Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63778
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

Summary

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

Abstract

קרום המרתף (BM) - יריעה מיוחדת של מטריצה חוץ-תאית הקיימת בצד הבסיסי של תאי אפיתל - חיונית לביסוס ותחזוקה של מורפולוגיה של רקמת אפיתל ומורפוגנזה של איברים. יתר על כן, ה- BM חיוני למידול רקמות, משמש כפלטפורמת איתות, ומספק כוחות חיצוניים לעיצוב רקמות ואיברים. למרות התפקידים החשובים הרבים שה-BM ממלא במהלך ההתפתחות התקינה והתנאים הפתולוגיים, המסלולים הביולוגיים השולטים בסחר התוך-תאי של שלפוחיות המכילות BM וכיצד הפרשה בסיסית מובילה לתצהיר מקוטב של חלבוני BM אינם מובנים היטב. האפיתל הזקיק של השחלה דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר התצהיר הבסיסי של חלבוני ממברנת BM, שכן הוא מייצר ומפריש את כל המרכיבים העיקריים של BM. הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה בשילוב עם עיבוד תמונה ברקמות קבועות מאפשרת זיהוי ואפיון של גורמים תאיים המעורבים במיוחד בסחר תוך תאי ובתצהיר של חלבוני BM. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצביעה והדמיה של בועיות המכילות BM ו- BM מופקד באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני באפיתל הזקיקי של שחלת דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לענות על שאלות איכותיות וכמותיות כאחד והוא פותח כדי להתאים לסינון בתפוקה גבוהה, המאפשר זיהוי מהיר ויעיל של גורמים המעורבים בסחר תוך תאי מקוטב ובהפרשה של שלפוחיות במהלך התפתחות רקמת אפיתל.

Introduction

קרום המרתף (BM) הוא יריעה דקה של מטריצה חוץ-תאית דביקה של תאים מרובדים (ECM) הקריטית למבנה אפיתל ולמורפוגנזה1. הוא מכיל כ-50 חלבונים ונמצא בכל מקום ביסוד תאי האפיתל והאנדותל, ומעורר תא שלד, חלק ושריר לב ואדיפוציטים 1,2,3. שלושת המרכיבים העיקריים של ה-BM בצד הבסיסי של תאי האפיתל הם קולגן IV, פרלקן ולמינינים. ה-BM עומד בבסיס תאי האפיתל ואחראי על תפקודים רבים, כולל הפרדת רקמות ומחסום, גדילה ותמיכה, וקיטוב תאים 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . תפקידה כפלטפורמת איתות מווסת את המורפולוגיה וההתמיינות של תאי אפיתל ורקמות במהלך ההתפתחות 3,13,14. יתר על כן, ויסות שגוי של ה- BM ו / או הפרה בשלמותו הם הגורמים העיקריים למצבים פתולוגיים רבים, כולל גרורות גידול 2,15,16. למרות הפונקציות החיוניות המבוצעות על ידי BM במהלך מורפוגנזה של רקמות ואיברים, מרכיבי המסלולים הביולוגיים המוקדשים לסחר תוך-תאי מקוטב ולהפרשה של חלבוני BM ידועים במעורפל.

כדי לחקור את הסחר התוך-תאי של בועיות המכילות BM ואת הפרשת חלבוני BM על ידי תאי אפיתל, האפיתל הזקיקי (FE) של שחלת דרוזופילה הוא מערכת מודל רבת עוצמה (איור 1). שחלת דרוזופילה מורכבת מ-16-20 מבנים ארוכים דמויי צינור, הנקראים אובריולים (איור 1A,B)17,18,19. ניתן לחשוב על כל שחלות כפס ייצור של ביצים, עם התקדמות הגיל של תאי הביצה (שכל אחד מהם מוליד ביצה) שמתחיל בקצה הקדמי ונע לאחור, עד שהביצה הבוגרת יוצאת דרך האובידוקט. כל תא ביצית עטוף על ידי ה-FE, חד-שכבתי של תאי זקיק סומטיים (FCs), המקיף את תאי הנבט המרכזיים (GCs). ה-FE מקוטב מאוד עם קוטביות אפית-בסיסית מובהקת שבה התחום האפיקלי פונה אל הנבט, וחלבוני ה-BM מופרשים באופן בסיסי18,19. ה-FCs מפרישים באופן פעיל את כל המרכיבים העיקריים של ה-BM, כולל קולגן IV, פרלקן ולמינינים 20,21. בתאי אפיתל כגון FCs, רכיבי ה-BM מיוצרים ודורשים מסלול הפרשה מקוטב מיוחד עבור התצהיר שלהם חוץ-תאי. לדוגמה, במקרה של המרכיב הנפוץ ביותר של BM, קולגן IV (Coll IV), הפרטים סביב הסחר וההפרשה התוך-תאיים המקוטבים שלו מעורפלים למרות שהייצור והתצהיר שלו הם המוקד של מחקרים רבים. קול IV מתורגם ברשתית האנדופלסמית (ER), שבה כל פיבריל - המורכב משלושה פוליפפטידים (שתי שרשראות α1 ושרשרת α2 אחת) - מורכב לסליל משולש22. קיפול תקין של Coll IV ותפקוד דורשים מלווים ואנזימים של ER, כולל ליזיל ופרוליל-הידרוקסילאזות כגון Plod ו-PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. אנזימים פוסט-טרנסלציוניים אלה מווסתים את מיון ה-ER של קול IV, שכן האובדן של כל אחד מהם גורם ל-Coll IV להילכד ב-ER הבסיסי 20,23,24,25,26. לאחר מכן, הקולג' הרביעי המסונתז החדש יוצא מהמיון עבור הגולגי בשלפוחיות מצופות COPII. קולטן המטען Tango1 מסייע באריזת קולגן לתוך שלפוחיות גדולות הקשורות לגולגי שיכולות להכיל חלבונים רב-חומריים גדולים20,27. ברגע ש-Coll IV נארז לתוך שלפוחיות אקסוציטיות תוך-תאיות, הוא מופרש באופן ספציפי באופן בסיסי מתאי אפיתל. כדי לכוון את תצהיר BM לצד הבסיסי, תאי אפיתל דורשים קבוצה נוספת של גורמים המוקדשים במיוחד להפרשת BM מקוטבת. באמצעות ה-FE של שחלת דרוזופילה, אופיינו כמה מרכיבים של התהליך התאי החדש הזה, כולל גורמי חילופי הנוקלאוטידים (GEFs) Crag ו-Stratum, ה-GTPases Rab8 ו-Rab10, כמו גם הרמות של הפוספונינוסיטיד PI(4,5)P2, ו-Kinesin 1 ו-3 חלבונים מוטוריים 20,28,29,30,31 . רכיבים אלה חיוניים להבטחת ההתפלגות המקוטבת של חלבוני BM.

כדי לנטר את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני BM ב-FE, חלבוני קרום מרתף המתויגים באופן אנדוגני (מלכודות חלבון), כגון Viking-GFP (Vkg-GFP או α2 Coll IV-GFP) ו-Perlecan-GFP (Pcan-GFP) יכולים לשמש32,33. הודגם כי קווי מלכודת חלבונים אלה משקפים במדויק את ההתפלגות האנדוגנית של חלבוני BM ומאפשרים זיהוי רגיש יותר של סחרבשלפוחית 28,30. הרכיבים המעורבים בתצהיר המקוטב של BM ב-FE אופיינו לראשונה באמצעות קווי מלכודת חלבונים עבור Vkg-GFP ו-Pcan-GFP 20,28,29,30. ניתן להשתמש במלכודות חלבונים ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטנטים וקווי Gal4 34. יתר על כן, ניתן להשתמש במלכודות חלבונים בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים ו/או חיסון פלואורסצנטי, מה שמאפשר אפיון מדויק של לוקליזציה של חלבוני BM כאשר משווים בין תנאים מסוג בר ומוטנטים35.

כדי להעריך באופן מדויק ויעיל את ההתפלגות והלוקליזציה של שלפוחיות המכילות חלבון BM, מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) וטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מהוות יתרון משמעותי לגישות הדמיה אחרות. גישות אלה משלבות הדמיה ברזולוציה גבוהה עם קלות שימוש יחסית. CLSM היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת רזולוציה אופטית משופרת על ידי סריקת הדגימה באמצעות לייזר באופן סריקת רסטר באמצעות גלוונומטרים. מפתח הצמצם של חור הפין הוא מרכיב מרכזי במיקרוסקופ קונפוקלי. על-ידי חסימת האותות מחוץ למיקוד המגיעים מעל או מתחת למישור המוקד, מפתח הצמצם של חור הפין מוביל לרזולוציה מעולה ביותר בציר z36. זה גם מאפשר לקבל סדרה של תמונות במישור z, הנקרא z-stack, המתאים לסדרה של קטעים אופטיים. z-stacks יוצרים לאחר מכן תמונה תלת-ממדית של הדגימה, באמצעות שחזור תלת-ממדי, בעזרת תוכנת הדמיה. מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים קונבנציונליים (שדה רחב), בניגוד למיקרוסקופים קונפוקליים, מאפשרים לאור מחוץ למיקוד לתרום לאיכות התמונה, ובכך להקטין את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות36,37. זה הופך את מיקרוסקופיית האפיפלואורסצנציה למועמדת פחות אטרקטיבית כאשר חוקרים לוקליזציה של חלבונים או קולוקליזציה.

למרות ש-CLSM היא גישה מתאימה ליישומים שונים, כולל הדמיה ואפיון של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM, היא עדיין מהווה בעיה בעת הדמיה של דגימות מתחת לגבול עקיפת האור של Abbe (200-250 ננומטר). בעת הדמיה של דגימות כאלה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, במיוחד בעת שימוש במטרת שמן, יכולה לגרום לרזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקות סופר-רזולוציה עוברות את הגבול של מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנן גישות שונות להשגת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, שלכל אחת מהן מגבלות רזולוציה ספציפיות, וכל אחת מהן מתאימה לניתוחים שונים. גישות אלה כוללות מיקרוסקופיית לוקליזציה פוטואקטיבית (PALM) או מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM) ומיקרוסקופיה אווירית (סופר-רזולוציה) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . למרות של-Airyscan יש רזולוציה גסה יותר מאשר PALM/STORM, STED ו-SIM, הוא עדיין יכול להשיג רזולוציה של עד ~120 ננומטר (בערך פי שניים מהרזולוציה של CLSM). יתר על כן, הודגם כי לגישת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה זו יש יתרון על פני SIM וטכניקות אחרות ברזולוציית-על בעת הדמיית דגימות ודגימות עבות עם יחס אות לרעש נמוך47,48.

Airyscan היא טכנולוגיית מיקרוסקופיה קונפוקלית חדשה יחסית ברזולוציה גבוההיחסית 46. בניגוד ל-CLSMs מסורתיים, המשתמשים ב-pinhole ובגלאי נקודה בודדת כדי לדחות אור מחוץ למיקוד, גישה זו של רזולוציית-על משתמשת בגלאי שטח שפופרת פוטומולטיפלייר (GaAsP) בעל 32 ערוצים של גליום ארסניד פוספיד (GaAsP) שאוסף את כל האור בכל מיקום סריקה45. כל אחד מ-32 הגלאים פועל כחור סיכה קטן, ומקטין את גודל חור הפין מיחידת ה-1.0 Airy Unit המסורתית (A.U.) ל-0.2 A.U. משופרת, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה עוד יותר ויחס אות לרעש, תוך שמירה על היעילות של קוטר45 של 1.25 A.U. יתר על כן, הדה-קונבולוציה הליניארית המשמשת את Airyscan גורמת לעלייה של עד פי 2 ברזולוציה45. בהתחשב בכך, CLSM, ובמיוחד מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, מתאימים היטב לחקר חלבוני BM וחלבונים המווסתים את התצהיר הבסיסי של חלבוני BM, מכיוון שהם יכולים לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד למחקרי לוקליזציה וקולוקליזציה, ובכך לספק תובנות חדשות באירועים המרחביים, הזמניים והמולקולריים השולטים בתהליכים אלה.

גישה חלופית למיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בה כדי לבצע ניסויי לוקליזציה היא דה-קונבולוציה של תמונות. מאחר שמיקרוסקופיית שדה רחב מאפשרת לאור מחוץ למיקוד להגיע לגלאים, ניתן ליישם אלגוריתמים מתמטיים וחישוביים של דקונבולוציה כדי להסיר או להקצות מחדש אור מחוץ למיקוד מתמונות המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה בשדה רחב, ובכך לשפר את הרזולוציה והניגודיות של התמונה49. ניתן ליישם אלגוריתמים של Deconvolution גם על תמונות קונפוקליות כדי להגדיל עוד יותר את הרזולוציה והניגודיות, ולהפיק תמונות סופיות כמעט דומות לאלה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה50. Airyscan עושה שימוש בפירוק מבוסס מסנן ויינר יחד עם הקצאת הפיקסלים מחדש של שפרד, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש משופרים ביותר. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, נצפתה עלייה של פי 2 ברזולוציה בכל שלושת הממדים המרחביים (120 ננומטר ב-x וב-y, ו-350 ננומטר ב-z) בעת שימוש בטכניקת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה זו45,51.

כתב יד זה מספק פרוטוקולים מפורטים וממוטבים לצביעה, רכישה והדגמה של סחר ותצהיר תוך-תאיים של חלבוני BM תוך שימוש ב-FE של שחלת דרוזופילה כמערכת מודל בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. קווי דרוזופילה המבטאים חלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, למשל Vkg-GFP ו-Pcan-GFP, הם כלים יעילים ומדויקים להמחשת סחר והפרשת חלבוני BM. בנוסף, ניתן להשתמש בהם בקלות ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטציה וקווי Gal4/UAS 34. למרות שמומלץ להשתמש בחלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, השימוש בנוגדנים נגד חלבוני BM ספציפיים תואם גם את הפרוטוקולים המתוארים. פרוטוקולים אלה שימושיים במיוחד עבור מדענים המעוניינים לחקור סחר תוך-תאי ואת הפרשת חלבוני BM ברקמת אפיתל שלמה באמצעות הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. יתר על כן, היכולת לשלב ניתוח רקמת אפיתל עם הכלים הנרחבים של הגנטיקה של Drosophila הופכת את הגישה הזו לחזקה במיוחד. לבסוף, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לחקר סחר בווסקולרי ומיון של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת זבובים לניתוחי שחלה

  1. שים 10-15 נקבות נקבות דרוזופילה מלנוגסטר (בנות 1-2 ימים) של הגנוטיפ הרצוי בבקבוקון צר המכיל כ-8 מ"ל של מדיום זבוב דרוזופילה מפוזר עם כמות קטנה של שמרי אופה מגורענים 2-3 ימים לפני הנתיחה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הוספת כמה זכרים לבקבוקון יכולה להגביר את תפוקת תאי הביצים. עם זאת, ודא כי המספר הכולל של זבובים לא יעלה על 20 כמו זה יכול להשפיע לרעה על התפתחות השחלה.
    הערה: תיאור של זכרים ונקבות של דרוזופילה, וטיפים ועצות שימושיים למדענים ללא ניסיון קודם בדרוזופילה ניתן למצוא במאמרים המצוטטים34,52. הוספת שמרים תעודד ייצור ביצים ותיצור שחלות עם שלבים שונים המיוצגים. יתר על כן, זה גם ישמין את השחלות ויהפוך אותם לקלים יותר לבלו. שמרים רטובים יכולים לשמש גם במקום שמרים מגורענים, אולם עבור מלאי חלש יותר, הזבובים עלולים להיתקע ולמות.

2. כריתה וקיבוע של השחלה

הערה: לקבלת משאבים נוספים על כריתה וכתם של השחלה, הקוראים מופנים לפרוטוקולים המצוטטים 53,54,55.

  1. ביום הנתיחה, הכינו תמיסת קיבוע טרייה עם ריכוז סופי של 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול תמיסת מלאי ה-PFA בתמיסת חיץ פוספט 1x (PBS).
  2. מרדימים את הזבובים באמצעות CO2 ומניחים אותם על משטח זבובים. שמור את הזבובים מורדמים עד כריתה. שקול זבובים מורדמים כראוי לאחר שתנועותיהם פסקו, מה שבדרך כלל לוקח 10-20 שניות.
    הערה: למרות ששימוש ב-CO2 מומלץ כאפשרות בטוחה ומהירה יותר, ניתן להרדים זבובים באמצעות קרח.
  3. מניחים שקופית קעורה מזכוכית או צלחת צביעה עם בארות שקע רדודות מתחת למיקרוסקופ ניתוח וממלאים את הבארות ב-1x PBS.
  4. תפסו זבוב נקבה בבית החזה התחתון באמצעות זוג מלקחיים. להבטיח את המין של הזבובים על ידי היעדר איברי מין זכריים בקצה האחורי של הבטן ואת היעדר מסרקי מין על הקדמיים שלהם כמאפיין משני52. לנתח זבובים בנפרד באמצעות זוג מלקחיים נוסף (שלב 2.5) תוך טבילתם לתוך בארות מלאות ב-1x PBS תחת מיקרוסקופ הניתוח (מומלץ להגדיל פי 20).
  5. תוך כדי התבוננות במיקרוסקופ הניתוח, השתמשו בזוג מלקחיים נוסף כדי למשוך את החלק האחורי של הבטן הזבובית, מה שהופך את האיברים הפנימיים (למשל, שחלות, מעיים) לנראים לעין.
  6. יש לסחוט בעדינות את החלק הקדמי של הבטן הזבובית (כמו עם צינור של משחת שיניים) כדי לדחוק את השחלות אל מחוץ לבטן. שיטה זו צריכה לשמור על השחלות שלמות. נתקו והסירו בזהירות איברים אחרים ופסולת זבובים.
  7. באמצעות מלקחיים או מחטים ניתוח, להפריד את ovarioles של השחלה תוך שמירה על מבנה השחלה הכוללת שלם. מטרת שלב זה היא לשבור את נדן השרירים המכסה את השחלות ולאפשר צביעה יעילה והומוגנית יותר.
  8. מעבירים במהירות את השחלות לצינור מיקרו-צנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 1x PBS ושומרים על הצינור על הקרח עד שכל הזבובים מנותחים. אל תשמור את הצינור על קרח אם יש לדמיין מיקרוטובולים או מיקרופילמנטים (או שלפוחיות הנסחרות על ידי רכיבי שלד ציטוסקטליים אלה), שכן הדבר עלול לגרום לדה-פולימריזציה.
  9. לאחר שכל השחלות מנותחות ומועברות לצינור microcentrifuge, אפשרו להן לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר את כל ה- PBS מלבד ~ 50 μL של ה- PBS. הוסיפו 1 מ"ל של 4% PFA והניחו על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך 15 דקות. חשוב לציין, בדקו אם השחלות נעות קדימה ואחורה בפתרון הקיבוע כדי לאפשר קיבוע תקין, שכן קיבוע לא שלם עלול להוביל לבעיות צביעה והדמיה.
    הערה: המהירות של nutator אינה קריטית. בעוד שלחלק מהנואטורים יש בקרת מהירות, אחרים מגיעים עם מהירות מוגדרת מראש. המהירות שנקבעה מראש מספיקה, ואם היא מתכווננת, מוגדרת ל-40-50 סל"ד.
  10. הסר את פתרון הקיבוע (כמו בשלב 2.9), ולאחר מכן בצע שתי שטיפות מהירות עם 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 0.1% Triton-X 100 (1x PBST), על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרופוגה 5-6 פעמים. לאחר מכן, המשך עם ארבע שטיפות של 10-15 דקות (שטיפה ארוכה) עם 1 מ"ל של 1x PBST (40-60 דקות בסך הכל).
    הערה: מומלץ להשתמש ב- 1x PBS + 0.1% Triton-X 100 לשטיפות מכיוון שהגדלת אחוז חומרי הניקוי עלולה לגרום לדנטורציה של GFP, מה שיוביל לירידה בפלואורסצנציה ולזיהוי של חלבוני BM המתויגים על ידי GFP.
  11. לצביעת צבע, למשל, צביעת דנ"א ו-F-אקטין, המשך לשלב 3. עבור immunostaining, המשך לשלב 4. ניתן לאחסן את השחלות ב- 1x PBST בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות לפני שתמשיך.

3. צביעת דנ"א/F-אקטין סטנדרטית

  1. לאחר קיבוע ושטיפה, הסר PBST. הוסיפו 500 μL של דנ"א ותמיסת צביעת F-Actin. כדי להכין את תמיסת ה-DNA/F-Actin, יש לערבב את Hoechst (כתם דנ"א; דילול 1:1000 של תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל) ואת הפלואידין המתויג על-ידי פלואור (כתם F-actin; דילול של 1:500 עבור Alexa Fluor 546 או 1:100 דילול עבור Alexa Fluor 647, כל אחד מתמיסת מלאי של 66 μM) ב-500 μL של PBST.
  2. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור על השחלות והצבעים בחושך כדי לשמור על הפלואורסצנציה להדמיה יעילה ודגירה על נדנדת פלטפורמה מתפרקת למשך 15 דקות.
  3. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הדנ"א/F-אקטין (כמו בשלב 2.9). בצע שתי שטיפות מהירות ושלוש שטיפות ארוכות (10-15 דקות) ב- 1x PBST כמתואר בשלב 2.10. המשך להרכבה כמתואר בשלב 5.

4. חיסון פלואורסצנטי

הערה: זהו פרוטוקול חיסון סטנדרטי להדמיה פלואורסצנטית והוא תואם לרוב הנוגדנים הראשוניים.

  1. חסימה ונוגדנים ראשוניים (יום 1)
    1. לאחר קיבוע ושטיפה, הסר PBST כמתואר בשלב 2.9. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חסימה (PBS + 5% BSA) וחסום את השחלות על נדנדת פלטפורמה מתנדנדת למשך שעה אחת מינימום.
      הערה: בנוסף ל-BSA, ניתן להוסיף סרום בקר עוברי (FBS) או סרום עזים רגיל (NGS) לתמיסת החסימה. לחלופין, ניתן לחסום את השחלות למשך הלילה על נדנדת פלטפורמה מתפרצת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר את תמיסת החסימה כמו בשלב 2.9 והוסף 300 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית המכילה נוגדנים ראשוניים המדוללים בריכוזים המתאימים להם (ספציפית לנוגדן המשמש) בתמיסת החסימה. דגירה למשך הלילה על נדנדת פלטפורמה מתפרצת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים הראשונית והמשך לחיסון נוגדנים משני.
      הערה: ניתן לשמור חלק מהנוגדנים הראשוניים ולעשות בהם שימוש חוזר. במקרים מסוימים, נוגדנים ראשוניים בשימוש חוזר יכולים להפחית את צביעת הרקע, וכתוצאה מכך הדמיה טובה יותר. עם זאת, יש לבדוק שימוש חוזר עבור כל נוגדן כדי להבטיח יעילות.
  2. נוגדנים משניים לחיסון (יום 2)
    1. לאחר הסרת תמיסת הנוגדן העיקרית, בצע שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות (10-15 דקות) כמו בשלב 2.10. שטיפות חוזרות ונשנות שנעשו בקפידה באמצעות PBST טרי של 1x יפחיתו את הרקע הלא ספציפי ויובילו להדמיה אופטימלית.
    2. הסר PBST כמו בשלב 2.9 והוסף 500 μL של תמיסת נוגדנים משנית המכילה נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שיזהו את הנוגדנים העיקריים שבהם נעשה שימוש. הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסויו ברדיד אלומיניום מנקודה זו ואילך לצורך שימור אופטימלי של פלואורסצנציה, שהוא קריטי לצורך רכישה וניתוח של תמונה.
      הערה: תמיסת הנוגדנים המשנית צריכה להכיל נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופורים שאינם חופפים לחלבונים המתויגים באופן אנדוגני. לדוגמה, אם משתמשים בחלבונים המתויגים על-ידי GFP, מומלץ להשתמש בנוגדנים משניים של Alexa Fluor באורכי גל אדומים או אדומים רחוקים (למשל, 546, 568 או 647 ננומטר). צבעים פלואורסצנטיים, כגון Hoechst ו- Alexa Fluor 546 או 647 פאלואידין מצומד, ניתנים להוספה לתמיסה המשנית. כתמים אלה עשויים לעזור לסמן את מבנה התא הכולל (כלומר, גרעינים ו-F-אקטין). עיין בשלב 3.1 עבור הריכוזים.
    3. הדגירה של השחלות בתמיסת הנוגדנים המשנית על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בצעו שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות (10-15 דקות) ב-1x PBST כמו בשלב 2.10. המשך להרכבה כמו בשלב 5.

5. הרכבה של שחלות מוכתמות

הערה: שיטה זו פועלת היטב אם השחלות מפותחות היטב ושופעות. הרכבה זהירה של השחלות בשקופית היא קריטית להדמיה אופטימלית.

  1. לאחר הכביסה האחרונה, השתמשו בפיפטה p1000 כדי לטפטף בעדינות את השחלות למעלה ולמטה בצינור כדי להפריד בין תאי הביצים. אפשרו לתאי הביצים לשקוע לתחתית על ידי שמירה על הצינור במצב זקוף למשך 5-10 דקות. הפרדה זהירה של תאי ביצים בודדים היא קריטית להשגת רכישת תמונה אופטימלית.
  2. הסר PBST באמצעות פיפטת פסטר, והשאר ~ 50 μL. הסר כמה שיותר מה- PBST הנותרים באמצעות פיפטה p200. הוסיפו שתי טיפות של מדיום הרכבה, מספיק כדי להתפשט באופן שווה על מכסה של 22 מ"מ x 22 מ"מ. ניתן לאחסן את השחלות במדיום ההרכבה בצינורות microcentrifuge בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש לפני ההרכבה.
    הערה: מספר מדיות הרכבה שונות זמינות באופן מסחרי; מומלץ להשתמש בחומרי הרכבה קשיחים, כגון תושבת אקווה-פולי/הר או תושבת אנטיפאדה מזכוכית ProLong, כדי להשיג תנאי הדמיה אופטימליים. השימוש בגליצרול כמדיום הרכבה אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול להוביל לתנאי הדמיה ירודים (למשל, חוסר יציבות פלואורופור). עבור חומרי הרכבה שאינם מתפלמרים, אטמו את הכיסוי באמצעות חומר איטום/לק לכיסויים כדי לאבטח אותו במקומו.
  3. תייג מגלשת זכוכית וניגב אותה בנייר רך ונטול אבק כדי להסיר אבק וטביעות אצבעות. חותכים את הקצה של קצה פיפטה p200 כדי לאפשר העברה קלה של מדיום ההרכבה הצמיג אל המגלשה מצינור המיקרו-סנטריפוג'. לאחר מכן, מעבירים באיטיות את כל תאי הביצים במדיום ההרכבה לשקופית הזכוכית, ומבטיחים לא ליצור בועות.
  4. תחת מיקרוסקופ ניתוח, פרשו בעדינות את התווך המורכב ותאי הביצים המופרדים באמצעות קצה p200 חדש או מלקחיים כדי לכסות שטח בערך בגודל של קליפת הכיסוי.
  5. בעזרת מלקחיים, הניחו בזהירות את הכיסוי (המנוקה בנייר נטול אבק) על תאי הביצים בזווית כדי למנוע בועות.
  6. אחסנו את המגלשה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח בחושך למשך יומיים כדי לבצע פולימריזציה. לאחר שמדיית ההרכבה נרפאה, ניתן לאחסן את השקופית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך מספר שבועות לצורך הדמיה.
    הערה: חשוב להגדרה קשה של מדיום הרכבה לפולימר לפני ההדמיה. אם המדיום עדיין לא עבר פולימריזציה, השחלות יצופו מתחת לכיסוי, מה שישפיע על רכישת התמונה. יתר על כן, האינדקס הרפלקטיבי האופטימלי של מדיית הרכבה מושג רק לאחר שהוא מתייצב לחלוטין (עיין במידע היצרן לפרטים).
  7. שיטת הרכבה חלופית: שיטה זו מומלצת כדי להפחית את אובדן הרקמות אם השחלות אינן בשפע. בשיטה זו (המתוארת להלן), להפריד את האובריולים ואת תאי הביצים על המגלשה בזמן ההרכבה, במקום להפריד אותם בצינור microcentrifuge על ידי צנרת כמתואר בשלב 5.1.
    1. לאחר הכביסה האחרונה, יש להסיר את כל תמיסת הכביסה מלבד כ-100 μL. באמצעות פיפטה של פסטר או פיפטה p1000, העבר את השחלות השלמות ב- PBS לשקופית. באמצעות פיפטה p200, הסר בזהירות כמה שיותר PBST מהשקופית. השתמשו בנייר נטול אבק כדי לנגב את ה-PBST, במידת הצורך. אל תיגע בשחלות.
    2. הוסף שתי טיפות של מדיית הרכבה. יש להפריד בזהירות בין השחלות לתאי הביצים באמצעות מלקחיים או מחט ניתוח. הסר והשליכו רקמה זרה, ולאחר מכן פזרו את תאי הביצים והאביריולים בתווך ההרכבה. המשך לשלבים 5.5-5.6.

6. רכישת תמונה קונפוקלית

הערה: חלק זה מספק פרמטרים מרכזיים להשגת רכישת תמונה אופטימלית באמצעות כל מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2).

  1. הגדר את המיקרוסקופ ואתר את הדגימה כמתואר להלן.
    1. לפני ההדמיה, חיוני לאתר את אזור העניין (ROI) באמצעות העינית של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. השתמש במטרת הגדלה נמוכה (20x) או במטרה שתשמש לרכישת תמונה (כלומר, 40x או 63x). בחר תא ביצים לתמונה.
      הערה: לרכישת תמונה, מומלץ להשתמש ביעדי הגדלה גבוהים כגון 40x או 63x (ראה 6.2.1).
    2. לאחר בחירת ההחזר על ההשקעה, המשך לרכישת תמונה; המשך לשלב 6.2 להדמיה קונפוקלית, ולשלב 7 להדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד.
  2. בחר את הפרמטרים המרכזיים לרכישת תמונה אופטימלית כמתואר להלן (דוגמאות לפרמטרים מרכזיים עבור התמונות המייצגות מופיעות בטבלה 1).
    1. בחירת מטרה: לרכישת תמונה קונפוקלית של סחר תוך-תאי והפרשה של חלבוני BM ב-FE, השתמש במטרה של פי 40 או פי 63.
      הערה: כדי להשיג את הרזולוציה הטובה ביותר האפשרית, מומלץ מאוד להשתמש במטרות Plan-Apochromat, עם מפתח צמצם מספרי גבוה (NA) המספק את התיקון האכרומטי הגבוה ביותר.
    2. בחירת לייזרים לכל ערוץ/רצועה: עבור GFP, השתמש בלייזר 488 ננומטר; עבור DAPI או Hoechst, השתמש בלייזר 405 ננומטר; עבור Alexa Fluor 546 או 568, השתמש בלייזר 561 ננומטר; ועבור אלקסה פלואור 647, השתמש בלייזר 640 ננומטר.
      הערה: כל בחירת לייזר תגרום להיווצרות ערוץ/מסלול שונה. כאן, המונח ערוץ מתייחס לתמונה שנוצרה על ידי התפלגות העוצמה המוקלטת עבור פלואורופורים נרגשים עבור החזר ההשקעה שנבחר באורך הגל הספציפי של כל ערוץ.
    3. הגדרת חור פין: כדי להפחית אור מחוץ למיקוד במהלך רכישת תמונה, הגדר את חור הסיכה עבור כל ערוץ ל- 1 AU.
    4. עוצמת הלייזר והגדרות העלייה בגלאי: כדי לכוונן את רגישות התמונה, השתמש הן ברווח הראשי של הגלאי והן בעוצמת הלייזר. כדי להגדיר כראוי את רגישות התמונה, מומלץ מחוון טווח. הגדר הן את הרווח הראשי והן את כוח הלייזר כך שיהיו בעלי רגישות נכונה כאשר המבנים המעניינים (למשל, שלפוחיות המכילות BM) נראים בבירור תוך הימנעות מרוויה של גלאי.
      הערה: כדי להימנע מהלבנת תמונות, השתמש בכוח הלייזר המינימלי הדרוש. מומלץ להגדיל את רווח הגלאי תחילה תוך שימוש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית. אם עלייה של רווח הגלאי אינה יכולה להשיג את העוצמה הרצויה, ואז להגדיל את כוח הלייזר. מומלץ לבצע עוצמת הספק לייזר בין 0.5%-1.2%.
    5. גודל מסגרת: מומלץ להשתמש בגודל התמונה האופטימלי שנקבע על ידי תוכנת הרכישה. עבור רוב היישומים, השתמש ברזולוציה מקסימלית של 1024 x 1024. רזולוציה גבוהה יותר תגדיל משמעותית את זמן הרכישה.
    6. מהירות סריקה: השתמש במהירות סריקה בין 6-9, שהיא בטוחה עבור רוב הדגימות. אם הדגימה רועשת, השתמש במהירות סריקה איטית יותר כדי לשפר את יחסי האות לרעש. עם זאת, מהירויות סריקה נמוכות מגדילות את זמן ההלבנה והרכישה של תמונות.
    7. ממוצע העוצמה הממוצעת: כדי לשפר את איכות התמונה, השתמש בממוצע העוצמה הממוצעת באמצעות סריקות עוקבות עם הגדרות זהות. עבור רוב המקרים, השתמש בממוצע של שניים כדי לשפר את יחסי האות לרעש מבלי להלבין את הדגימה.
    8. זום: התאם את אזור הסריקה באמצעות פונקציית הזום. השתמש בזום בין 2x-4x עם מטרות של 40x ו- 63x כערך היעיל ביותר כדי לדמיין בבירור בועיות המכילות BM ב- FE. בחר בקפידה את ההחזר המינימלי ROI כדי לקצר את זמן הרכישה.
  3. כדי לרכוש z-stack באמצעות תוכנת Zeiss Zen, השתמש בפרמטרים הבאים של חיתוך Z והגדר אותם כמתואר להלן.
    הערה: שלפוחיות ומבנים תוך-תאיים אחרים המכילים חלבוני BM הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). רכישת מחסנית z באמצעות ה-FE תשפר משמעותית את איכות התמונה ואת הרזולוציה שלה. בדרך כלל, די בטווח המשתרע על עובי/עומק הרקמה כדי לדמיין ביעילות לוקליזציה תוך תאית. לשחזור תלת מימדי אופטימלי, מומלץ להשתמש במרווח האופטימלי שנקבע על ידי התוכנה. עבור יעדים של 40x ו- 63x, הימנע ממרווחים גבוהים מ- 0.5 מיקרומטר בין כל מקטע z כדי לאפשר שחזור תלת-ממדי אופטימלי.
    1. לחץ על תיבת הסימון z-Stack באזור הראשי תחת הכרטיסייה רכישה . בחר במצב סריקה של כל הרצועות לכל פרוסה עבור מחסנית z. התוצאה תהיה שינוי ברצועות הערוצים עבור כל פרוסת מיקום z.
    2. בחר את הערוץ הרצוי כדי לצפות בדגימה ולחץ על Live כדי להתחיל בסריקה חיה. מומלץ להשתמש בתעלה הדרושה לזיהוי חלבון ה-BM המתויג ב-GFP.
    3. הגדר טווח עבור מחסנית z כמתואר. באמצעות ידית ההתאמה העדינה במיקרוסקופ, מצא את מיקום z עבור קצה אחד של הדגימה, ולחץ על Set First. באופן דומה, מצא את מיקום z עבור הקצה השני של הדגימה ולחץ על Set Last.
    4. עבור כל מיקום במחסנית z, לחץ על כל ערוץ בנפרד עם מחוון הטווח שנבחר, והתאם את עוצמת הלייזר ואת הרווח הראשי לפי הצורך, כמתואר בשלב 6.2.4.
    5. הגדר את מרווח הזמן עבור מחסנית z כדי להקצות את גודל הצעד כפי שמומלץ בהערה מתחת לשלב 6.3. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת z-stack.

7. רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה במיוחד

  1. בחר מטרה תואמת Airyscan. כדי לדמיין את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבון BM, השימוש במטרת שמן 63x הוא אופטימלי (איור 3). הגדר את המטרה לפי 63 והנח בעדינות טיפה של שמן טבילה על העדשה שלה. מקם את השקופית על המטרה עם כיסוי הפונה למטרה לאתר את הדגימה.
  2. בחר תצורה עם הגדרות מתאימות עבור הפלואורופור לתמונה כמתואר להלן.
    1. לחץ על לחצן התקנה חכמה בכרטיסיה רכישה כדי להגדיר ניסוי חדש. בחר Airyscan (רזולוציית-על); כאשר אפשרות זו נבחרה, תידרש בחירה נוספת בין רזולוציה (Airyscan SR), SNR/רגישות (Airyscan Confocal) ומהירות (Multiplex SR-2Y). עבור רקמות קבועות, בחר רזולוציה מכיוון שתביא לרכישה הטובה ביותר.
    2. לחץ על + בתיבה קבע את תצורת הניסוי שלך כדי להוסיף רצועות/ערוצים. בחר את הרצועות עבור צבעים ספציפיים ממסד הנתונים של Dye. לניסוי רב-ערוצי, הוסף כל רצועה לפי הצורך על-ידי בחירת הצבעים המתאימים.
    3. לאחר שכל המסלולים נוספו, בחר אחת מהצעות הניסוי שסופקו על ידי התוכנה. עבור ניסוי זה, השתמש ב- Best Signal, מכיוון שלמרות שהמהירות תהיה מעט איטית יותר בהשוואה להצעת Smartest (Line), היא תיצור את הגדרות החומרה הטובות ביותר עבור כל צבע, וכתוצאה מכך רווח אות מקסימלי וצלב פליטה מינימלי. לאחר שהניסוי הוגדר ונטען, הוא יופיע בחלון 'הגדרת הדמיה' בכרטיסיה 'רכישה'.
    4. לאחר בחירת הגדרה חכמה, ייבחר באופן אוטומטי טווח אורכי הגל של הגלאי GaAsP-PMT. התאם את הטווח על-ידי הזזת פס הגלילה בתחתית כדי להגדיל או להקטין את הטווח או להזיז לחלוטין את הטווח לאזור אחר כנדרש. השתמש באפשרות זו כדי לוודא שהטווחים של שני ערוצים שונים אינם חופפים כדי למנוע הצלבה. שמור את התצורה לשימוש חוזר בעתיד.
  3. לאחר הגדרת התצורה, המשך לכוונן את אזור הזום והסריקה כמו בשלב 6.2.8. מטב את אזור הסריקה כדי להתמקד באזור העניין כדי לצמצם את זמן הסריקה ואת שטח האחסון. המשך לרכישת תמונות.
  4. עבור כל ערוץ בנפרד, בחר רצועה תחת ערוץ ולחץ על שידור חי. התאם את הרווח הראשי ואת עוצמת הלייזר באמצעות כלי מחוון הטווח כמתואר בשלב 6.2.4 ופעל לפי כל ההנחיות המתוארות כדי למנוע פיקסלים רוויים. אשר כי תצוגת הגלאי המשושה ממורכזת ומיושרת על ידי לחיצה על לחצן תצוגת גלאי Airyscan . ברוב המקרים, תצוגת הגלאי המשושה ממורכזת ומיושרת באופן אוטומטי. חזור על הפעולה לקבלת ערוצים נוספים.
  5. בחלון החלפת המצב רכישה, תחת גודל תמונה, לחץ על SR (ספירת פיקסלים מוגבלת ברזולוציה גבוהה במיוחד) כדי למקסם את היכולות של הגלאי. פעולה זו תתאים את גודל המסגרת באופן אוטומטי.
  6. שמור את הממוצע ל - None מכיוון שבדרך כלל אין בו צורך, וזה יקטין את זמן הסריקה. במקרים מסוימים, ממוצע של פי 2 עשוי לשפר את יחס האות לרעש.
  7. אסוף נתונים גולמיים עם עומקי נתונים של 8 סיביות. לחץ על הצמד כדי להשיג תמונה. כדי לרכוש מחסנית z, בצע את שלב 6.3.
  8. בצע עיבוד תמונה כמתואר להלן. פעולה זו תפיק תמונה של 16 סיביות.
    1. לאחר קבלת התמונה או מחסנית z, לחץ על שיטת עיבוד > ובחר עיבוד Airyscan.
    2. בצע מסנן אוטומטי כדי להתחיל בו ולבצע עיבוד ידני נוסף על-ידי שינוי ערך ה- SR כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר עבור המדגם. לאחר קביעת ערך ה- SR האופטימלי, לחץ על החל כדי ליצור תמונה מעובדת. במקרה של תמונות z-stack, תעבדו כ-z-slice אחד (תמונה נוכחית [2D]) או כ-z-stack כולו על-ידי לחיצה על התיבה 'עיבוד תלת-ממדי '.

8. עיבוד תמונה וניתוח נתונים (הקרנה אורתוגונלית, שחזור תלת מימדי ופרופיל עוצמה)

הערה: עבור שיטה זו, השלבים המשמשים ליצירת הקרנות אורתוגונליות, שחזורים תלת-ממדיים ופרופילי עוצמה מתוארים עבור תוכנת Zen (ראה טבלת חומרים). ניתוחי נתונים דומים עשויים להתבצע גם עם תוכנת ImageJ56.

  1. בצע הקרנה אורתוגונלית כמתואר להלן (איור 4).
    1. לאחר קבלת מחסנית z באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או סופר-רזולוציה, צור הקרנה אורתוגונלית כדי להציג את הבועיות בציר z של התא בתצוגה דו-ממדית (בהשוואה לשחזור תלת-ממדי). לשם כך, לחץ על שיטת עיבוד > ובחר הקרנה אורתוגונלית.
    2. תחת הפרמטרים, בחר את מישור ההקרנה הנדרש. להקרנה של ציר z (z-stack), בחר את המישור החזיתי (XY). תחת שיטה, בחר מקסימום כדי לגרום להקרנה באיכות הגבוהה ביותר.
    3. לאחר מכן, קבע את עובי ההקרנה על-ידי בחירת מיקום ההתחלה (תחילת פרוסת z), וקבע את העובי (המספר הכולל של פרוסות z) בהקרנה. זה אידיאלי לבחור את העובי השווה לזה של תא אחד בציר z.
    4. לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על החל כדי ליצור את ההקרנה של מחסנית z באופן מישור XY.
      הערה: בעת יצירת היטלים אורתוגונליים של z-stacks מרובים כדי להשוות את הכמות של אובייקט מסוים שמעניין אותו, חובה לשמור על עובי ההקרנה זהה (או קרוב ככל האפשר) לדיוק הנתונים.
  2. בצע שחזור תלת-ממדי כמתואר להלן (איור 5).
    1. צור שחזורים תלת-ממדיים של z-stacks כדי לבחון את הלוקליזציה והצורה של מבנים. עשה זאת עבור z-stacks שנרכשו באמצעות גישות קונפוקליות וסופר-רזולוציה. עיבוד z-stacks ברזולוציה מעולה תחילה באמצעות עיבוד תלת-ממדי כמו בשלב 7.8 לשחזור תלת-ממדי.
    2. כדי ליצור תמונה תלת-ממדית, לחץ על הסמל התלת-ממדי בחלון התצוגה המקדימה. לאחר הלחיצה, לשונית תלת-ממדית תופיע במקטע בקרת התצוגה בחצי התחתון של המסך. תצוגות תלת-ממד, כגון שקיפות, עוצמת קול, מקסימום, משטח ו-Mixed, יהיו גלויות לעין. השתמש בתצוגות Surface או Mixed בעת הצגת מבנה הבועיות (עדיף).
    3. עבור התמונה באיכות הגבוהה ביותר, בחר את ההגדרה 'מדויק' , מכיוון שההגדרה המהירה ביותר תהיה פחות מדויקת ותוביל לעיבוד תלת-ממדי גרוע.
    4. לאחר יצירת התמונה, תפעל אותה על-ידי סיבוב ושינוי גודל התצוגה כדי להתמקד במיקום מועדף כדי להציג את האובייקטים המעניינים. תפעל את התמונה התלת-ממדית תחת הכרטיסיה 'מראה '.
    5. לאחר שהושגה תצוגה משביעת רצון, תחת הכרטיסייה 3D, בחר רזולוציה מוצגת ולאחר מכן לחץ על צור תמונה. פעולה זו תיצור תמונת מצב של התמונה באותו כיוון שבו היא הוצגה וניתן לשמור ולייצא אותה בפורמטים שונים של קבצים.
  3. צור פרופיל עוצמה כמתואר להלן (איור 7).
    הערה: ניתן לראות את פרופילי ההתפלגות והעוצמה של הפיקסלים המשויכים לאותות הפלורסנט השונים כתמונת שכבה כדי לקבוע את הקולוקליזציה שלהם.
    1. לאחר שתמונה אופטימלית נרכשה באמצעות הדמיה קונפוקלית או ברזולוציה גבוהה במיוחד, בחלונית View של חלון התצוגה המקדימה , לחץ על פרופיל. בחלון התצוגה המקדימה תופיע היסטוגרמה המציגה את פרופיל העוצמה כפונקציה של מרחק, וכן טבלה המציגה מרחקים וערכי עוצמה.
    2. באזור פקדי התצוגה בתחתית המסך, לחץ על כלי החץ בכרטיסיה הגדרת פרופיל . ציירו חץ לאורך העצם שעבורו יש להעריך את פרופיל העוצמה של הפיקסלים השונים. כדי לצייר את החץ, הגדל את התצוגה של התמונה.
    3. פרופיל העוצמה יופיע בצד שמאל של התצוגה המקדימה של התמונה, שם יוצגו המרחק והפסגות המתאימות לאורך נתיב החץ. כדי להסיר את ההיסטוגרמה המוצגת בתמונה עצמה, בטל את הסימון בתיבה הצג פרופיל בגרפיקה .
    4. בכרטיסיה ממדים באזור בקרת התצוגה, בטל את הבחירה בערוצים שאינם אמורים להיכלל בפרופיל העוצמה.
    5. בכרטיסיה גרפיקה, לחץ פעמיים על פרופיל המוצג תחת התיבה ביאורים/מדידות כדי לפתוח את התיבה הנפתחת עיצוב רכיבים גרפיים . השתמש באפשרות זו כדי לשנות את צבע החץ, כמו גם את הסגנון ואת עובי הקו שלו. סגור את התיבה לאחר בחירת ההגדרות הרצויות.
    6. לחץ על הכרטיסיה תצוגת פרופיל . במקטע התמונה החדשה, לחץ על תצוגה נוכחית ולאחר מכן על שמור בשם כדי לשמור את הקובץ. מומלץ לשמור את הקובץ כקובץ .tif כדי למנוע דחיסה ואובדן נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לצלם ולאפיין ביעילות ובדייקנות את הסחר וההפרשה התוך-תאיים של חלבוני BM בתאי אפיתל מקוטבים, כגון FE של שחלת דרוזופילה . לאחר מכן, אנו מספקים תוצאות צפויות שהושגו באמצעות השיטות המתוארות, כמו גם עצות מועילות ומלכודות פוטנציאליות. כדי לעשות זאת, Vkg-GFP, Vkg מתויג אנדוגני (Drosophila Col IV) משמש. עם זאת, ניתן להשיג את אותן תוצאות עם חלבוני BM אחרים המתויגים באופן אנדוגני כגון Pcan-GFP.

הגדרת פרמטרי רכישה אופטימליים (איור 2)
כדי לאפיין במדויק את הסחר וההפרשה התוך-תאיים של חלבוני BM, כגון Vkg ו-Pcan, בתאי אפיתל, חשוב להגדיר כראוי את פרמטרי הרכישה של המיקרוסקופ הקונפוקלי כמתואר בשיטות שסופקו.

באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לזהות את הלוקליזציה התוך-תאית של Vkg-GFP לפני שהיא מופרשת ומופקדת באופן בסיסי ב-FE (איור 2A). הוכח כי לאחר תרגום במיון, קול IV מועבר לגולגי לפני שהוא נארז לתוך שלפוחית אקסוציטית תוך תאית. באמצעות גישת ההדמיה הזו, אנו רואים ש-Vkg-GFP מצטבר בתאים תוך-תאיים עם צורות שונות, מה שעשוי לייצג אברונים שונים, תאים אנדוזומליים וסוגי שלפוחית (איור 2A, חצים). בשלפוחיות אקסוציטיות, קול IV כבר מורכב לפיברילים המורכבים משלושה פוליפפטידים: שתי שרשראות α1 ושרשרת α2 אחת (Vkg בדרוזופילה), מה שמוביל להיווצרות של שלפוחיות מתוחות שניתן לדמיין גם באמצעות הדמיה קונפוקלית (איור 2A, חצים). לאחר מכן, קול IV מופרש באופן ספציפי באופן בסיסי מתאי אפיתל שבהם הוא מופקד ב-BM (איור 2, ראשי חץ).

אם פרמטרי הרכישה אינם מוגדרים כראוי, לא ניתן לבחון במדויק את המורפולוגיות והמיקומים השונים במהלך הסחר התוך-תאי בחלבוני BM (איור 2B,C). לדוגמה, אם פרמטרי הרכישה ממוטבים כדי להמחיש את ה-BM החוץ-תאי ולא את המבנים התוך-תאיים, התאים והבועיות האנדוסומיים המכילים חלבון BM (כאן מסומנים על-ידי Vkg-GFP) נראים עמומים או שאינם נראים לעין (איור 2B). לעומת זאת, אם הגלאים רוויים יתר על המידה, ניתן לזהות את הלוקליזציה התוך-תאית של Vkg-GFP במצב האופטימלי (השווה איור 2A ואיור 2C), אך עלייה ברעשי פלואורסצנציה ברקע מקשה על פענוח לוקליזציה של חלבון BM, במיוחד עבור ניסויי קולוקליזציה (ראו איור 7 ). בסך הכל, נתונים אלה ממחישים את החשיבות של פרמטרי רכישה נכונים כדי להשיג לוקליזציה מדויקת של חלבוני BM באפיתל.

הגדרת פרמטרים אופטימליים של רזולוציית-על ופירוק (איור 3)
כפי שהודגם עבור רכישת תמונה קונפוקלית, זה גם קריטי להגדיר כראוי את הפרמטרים הרכישה בעת שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד כדי למנוע תת-רוויה או רוויית יתר. גישת הדמיה זו של סופר-רזולוציה כוללת גם את התצורה הזהירה של פרמטרים של דה-קונבולוציה כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד (איור 3). כאשר עיבוד הדה-קונבולוציה מוגדר בצורה אופטימלית, הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מגדילה באופן משמעותי את הרזולוציה של מבנים תוך-תאיים המכילים חלבוני BM (איור 3A, חצים), כגון שלפוחיות או מבני גולג'י (איור 3A ואיור 7C), ה-BM עצמו (איור 3A, ראשי חץ), ומשפרת את יחס האות לרעש45 . מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מובילה לעלייה של פי 2 ברזולוציה בכל שלושת הממדים המרחביים בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. עלייה זו ברזולוציה מומחשת בבירור על-ידי התמונות המוגדרות טוב יותר של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM וה-BM שצולמו באמצעות הדמיה ברזולוציה גבוהה בהשוואה לתמונות שצולמו עם CSLM סטנדרטי (השווה איור 2A ואיור 3A).

אם הפרמטרים של deonvolution אינם מוגדרים כראוי, רזולוציית העל אינה מושגת בצורה אופטימלית, והעלייה ברזולוציה הולכת לאיבוד. תת-עיבוד של תמונות ברזולוציה גבוהה מוביל לתמונות מטושטשות, וכתוצאה מכך לוקליזציה תוך-תאית של חלבוני BM נראית עמומה ולא מוגדרת היטב כמו בתנאים אופטימליים (השווה איור 3B לאיור 3A). לעומת זאת, עיבוד יתר של התמונות מוביל לתמונות מגורענות, שבהן הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני BM נראית מפוקסלת (איור 3C). נתונים אלה מדגישים את החשיבות של שימוש בפרמטרים נכונים של דה-קונבולוציה כדי להשיג תמונות משמעותיות ומייצגות המשקפות את ההתפלגות התוך-תאית של חלבוני BM.

בסך הכל, נתונים אלה מראים ומדגישים בבירור את הרזולוציה המשופרת של סחר תוך-תאי בחלבוני BM באמצעות עיבוד תמונה ברזולוציה גבוהה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. באופן ספציפי, גישה זו מאפשרת הדמיה טובה יותר של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM על ידי שיפור הרזולוציה של המבנים התוך-תאיים המעורבים. זה מאפשר השוואה של גדלים וצורות שונים של מבנים כדי לזהות ולאפיין טוב יותר גורמים חדשים המעורבים בתצהיר המקוטב של חלבוני BM ב- FE.

הקרנה אורתוגונלית ושחזור תלת-ממדי של מקטעי z אופטיים (z-stack) דרך FE כדי לשפר את ההדמיה של ההתפלגות התוך-תאית של חלבוני BM (איור 4 ואיור 5)
מאחר שההתפלגות התוך-תאית של חלבוני BM קיימת לאורך כל ה-FE בצירים תלת-ממדיים (צירי x-, y-ו-z), ניתן להשתמש בהקרנה אורתוגונלית ו/או בשחזור תלת-ממדי של מקטעי z אופטיים דרך ה-FE, תוך שימוש ברזולוציה-על או במיקרוסקופיה קונפוקלית, כדי להעריך את הלוקליזציה וההתפלגות של חלבוני BM בתוך תאים מסוג בר או מוטציה (למשל, באיור 4 ובאיור 5).

הקרנה אורתוגונלית מאפשרת להקרין את כל מקטעי ה-z שנרכשו במישור אחד. שיטה זו שימושית במיוחד כדי להראות את ההתפלגות הכוללת של שלפוחיות ותאים המכילים חלבוני BM בתמונה אחת באמצעות הדמיה קונפוקלית (איור 4A) או ברזולוציה גבוהה (איור 4B). עם זאת, רזולוציה טובה יותר באופן משמעותי ותוצאה של רעשי רקע נמוכים יותר בעת שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית (השווה איור 4B ואיור 4A).

גישה נוספת להמחשת ההתפלגות הכוללת של תאים ושלפוחיות המכילים BM היא ליצור שחזור תלת-ממדי על-ידי הרכבת ערימה של מקטעי z אופטיים שנלקחו על-ידי הדמיה קונפוקלית (איור 5A) או ברזולוציית-על (איור 5B). גישה זו יכולה גם להיות יעילה מאוד כדי להעריך את הלוקליזציה וההתפלגות של חלבוני BM תוך-תאיים ואת צורתם של תאים ושלפוחיות המכילים Vkg-GFP, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד (איור 5). מיקרוסקופיה קונפוקלית מסורתית (איור 5A) גורמת לרעשי רקע גבוהים יותר בהשוואה לרזולוציה גבוהה יותר (איור 5B), שכאשר לוקחים בחשבון אותה בעיבוד תלת-ממדי עלולה לגרום לממצאים. יתר על כן, הרזולוציה הנמוכה יותר של הקונפוקל גם גורמת לכך שהתמונות שנוצרו יהיו פחות חלקות ומוגדרות מאלו שנוצרו על-ידי רזולוציית-על (השווה איור 5A ואיור 5B).

אפיון הפנוטיפים הקשורים לאובדן רכיבים המעורבים בהפרשת חלבוני BM מקוטבים באמצעות הדמיה ברזולוציה גבוהה (איור 6)
כפי שהוכח עד כה (איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5), ניתן להשתמש במיקרוסקופיה ובעיבוד תמונה ברזולוציה גבוהה במיוחד כדי להעריך את הלוקליזציה וההתפלגות התוך-תאית של חלבוני BM בטבע FE של שחלת דרוזופילה . יתר על כן, ניתן להשתמש בגישה זו גם כדי לקבוע ולהשוות את הלוקליזציה של חלבוני BM בתנאי מוטציה או נפילה. זוהי, אם כן, שיטה יעילה לאפיון התפקיד(ים) של רכיבים שזוהו לאחרונה המוקדשים לסחר, להפרשה ולתצהיר תוך-תאיים מקוטבים של חלבוני BM.

גורם החליפין GTPase (GEF) Crag הוכח כמרכיב מפתח במסלול ביולוגי המוקדש לתצהיר מקוטב של חלבוני BM28. ב-Crag knockdown FCs, חלבוני BM מצטברים הן באופן אפי והן באופן בסיסי, מה שמצביע על כך ש-Crag שולט בהפרשה המקוטבת של חלבוני BM כגון Vkg-GFP (איור 6). השימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מאפשר אפיון טוב יותר של הפנוטיפ הנובע מאובדן ה-Crag. לדוגמה, הצטברות אפיקלית חזקה של חלבוני BM, כמו גם הארגון של BM האפי האקטופי, נצפית ב-FCs של Crag-knockdown (איור 6B, ראשי חץ). יתר על כן, כאשר הפנוטיפ פחות חריג, ממברנת BM המצטברת באופן אופייני בכתמים קטנים ב-FCs מזוהה (איור 6B, חצים). בסך הכל, נתונים אלה ממחישים כי ניתן להשתמש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כדי לאפיין פנוטיפים מוטנטיים כדי להבין טוב יותר את התפקידים של רכיבים המעורבים בתצהיר המקוטב של BM.

ניסוי קולוקליזציה באמצעות נוגדנים וחלבוני BM מתויגים באופן אנדוגני שצולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה (איור 7)
לבסוף, ניתן להשתמש בשימוש בנוגדנים נגד סמנים תוך-תאיים ספציפיים או רכיבים שזוהו לאחרונה בשילוב עם חלבוני BM המתויגים באופן אנדוגני כדי לאפיין טוב יותר את הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני BM באפיתל המקוטב. GM-130, סמן cis-Golgi, משמש להמחשת נקודה זו. לפני שהוא נארז בשלפוחיות הפרשה, קול IV מועבר לגולגי. כאשר ההתפלגות התת-תאית של Vkg-GFP מוערכת באמצעות הדמיה קונפוקלית (איור 7A,B) או ברזולוציה-על (איור 7C,D), שתי הגישות מראות כי Vkg-GFP משתף פעולה באופן חלקי עם GM-130, ומאשר כי Coll IV ממוין לגולגי לפני ההפרשה. עם זאת, נצפתה עלייה ביחס האות לרעש ורזולוציה טובה יותר של הקולוקליזציה בין Vkg-GFP ל-GM130 בעת שימוש בהדמיה ברזולוציה גבוהה (השווה את איור 7A לאיור 7C).

יתר על כן, כאשר ניתן לכמת את ההתפלגות המרחבית ואת הרמות של פיקסלים ירוקים (Vkg-GFP) ואדומים (GM-130) על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנציה של חתך אופטי באמצעות FCs שנלקחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 7B) וסופר-רזולוציה (איור 7D), נצפית הקולוקליזציה של Vkg-GFP ו-GM-130. ההתפלגות של Vkg-GFP ו-GM-130 פיקסלים משורטטת בהיסטוגרמות שבהן חפיפה של פסגות Vkg-GFP ו-GM-130 מצביעות על הקולוקליזציה שלהם (איור 7B',D'). לפיכך, באמצעות כלי ניתוח תמונה זה, ניתן לקבוע במדויק את המיקום של Vkg-GFP בתאים תוך תאיים ספציפיים. עם זאת, ההשוואה בין ההיסטוגרמות שנוצרו מתמונות קונפוקליות (איור 7B') לתמונות ברזולוציה גבוהה יותר (איור 7D') מאשרת שמיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר מניבה תוצאות טובות יותר, כפי שניתן לראות בעוצמה הגבוהה יותר של פסגות ורעשי רקע מופחתים המיוצגים על ידי היעדר פסגות קטנות יותר (השווה איור 7B' ואיור 7D' ) הקשורים להיסטוגרמות שנוצרו ברזולוציית-על. בסך הכל, נתונים אלה מדגישים כי למרות שניתן להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לכמת את הקולוקליזציה, רזולוציית-על היא גישה חזקה יותר, המובילה לכימות יעיל ומדויק יותר של הלוקליזציה.

Figure 1
איור 1: האפיתל הזקיקי (FE) של שחלת דרוזופילה : מערכת מודל לחקר התצהיר המקוטב של חלבוני קרום המרתף (BM). (A) תמונה של שחלות שלמות לאחר כריתה וכריתה שצולמו באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השחלות מבטאות חלבון BM אנדוגני המתויג ב-GFP (Vkg-GFP). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (A') שתי שחלות של נקבת זבוב מחוברות באובידוקט. כל שחלה מכילה 16-20 ovarioles. מתוארת שחלות בודדות (מלבן). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) קטע אורכי, שצולם במיקרוסקופ קונפוקלי, דרך שחלה המבטאת Vkg-GFP ומוכתמת עבור DNA (כחול) ו- F-אקטין (אדום). Ovarioles מורכבים מתאי ביצים בשלבים שונים. תאי הביצים מורכבים מאפיתל זקיקי חד-שכבתי יותר (FE) המקיף את תאי הנבט (GCs). ה-FE מסנתז ומפריש באופן בסיסי חלבוני BM (למשל, Pcan ו-Vkg). סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) סכמטי של FE. ה-FE הוא אפיתל קלאסי בעל קוטביות אפיתלית-בסיסית מובהקת שבה התחום האפיקלי פונה לתאי הנבט, והתחום הבסיסי פונה ל-BM (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של סחר תוך-תאי בחלבוני BM באמצעות הדמיה קונפוקלית. (A-C) חתך אורכי דרך תא ביצים המבטא Vkg-GFP (ירוק) ומוכתם עבור DNA (כחול) ו-F-אקטין (אדום). (א'-ג') תאים תוך-תאיים ושלפוחיות המכילים Vkg-GFP (חצים), ו-BM (ראשי חץ) שהופקדו באופן בסיסי וחוץ-תאי מוצגים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. (A) תמונה שנרכשה באופן אופטימלי שעבורה נראה הסחר התוך-תאי של Vkg-GFP. (א') Vkg-GFP מתמקם לאורך כל הציטופלסמה של FCs בתאים סלולריים שונים (למשל, גולג'י) ובשלפוחיות. בשל ארגון הפיבריל של קולגן IV, שלפוחית המכילה Vkg-GFP נראית מוארכת (חצים). (B) תמונה לא חשופה שעבורה פרמטרי הרכישה מותאמים כדי לדמיין את ה-BM החוץ-תאי ולא את ההתפלגות התוך-תאית של חלבוני BM. Vkg-GFP (ירוק) נראה עמום לאורך כל הציטופלסמה (B'), וכתוצאה מכך שלפוחית המכילה Vkg-GFP שאינה ניתנת לגילוי בהשוואה ל-(A). (C) תמונה שנחשפה יתר על המידה שעבורה גלאי ה-GFP רווי, וכתוצאה מכך נוצרת עלייה בפלואורסצנציה ברקע. למרות שניתן לראות את ההתפלגות התוך-תאית של Vkg-GFP (ירוק) במיקום מקומי לאורך הציטופלסמה של ה-FCs (חצים), חשיפת יתר גורמת לממצאי הדמיה שבהם המבנים התוך-תאיים נראים גדולים מכפי שהם, כמו ב-(A-A'). סרגלי קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה של סחר תוך-תאי בחלבוני BM באמצעות הדמיה ועיבוד ברזולוציה גבוהה במיוחד. (א-ג) חתך אורך דרך תא ביצים המבטא Vkg-GFP (ירוק) ומוכתם בדנ"א (כחול) ו-F-אקטין (אדום). (A) תמונה מעובדת בצורה אופטימלית ברזולוציה גבוהה, שבה נצפה בבירור הסחר התוך-תאי של Vkg-GFP. (א') Vkg-GFP מתואם לאורך כל הציטופלסמה של ה-FCs בתאים תאיים שונים (למשל, Golgi) ושלפוחיות (חצים) וב-BM (ראשי חץ). (B) תמונה לא מעובדת וכתוצאה מכך פלואורסצנציה גבוהה יותר ברקע מאשר ב-(A). הלוקליזציה התוך-תאית של Vkg-GFP (ירוק) נראית עמומה ופחות מוגדרת (השווה בין B ל-A). (C) תמונה מעובדת יתר על המידה וכתוצאה מכך נוצרת תמונה שבה הלוקליזציה התוך-תאית של Vkg-GFP נראית מפוקסלת ומגורענת. סרגלי קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הקרנה אורתוגונלית של ערימת z שנרכשה ועובדה באמצעות גישות מיקרוסקופיה קונפוקליות וסופר-רזולוציה. (A-B) היטל אורתוגונלי של מקטעי z אופטיים דרך תא ביצים המבטאים Vkg-GFP (ירוק) ומוכתמים עבור דנ"א (כחול) ו-F-אקטין (אדום) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (A) או סופר-רזולוציה (B). (A) הקרנה של מחסנית z שנרכשה באמצעות פרמטרים קונפוקליים אופטימליים. ניתן לראות את הלוקליזציה התוך-תאית של Vkg-GFP בכל ציר ה-z ב-FCs (A', חצים). ה-BM נראה גם הוא ונראה בהיר מאוד (A', ראשי חץ). (B) הקרנה של מחסנית z שנרכשה באמצעות עיבוד אופטימלי ברזולוציה גבוהה במיוחד. ניתן להבחין בתאים תוך-תאיים מוגדרים היטב ובשלפוחית המכילים Vkg-GFP לאורך ציר ה-z ב-FCs (B', חצים). ה-BM גם מוגדר היטב (B', ראשי חץ). ההבדל בין הדמיה קונפוקלית סטנדרטית להדמיה ברזולוציה גבוהה ניכר לעין, שכן הלוקליזציה התוך-תאית של Vkg-GFP וה-BM מוגדרת באופן משמעותי יותר בעת שימוש ברזולוציה גבוהה יותר מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. יתר על כן, התמונה שצולמה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית יש פלואורסצנציה רקע גבוהה יותר. סרגלי קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: שחזור תלת-ממדי של ערימת z שנרכשה ועובדה באמצעות גישות מיקרוסקופיה קונפוקליות וסופר-רזולוציה. (A-B) עיבוד תלת-ממדי של ערימות z (תצוגה מעורבת) של תאי ביצים המבטאים Vkg-GFP (ירוק) ומוכתמים עבור DNA (כחול) ו-F-אקטין (אדום). (A) עיבוד תלת-ממדי של ערימת z שנרכשה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ניתן לראות את מיקומם וצורתם של תאים ושלפוחיות המכילים Vkg-GFP בכל התאים (A'). (B) עיבוד תלת-ממדי של מחסנית z שנרכשה באמצעות עיבוד אופטימלי ברזולוציית-על. ניתן לראות את המיקום והצורה של תאים ושלפוחיות המכילים Vkg-GFP (B'). צורת הבועיות, כמו גם ה-BM והגרעינים, מוגדרים בצורה חלקה, והרזולוציה גבוהה יותר בהשוואה לזו של מיקרוסקופיה קונפוקלית (בהשוואה ל-B' ו-A). ניתן גם לקבוע טוב יותר את הצורה והגודל של התאים והבועיות המכילים Vkg-GFP באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה (בהשוואה בין B' ו-A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: אפיון לוקליזציה של Vkg-GFP ב-Crag הפיל FCs. (א-ב) חתך אורכי דרך תא ביצים המבטא Vkg-GFP (ירוק), מוכתם בדנ"א (כחול) ו-F-אקטין (אדום) ונרכש באמצעות עיבוד אופטימלי ברזולוציית-על. (A) קו בקרה המבטא את wildtype Crag, חלבון קריטי לתצהיר BM תקין. ה-FE מראה לוקליזציה טיפוסית של חלבון BM, שבה Vkg-GFP מופץ תוך-תאי ומופקד באופן בסיסי ב-FE (A'). (B) קו דרוזופילה מהונדס המבטא RNAi עבור Crag ב- FE, וכתוצאה מכך התרסקות Crag. אובדן ה-Crag מוביל לטעות של איזוקליזציה של חלבוני BM (למשל, Vkg-GFP) באופן אופייני ב-FE (B', חצים וראשי חץ). תמונה ברזולוציה גבוהה במיוחד משמשת לאפיון פנוטיפים של סילוקליזציה של BM הקשורים לאובדן Crag. באופן ספציפי, חלק מה-FCs של Crag RNAi מראים אי-סלוקליזציה אפית חזקה של חלבוני BM (B', ראשי חץ), בעוד ש-FCs אחרים של Crag RNAi מציגים אי-סלוקליזציה אפית חלשה יותר (B', חצים). הדמיה ברזולוציה גבוהה חושפת בבירור את הפנוטיפים הקשורים לאובדן Crag (B', ראשי חץ לעומת חצים). סרגלי קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: קולוקליזציה של Vkg-GFP ו-GM-130 (סמן גולג'י) תוך שימוש בגישות מיקרוסקופיה קונפוקליות וסופר-רזולוציה. (A-D) מקטעי אורך דרך תאי ביצים המבטאים Vkg-GFP ומוכתמים עבור סמן cis-Golgi (GM-130, אדום), המצולם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (A,B) או סופר-רזולוציה (C,D). (א,ב) הדמיה קונפוקלית מראה כי Vkg-GFP תוך-תאי מתמזג חלקית עם סמן ציס-גולג'י (A, ראש חץ). (B) אזור מוגדל של (A). ההתפלגויות של פיקסלים ירוקים (Vkg-GFP) ואדומים (GM-130) לאורך החץ הלבן משורטטים בהיסטוגרמה (B'). ציר ה-x של ההיסטוגרמה מייצג את המרחק (μm) לאורך החץ בעוד שציר ה-y מייצג את עוצמת הפיקסלים. הפסגות הירוקות והאדומות החופפות (*) מראות היכן Vkg-GFP ו-GM-130 מתמזגים. (ג,ד) הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר מראה גם כי Vkg-GFP תוך-תאי מתחלף באופן חלקי עם סמן cis-Golgi (C, ראש חץ). (D) אזור מוגדל של (C). ההתפלגויות של פיקסלים ירוקים (Vkg-GFP) ואדומים (GM-130) לאורך החץ הלבן משורטטים בהיסטוגרמה (D'). ציר ה-x של ההיסטוגרמה מייצג את המרחק (μm) לאורך החץ בעוד שציר ה-y מייצג את עוצמת הפיקסלים. הפסגות הירוקות והאדומות החופפות (*) מראות היכן Vkg-GFP ו-GM-130 מתמזגים. נתונים אלה מראים כי הדמיה ברזולוציה גבוהה היא גישה יעילה ומדויקת יותר מאשר הדמיה קונפוקלית כדי לאפיין ולכמת את הקולוקליזציה. סרגלי קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: פרמטרים של רכישה ועיבוד של מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה עבור התמונות הייצוגיות. כל פרמטרי ההדמיה העיקריים נאספים עבור התמונות הייצוגיות שסופקו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ה-BM חיוני למורפוגנזה עוברית ואיברית, ולתפקודים פיזיולוגיים של מבוגרים. יתר על כן, BM פועל כפלטפורמה איתות לביסוס ותחזוקה של קוטביות אפיתל ומספק לרקמות תמיכה2. עם זאת, המנגנונים המווסתים את המיקום הנכון של חלבוני BM אינם מובנים היטב. הבנה טובה יותר של המסלולים הביולוגיים המוקדשים לסחר תוך-תאי ולהפרשה מקוטבת של חלבוני BM דורשת ניתוח זהיר של מרכיבי מסלולים אלה ותפקידם בעיבוד BM. אחת הדרכים להשיג זאת היא להשתמש בהדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. כאן, תיארנו שיטות להכנה וצביעה או שמירה חיסונית של שחלות Drosophila כדי לדמות ביעילות את הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני BM ב-FE באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

היתרונות של מלכודת חלבונים וחלבונים המתויגים באופן אנדוגני כדי לדמיין את הסחר וההפרשה התוך-תאיים של חלבוני BM בתנאים של סוג בר ומוטנטים
הפרוטוקול המסופק מנצל את מלוא היתרונות של מלכודות חלבונים וחלבוני BM המתויגים באופן אנדוגני (למשל, Vkg-GFP ו-Pcan-GFP) כדי לדמות ולהעריך את הלוקליזציה וההתפלגות של חלבוני BM ב-FE בתנאים של סוג בר (בקרה) ומוטנטים. לקווים אלה יש יתרונות חשובים על פני השימוש בנוגדנים נגד חלבוני BM. ראשית, נוגדנים נגד חלבונים ספציפיים בעלי עניין הם לעתים קרובות נדירים ובשפע נמוך. בנוסף, לעיתים קרובות יש בעיות עם חדירת רקמות הקשורות לנוגדנים אשר יכול להוביל לתצפית והערכה לא מדויקת של החלבון המעניין. יתר על כן, ניתן להחדיר קווי מלכודת חלבונים לרקע גנטי שונה המשמש לקביעת הפונקציות של גורמים הדרושים לתצהיר תקין של BM כגון (i) שיטות למניפולציה של ביטוי גנים (למשל, UAS/Gal4), (ii) מוטאנטים, ו-(iii) קווי הפרעת RNA (RNAi). לבסוף, ניתן להשתמש במלכודות חלבון אלה כדי לדמיין את הלוקליזציה והתפקוד של BM באמצעות הדמיה חיה57.

עם זאת, מיזוג של תג פלואורסצנטי לחלבון בעל עניין יכול להפריע ללוקליזציה ולתפקודים שלו. לכן, זה קריטי להעריך את כל ההשפעות החריגות של התג על החלבון. אחת הדרכים להבטיח כי הוספת תג פלואורסצנטי לא תפריע לתפקוד וללוקליזציה של חלבוני BM היא לקבוע אם קו Drosophila מהונדס הוא הומוזיגוטי בר קיימא. הן קווי Vkg-GFP והן קווי Pcan-GFP המשמשים בניסויים השונים המתוארים כאן ובעבר, הם בני קיימא הומוזיגוטיים, מה שמצביע על כך שהוספת תג GFP אינה מפריעה לתפקודם של חלבונים חיוניים אלה29,30.

חשיבות הכנת הרקמות, קיבוע וכתמים להדמיה
כדי לדמות בצורה יעילה ומדויקת את ה-FE, חשוב להכין, לתקן ולהכתים את רקמת השחלות כראוי בהתאם להוראות בשיטה זו. ראשית, לאחר הנתיחה, להסיר בזהירות את כל האיברים האחרים ולעוף פסולת לפני הקיבוע. מומלץ להשתמש ב-paraformaldehyde (PFA) כדי לתקן רקמות, שכן הוא מוביל לפלואורסצנציה בהירה של GFP ותואם את רוב הנוגדנים. עם זאת, ייתכן ש-PFA אינו תואם את כל הנוגדנים; חלקם עשויים לדרוש קיבוע גלוטארלדהיד או מתנול. יתר על כן, כדי למנוע פלואורסצנציה ברקע עקב קשירת הנוגדן הראשונית שאינה ספציפית, יש לדוגר את רקמת השחלות על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך שעה לפחות בתמיסת חסימה, ולשטוף אותה באופן נרחב מספר פעמים לאחר דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים כמתואר בפרוטוקול. לבסוף, הרכבה נכונה של רקמת השחלות חיונית להשגת הדמיה אופטימלית. זה דורש הפרדה זהירה של תאי ביצים בודדים כדי למנוע את ערימתם זה על גבי זה. חשוב גם לתת לתווך ההרכבה להתפלמר באופן מלא לפני ההדמיה כדי למנוע ציפה של הרקמה מתחת לכיסוי. זה גם מאפשר למדיה ההרכבה להגיע לאינדקס הרפלקטיבי האופטימלי שלה, שהוא חשוב מאוד להדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד. אם לא תעשו זאת, הדבר ישפיע על איכות התמונה. יתר על כן, ניתן לאחסן את השקופיות המוכנות למשך עד חודש אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, לפני שהפלואורסצנציה מרווה. בנוסף לפרוטוקול שסופק, מספר פרוטוקולים אחרים זמינים עבור כריתת השחלות וכתם 53,54,55.

השימוש בפרמטרים נכונים של רכישה ועיבוד הוא קריטי להדמיה אופטימלית ולהערכת לוקליזציה של חלבוני BM באמצעות הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה
כפי שתואר קודם לכן, זה קריטי להגדיר כראוי את פרמטרי הרכישה עבור הדמיה confocal ו super-רזולוציה כדי לקבל תמונות אופטימליות של הדגימה. לרכישת תמונה, יש לבחור את ההחזר על ההשקעה בקפידה באמצעות פונקציית הזום, ולאחר מכן להגדיר את גודל המסגרת ואת מהירות הרכישה בצורה אופטימלית. יתר על כן, כפי שמודגם באיור 2, חשוב מאוד להתאים את עוצמת הלייזר ואת העלייה המתאימה של הגלאי כדי לדמיין את הסחר התוך-תאי מבלי להרוות את הגלאים. יש להגדיר את הפרמטרים האלה בזהירות רבה כדי למנוע תמונות שלא נחשפו או נחשפו יתר על המידה (איור 2). תמונות שאינן חשופות מספיק יגרמו לתמונות ברזולוציה נמוכה, שבהן יהיה קשה לדמיין ולאפיין את המבנים התוך-תאיים (איור 2B). תמונות שנחשפו יתר על המידה עקב הרוויה של הגלאי מובילות לפרשנות שגויה של נתונים, ולממצאי קולוקליזציה (איור 2C). אם המטרה היא לקבוע את לוקליזציה שלפוחיתית של חלבוני BM המתויגים באופן אנדוגני, הפלואורסצנציה מחלבונים המתויגים ב-GFP (למשל, Vkg-GFP ו-Pcan-GFP) ב-BM הבסיסי מרווה במהירות את הגלאי. עם זאת, שלפוחיות המכילות פחות חלבוני BM המתויגים ב-GFP ייראו עמומות. לפיכך, חשוב להגדיר את רגישות התמונה באמצעות המבנים התוך-תאיים המכילים BM (למשל, שלפוחיות), ולא באמצעות BM (איור 2). בחירת גודל חור הסיכה היא גם מאוד חשובה. באופן אידיאלי, יש לבחור גודל חור סיכה של 1 AU עבור כל ערוץ עבור תמונות באיכות הטובה ביותר, במיוחד כאשר הרזולוציה בציר z חשובה. גודל חור הפין הקטן יותר הוא אופטימלי עבור מקטעים אופטיים דקים יותר. עם זאת, כאשר לא נדרשת רזולוציה אופטימלית של ציר z או ערימת z שאינה נלכדת, ניתן להגדיל את גודל חור הפין כדי למנוע הלבנת תמונות. יתר על כן, עבור אותות עמומים מאוד, הגדלת גודל חור הפין עשויה לעזור בשל יחס אות לרעש גבוה יותר ולכידת יותר פוטונים, מה שמסייע בפענוח נתונים.

עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לעיבוד דה-קונבולוציה כדי להימנע מיצירת תמונות שעברו עיבוד חסר או מעובד יתר על המידה, שנפתרו בצורה גרועה, כפי שמודגם באיור 3. לבסוף, כדי להשיג שחזור תלת מימד אופטימלי, מומלץ מאוד להגדיר את המרווח הטוב ביותר שנקבע על ידי התוכנה. מרווח גדול מדי בין מקטעי z (כלומר, גבוה מ-0.5 מיקרומטר) יוביל לעיבוד תלת-ממדי לקוי וישפיע על הניתוח הבא של הפנוטיפ.

יתרון של רזולוציית-על על פני מיקרוסקופיה קונפוקלית מסורתית בעת הדמיה של סחר תוך-תאי BM
כפי שמודגם בסעיף התוצאות, למרות שניתן להעריך במדויק את הלוקליזציה וההתפלגות של חלבוני BM באמצעות הדמיה קונפוקלית, גישת רזולוציית העל המתוארת מייצרת נתוני הדמיה מדויקים יותר עם עלייה משמעותית ברזולוציה של מבנים תוך תאיים המכילים חלבוני BM, כמו גם יחס אות לרעש משופר. יתר על כן, טכניקת מיקרוסקופיה זו ברזולוציה גבוהה יחסית קלה לשימוש. מאחר שהדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מגדילה את הרזולוציה באופן משמעותי בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, עד 120 ננומטר בצירי x ו-y ו-350 ננומטר בציר z, גישה זו תשפיע מאוד על הבנתנו את התצהיר המקוטב של BM על ידי אפיון מדויק יותר של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני BM בתאי אפיתל כגון FCs.

יתר על כן, גישת הדמיה נוספת ברזולוציית-על (Microscopy של תאורה מובנית, SIM) ושימוש באלגוריתמי דה-קונבולוציה המיועדים למיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקה נקודתית (כלומר, מודול התוכנה ברזולוציה משופרת של Nikon) שימשו בעבר כדי לאפיין את תפקידם של הגורמים המעורבים בתצהיר BM29. הרזולוציה המוגברת הקשורה לטכניקות אלה סיפקה תובנות מפתח לגבי הבנתנו את הסחר התוך-תאי בחלבוני BM ואת ארגון ה-BM. עם זאת, גישות אלה מציגות כמה מגבלות בהשוואה למיקרוסקופיה אווירית. לדוגמה, SIM אינו יעיל במיוחד ברכישת תמונות אופטימליות בעת קבלת מקטעי z אופטיים בעומק הרקמה. זה הופך את ה- SIM לקשה לשימוש בעת סינון עבור רכיבים חדשים המעורבים בתצהיר BM. בנוסף, השימוש באלגוריתמים של deconvolution המיושמים על תמונות קונפוקליות אינו משיג את אותה רמה של רזולוציית-על. באופן כללי, הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של Airyscan על רקמה קבועה היא גישה עוצמתית ומעולה לחקר סחר תוך-תאי BM ותצהיר.

עם זאת, כמו בכל מיקרוסקופיה אחרת ברזולוציה גבוהה במיוחד, גם כמה אי-נוחות קשורה לגישה זו, ויש לקחת אותן בחשבון בזמן ההדמיה. ראשית, מצב רזולוציית העל דורש בדרך כלל זמן רכישה ארוך יותר של המדגם מאשר מצב קונפוקלי. לפיכך, יש להגדיר בקפידה את פרמטרי הרכישה ואת אזור העניין כדי למזער את ההלבנה של המדגם. יתר על כן, קבצי תמונה שנוצרו על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה בהרבה מקבצים שנוצרו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ועשויים להזדקק למחשבים או שרתים מיוחדים לעיבוד ואחסון תמונה.

לבסוף, הדמיה חיה של חלבוני BM במהלך Drosophila oogenesis שימשה לאפיון גורמים חדשים המעורבים בקוטביות BM57. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות, במיוחד ברזולוציה של מבנים תוך תאיים במהלך סחר בחלבון BM. מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד היא גישה רבת עוצמה לשימוש בשילוב עם הדמיה חיה כדי לקבוע במדויק את התפקידים של גורמים מזוהים בתצהיר המקוטב של חלבוני BM.

יישומים אחרים של שיטה זו לחקר לוקליזציה של רכיבים תוך-תאיים המוקדשים לסחר בשלפוחית באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני והדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד
ההקמה והתחזוקה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות ובאורגניזם בוגר נשענים בחלקם על איתות בין תאים ועל מתח והידבקות תאיים. תהליכים אלה תלויים בסחר תוך תאי, אנדוציטוזה, אקסוציטוזה והפרשת חלבונים ספציפיים. לפיכך, ניתן היה להתאים בקלות את השיטות המתוארות כאן לפענוח הסחר התוך-תאי של BM באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני ומיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה כדי לחקור כל תהליך. יתר על כן, קלות השימוש בעריכה גנטית בתיווך CRISPR/Cas9 ליצירת חלבונים המתויגים באופן אנדוגני הופכת את הגישה הזו לרב-תכליתית וחזקה עוד יותר58.

לסיכום, תיארנו שיטות להכנה והדמיה של חלבוני BM ב- FE של שחלת דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מיושמים עבור בדיקות סקר בתפוקה גבוהה כדי לזהות רכיבים חדשים המוקדשים למיקום נכון של חלבוני BM. לבסוף, לשימוש במתודולוגיה זו יש פוטנציאל לתרום תרומה משמעותית להבנתנו כיצד תאי אפיתל שולטים בהפרשה המקוטבת של חלבוני BM, תהליך מפתח בביסוס ובתחזוקה של ארכיטקטורת אפיתל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לג'ולי מרקל על הערותיה המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R15GM137236 ל- O.D. התמונות הקונפוקליות והסופר-רזולוציה נרכשו באמצעות Zeiss LSM 900 עם Airyscan 2, שנרכשה במענק NSF MRI 2018748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 183 קרום מרתף דרוזופילה שחלה אפיתל מיקרוסקופיה קונפוקלית מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה סחר בבני אדם
הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך <em>Drosophila</em> Oogenesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal… More

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter