf und ab zu pipettieren, um die Eierkammern zu trennen. Lassen Sie die Eierkammern auf den Boden sinken, indem Sie das Rohr für 5-10 min in einer aufrechten Position halten. Eine sorgfältige Trennung der einzelnen Eizellen ist entscheidend, um eine optimale Bildaufnahme zu erreichen.
2. Entfernen Sie PBST mit einer Pasteur-Pipette und lassen Sie ~ 50 μL zurück. Entfernen Sie so viel wie möglich von der verbleibenden PBST mit einer p200-Pipette. Fügen Sie zwei Tropfen Montagemedium hinzu, genug, um sich gleichmäßig auf einem 22 mm x 22 mm großen Deckglas zu verteilen. Eierstöcke können bis zu 1 Monat vor der Montage in Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Mehrere verschiedene Montagemedien sind im Handel erhältlich; Die Verwendung von hart abbindenden Mountants wie Aqua-Poly/Mount oder ProLong Glass Antifade Mountant wird empfohlen, um optimale Bildgebungsbedingungen zu erreichen. Von der Verwendung von Glycerin als Montagemedium wird abgeraten, da es zu schlechten Bildgebungsbedingungen (z. B. Fluorophorinstabilität) führen kann. Bei Montagemedien, die nicht polymerisieren, versiegeln Sie das Deckglas mit einem Deckglasversiegelungsmittel / Nagellack, um es an Ort und Stelle zu befestigen.
3. Beschriften Sie einen Glasträger und wischen Sie ihn mit weichem, staubfreiem Papier ab, um Staub und Fingerabdrücke zu entfernen. Schneiden Sie das Ende einer p200-Pipettenspitze ab, um eine einfache Übertragung des viskosen Montagemediums vom Mikrozentrifugenröhrchen auf den Objektträger zu ermöglichen. Als nächstes übertragen Sie langsam alle Eizellen im Montagemedium auf den Glasobjektträger, um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen.
4. Verteilen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig das Montagemedium und trennen Sie die Eierkammern mit einer neuen p200-Spitze oder einer neuen Pinzette, um einen Bereich von etwa der Größe des Deckglases abzudecken.
5. Legen Sie mit einer Pinzette das Deckglas (mit staubfreiem Papier gereinigt) vorsichtig schräg auf die Eierkammern, um Blasen zu vermeiden.
6. Lagern Sie den Objektträger bei Raumtemperatur auf einer ebenen Oberfläche im Dunkeln für 2 Tage, um zu polymerisieren. Sobald das Montagemedium ausgehärtet ist, kann das Dia bei 4 °C im Dunkeln für einige Wochen zur Bildgebung gelagert werden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Montagemedium vor der Bildgebung hart eingestellt wird. Wenn das Medium noch nicht polymerisiert ist, schwimmen die Eierstöcke unter dem Deckglas, was sich auf die Bildaufnahme auswirkt. Darüber hinaus wird der optimale Reflexionsindex von Trägermedien erst erreicht, wenn er vollständig eingestellt ist (Details siehe Herstellerangaben).
7. Alternative Montagemethode: Diese Methode wird empfohlen, um den Gewebeverlust zu reduzieren, wenn die Eierstöcke nicht reichlich vorhanden sind. Bei diesem Verfahren (unten beschrieben) werden die Ovariolen und die Eizellen auf dem Objektträger während der Montage getrennt, anstatt sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen durch Pipettieren zu trennen, wie in Schritt 5.1 beschrieben.
   1. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche alle bis auf ~ 100 μL der Waschlösung. Übertragen Sie mit einer Pasteur-Pipette oder einer p1000-Pipette die intakten Eierstöcke in PBS auf den Objektträger. Entfernen Sie mit einer p200-Pipette vorsichtig so viel PBST wie möglich von der Folie. Verwenden Sie ein staubfreies Papier, um den PBST bei Bedarf wegzuwischen. Berühren Sie nicht die Eierstöcke.
   2. Fügen Sie zwei Tropfen Mounting-Medien hinzu. Trennen Sie die Ovariolen und Eierkammern vorsichtig mit einer Pinzette oder Seziernadeln. Entfernen und verwerfen Sie Fremdgewebe und verteilen Sie dann die Eizellen und Eizellen im Befestigungsmedium. Fahren Sie mit den Schritten 5.5-5.6 fort.

6. Konfokale Bildaufnahme

HINWEIS: Dieser Abschnitt enthält wichtige Parameter für eine optimale Bildaufnahme mit einem beliebigen konfokalen Mikroskop (Abbildung 2).

1. Richten Sie das Mikroskop ein und suchen Sie die Probe wie unten beschrieben.
   1. Vor der Bildgebung ist es entscheidend, die Region of Interest (ROI) mit dem Okular des Fluoreszenzmikroskops zu lokalisieren. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (20x) oder das Objektiv, das für die Bildaufnahme verwendet werden soll (d. h. 40x oder 63x). Wählen Sie eine Eierkammer aus, um sie abzubilden.
      HINWEIS: Für die Bildaufnahme wird die Verwendung von Objektiven mit hoher Vergrößerung wie 40x oder 63x empfohlen (siehe 6.2.1).
   2. Sobald der ROI ausgewählt ist, fahren Sie mit der Bilderfassung fort. Fahren Sie mit Schritt 6.2 für die konfokale Bildgebung und Schritt 7 für die hochauflösende Bildgebung fort.
2. Wählen Sie die Schlüsselparameter für eine optimale Bildaufnahme wie unten beschrieben aus (Beispiele für Schlüsselparameter für die repräsentativen Bilder finden Sie in Tabelle 1).
   1. Auswahl eines Objektivs: Für die konfokale Bildaufnahme des intrazellulären Transports und der Sekretion von BM-Proteinen in der FE verwenden Sie ein 40-faches oder 63-faches Objektiv.
      HINWEIS: Um die bestmögliche Auflösung zu erreichen, wird die Verwendung von Plan-Apochromat-Objektiven mit hoher numerischer Apertur (NA), die die höchste achromatische Korrektur bieten, dringend empfohlen.
   2. Auswahl von Lasern für jeden Kanal/Spur: Für GFP verwenden Sie Laser 488 nm; Verwenden Sie für DAPI oder Hoechst den Laser 405 nm; für Alexa Fluor 546 oder 568, verwenden Sie Laser 561 nm; und für Alexa Fluor 647, verwenden Sie Laser 640 nm.
      HINWEIS: Jede Laserauswahl führt zu einer anderen Kanal-/Spurbildung. Hier bezieht sich der Begriff Kanal auf das Bild, das durch die aufgezeichnete Intensitätsverteilung für angeregte Fluorophore für den ausgewählten ROI bei der spezifischen Wellenlänge jedes Kanals gebildet wird.
   3. Pinhole-Einstellung: Um unscharfes Licht während der Bildaufnahme zu reduzieren, stellen Sie das Loch für jeden Kanal auf 1 AU ein.
   4. Laserintensität und Detektorverstärkungseinstellungen: Um die Bildempfindlichkeit fein abzustimmen, verwenden Sie sowohl die Detektor-Masterverstärkung als auch die Laserleistung. Um die Bildempfindlichkeit richtig einzustellen, wird eine Bereichsanzeige empfohlen. Stellen Sie sowohl die Masterverstärkung als auch die Laserleistung so ein, dass sie eine angemessene Empfindlichkeit aufweisen, bei der die interessierenden Strukturen (z. B. BM-haltige Vesikel) deutlich sichtbar sind, während eine Sättigung des Detektors vermieden wird.
      HINWEIS: Um Photobleaching zu vermeiden, verwenden Sie die minimal erforderliche Laserleistung. Es wird empfohlen, zuerst die Detektorverstärkung zu erhöhen und dabei die geringstmögliche Laserleistung zu verwenden. Wenn eine Erhöhung der Detektorverstärkung nicht die gewünschte Intensität erreichen kann, erhöhen Sie die Laserleistung. Laserleistungsintensität zwischen 0,5% -1,2% wird empfohlen.
   5. Rahmengröße: Es wird empfohlen, die optimale Bildgröße zu verwenden, die von der Aufnahmesoftware bestimmt wird. Verwenden Sie für die meisten Anwendungen eine maximale Auflösung von 1024 x 1024. Eine höhere Auflösung erhöht die Erfassungszeit erheblich.
   6. Scangeschwindigkeit: Verwenden Sie eine Scangeschwindigkeit zwischen 6-9, die für die meisten Proben sicher ist. Wenn das Sample verrauscht ist, verwenden Sie eine langsamere Scangeschwindigkeit, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Niedrige Scangeschwindigkeiten erhöhen jedoch die Fotobleich- und Aufnahmezeit.
   7. Mittelwertbildung der Intensität: Um die Bildqualität zu verbessern, verwenden Sie die Mittelwertbildung über aufeinanderfolgende Scans mit identischen Einstellungen. Verwenden Sie in den meisten Fällen einen Mittelwert von zwei, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, ohne die Probe zu photobleichen.
   8. Zoom: Passen Sie den Scanbereich mit der Zoomfunktion an. Verwenden Sie einen Zoom zwischen 2x-4x mit 40x und 63x Objektiven als effektivsten Wert, um BM-haltige Vesikel in der FE klar zu visualisieren. Wählen Sie sorgfältig den minimalen ROI aus, um die Erfassungszeit zu verkürzen.
3. Um einen Z-Stack mit der Zeiss Zen-Software zu erwerben, verwenden Sie die folgenden Z-Sectioning-Parameter und legen Sie sie wie unten beschrieben fest.
   HINWEIS: Vesikel und andere intrazelluläre Strukturen, die BM-Proteine enthalten, sind 3-dimensionale (3D) Strukturen. Der Erwerb eines Z-Stacks über die FE verbessert die Bildqualität und -auflösung erheblich. Normalerweise reicht ein Bereich, der die Dicke / Tiefe des Gewebes umfasst, aus, um die intrazelluläre Lokalisation effizient zu visualisieren. Für eine optimale 3D-Rekonstruktion empfiehlt sich die Verwendung des optimalen Intervalls, das von der Software festgelegt wird. Vermeiden Sie bei 40-fachen und 63-fachen Objektiven Intervalle von mehr als 0,5 μm zwischen den einzelnen Z-Abschnitten, um eine optimale 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen.
   1. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen z-Stack im Hauptbereich unter der Registerkarte Akquisition. Wählen Sie den Scanmodus Alle Spuren pro Slice für den z-stack aus. Dies führt zu einer Änderung der Kanalspuren für jedes Z-Position-Segment.
   2. Wählen Sie den gewünschten Kanal aus, um die Probe zu beobachten und klicken Sie auf Live, um einen Live-Scan zu starten. Es wird empfohlen, den Kanal zu verwenden, der zum Nachweis des GFP-markierten BM-Proteins benötigt wird.
   3. Legen Sie wie beschrieben einen Bereich für den Z-Stack fest. Suchen Sie mit dem Feinjustierknopf am Mikroskop die Z-Position für ein Ende der Probe und klicken Sie auf Set First. Suchen Sie in ähnlicher Weise die z-Position für das andere Ende der Probe und klicken Sie auf Set Last.
   4. Klicken Sie für jede Position im Z-Stack auf jeden Kanal separat, wobei die Bereichsanzeige ausgewählt ist, und passen Sie die Intensität des Lasers und die Masterverstärkung nach Bedarf an, wie in Schritt 6.2.4 beschrieben.
   5. Legen Sie das Intervall für den z-Stack fest, um die Schrittgröße wie in der NOTE unter Schritt 6.3 empfohlen zuzuweisen. Klicken Sie auf Experiment starten , um mit der Z-Stack-Erfassung zu beginnen.

7. Hochauflösende Bildaufnahme

1. Wähle ein Airyscan kompatibles Ziel aus. Um die intrazelluläre Lokalisation des BM-Proteins zu visualisieren, ist die Verwendung eines 63x-Ölobjektivs optimal (Abbildung 3). Stellen Sie das Objektiv auf 63x und geben Sie vorsichtig einen Tropfen Tauchöl auf die Linse. Positionieren Sie den Objektträger auf dem Objektiv mit einem Deckglas zum Ziel, um die Probe zu lokalisieren.
2. Wählen Sie eine Konfiguration mit den entsprechenden Einstellungen für das Fluorophor-Bild aus, wie unten beschrieben.
   1. Klicken Sie auf der Registerkarte Erfassung auf die Schaltfläche Intelligentes Setup, um ein neues Experiment zu konfigurieren. Wählen Sie Airyscan (Superauflösung); Wenn diese Option ausgewählt ist, ist eine weitere Auswahl zwischen Auflösung (Airyscan SR), SNR/Empfindlichkeit (Airyscan Confocal) und Geschwindigkeit (Multiplex SR-2Y) erforderlich. Wählen Sie für festsitzendes Gewebe Auflösung aus, da dies zu der besten Akquisition führt.
   2. Klicken Sie im Feld Experiment konfigurieren auf +, um Tracks/Kanäle hinzuzufügen. Wählen Sie die Spuren für bestimmte Farbstoffe aus der Farbstoffdatenbank aus. Fügen Sie für ein Mehrkanalexperiment jede Spur nach Bedarf hinzu, indem Sie die entsprechenden Farbstoffe auswählen.
   3. Nachdem alle Spuren hinzugefügt wurden, wählen Sie einen der von der Software bereitgestellten Experimentvorschläge aus. Verwenden Sie für dieses Experiment Best Signal, denn obwohl die Geschwindigkeit im Vergleich zum Smartest (Line) -Vorschlag etwas langsamer ist, werden die besten Hardwareeinstellungen für jeden Farbstoff erstellt, was zu einer maximalen Signalverstärkung und einem minimalen Emissionsübersprechen führt. Sobald das Experiment eingestellt und geladen wurde, wird es im Fenster Imaging Setup auf der Registerkarte Erfassung angezeigt.
   4. Sobald ein intelligentes Setup ausgewählt ist, wird automatisch der Wellenlängenbereich für den Detektor GaAsP-PMT ausgewählt. Passen Sie den Bereich an, indem Sie die Bildlaufleiste am unteren Rand verschieben, um den Bereich zu vergrößern oder zu verringern oder den Bereich nach Bedarf vollständig in einen anderen Bereich zu verschieben. Verwenden Sie diese Option, um sicherzustellen, dass sich die Bereiche zweier verschiedener Kanäle nicht überlappen, um Übersprechen zu vermeiden. Speichern Sie die Konfiguration, um sie in Zukunft wiederzuverwenden.
3. Sobald die Konfiguration festgelegt ist, fahren Sie fort, den Zoom- und Scanbereich wie in Schritt 6.2.8 anzupassen. Optimieren Sie den Scanbereich, um sich auf die Region von Interesse zu konzentrieren, um die Scanzeit und den Speicherplatz zu reduzieren. Fahren Sie mit dem Erfassen von Bildern fort.
4. Wählen Sie für jeden einzelnen Kanal unter Kanal einen Track aus und klicken Sie auf Live. Passen Sie die Masterverstärkung und Laserleistung mit dem Entfernungsanzeigewerkzeug an, wie in Schritt 6.2.4 beschrieben, und befolgen Sie alle beschriebenen Richtlinien, um gesättigte Pixel zu vermeiden. Vergewissern Sie sich, dass die hexagonale Detektoransicht zentriert und ausgerichtet ist, indem Sie auf die Schaltfläche Airyscan Detector View klicken. In den meisten Fällen wird die hexagonale Detektoransicht automatisch zentriert und ausgerichtet. Wiederholen Sie den Vorgang für zusätzliche Kanäle.
5. Klicken Sie im Umschaltfenster des Aufnahmemodus unter Bildgröße auf SR (superauflösungsbeschränkte Pixelanzahl), um die Fähigkeiten des Detektors zu maximieren. Dadurch wird die Rahmengröße automatisch angepasst.
6. Halten Sie die Mittelwertbildung auf Keine , da dies normalerweise nicht erforderlich ist, und dies verringert die Scanzeit. In einigen Fällen kann eine Mittelung von 2x das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern.
7. Sammeln Sie Rohdaten mit 8-Bit-Datentiefen. Klicken Sie auf Ausrichten, um ein Bild zu erhalten. Um einen Z-Stack zu erhalten, führen Sie Schritt 6.3 aus.
8. Führen Sie die Bildverarbeitung wie unten beschrieben durch. Dadurch wird ein 16-Bit-Image erzeugt.
   1. Sobald das Bild oder der Z-Stack erhalten ist, klicken Sie auf die Processing > Method und wählen Sie Airyscan Processing.
   2. Führen Sie zunächst einen automatischen Filter durch und führen Sie eine weitere manuelle Verarbeitung durch, indem Sie den SR-Wert ändern, um die besten Ergebnisse für die Probe zu erzielen. Sobald der optimale SR-Wert ermittelt wurde, klicken Sie auf Übernehmen , um ein verarbeitetes Bild zu generieren. Bei z-stack-Bildern entweder als ein z-slice (aktuelles Bild [2D]) oder als gesamter z-stack bearbeiten, indem Sie auf das Feld 3D-Verarbeitung klicken.

8. Bildverarbeitung und Datenanalyse (orthogonale Projektion, 3D-Rekonstruktion und Intensitätsprofil)

HINWEIS: Für diese Methode werden die Schritte zur Generierung orthogonaler Projektionen, 3D-Rekonstruktionen und Intensitätsprofile für die Zen-Software beschrieben (siehe Materialtabelle). Ähnliche Datenanalysen können auch mit der ImageJ-Software⁵⁶ durchgeführt werden.

1. Führen Sie eine orthogonale Projektion wie unten beschrieben durch (Abbildung 4).
   1. Sobald ein Z-Stack mit konfokaler oder hochauflösender Mikroskopie erhalten wurde, erzeugen Sie eine orthogonale Projektion, um die Vesikel in der z-Achse der Zelle in einer 2D-Ansicht zu betrachten (im Vergleich zur 3D-Rekonstruktion). Klicken Sie dazu auf die Verarbeitungs- > Methode und wählen Sie Orthogonale Projektion.
   2. Wählen Sie unter Parameter die gewünschte Projektionsebene aus. Für eine Projektion der z-Achse (z-stack) wählen Sie die Frontalebene (XY). Wählen Sie unter Methode die Option Maximum aus, um die höchste Projektionsqualität zu erzielen.
   3. Als nächstes bestimmen Sie die Dicke der Projektion, indem Sie die Ausgangsposition (beginnende z-Scheibe) auswählen, und bestimmen Sie die Dicke (Gesamtzahl der z-Scheiben) in der Projektion. Es ist ideal, die Dicke zu wählen, die der einer Zelle in der z-Achse entspricht.
   4. Sobald die Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf Übernehmen , um die Projektion des z-Stacks in einer XY-Ebene zu erstellen.
      HINWEIS: Beim Erstellen orthogonaler Projektionen mehrerer z-Stacks, um die Menge eines bestimmten Objekts von Interesse zu vergleichen, ist es unerlässlich, die Dicke der Projektion für die Datengenauigkeit gleich (oder so nah wie möglich) zu halten.
2. Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion wie unten beschrieben durch (Abbildung 5).
   1. Erstellen Sie 3D-Rekonstruktionen von Z-Stacks, um die Lokalisation und Form von Strukturen zu beobachten. Tun Sie dies für Z-Stacks, die mit konfokalen und superauflösenden Ansätzen erworben wurden. Verarbeiten Sie hochauflösende Z-Stacks zuerst mit 3D-Verarbeitung wie in Schritt 7.8 für die 3D-Rekonstruktion.
   2. Um ein 3D-Bild zu erzeugen, klicken Sie auf das 3D-Symbol im Vorschaufenster. Nach dem Klicken wird im Bereich der Anzeigesteuerung in der unteren Hälfte des Bildschirms eine 3D-Registerkarte angezeigt. 3D-Ansichten wie "Transparenz", "Volumen", "Maximum", "Oberfläche" und "Gemischt" werden angezeigt. Verwenden Sie Flächenansichten oder gemischte Ansichten, wenn Sie die Struktur von Vesikeln betrachten (bevorzugt).
   3. Für die höchste Bildqualität wählen Sie die Einstellung Präzise, da die schnellste Einstellung weniger genau ist und zu einem schlechten 3D-Rendering führt.
   4. Sobald das Bild generiert wurde, bearbeiten Sie es, indem Sie es drehen und zoomen, um sich auf einen bevorzugten Ort zu konzentrieren, um die Objekte von Interesse anzuzeigen. Bearbeiten Sie das 3D-Bild auf der Registerkarte Aussehen .
   5. Sobald eine zufriedenstellende Ansicht erhalten wurde, wählen Sie auf der Registerkarte 3D die Option Angezeigte Auflösung aus, und klicken Sie dann auf Bild erstellen. Dadurch wird ein Schnappschuss des Bildes in der gleichen Ausrichtung erstellt, in der es angezeigt wurde, und kann in verschiedenen Dateiformaten gespeichert und exportiert werden.
3. Generieren Sie ein Intensitätsprofil, wie unten beschrieben (Abbildung 7).
   HINWEIS: Die Verteilungs- und Intensitätsprofile der Pixel, die den verschiedenen Fluoreszenzsignalen zugeordnet sind, können als Overlay-Bild betrachtet werden, um ihre Kolokalisation zu bestimmen.
   1. Sobald ein optimales Bild über konfokale oder hochauflösende Bildgebung aufgenommen wurde, klicken Sie im Ansichtsfenster des Vorschaufensters auf Profil. Im Vorschaufenster erscheint ein Histogramm, das das Intensitätsprofil als Funktion der Entfernung anzeigt, sowie eine Tabelle mit Entfernungen und Intensitätswerten.
   2. Klicken Sie im Bereich der Anzeigesteuerelemente am unteren Bildschirmrand auf das Pfeilwerkzeug auf der Registerkarte Profildefinition . Zeichnen Sie einen Pfeil entlang der Länge des Objekts, für das das Intensitätsprofil der verschiedenen Pixel bewertet werden muss. Um den Pfeil zu zeichnen, zoomen Sie auf das Bild.
   3. Das Intensitätsprofil erscheint auf der linken Seite der Bildvorschau, wo die Entfernung und die entsprechenden Spitzen entlang des Weges des Pfeils angezeigt werden. Um das auf dem Bild selbst angezeigte Histogramm zu entfernen, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Profil in Grafiken anzeigen .
   4. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte Bemaßungen im Steuerungsbereich der Anzeige alle Kanäle, die nicht in das Intensitätsprofil aufgenommen werden sollen.
   5. Doppelklicken Sie auf der Registerkarte Grafiken auf Profil , das im Feld Anmerkungen/Maße angezeigt wird, um das Popup-Fenster Grafische Elemente formatieren zu öffnen. Verwenden Sie diese Option, um die Farbe des Pfeils sowie seinen Stil und seine Strichstärke zu ändern. Schließen Sie das Feld, nachdem Sie die gewünschten Einstellungen ausgewählt haben.
   6. Klicken Sie auf die Registerkarte Profilansicht . Klicken Sie im neuen Bildbereich auf Aktuelle Ansicht und dann auf Speichern unter, um die Datei zu speichern. Es wird empfohlen, die Datei als .tif Datei zu speichern, um Datenkomprimierung und -verlust zu vermeiden.

Representative Results

Die hierin beschriebenen Methoden können verwendet werden, um den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen in polarisierten Epithelzellen, wie der FE des Drosophila-Eierstocks , effizient und genau abzubilden und zu charakterisieren. Als nächstes liefern wir erwartete Ergebnisse, die mit den beschriebenen Methoden erzielt wurden, sowie hilfreiche Ratschläge und mögliche Fallstricke. Dazu wird Vkg-GFP, ein endogen getaggtes Vkg (Drosophila Col IV), verwendet. Die gleichen Ergebnisse können jedoch mit anderen endogen markierten BM-Proteinen wie Pcan-GFP erzielt werden.

Einstellen optimaler Erfassungsparameter (Abbildung 2)
Um den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen wie Vkg und Pcan in Epithelzellen genau zu charakterisieren, ist es wichtig, die Erfassungsparameter des konfokalen Mikroskops richtig einzustellen, wie in den bereitgestellten Methoden beschrieben.

Mittels konfokaler Mikroskopie kann die intrazelluläre Lokalisation von Vkg-GFP nachgewiesen werden, bevor sie abgesondert und basal in der FE abgeschieden wird (Abbildung 2A). Es wurde gezeigt, dass Coll IV nach der Übersetzung in der Notaufnahme zum Golgi transportiert wird, bevor es in intrazelluläre exozytäre Vesikel verpackt wird. Mit diesem bildgebenden Ansatz beobachten wir, dass sich Vkg-GFP in intrazellulären Kompartimenten mit unterschiedlichen Formen ansammelt, die möglicherweise verschiedene Organellen, endosomale Kompartimente und Vesikeltypen darstellen (Abbildung 2A, Pfeile). In exozytären Vesikeln ist Coll IV bereits zu Fibrillen zusammengesetzt, die aus drei Polypeptiden bestehen: zwei α1-Ketten und einer α2-Kette (Vkg in Drosophila), was zur Bildung von gestreckten Vesikeln führt, die auch mittels konfokaler Bildgebung sichtbar gemacht werden können (Abbildung 2A, Pfeile). Dann wird Coll IV spezifisch basal aus Epithelzellen sezerniert, wo es im BM abgelagert wird (Abbildung 2, Pfeilspitzen).

Wenn die Erfassungsparameter nicht richtig eingestellt sind, ist es nicht möglich, die verschiedenen Morphologien und Positionen während des intrazellulären Transports von BM-Proteinen genau zu beobachten (Abbildung 2B,C). Werden beispielsweise die Erfassungsparameter optimiert, um die extrazelluläre BM und nicht die intrazellulären Strukturen sichtbar zu machen, erscheinen die BM-proteinhaltigen endosomalen Kompartimente und Vesikel (hier durch Vkg-GFP gekennzeichnet) dunkel oder nicht sichtbar (Abbildung 2B). Umgekehrt, wenn die Detektoren übermäßig gesättigt sind, kann die intrazelluläre Lokalisation von Vkg-GFP wie im optimalen Zustand nachgewiesen werden (vergleichen Sie Abbildung 2A und Abbildung 2C), aber eine Zunahme des Hintergrundfluoreszenzrauschens erschwert die Interpretation der BM-Proteinlokalisierung, insbesondere für Kolokalisierungsexperimente (siehe Abbildung 7 ). Insgesamt veranschaulichen diese Daten, wie wichtig geeignete Erfassungsparameter sind, um eine genaue Lokalisierung von BM-Proteinen im Epithel zu erreichen.

Einstellen optimaler Superauflösungs- und Dekonvolutionsparameter (Abbildung 3)
Wie für die konfokale Bildaufnahme veranschaulicht, ist es auch wichtig, die Erfassungsparameter bei der Verwendung von hochauflösender Mikroskopie richtig einzustellen, um Unter- oder Übersättigung zu vermeiden. Dieser hochauflösende Bildgebungsansatz beinhaltet auch die sorgfältige Konfiguration von Dekonvolutionsparametern, um eine hochauflösende Bildgebung zu erreichen (Abbildung 3). Wenn die Dekonvolutionsverarbeitung optimal konfiguriert ist, erhöht die hochauflösende Bildgebung signifikant die Auflösung von intrazellulären Strukturen, die BM-Proteine enthalten (Abbildung 3A, Pfeile), wie Vesikel oder Golgi-Strukturen (Abbildung 3A und Abbildung 7C), die BM selbst (Abbildung 3A, Pfeilspitzen) und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis⁴⁵ . Die hochauflösende Mikroskopie führt zu einer ~2-fachen Erhöhung der Auflösung in allen drei räumlichen Dimensionen im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie. Dieser Anstieg der Auflösung wird deutlich durch die besser definierten Bilder des intrazellulären Transports von BM-Proteinen und der BM veranschaulicht, die mit hochauflösender Bildgebung im Vergleich zu denen mit Standard-CSLM aufgenommen wurden (vergleichen Sie Abbildung 2A und Abbildung 3A).

Wenn die Dekonvolutionsparameter nicht richtig eingestellt sind, wird die Superauflösung nicht optimal erreicht und die Erhöhung der Auflösung geht verloren. Die Unterverarbeitung von hochauflösenden Bildern führt zu verschwommenen Bildern, was dazu führt, dass die intrazelluläre Lokalisation von BM-Proteinen schwach und nicht so gut definiert erscheint wie unter optimalen Bedingungen (vergleichen Sie Abbildung 3B mit Abbildung 3A). Umgekehrt führt die Überverarbeitung der Bilder zu körnigen Bildern, bei denen die intrazelluläre Lokalisation von BM-Proteinen pixelig erscheint (Abbildung 3C). Diese Daten unterstreichen, wie wichtig es ist, geeignete Dekonvolutionsparameter zu verwenden, um aussagekräftige und repräsentative Bilder zu erhalten, die die intrazelluläre Verteilung von BM-Proteinen widerspiegeln.

Insgesamt zeigen und unterstreichen diese Daten deutlich die verbesserte Auflösung des intrazellulären Transports von BM-Proteinen mittels hochauflösender Bildverarbeitung im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie. Insbesondere ermöglicht dieser Ansatz eine bessere Visualisierung des intrazellulären Transports von BM-Proteinen, indem die Auflösung der beteiligten intrazellulären Strukturen verbessert wird. Dies ermöglicht den Vergleich verschiedener Größen und Formen von Strukturen, um neue Faktoren, die an der polarisierten Ablagerung von BM-Proteinen in der FE beteiligt sind, besser zu identifizieren und zu charakterisieren.

Orthogonale Projektion und 3D-Rekonstruktion optischer Z-Schnitte (Z-Stack) durch die FE zur besseren Visualisierung der intrazellulären Verteilung von BM-Proteinen (Abbildung 4 und Abbildung 5)
Da die intrazelluläre Verteilung von BM-Proteinen in der gesamten FE in 3D (x-, y- und z-Achsen) vorhanden ist, kann die orthogonale Projektion und/oder 3D-Rekonstruktion optischer Z-Schnitte durch die FE entweder mittels Superauflösung oder konfokaler Mikroskopie verwendet werden, um die Lokalisation und die Verteilung von BM-Proteinen in Wildtyp - oder Mutantenzellen zu beurteilen (z. B. in Abbildung 4 und Abbildung 5).

Die orthogonale Projektion ermöglicht es, alle erfassten z-Abschnitte in einer einzigen Ebene zu projizieren. Diese Methode ist besonders nützlich, um die Gesamtverteilung von Vesikeln und Kompartimenten, die BM-Proteine enthalten, in einem einzigen Bild mit konfokaler (Abbildung 4A) oder hochauflösender (Abbildung 4B) Bildgebung zu zeigen. Bei der Verwendung der hochauflösenden Mikroskopie als der konfokalen Mikroskopie ergeben sich jedoch eine deutlich bessere Auflösung und geringere Hintergrundgeräusche (siehe Abbildung 4B und Abbildung 4A).

Ein weiterer Ansatz zur Visualisierung der Gesamtverteilung von BM-haltigen Kompartimenten und Vesikeln besteht darin, eine 3D-Rekonstruktion zu erzeugen, indem ein Stapel optischer Z-Abschnitte zusammengesetzt wird, die durch konfokale (Abbildung 5A) oder hochauflösende (Abbildung 5B) Bildgebung aufgenommen wurden. Dieser Ansatz kann auch sehr effizient sein, um die Lokalisation und Verteilung intrazellulärer BM-Proteine und die Form von Kompartimenten und Vesikeln zu beurteilen, die Vkg-GFP enthalten, insbesondere bei Verwendung einer hochauflösenden Mikroskopie (Abbildung 5). Die herkömmliche konfokale Mikroskopie (Abbildung 5A) führt im Vergleich zur Superauflösung zu einem höheren Hintergrundrauschen (Abbildung 5B), was bei der Berücksichtigung beim 3D-Rendering zu Artefakten führen kann. Darüber hinaus führt die geringere Auflösung des Konfokus auch dazu, dass die erzeugten Bilder weniger glatt und definiert sind als diejenigen, die durch Superauflösung erzeugt werden (vergleichen Sie Abbildung 5A und Abbildung 5B).

Charakterisierung der Phänotypen, die mit dem Verlust von Komponenten assoziiert sind, die an der polarisierten Sekretion von BM-Proteinen beteiligt sind, mittels hochauflösender Bildgebung (Abbildung 6)
Wie bisher gezeigt (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5), kann mittels hochauflösender Mikroskopie und Bildverarbeitung die intrazelluläre Lokalisation und Verteilung von BM-Proteinen im Wildtyp FE des Drosophila-Eierstocks beurteilt werden. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch verwendet werden, um die Lokalisation von BM-Proteinen unter mutierten oder Knockdown-Bedingungen zu bestimmen und zu vergleichen. Dies ist dabei eine effiziente Methode, um die Rolle(n) neu identifizierter Komponenten zu charakterisieren, die dem polarisierten intrazellulären Transport, der Sekretion und der Ablagerung von BM-Proteinen gewidmet sind.

Es hat sich gezeigt, dass der GTPase-Austauschfaktor (GEF) Crag eine Schlüsselkomponente in einem biologischen Signalweg ist, der der polarisierten Ablagerung von BM-Proteinen gewidmet ist²⁸. In Crag-Knockdown-FCs reichern sich BM-Proteine sowohl apikal als auch basal an, was darauf hindeutet, dass Crag die polarisierte Sekretion von BM-Proteinen wie Vkg-GFP steuert (Abbildung 6). Die Verwendung der hochauflösenden Mikroskopie ermöglicht eine bessere Charakterisierung des Phänotyps, der sich aus dem Verlust von Crag ergibt. Zum Beispiel wird eine starke apikale Akkumulation von BM-Proteinen sowie die Organisation der ektopischen apikalen BM in Crag-Knockdown-FCs beobachtet (Abbildung 6B, Pfeilspitzen). Wenn der Phänotyp weniger abweichend ist, wird außerdem eine BM-Membran nachgewiesen, die sich apikal in kleinen Flecken in FCs ansammelt (Abbildung 6B, Pfeile). Insgesamt veranschaulichen diese Daten, dass die hochauflösende Mikroskopie verwendet werden kann, um mutierte Phänotypen zu charakterisieren, um die Rolle der Komponenten, die an der polarisierten Ablagerung von BM beteiligt sind, besser zu verstehen.

Kolokalisierungsexperiment mit Antikörpern und endogen markierten BM-Proteinen, aufgenommen mit konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (Abbildung 7)
Schließlich kann die Verwendung von Antikörpern gegen spezifische intrazelluläre Marker oder neu identifizierte Komponenten in Kombination mit endogen markierten BM-Proteinen genutzt werden, um den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen im polarisierten Epithel besser zu charakterisieren. GM-130, ein cis-Golgi-Marker, wird verwendet, um diesen Punkt zu veranschaulichen. Bevor es in Sekretionsvesikel verpackt wird, wird Coll IV zum Golgi transportiert. Wenn die subzelluläre Verteilung von Vkg-GFP mittels konfokaler (Abbildung 7A,B) oder superauflösender (Abbildung 7C,D) Bildgebung beurteilt wird, zeigen beide Ansätze, dass Vkg-GFP teilweise mit GM-130 kolokalisiert, was bestätigt, dass Coll IV vor der Sekretion zum Golgi sortiert wird. Bei Verwendung von hochauflösender Bildgebung wird jedoch eine Zunahme des Signal-Rausch-Verhältnisses und eine bessere Auflösung der Kolokalisation zwischen Vkg-GFP und GM130 beobachtet (vergleichen Sie Abbildung 7A mit Abbildung 7C).

Wenn die räumliche Verteilung und die Konzentrationen von grünen (Vkg-GFP) und roten (GM-130) Pixeln quantifiziert werden, indem die Fluoreszenzintensität eines optischen Abschnitts durch FCs quantifiziert wird, die mit konfokaler (Abbildung 7B) und hochauflösender (Abbildung 7D) Mikroskopie aufgenommen wurden, wird die Kolokalisation von Vkg-GFP und GM-130 beobachtet. Die Verteilung der Vkg-GFP- und GM-130-Pixel wird in Histogrammen dargestellt, in denen Überlappungen der Vkg-GFP- und GM-130-Peaks auf ihre Kolokalisierung hinweisen (Abbildung 7B',D'). So kann mit diesem Bildanalyse-Tool die Lage von Vkg-GFP in bestimmten intrazellulären Kompartimenten genau bestimmt werden. Der Vergleich von Histogrammen, die aus konfokalen Bildern (Abbildung 7B') mit hochauflösenden Bildern (Abbildung 7D') erzeugt wurden, bestätigt jedoch, dass die hochauflösende Mikroskopie bessere Ergebnisse liefert, wie die höhere Intensität der Peaks und das reduzierte Hintergrundrauschen zeigen, die durch das Fehlen kleinerer Peaks dargestellt werden (vgl. Abbildung 7B' und Abbildung 7D'). ), die mit hochauflösenden Histogrammen verbunden sind. Insgesamt unterstreichen diese Daten, dass, obwohl die konfokale Mikroskopie zur Quantifizierung der Kolokalisation verwendet werden kann, die Superauflösung ein leistungsfähigerer Ansatz ist, der zu einer effizienteren und präziseren Quantifizierung der Lokalisierung führt.

Abbildung 1: Das follikuläre Epithel (FE) des Drosophila-Eierstocks: ein Modellsystem zur Untersuchung der polarisierten Ablagerung von Basalmembranproteinen (BM). (A) Bild der intakten Eierstöcke nach Dissektion und Exzision, aufgenommen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Eierstöcke exprimieren ein endogenes GFP-markiertes BM-Protein (Vkg-GFP). Maßstabsleiste = 1 mm. (A') Zwei Eierstöcke einer weiblichen Fliege sind am Eileiter befestigt. Jeder Eierstock enthält 16-20 Ovarien. Ein einzelnes Ovariole ist umrissen (Rechteck). Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Längsschnitt, aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop, durch eine Ovarile, die Vkg-GFP exprimiert und auf DNA (blau) und F-Actin (rot) gefärbt ist. Ovariolen bestehen aus Eizellen in verschiedenen Stadien. Eizellen bestehen aus einem einschichtigen follikulären Epithel (FE), das die Keimbahnzellen (GCs) umgibt. Die FE synthetisiert und sezerniert basal BM-Proteine (z.B. Pcan und Vkg). Maßstabsleiste = 100 μm. (C) Schematische Darstellung der FE. Das FE ist ein klassisches Epithel mit einer ausgeprägten apikal-basalen Polarität, bei der die apikale Domäne den Keimbahnzellen und die basale Domäne der BM (grün) zugewandt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Abbildung des intrazellulären Transports von BM-Proteinen mittels konfokaler Bildgebung. (A-C) Längsschnitt durch eine Eizellkammer, die Vkg-GFP (grün) exprimiert und für DNA (blau) und F-Actin (rot) gefärbt ist. (A'-C') Intrazelluläre Kompartimente und Vesikel, die Vkg-GFP (Pfeile) enthalten, sowie die basal und extrazellulär abgelagerten BM (Pfeilspitzen) werden konfokalmikroskopisch dargestellt. (A) Optimal aufgenommenes Bild, für das der intrazelluläre Verkehr von Vkg-GFP sichtbar ist. (A') Vkg-GFP ist im gesamten Zytoplasma von FCs in verschiedenen zellulären Kompartimenten (z. B. Golgi) und in Vesikeln lokalisiert. Aufgrund der Fibrillenorganisation von Kollagen IV erscheinen Vkg-GFP-haltige Vesikel länglich (Pfeile). (B) Unterbelichtetes Bild, für das die Aufnahmeparameter optimiert sind, um die extrazelluläre BM und nicht die intrazelluläre Verteilung von BM-Proteinen sichtbar zu machen. Vkg-GFP (grün) erscheint im gesamten Zytoplasma schwach (B'), was zu nicht nachweisbaren Vkg-GFP-haltigen Vesikeln im Vergleich zu (A) führt. (C) Überbelichtetes Bild, bei dem der GFP-Detektor gesättigt ist, was zu einer Zunahme der Hintergrundfluoreszenz führt. Obwohl die intrazelluläre Verteilung von Vkg-GFP (grün) im gesamten Zytoplasma der FCs lokalisiert zu sehen ist (Pfeile), führt eine Überbelichtung zu Bildgebungsartefakten, bei denen die intrazellulären Strukturen größer erscheinen als sie sind, wie in (A-A'). Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Abbildung des intrazellulären Transports von BM-Proteinen mittels hochauflösender Bildgebung und Verarbeitung. (A-C) Längsschnitt durch eine Eizellkammer, die Vkg-GFP (grün) exprimiert und auf DNA (blau) und F-Actin (rot) gefärbt ist. (A) Optimal verarbeitetes hochauflösendes Bild, in dem der intrazelluläre Verkehr von Vkg-GFP deutlich beobachtet wird. (A') Vkg-GFP ist im gesamten Zytoplasma der FCs in verschiedenen zellulären Kompartimenten (z. B. Golgi) und Vesikeln (Pfeile) und am BM (Pfeilspitzen) lokalisiert. (B) Unterverarbeitetes Bild, was zu einer höheren Hintergrundfluoreszenz als in (A) führt. Die intrazelluläre Lokalisation von Vkg-GFP (grün) erscheint schwach und weniger definiert (vgl. B mit A). (C) Überverarbeitetes Bild, das zu einem Bild führt, bei dem die intrazelluläre Lokalisation von Vkg-GFP pixelig und körnig erscheint. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Orthogonale Projektion eines Z-Stacks, aufgenommen und verarbeitet mit konfokalen und hochauflösenden Mikroskopieansätzen. (A-B) Orthogonale Projektion optischer Z-Schnitte durch eine Eizellkammer, die Vkg-GFP (grün) exprimiert und für DNA (blau) und F-Actin (rot) mittels konfokaler (A) oder hochauflösender (B) Mikroskopie gefärbt wird. (A) Projektion eines Z-Stacks, der unter Verwendung optimaler konfokaler Parameter erfasst wurde. Die intrazelluläre Lokalisation von Vkg-GFP kann über die gesamte z-Achse in den FCs (A', Pfeile) beobachtet werden. Der BM ist ebenfalls sichtbar und erscheint sehr hell (A', Pfeilspitzen). (B) Projektion eines Z-Stacks, der mit optimaler hochauflösender Verarbeitung erfasst wurde. Gut definierte intrazelluläre Kompartimente und Vesikel, die Vkg-GFP enthalten, können entlang der z-Achse in den FCs beobachtet werden (B', Pfeile). Der BM ist auch sehr gut definiert (B', Pfeilspitzen). Der Unterschied zwischen konfokaler Standardbildgebung und hochauflösender Bildgebung ist offensichtlich, da die intrazelluläre Lokalisation von Vkg-GFP und BM bei Verwendung von Super-Resolution deutlich stärker definiert ist als die Standard-konfokalmikroskopie. Darüber hinaus weist das von der konfokalen Mikroskopie aufgenommene Bild eine höhere Hintergrundfluoreszenz auf. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: 3D-Rekonstruktion eines Z-Stacks, der mit konfokalen und hochauflösenden Mikroskopieansätzen erfasst und verarbeitet wurde. (A-B) 3D-Darstellung von Z-Stacks (gemischte Ansicht) von Eizellen, die Vkg-GFP (grün) exprimieren und für DNA (blau) und F-Aktin (rot) gefärbt sind. (A) 3D-Darstellung eines mit konfokaler Mikroskopie aufgenommenen Z-Stacks. Die Lage und Form der Kompartimente und Vesikel, die Vkg-GFP enthalten, ist in den Zellen zu sehen (A'). (B) 3D-Rendering eines Z-Stacks, das über eine optimale hochauflösende Verarbeitung erfasst wurde. Die Lage und Form der Kompartimente und Vesikel, die Vkg-GFP enthalten, ist zu sehen (B'). Die Form der Vesikel sowie der BM und der Kerne sind glatt definiert, und die Auflösung ist höher als bei der konfokalen Mikroskopie (im Vergleich zu B 'und A '). Die Form und Größe der Kompartimente und Vesikel, die Vkg-GFP enthalten, können auch besser mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie (im Vergleich zu B' und A') bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Charakterisierung der Vkg-GFP-Lokalisierung in Crag Knocked Down FCs. (A-B) Längsschnitt durch eine Eizellkammer, die Vkg-GFP (grün) exprimiert, für DNA (blau) und F-Actin (rot) gefärbt und durch optimale Super-Resolution-Verarbeitung aufgenommen wurde. (A) Kontrolllinie, die Wildtyp-Crag exprimiert, ein Protein, das für die ordnungsgemäße BM-Ablagerung entscheidend ist. Die FE zeigt eine typische BM-Proteinlokalisation, wobei Vkg-GFP intrazellulär verteilt und basal in der FE (A') abgeschieden wird. (B) Transgene Drosophila-Linie, die RNAi für Crag in der FE exprimiert, was zu einem Crag-Knockdown führt. Der Verlust von Crag führt zur Fehllokalisierung von BM-Proteinen (z.B. Vkg-GFP) apikal in der FE (B', Pfeile und Pfeilspitzen). Das hochauflösende Bild wird verwendet, um die BM-Fehllokalisierungsphänotypen zu charakterisieren, die mit dem Verlust von Crag verbunden sind. Insbesondere zeigen einige Crag RNAi FCs eine starke apikale Fehllokalisation von BM-Proteinen (B', Pfeilspitzen), während andere Crag RNAi FCs eine schwächere apikale Fehllokalisation (B', Pfeile) aufweisen. Die hochauflösende Bildgebung zeigt deutlich die Phänotypen, die mit dem Verlust von Crag verbunden sind (B', Pfeilspitzen vs. Pfeile). Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Kolokalisation von Vkg-GFP und GM-130 (Golgi-Marker) unter Verwendung konfokaler und hochauflösender Mikroskopieansätze. (A-D) Längsschnitte durch Eizellen, die Vkg-GFP exprimieren und für einen cis-Golgi-Marker (GM-130, rot) immungefärbt sind, aufgenommen mit konfokaler (A,B) oder hochauflösender (C,D) Mikroskopie. (A,B) Konfokale Bildgebung zeigt, dass intrazelluläres Vkg-GFP teilweise mit einem cis-Golgi-Marker (A, Pfeilspitze) kolokalisiert. (B) Vergrößerter Bereich von (A). Die Verteilungen der grünen (Vkg-GFP) und roten (GM-130) Pixel entlang des weißen Pfeils sind in einem Histogramm (B') dargestellt. Die x-Achse des Histogramms stellt den Abstand (μm) entlang des Pfeils dar, während die y-Achse die Pixelintensität darstellt. Die überlappenden grünen und roten Peaks (*) zeigen, wo Vkg-GFP und GM-130 kolokalisieren. (C,D) Superauflösende Bildgebung zeigt auch, dass intrazelluläres Vkg-GFP teilweise mit einem cis-Golgi-Marker (C, Pfeilspitze) kolokalisiert. (D) Vergrößerter Bereich von (C). Die Verteilungen der grünen (Vkg-GFP) und roten (GM-130) Pixel entlang des weißen Pfeils sind in einem Histogramm (D') dargestellt. Die x-Achse des Histogramms stellt den Abstand (μm) entlang des Pfeils dar, während die y-Achse die Pixelintensität darstellt. Die überlappenden grünen und roten Peaks (*) zeigen, wo Vkg-GFP und GM-130 kolokalisieren. Diese Daten zeigen, dass die hochauflösende Bildgebung ein effizienterer und präziserer Ansatz als die konfokale Bildgebung ist, um die Kolokalisation zu charakterisieren und zu quantifizieren. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Konfokale und hochauflösende Mikroskopie-Erfassungs- und Verarbeitungsparameter für die repräsentativen Bilder. Alle wichtigen Bildgebungsparameter werden für die bereitgestellten repräsentativen Bilder zusammengestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Die BM ist entscheidend für die embryonale und Organmorphogenese sowie die physiologischen Funktionen von Erwachsenen. Darüber hinaus fungiert das BM als Signalisierungsplattform für die Etablierung und Aufrechterhaltung der epithelialen Polarität und versorgt Gewebe mit Unterstützung². Die Mechanismen, die die richtige Platzierung von BM-Proteinen regulieren, sind jedoch kaum verstanden. Ein besseres Verständnis der biologischen Signalwege, die dem intrazellulären Transport und der polarisierten Sekretion von BM-Proteinen gewidmet sind, erfordert eine sorgfältige Analyse der Komponenten dieser Signalwege und ihrer Rolle bei der BM-Verarbeitung. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Verwendung von konfokaler und hochauflösender Bildgebung. Hier beschrieben wir Methoden zur Herstellung und Färbung oder Immunfärbung von Drosophila-Eierstöcken , um den intrazellulären Transport und die Sekretion von BM-Proteinen in der FE mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie effizient abzubilden.

Vorteile von Proteinfallen und endogen markierten Proteinen zur Visualisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von BM-Proteinen unter Wildtyp- und Mutantenbedingungen
Das bereitgestellte Protokoll nutzt Proteinfallen und endogen markierte BM-Proteine (z. B. Vkg-GFP und Pcan-GFP) voll aus, um die Lokalisation und Verteilung von BM-Proteinen in der FE unter Wildtyp- (Kontroll-) und Mutantenbedingungen abzubilden und zu bewerten. Diese Linien haben wichtige Vorteile gegenüber der Verwendung von Antikörpern gegen BM-Proteine. Erstens sind Antikörper gegen bestimmte Proteine von Interesse oft selten und in geringer Häufigkeit. Darüber hinaus gibt es oft Probleme mit der Gewebepenetranz im Zusammenhang mit Antikörpern, die zu einer ungenauen Beobachtung und Bewertung des interessierenden Proteins führen können. Darüber hinaus können Proteinfallenlinien in verschiedene genetische Hintergründe eingefügt werden, die verwendet werden, um die Funktionen von Faktoren zu bestimmen, die für die ordnungsgemäße Ablagerung des BM erforderlich sind, wie (i) Methoden zur Manipulation der Genexpression (z. B. UAS / Gal4), (ii) Mutanten und (iii) RNA-Interferenzlinien (RNAi). Schließlich können diese Proteinfallen verwendet werden, um die Lokalisation und Funktion von BM mithilfe von Live-Imaging⁵⁷ zu visualisieren.

Die Fusion eines fluoreszierenden Tags mit einem interessierenden Protein kann jedoch seine Lokalisation und Funktionen beeinträchtigen. Daher ist es wichtig, alle abweichenden Wirkungen des Tags auf das Protein zu bewerten. Eine Möglichkeit, um sicherzustellen, dass die Zugabe eines fluoreszierenden Tags die Funktion und Lokalisation von BM-Proteinen nicht beeinträchtigt, besteht darin, festzustellen, ob die transgene Drosophila-Linie homozygot lebensfähig ist. Sowohl die Vkg-GFP- als auch die Pcan-GFP-Linien, die in den verschiedenen hier beschriebenen Experimenten und zuvor verwendet werden, sind homozygot lebensfähig, was darauf hindeutet, dass die Zugabe eines GFP-Tags die Funktion dieser essentiellen Proteine nicht beeinträchtigt^29,30.

Bedeutung der Gewebevorbereitung, -fixierung und -färbung für die Bildgebung
Um die FE effizient und genau abzubilden, ist es wichtig, das Eierstockgewebe gemäß dieser Methode richtig vorzubereiten, zu fixieren und zu färben. Entfernen Sie zuerst nach der Dissektion vorsichtig alle anderen Organe und Fliegentrümmer vor der Fixierung. Die Verwendung von Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung von Gewebe wird empfohlen, da es zu heller GFP-Fluoreszenz führt und mit den meisten Antikörpern kompatibel ist. PFA ist jedoch möglicherweise nicht mit allen Antikörpern kompatibel; Einige können eine Glutaraldehyd- oder Methanolfixierung erfordern. Um eine Hintergrundfluoreszenz aufgrund einer unspezifischen Bindung des primären Antikörpers zu vermeiden, sollte das Eierstockgewebe auf einer nutierenden Plattformwippe für mindestens 1 h in Blocklösung inkubiert und nach der primären und sekundären Antikörperinkubation, wie im Protokoll beschrieben, mehrmals ausgiebig gewaschen werden. Schließlich ist die richtige Montage des Eierstockgewebes unerlässlich, um eine optimale Bildgebung zu erreichen. Dies erfordert eine sorgfältige Trennung der einzelnen Eierkammern, um zu vermeiden, dass sie übereinander gestapelt werden. Es ist auch wichtig, das Montagemedium vor der Bildgebung vollständig polymerisieren zu lassen, um zu vermeiden, dass das Gewebe unter dem Deckglas schwimmt. Dadurch erreicht das Montagemedium seinen optimalen Reflexionsindex, der für die hochauflösende Bildgebung sehr wichtig ist. Wenn Sie dies nicht tun, wirkt sich dies auf die Bildqualität aus. Des Weiteren können die vorbereiteten Objektträger bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden, bevor die Fluoreszenz abgeschreckt wird. Zusätzlich zu dem bereitgestellten Protokoll sind mehrere andere Protokolle für die Ovarialdissektion und Färbung^53,54,55 verfügbar.

Die Verwendung geeigneter Erfassungs- und Verarbeitungsparameter ist entscheidend für eine optimale Bildgebung und zur Beurteilung der Lokalisation von BM-Proteinen mittels konfokaler und hochauflösender Bildgebung.
Wie bereits beschrieben, ist es wichtig, die Erfassungsparameter für konfokale und hochauflösende Bildgebung richtig einzustellen, um optimale Bilder der Probe zu erhalten. Für die Bildaufnahme muss der ROI sorgfältig über die Zoomfunktion ausgewählt und dann die Bildgröße und Aufnahmegeschwindigkeit optimal eingestellt werden. Darüber hinaus ist es, wie in Abbildung 2 dargestellt, wichtig, die Laserleistung und die Detektorverstärkung entsprechend anzupassen, um den intrazellulären Verkehr zu visualisieren, ohne die Detektoren zu sättigen. Diese Parameter müssen sehr sorgfältig eingestellt werden, um unter- oder überbelichtete Bilder zu vermeiden (Abbildung 2). Unterbelichtete Bilder führen zu Bildern mit niedriger Auflösung, in denen die intrazellulären Strukturen schwer zu visualisieren und zu charakterisieren sind (Abbildung 2B). Überbelichtete Bilder aufgrund der Sättigung des Detektors führen zu Datenfehlinterpretationen und Kolokalisierungsartefakten (Abbildung 2C). Wenn es darum geht, die vesikuläre Lokalisation von endogen markierten BM-Proteinen zu bestimmen, sättigt die Fluoreszenz von GFP-markierten Proteinen (z.B. Vkg-GFP und Pcan-GFP) im basalen BM den Detektor schnell. Vesikel, die weniger GFP-markierte BM-Proteine enthalten, erscheinen jedoch dunkel. Daher ist es wichtig, die Bildempfindlichkeit über die BM-haltigen intrazellulären Strukturen (z. B. Vesikel) und nicht über die BM einzustellen (Abbildung 2). Die Auswahl der Pinhole-Größe ist ebenfalls sehr wichtig. Idealerweise sollte eine Pinhole-Größe von 1 AE für jeden Kanal für Bilder in bester Qualität ausgewählt werden, insbesondere wenn die Auflösung in der z-Achse wichtig ist. Die kleinere Lochgröße ist optimal für dünnere optische Abschnitte. Wenn jedoch keine optimale Auflösung der Z-Achse erforderlich ist oder kein Z-Stack erfasst wird, kann die Lochgröße erhöht werden, um Fotobleichen zu vermeiden. Darüber hinaus kann bei sehr schwachen Signalen eine Erhöhung der Pinhole-Größe aufgrund eines höheren Signal-Rausch-Verhältnisses und der Erfassung von mehr Photonen hilfreich sein, was die Dateninterpretation unterstützt.

Bei der hochauflösenden Bildgebung sollte besonderes Augenmerk auf die Dekonvolutionsverarbeitung gelegt werden, um zu vermeiden, dass zu wenig oder zu viel verarbeitete Bilder erzeugt werden, die schlecht aufgelöst sind, wie in Abbildung 3 dargestellt. Um eine optimale 3D-Rekonstruktion zu erreichen, wird dringend empfohlen, das beste von der Software festgelegte Intervall einzustellen. Ein zu großes Intervall zwischen den Z-Abschnitten (d. h. höher als 0,5 μm) führt zu einer schlechten 3D-Darstellung und beeinträchtigt die anschließende Analyse des Phänotyps.

Vorteil der Superauflösung gegenüber der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie bei der Bildgebung des intrazellulären BM-Verkehrs
Wie im Abschnitt "Ergebnisse" dargestellt, kann die Lokalisierung und Verteilung von BM-Proteinen zwar mithilfe der konfokalen Bildgebung genau beurteilt werden, der beschriebene Super-Resolution-Ansatz erzeugt jedoch präzisere Bildgebungsdaten mit einer signifikanten Erhöhung der Auflösung von intrazellulären Strukturen, die BM-Proteine enthalten, sowie einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus ist diese hochauflösende Mikroskopietechnik relativ einfach zu bedienen. Da die hochauflösende Bildgebung die Auflösung im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie signifikant erhöht, bis zu 120 nm in der x- und y-Achse und 350 nm in der z-Achse, wird dieser Ansatz unser Verständnis der polarisierten Ablagerung von BM stark beeinflussen, indem er den intrazellulären Verkehr und die Sekretion von BM-Proteinen in Epithelzellen wie den FCs genauer charakterisiert.

Darüber hinaus wurden zuvor ein weiterer hochauflösender Bildgebungsansatz (Structured Illumination Microscopy, SIM) und die Verwendung von Dekonvolutionsalgorithmen, die für die konfokale Punkt-Rastermikroskopie entwickelt wurden (d. h. Nikons Softwaremodul mit verbesserter Auflösung), verwendet, um die Rolle der Faktoren zu charakterisieren, die an der BM-Abscheidung^{beteiligt sind 29}. Die erhöhte Auflösung, die mit diesen Techniken verbunden ist, hat wichtige Einblicke in unser Verständnis des intrazellulären Handels von BM-Proteinen und der Organisation der BM gegeben. Diese Ansätze weisen jedoch im Vergleich zur Airyscan-Mikroskopie einige Einschränkungen auf. Zum Beispiel ist SIM nicht sehr effizient bei der Erfassung optimaler Bilder, wenn optische Z-Abschnitte tief im Gewebe aufgenommen werden. Dies macht es schwierig, SIM beim Screening auf neue Komponenten zu verwenden, die an der BM-Abscheidung beteiligt sind. Darüber hinaus erreicht die Verwendung von Dekonvolutionsalgorithmen, die auf konfokale Bilder angewendet werden, nicht das gleiche Maß an Superauflösung. Insgesamt ist die hochauflösende Airyscan-Bildgebung auf festem Gewebe ein leistungsfähiger und überlegener Ansatz zur Untersuchung des intrazellulären BM-Transports und der Ablagerung.

Wie bei jeder anderen hochauflösenden Mikroskopie sind jedoch auch mit diesem Ansatz einige Unannehmlichkeiten verbunden, die bei der Bildgebung berücksichtigt werden müssen. Erstens erfordert der Super-Resolution-Modus in der Regel eine längere Erfassungszeit der Probe als der konfokale Modus. Daher müssen die Erfassungsparameter und der interessierende Bereich sorgfältig eingestellt werden, um das Photobleichen der Probe zu minimieren. Darüber hinaus sind Bilddateien, die durch hochauflösende Mikroskopie erzeugt werden, viel größer als Dateien, die durch konfokale Mikroskopie erzeugt werden, und benötigen möglicherweise spezielle Computer oder Server für die Bildverarbeitung und -speicherung.

Schließlich wurde die Live-Bildgebung der BM-Proteine während der Drosophila-Oogenese verwendet, um neue Faktoren zu charakterisieren, die an der BM-Polarität^{beteiligt sind 57}. Dieser Ansatz hat jedoch Einschränkungen, insbesondere bei der Auflösung intrazellulärer Strukturen während des BM-Proteintransports. Die hochauflösende Mikroskopie ist ein leistungsstarker Ansatz, der in Verbindung mit Live-Bildgebung verwendet werden kann, um die Rolle der identifizierten Faktoren bei der polarisierten Ablagerung von BM-Proteinen genau zu bestimmen.

Weitere Anwendungen dieser Methode zur Untersuchung der Lokalisation intrazellulärer Komponenten, die dem vesikulären Transport gewidmet sind, unter Verwendung von endogen markierten Proteinen und hochauflösender Bildgebung
Die Etablierung und Aufrechterhaltung von Geweben und Organen während der Entwicklung und in einem erwachsenen Organismus hängt zum Teil von Zell-zu-Zell-Signalen und zellulärer Spannung und Adhäsion ab. Diese Prozesse hängen vom intrazellulären Transport, der Endozytose, der Exozytose und der Sekretion spezifischer Proteine ab. Daher könnten die hierin beschriebenen Methoden zur Entschlüsselung des intrazellulären Transports von BM unter Verwendung von endogen markierten Proteinen und konfokaler und hochauflösender Mikroskopie leicht angepasst werden, um jeden Prozess zu untersuchen. Darüber hinaus macht die einfache Anwendung der CRISPR/Cas9-vermittelten genetischen Bearbeitung zur Generierung von körpereigenen Proteinen diesen Ansatz noch vielseitiger und leistungsfähiger⁵⁸.

Abschließend haben wir Methoden zur Herstellung und Bildgebung von BM-Proteinen in der FE des Drosophila-Eierstocks mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie beschrieben. Diese Protokolle können für das Hochdurchsatz-Screening angewendet werden, um neue Komponenten für die richtige Platzierung von BM-Proteinen zu identifizieren. Schließlich hat die Anwendung dieser Methodik das Potenzial, wesentliche Beiträge zu unserem Verständnis darüber zu leisten, wie Epithelzellen die polarisierte Sekretion von BM-Proteinen kontrollieren, ein Schlüsselprozess bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Epithelarchitektur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing