Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Summary

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Abstract

Het keldermembraan (BM) - een gespecialiseerd vel extracellulaire matrix aanwezig aan de basale kant van epitheelcellen - is van cruciaal belang voor de vaststelling en het onderhoud van epitheliale weefselmorfologie en orgaanmorfogenese. Bovendien is de BM essentieel voor weefselmodellering, dient het als een signaleringsplatform en biedt het externe krachten om weefsels en organen te vormen. Ondanks de vele belangrijke rollen die de BM speelt tijdens normale ontwikkeling en pathologische omstandigheden, zijn de biologische routes die de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes beheersen en hoe basale secretie leidt tot de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten slecht begrepen. Het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok is een uitstekend modelsysteem om de basale afzetting van BM-membraaneiwitten te bestuderen, omdat het alle belangrijke componenten van de BM produceert en afscheidt. Confocale en superresolutie beeldvorming in combinatie met beeldverwerking in vaste weefsels maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van cellulaire factoren die specifiek betrokken zijn bij de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het kleuren en afbeelden van BM-bevattende blaasjes en gedeponeerde BM met behulp van endogene gelabelde eiwitten in het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok . Dit protocol kan worden toegepast om zowel kwalitatieve als kwantitatieve vragen aan te pakken en het is ontwikkeld om high-throughput screening mogelijk te maken, waardoor factoren die betrokken zijn bij de gepolariseerde intracellulaire handel en afscheiding van blaasjes tijdens de ontwikkeling van epitheelweefsel mogelijk is.

Introduction

Het keldermembraan (BM) is een dunne plaat van gelaagde cel-adherente extracellulaire matrix (ECM) die cruciaal is voor de epithelstructuur en morfogenese¹. Het bestaat uit ~ 50 eiwitten en wordt alomtegenwoordig aangetroffen onder de epitheel- en endotheelcellen, en verwarmt skelet-, gladde en hartspiercellen en adipocyten ^1,2,3. De drie belangrijkste componenten van de BM aan de basale kant van de epitheelcellen zijn Collageen IV, Perlecan en Lamininen. De BM ligt ten grondslag aan de epitheelcellen en is verantwoordelijk voor vele functies, waaronder weefselscheiding en -barrière, groei en ondersteuning, en celpolarisatie ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Zijn rol als signaleringsplatform reguleert de morfologie en differentiatie van epitheelcellen en weefsels tijdens de ontwikkeling ^3,13,14. Bovendien zijn de verkeerde regulatie van de BM en /of een schending van de integriteit ervan de primaire oorzaken van veel pathologische aandoeningen, waaronder tumormetastase ^2,15,16. Ondanks de essentiële functies die de BM uitvoert tijdens weefsel- en orgaanmorfogenese, zijn de componenten van de biologische route (s) gewijd aan de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten vaag bekend.

Om de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes en de secretie van BM-eiwitten door epitheelcellen te bestuderen, is het folliculaire epitheel (FE) van de Drosophila-eierstok een krachtig modelsysteem (figuur 1). Een Drosophila-eierstok bestaat uit 16-20 lange, buisachtige structuren, ovarioles genaamd (figuur 1A, B)17,18,19. Elke ovariole kan worden gezien als een eierassemblagelijn, met de leeftijdsprogressie van eikamers (die elk aanleiding geven tot een ei) die begint aan het voorste uiteinde en achterste beweegt, totdat het rijpe ei door de eileider naar buiten komt. Elke eikamer wordt ingekapseld door de FE, een monolaag van somatische follikelcellen (FCs), die de centrale kiembaancellen (GC's) omringt. De FE is sterk gepolariseerd met een duidelijke apicale-basale polariteit waarbij het apicale domein naar de kiembaan is gericht en de BM-eiwitten basaal worden uitgescheiden^18,19. De VC's scheiden actief alle belangrijke componenten van de BM af, waaronder Collagen IV, Perlecan en Laminins^20,21. In epitheelcellen zoals FCs worden de BM-componenten geproduceerd en vereisen ze een gespecialiseerde gepolariseerde secretieroute voor hun afzetting extracellulair. Bijvoorbeeld, in het geval van de meest voorkomende component van de BM, Collageen IV (Coll IV), zijn de details rond de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie vaag, ondanks dat de productie en afzetting de focus is van veel studies. Coll IV wordt vertaald in het endoplasmatisch reticulum (ER), waar ook elk fibril - samengesteld uit drie polypeptiden (twee α1-ketens en één α2-keten) - wordt geassembleerd tot een drievoudige helix²². Een goede Coll IV-vouwing en -functie vereisen ER-chaperonnes en enzymen, waaronder lysyl- en prolyl-hydroxylasen zoals Plod en PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Deze posttranslationele enzymen reguleren de ER-sortering van Coll IV, omdat het verlies van elk ervoor zorgt dat Coll IV gevangen zit in de basale ER 20,23,24,25,26. Vervolgens verlaat nieuw gesynthetiseerde Coll IV de ER voor de Golgi in COPII-gecoate blaasjes. De ladingreceptor Tango1 helpt bij het verpakken van collageen in aanzienlijke Golgi-gebonden blaasjes die plaats bieden aan grote multimere eiwitten^20,27. Zodra Coll IV is verpakt in intracellulaire exocytaire blaasjes, wordt het specifiek basaal uitgescheiden uit epitheelcellen. Om BM-afzetting naar de basale kant te leiden, hebben epitheelcellen een andere reeks factoren nodig die specifiek zijn gewijd aan gepolariseerde BM-secretie. Met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok zijn enkele componenten van dit nieuwe cellulaire proces gekarakteriseerd, waaronder de nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF's) Crag en Stratum, de GTPases Rab8 en Rab10, evenals de niveaus van de fosfoinositide PI (4,5) P2 en Kinesine 1 en 3 motoreiwitten 20,28,29,30,31 . Deze componenten zijn van cruciaal belang voor de gepolariseerde verdeling van BM-eiwitten.

Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten in de FE te monitoren, kunnen endogene gelabelde keldermembraaneiwitten (eiwitvallen), zoals Viking-GFP (Vkg-GFP of α2 Coll IV-GFP) en Perlecan-GFP (Pcan-GFP) worden gebruikt ^32,33. Van deze eiwitvallijnen is aangetoond dat ze de endogene verdeling van BM-eiwitten nauwkeurig weergeven en een gevoeligere detectie van vesiculaire handel mogelijk maken^28,30. De componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM in de FE werden voor het eerst gekarakteriseerd met behulp van eiwitvallijnen voor Vkg-GFP en Pcan-GFP ^20,28,29,30. Eiwitvallen kunnen worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutanten en Gal4-lijnen ³⁴. Bovendien kunnen eiwitvallen worden gebruikt in combinatie met fluorescerende kleurstoffen en/of fluorescentie-immunostaining, waardoor een nauwkeurige karakterisering van de lokalisatie van BM-eiwitten mogelijk is bij het vergelijken van wildtype en mutante condities³⁵.

Om de distributie en lokalisatie van BM-eiwitbevattende blaasjes nauwkeurig en efficiënt te beoordelen, vormen confocale laserscanmicroscopie (CLSM) en beeldvormingstechnieken met superresolutie een aanzienlijk voordeel voor andere beeldvormingsbenaderingen. Deze benaderingen koppelen beeldvorming met hoge resolutie aan relatief gebruiksgemak. CLSM is een microscopietechniek die een verbeterde optische resolutie mogelijk maakt door het monster met een laser te scannen op een rasterscanmanier met behulp van galvanometers. De opening van het gaatje is een kerncomponent van een confocale microscoop. Door de onscherpe signalen van boven of onder het brandpuntsvlak te blokkeren, resulteert het gaatje diafragma in een zeer superieure resolutie in de z-as³⁶. Dit maakt het ook mogelijk om een reeks afbeeldingen in het z-vlak te verkrijgen, een z-stack genaamd, die overeenkomen met een reeks optische secties. z-stacks maken vervolgens een 3D-beeld van het specimen, via 3D-reconstructie, met behulp van beeldbewerkingssoftware. Conventionele epifluorescentie (widefield) microscopen, in tegenstelling tot confocale microscopen, zorgen ervoor dat onscherp licht bijdraagt aan de beeldkwaliteit, waardoor de beeldresolutie en het contrast^{met 36,37} afnemen. Dit maakt epifluorescentiemicroscopie een minder aantrekkelijke kandidaat bij het bestuderen van eiwitlokalisatie of colocalisatie.

Hoewel CLSM een geschikte aanpak is voor verschillende toepassingen, waaronder beeldvorming en karakterisering van de intracellulaire handel in BM-eiwitten, vormt het nog steeds een probleem bij het afbeelden van monsters onder de diffractielimiet van Abbe van licht (200-250 nm). Bij het afbeelden van dergelijke monsters kan confocale microscopie, vooral bij gebruik van een olieobjectief, resulteren in een hoge resolutie. Superresolutietechnieken overschrijden echter de limiet van confocale microscopie. Er zijn verschillende benaderingen om superresolutiemicroscopie te bereiken, elk met specifieke resolutielimieten en elk geschikt voor verschillende analyses. Deze benaderingen omvatten foto-geïnactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED), gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en Airyscan (superresolutie) microscopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Hoewel Airyscan een grovere resolutie heeft dan PALM / STORM, STED en SIM, kan het nog steeds een resolutie van maximaal ~ 120 nm bereiken (ongeveer twee keer de resolutie van CLSM). Bovendien is aangetoond dat deze superresolutiemicroscopiebenadering een voordeel heeft ten opzichte van SIM- en andere superresolutietechnieken bij het afbeelden van dikke monsters en monsters met een lage signaal-ruisverhouding^{van 47,48}.

Airyscan is een relatief nieuwe superresolutie confocale microscopietechnologie⁴⁶. In tegenstelling tot traditionele CLSM's, die de pinhole- en single point-detectors gebruiken om onscherp licht af te stoten, maakt deze superresolutiebenadering gebruik van een 32-kanaals galliumarsenidefosfide (GaAsP) fotomultiplicatorbuisgebieddetector die al het licht verzamelt op elke scanpositie⁴⁵. Elk van de 32 detectoren werkt als een klein gaatje, waardoor de pinhole-grootte wordt verkleind van de traditionele 1.0 Airy Unit (A.U.) tot een verbeterde 0.2 A.U., waardoor een nog hogere resolutie en signaal-ruisverhouding mogelijk is, met behoud van de efficiëntie van een 1.25 A.U. diameter⁴⁵. Bovendien resulteert de lineaire deconvolutie die Airyscan gebruikt in een tot 2x hogere resolutie⁴⁵. Dit in aanmerking nemend, zijn CLSM, en specifiek superresolutiemicroscopie, zeer geschikt om BM-eiwitten en eiwitten te bestuderen die de basale afzetting van BM-eiwitten reguleren, omdat ze afbeeldingen met een zeer hoge resolutie kunnen produceren voor lokalisatie- en colokalisatiestudies, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de ruimtelijke, temporele en moleculaire gebeurtenissen die deze processen beheersen.

Een alternatieve benadering van confocale microscopie die kan worden gebruikt om lokalisatie-experimenten uit te voeren, is beelddeconvolutie. Aangezien widefield-microscopie het mogelijk maakt om onscherp licht de detectoren te bereiken, kunnen wiskundige en computationele deconvolutie-algoritmen worden toegepast om onscherp licht uit beelden verkregen door widefield-microscopie te verwijderen of opnieuw toe te wijzen, waardoor de resolutie en het contrast van het beeld worden verbeterd⁴⁹. Deconvolutie-algoritmen kunnen ook worden toegepast op confocale beelden om de resolutie en het contrast verder te verhogen, waardoor uiteindelijke beelden worden geproduceerd die bijna vergelijkbaar zijn met die van superresolutiemicroscopie⁵⁰. Airyscan maakt gebruik van Weiner filter-gebaseerde deconvolutie samen met Sheppard's pixel hertoewijzing, wat resulteert in een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding. Vergeleken met confocale microscopie wordt een toename van 2x in resolutie in alle drie de ruimtelijke dimensies (120 nm in x en y en 350 nm in z) waargenomen bij gebruik van deze superresolutiemicroscopietechniek^45,51.

Dit manuscript biedt gedetailleerde en geoptimaliseerde protocollen om de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten te kleuren, te verwerven en te visualiseren met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok als een modelsysteem in combinatie met confocale en superresolutiemicroscopie. Drosophila-lijnen die endogene gelabelde keldermembraaneiwitten tot expressie brengen, bijvoorbeeld Vkg-GFP en Pcan-GFP, zijn efficiënte en nauwkeurige hulpmiddelen om BM-eiwithandel en -secretie te visualiseren. Bovendien kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutant en Gal4 / UAS-lijnen ³⁴. Hoewel endogeen gelabelde keldermembraaneiwitten worden aanbevolen, is het gebruik van antilichamen tegen specifieke BM-eiwitten ook compatibel met de beschreven protocollen. Deze protocollen zijn vooral nuttig voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van intracellulaire handel en de secretie van BM-eiwitten in intact epitheelweefsel met behulp van confocale en superresolutie beeldvorming. Bovendien maakt de mogelijkheid om epitheliale weefselanalyse te combineren met de uitgebreide hulpmiddelen van Drosophila genetica deze aanpak bijzonder krachtig. Ten slotte kunnen deze protocollen eenvoudig worden aangepast om de vesiculaire handel en het sorteren van andere interessante eiwitten te bestuderen.

Protocol

1. Vliegvoorbereiding voor eierstokdissecties

1. Doe 10-15 Drosophila melanogaster vrouwelijke vliegen (1-2 dagen oud) van het gewenste genotype in een smalle injectieflacon met ~8 ml Drosophila fly medium besprenkeld met een kleine hoeveelheid gegranuleerde bakkersgist 2-3 dagen voorafgaand aan de dissectie bij 25 °C. Het toevoegen van een paar mannetjes aan de injectieflacon kan de opbrengst van de eikamer verhogen. Zorg er echter voor dat het totale aantal vliegen niet hoger is dan 20, omdat dit de ontwikkeling van de eierstokken negatief kan beïnvloeden.
   OPMERKING: Beschrijving van Drosophila-mannen en -vrouwen, en nuttige tips en adviezen voor wetenschappers zonder eerdere Drosophila-ervaring zijn te vinden in de geciteerde artikelen^34,52. Het toevoegen van gist zal de eiproductie stimuleren en eierstokken genereren met verschillende stadia vertegenwoordigd. Bovendien zal het ook de eierstokken vetmesten en ze gemakkelijker te verwijderen maken. Natte gist kan ook worden gebruikt in plaats van gegranuleerde gist, maar voor zwakkere voorraden kunnen de vliegen vast komen te zitten en sterven.

2. Ovariumdissectie en fixatie

OPMERKING: Voor aanvullende bronnen over eierstokdissectie en kleuring worden lezers verwezen naar de geciteerde protocollen 53,54,55.

1. Bereid op de dag van de dissectie verse fixatieoplossing met een eindconcentratie van 4% paraformaldehyde (PFA) door de PFA-stamoplossing te verdunnen in 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
2. Verdoof de vliegen met CO₂ en plaats ze op een vliegkussen. Houd de vliegen verdoofd totdat ze worden gedissectieerd. Overweeg vliegen die goed worden verdoofd zodra hun bewegingen zijn gestopt, wat meestal 10-20 s duurt.
   OPMERKING: Hoewel het gebruik van CO₂ wordt aanbevolen als een veiligere en snellere optie, kunnen vliegen worden verdoofd met behulp van ijs.
3. Plaats een glazen concave dia of vlekschaal met ondiepe depressieputten onder een ontleedmicroscoop en vul de putten met 1x PBS.
4. Grijp een vrouwelijke vlieg aan de onderste thorax met behulp van een tang. Zorg voor het geslacht van de vliegen door de afwezigheid van mannelijke genitaliën aan het achterste uiteinde van de buik en de afwezigheid van geslachtscommen op hun voorpoten als een secundair kenmerk⁵². Dissect vliegt individueel met behulp van een ander paar tangen (stap 2.5) terwijl ze worden ondergedompeld in putten gevuld met 1x PBS onder de ontleedmicroscoop (20x vergroting wordt aanbevolen).
5. Terwijl u door de ontleedmicroscoop kijkt, gebruikt u een ander paar tangen om aan het achterste deel van de vliegenbuik te trekken, waardoor de inwendige organen (bijv. Eierstokken, darm) zichtbaar worden.
6. Knijp zachtjes in het voorste deel van de vliegbuik (zoals bij een tube tandpasta) om de eierstokken uit de buik te dwingen. Deze methode moet de eierstokken intact houden. Maak andere organen en vliegresten los en verwijder ze voorzichtig.
7. Gebruik een tang of ontleednaalden om de ovariolen van de eierstok te scheiden terwijl de algehele eierstokstructuur intact blijft. Het doel van deze stap is om de spierschede die de eierstokken bedekt te breken en een efficiëntere en homogene kleuring mogelijk te maken.
8. Breng de eierstokken snel over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1x PBS en houd de buis op ijs totdat alle vliegen zijn ontleed. Houd de buis niet op ijs als microtubuli of microfilamenten (of blaasjes die door deze cytoskeletale componenten worden verhandeld) moeten worden gevisualiseerd, omdat dit depolymerisatie kan veroorzaken.
9. Zodra alle eierstokken zijn ontleed en overgebracht naar een microcentrifugebuis, laat ze dan naar de bodem van de buis zinken en verwijder alles behalve ~ 50 μL van de PBS. Voeg 1 ml 4% PFA toe en plaats 15 minuten op een noterende platformrocker. Belangrijk is om te controleren of de eierstokken heen en weer bewegen in de fixatieoplossing om een goede fixatie mogelijk te maken, omdat onvolledige fixatie kan leiden tot vlekken en beeldvormingsproblemen.
   OPMERKING: De snelheid van de nutator is niet cruciaal. Terwijl sommige nutators een snelheidsregeling hebben, worden anderen geleverd met een vooraf ingestelde snelheid. De vooraf ingestelde snelheid is voldoende en indien instelbaar, ingesteld op 40-50 tpm.
10. Verwijder de fixatieoplossing (zoals in stap 2.9) en voer vervolgens twee snelle wasbeurten uit met 1 ml 1x PBS met 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), door de microfugebuizen 5-6 keer voorzichtig om te keren. Ga vervolgens verder met vier wasbeurten van 10-15 minuten (lange wasbeurt) met 1 ml 1x PBST (40-60 minuten totaal).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 te gebruiken voor wasbeurten, omdat het verhogen van het percentage wasmiddel kan leiden tot GFP-denaturatie, wat leidt tot verminderde fluorescentie en detectie van GFP-gelabelde BM-eiwitten.
11. Ga voor kleurstofkleuring, bijvoorbeeld DNA- en F-actinekleuring, verder met stap 3. Ga voor immunostaining verder met stap 4. De eierstokken kunnen tot 24 uur in 1x PBST bij 4 °C worden bewaard voordat ze verder gaan.

3. Standaard DNA/F-Actine kleuring

1. Verwijder na het fixeren en wassen PBST. Voeg 500 μL DNA en F-Actin kleuringsoplossing toe. Om de DNA/F-Actin-oplossing te bereiden, mengt u Hoechst (DNA-kleuring; 1:1000 verdunning van 1 mg/ml stamoplossing) en fluorofoor-gelabelde falloidine (F-actinekleuring; 1:500 verdunning voor Alexa Fluor 546 of 1:100 verdunning voor Alexa Fluor 647, elk van 66 μM stockoplossing) in 500 μL PBST.
2. Bedek de buizen met aluminiumfolie om de eierstokken en kleurstoffen in het donker te houden om de fluorescentie te behouden voor efficiënte beeldvorming en incubeer gedurende 15 minuten op een nutating platform rocker.
3. Verwijder na incubatie de DNA/F-Actin-oplossing (zoals in stap 2.9). Voer twee snelle wasbeurten en drie lange (10-15 min) wasbeurten uit in 1x PBST zoals beschreven in stap 2.10. Ga verder met het monteren zoals beschreven in stap 5.

4. Fluorescentie immunostaining

OPMERKING: Dit is een standaard immunostaining protocol voor fluorescerende beeldvorming en is compatibel met de meeste primaire antilichamen.

1. Blokkerende en primaire antilichaam immunostaining (Dag 1)
   1. Verwijder PBST na het fixeren en wassen zoals beschreven in stap 2.9. Voeg 1 ml blokkeringsoplossing (PBS + 5% BSA) toe en blokkeer de eierstokken op een nooterende platformknop gedurende minimaal 1 uur.
      OPMERKING: Naast BSA kan foetaal runderserum (FBS) of normaal geitenserum (NGS) aan de blokkerende oplossing worden toegevoegd. Als alternatief kunnen de eierstokken 's nachts worden geblokkeerd op een notenplatform rocker bij 4 °C.
   2. Verwijder de blokkeringsoplossing zoals in stap 2.9 en voeg 300 μL primaire antilichaamoplossing met primaire antilichamen verdund in de juiste concentraties (specifiek voor het gebruikte antilichaam) toe aan de blokoplossing. Incubeer een nacht op een noterend platform rocker bij 4 °C. Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing en ga verder met secundaire antilichaamimmunostaining.
      OPMERKING: Sommige primaire antilichamen kunnen worden opgeslagen en hergebruikt. In sommige gevallen kunnen hergebruikte primaire antilichamen achtergrondkleuring verminderen, wat resulteert in betere beeldvorming. Hergebruik moet echter voor elk antilichaam worden getest om de efficiëntie te garanderen.
2. Secundair antilichaam immunostaining (Dag 2)
   1. Voer na het verwijderen van de primaire antilichaamoplossing twee snelle wasbeurten en vier lange (10-15 min) wasbeurten uit zoals in stap 2.10. Zorgvuldig uitgevoerde repetitieve wasbeurten met verse 1x PBST zullen de niet-specifieke achtergrond verminderen en leiden tot optimale beeldvorming.
   2. Verwijder PBST zoals in stap 2.9 en voeg 500 μL secundaire antilichaamoplossing toe die fluorescerende secundaire antilichamen bevat die de gebruikte primaire antilichamen detecteren. Bescherm de buis tegen licht door deze vanaf dit punt te bedekken met aluminiumfolie voor een optimaal behoud van fluorescentie, wat van cruciaal belang is voor beeldacquisitie en -analyse.
      OPMERKING: De secundaire antilichaamoplossing moet secundaire antilichamen bevatten die zijn geconjugeerd met fluoroforen die niet overlappen met endogene gelabelde eiwitten. Als u bijvoorbeeld GFP-gelabelde eiwitten gebruikt, wordt het gebruik van secundaire Alexa Fluor-antilichamen op rode of verrode golflengten aanbevolen (bijvoorbeeld 546, 568 of 647 nm). Fluorescerende kleurstoffen, zoals Hoechst en Alexa Fluor 546 of 647 geconjugeerd falloïdine, kunnen aan de secundaire oplossing worden toegevoegd. Deze vlekken kunnen nuttig zijn om de algehele celstructuur (d.w.z. kernen en F-Actine) te markeren. Zie stap 3.1 voor de concentraties.
   3. Incubeer de eierstokken in de secundaire antilichaamoplossing op een nutating platform rocker gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Voer twee snelle wasbeurten en vier lange (10-15 min) wasbeurten uit in 1x PBST zoals in stap 2.10. Ga verder met monteren zoals in stap 5.

5. Montage van gekleurde eierstokken

OPMERKING: Deze methode werkt heel goed als de eierstokken goed ontwikkeld en overvloedig zijn. Zorgvuldige montage van de eierstokken op de dia is van cruciaal belang voor een optimale beeldvorming.

1. Gebruik na de laatste wasbeurt een p1000-pipet om de eierstokken voorzichtig op en neer in de buis te pipetteren om de eikamers te scheiden. Laat de eikamers naar de bodem zakken door de buis 5-10 minuten rechtop te houden. Zorgvuldige scheiding van individuele eikamers is van cruciaal belang om optimale beeldacquisitie te bereiken.
2. Verwijder PBST met een Pasteur pipet, waardoor ~50 μL overblijft. Verwijder zoveel mogelijk van de resterende PBST met een p200 pipet. Voeg twee druppels montagemedium toe, genoeg om gelijkmatig te verspreiden over een afdekplaat van 22 mm x 22 mm. Eierstokken kunnen tot 1 maand voorafgaand aan de montage in microcentrifugebuizen bij 4 °C worden bewaard in montagemedium.
   OPMERKING: Verschillende bevestigingsmedia zijn in de handel verkrijgbaar; het gebruik van hardwerkende mountants, zoals Aqua-Poly/Mount of ProLong Glass Antifade Mountant, wordt aanbevolen om optimale beeldomstandigheden te bereiken. Het gebruik van glycerol als montagemedium wordt afgeraden omdat het kan leiden tot slechte beeldvormingsomstandigheden (bijv. Fluorofoorinstabiliteit). Voor montagemedia die niet polymeriseren, sluit u de coverslip af met een coverslipkit / nagellak om deze op zijn plaats te houden.
3. Label een glazen dia en veeg deze af met zacht, stofvrij papier om stof en vingerafdrukken te verwijderen. Knip het uiteinde van een p200 pipetpunt af zodat het viskeuze montagemedium gemakkelijk vanuit de microcentrifugebuis naar de schuif kan worden overgebracht. Breng vervolgens langzaam alle eierkamers in het montagemedium over naar de glazen schuif en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.
4. Onder een ontleedmicroscoop spreidt u voorzichtig het montagemedium en de gescheiden eierkamers uit met behulp van een nieuwe p200-punt of -tang om een gebied te bedekken dat ongeveer zo groot is als de coverslip.
5. Plaats met behulp van een tang voorzichtig de deklip (gereinigd met stofvrij papier) onder een hoek op de eierkamers om bubbels te voorkomen.
6. Bewaar de glijbaan bij kamertemperatuur op een vlak oppervlak in het donker gedurende 2 dagen om te polymeriseren. Zodra het montagemedium is uitgehard, kan de dia enkele weken bij 4 °C in het donker worden bewaard voor beeldvorming.
   OPMERKING: Het is belangrijk dat het montagemedium met harde instelling polymeriseert voordat het wordt afgebeeld. Als het medium nog niet is gepolymeriseerd, zullen de eierstokken onder de coverslip zweven, wat de beeldacquisitie beïnvloedt. Bovendien wordt de optimale reflecterende index van montagemedia pas bereikt nadat deze volledig is ingesteld (zie de informatie van de fabrikant voor meer informatie).
7. Alternatieve montagemethode: Deze methode wordt aanbevolen om weefselverlies te verminderen als de eierstokken niet overvloedig zijn. Bij deze methode (hieronder beschreven) scheidt u de ovariolen en de eikamers op de dia tijdens het monteren, in plaats van ze in een microcentrifugebuis te scheiden door te pipetteren zoals beschreven in stap 5.1.
   1. Verwijder na de laatste wasbeurt alles behalve ~100 μL van de wasoplossing. Breng met behulp van een Pasteur-pipet of p1000-pipet de intacte eierstokken in PBS over naar de dia. Gebruik een p200 pipet om voorzichtig zoveel mogelijk PBST van de dia te verwijderen. Gebruik indien nodig een stofvrij papier om de PBST weg te vegen. Raak de eierstokken niet aan.
   2. Voeg twee druppels montagemedia toe. Scheid de ovariolen en eierkamers zorgvuldig met behulp van een tang of ontleednaalden. Verwijder en gooi vreemd weefsel weg en spreid vervolgens de eikamers en ovarioles uit in het montagemedium. Ga verder met de stappen 5.5-5.6.

6. Confocale beeldverwerving

OPMERKING: Deze sectie bevat belangrijke parameters om optimale beeldacquisitie te bereiken met behulp van een confocale microscoop (figuur 2).

1. Stel de microscoop in en lokaliseer het monster zoals hieronder beschreven.
   1. Voordat u gaat fotograferen, is het cruciaal om de regio van belang (ROI) te lokaliseren met behulp van het oculair van de fluorescentiemicroscoop. Gebruik een objectief met een lage vergroting (20x) of het objectief dat moet worden gebruikt voor beeldacquisitie (d.w.z. 40x of 63x). Selecteer een eierkamer om af te beelden.
      OPMERKING: Voor beeldacquisitie wordt het gebruik van hoge vergrotingsdoelstellingen zoals 40x of 63x aanbevolen (zie 6.2.1).
   2. Zodra de ROI is geselecteerd, gaat u verder met het verwerven van afbeeldingen; ga verder met stap 6.2 voor confocale beeldvorming en stap 7 voor beeldvorming met superresolutie.
2. Selecteer de belangrijkste parameters voor optimale beeldacquisitie zoals hieronder beschreven (voorbeelden van belangrijke parameters voor de representatieve afbeeldingen worden gegeven in tabel 1).
   1. Een doel selecteren: Gebruik voor confocale beeldverwerving van de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in de FE een 40x- of 63x-doelstelling.
      OPMERKING: Om de best mogelijke resolutie te bereiken, wordt het gebruik van Plan-Apochromat-objectieven, met een hoog numeriek diafragma (NA) dat de hoogste achromatische correctie biedt, ten zeerste aanbevolen.
   2. Lasers selecteren voor elk kanaal/spoor: Gebruik voor GFP laser 488 nm; gebruik voor DAPI of Hoechst laser 405 nm; gebruik voor Alexa Fluor 546 of 568 laser 561 nm; en gebruik voor Alexa Fluor 647 laser 640 nm.
      OPMERKING: Elke laserselectie resulteert in een andere kanaal-/spoorvorming. Hier verwijst de term kanaal naar het beeld gevormd door de opgenomen intensiteitsverdeling voor geëxciteerde fluoroforen voor de geselecteerde ROI op de specifieke golflengte van elk kanaal.
   3. Pinhole-instelling: Om onscherp licht tijdens beeldacquisitie te verminderen, stelt u het gaatje voor elk kanaal in op 1 AE.
   4. Laserintensiteit en detectorversterkingsinstellingen: Om de beeldgevoeligheid te verfijnen, gebruikt u zowel de detectormasterversterking als het laservermogen. Om de beeldgevoeligheid goed in te stellen, wordt een bereikindicator aanbevolen. Stel zowel de hoofdversterking als het laservermogen in op een juiste gevoeligheid waarbij de interessante structuren (bijv. BM-bevattende blaasjes) duidelijk zichtbaar zijn en tegelijkertijd detectorverzadiging vermijden.
      OPMERKING: Om fotobleaching te voorkomen, gebruikt u het minimale laservermogen dat nodig is. Het wordt aanbevolen om eerst de detectorversterking te verhogen met behulp van het laagst mogelijke laservermogen. Als een toename van de detectorversterking niet de gewenste intensiteit kan bereiken, verhoog dan het laservermogen. Laservermogensintensiteit tussen 0,5% -1,2% wordt aanbevolen.
   5. Framegrootte: het wordt aanbevolen om de optimale afbeeldingsgrootte te gebruiken die wordt bepaald door de acquisitiesoftware. Gebruik voor de meeste toepassingen een maximale resolutie van 1024 x 1024. Een hogere resolutie zal de acquisitietijd aanzienlijk verlengen.
   6. Scansnelheid: gebruik een scansnelheid tussen 6-9, wat veilig is voor de meeste monsters. Als het monster luidruchtig is, gebruikt u een lagere scansnelheid om de signaal-ruisverhoudingen te verbeteren. Lage scansnelheden verhogen echter de fotobleaching en acquisitietijd.
   7. Gemiddelde intensiteitsgemiddelde: Om de beeldkwaliteit te verbeteren, gebruikt u gemiddelde intensiteitsgemiddelde via opeenvolgende scans met identieke instellingen. Gebruik in de meeste gevallen een gemiddelde van twee om de signaal-ruisverhoudingen te verbeteren zonder het monster te fotobleachen.
   8. Zoomen: Pas het scangebied aan met de zoomfunctie. Gebruik een zoom tussen 2x-4x met zowel 40x als 63x objectieven als de meest effectieve waarde om BM-bevattende blaasjes in de FE duidelijk te visualiseren. Selecteer zorgvuldig de minimale ROI om de acquisitietijd te verkorten.
3. Om een z-stack te verkrijgen met Zeiss Zen-software, gebruikt u de volgende Z-sectieparameters en stelt u deze in zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Blaasjes en andere intracellulaire structuren die BM-eiwitten bevatten, zijn 3-dimensionale (3D) structuren. Het aanschaffen van een z-stack via de FE zal de beeldkwaliteit en resolutie aanzienlijk verbeteren. Meestal is een bereik dat de dikte / diepte van het weefsel beslaat voldoende om intracellulaire lokalisatie efficiënt te visualiseren. Voor een optimale 3D-reconstructie wordt aanbevolen om het optimale interval te gebruiken dat door de software wordt bepaald. Vermijd voor 40x- en 63x-doelstellingen intervallen hoger dan 0,5 μm tussen elke z-sectie om een optimale 3D-reconstructie mogelijk te maken.
   1. Klik op het selectievakje z-Stack in het hoofdgebied onder het tabblad Acquisitie . Selecteer de scanmodus Alle tracks per segment voor de z-stack. Dit resulteert in een verandering in kanaaltracks voor elke z-positie slice.
   2. Selecteer het gewenste kanaal om het exemplaar te observeren en klik op Live om een live scan te starten. Het gebruik van het kanaal dat nodig is om het GFP-gelabelde BM-eiwit te detecteren, wordt aanbevolen.
   3. Stel een bereik in voor de z-stack zoals beschreven. Gebruik de fijnafstellingsknop op de microscoop om de z-locatie voor het ene uiteinde van het monster te vinden en klik op Eerst instellen. Zoek op dezelfde manier de z-locatie voor het andere uiteinde van het exemplaar en klik op Laatste instellen.
   4. Klik voor elke locatie in de z-stack op elk kanaal afzonderlijk met de bereikindicator geselecteerd en pas de intensiteit van de laser en de masterversterking indien nodig aan, zoals beschreven in stap 6.2.4.
   5. Stel het interval voor de z-stack in om de stapgrootte toe te wijzen zoals aanbevolen in de OPMERKING onder stap 6.3. Klik op Experiment starten om te beginnen met het aanschaffen van z-stack.

7. Superresolutie beeldacquisitie

1. Selecteer een Airyscan-compatibel doel. Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwit te visualiseren, is het gebruik van een 63x oliedoelstelling optimaal (figuur 3). Stel het doel in op 63x en plaats voorzichtig een druppel dompelolie op de lens. Plaats de dia op het objectief met coverslip naar het doel gericht om het monster te lokaliseren.
2. Selecteer een configuratie met de juiste instellingen voor de fluorofoor om af te beelden zoals hieronder beschreven.
   1. Klik op de knop Slimme installatie op het tabblad Acquisitie om een nieuw experiment te configureren. Selecteer Airyscan (superresolutie); wanneer dit is geselecteerd, is een verdere selectie vereist tussen Resolutie (Airyscan SR), SNR/gevoeligheid (Airyscan Confocal) en Snelheid (Multiplex SR-2Y). Voor vast weefsel selecteert u Resolutie , omdat dit zal resulteren in de beste acquisitie.
   2. Klik op + in het vak Uw experiment configureren om tracks/kanalen toe te voegen. Selecteer de tracks voor specifieke kleurstoffen uit de Dye Database. Voor een experiment met meerdere kanalen voegt u elke track indien nodig toe door de juiste kleurstoffen te selecteren.
   3. Nadat alle tracks zijn toegevoegd, selecteert u een van de experimentvoorstellen die door de software worden geleverd. Gebruik voor dit experiment Best Signal, want hoewel de snelheid iets langzamer zal zijn in vergelijking met het Slimste (Line) voorstel, zal het de beste hardware-instellingen voor elke kleurstof creëren, wat resulteert in maximale signaalversterking en minimale emissie-overspraak. Zodra het experiment is ingesteld en geladen, wordt het weergegeven in het venster Imaging Setup op het tabblad Acquisitie.
   4. Zodra een slimme opstelling is geselecteerd, wordt het golflengtebereik voor de detector GaAsP-PMT automatisch geselecteerd. Pas het bereik aan door de schuifbalk onderaan te verplaatsen om het bereik te vergroten of te verkleinen of het bereik naar een ander gebied te verplaatsen als dat nodig is. Gebruik dit om ervoor te zorgen dat de bereiken van twee verschillende kanalen elkaar niet overlappen om overspraak te voorkomen. Sla de configuratie op om in de toekomst opnieuw te gebruiken.
3. Zodra de configuratie is ingesteld, gaat u verder met het aanpassen van het zoom- en scangebied zoals in stap 6.2.8. Optimaliseer het scangebied om u te concentreren op de gewenste regio om de scantijd en opslagruimte te verminderen. Ga verder met het verkrijgen van afbeeldingen.
4. Selecteer voor elk afzonderlijk kanaal een track onder Kanaal en klik op Live. Pas de hoofdversterking en het laservermogen aan met behulp van het bereikindicatorgereedschap zoals beschreven in stap 6.2.4 en volg alle beschreven richtlijnen om verzadigde pixels te voorkomen. Controleer of de zeshoekige detectorweergave is gecentreerd en uitgelijnd door op de knop Airyscan-detectorweergave te klikken. In de meeste gevallen wordt de zeshoekige detectorweergave automatisch gecentreerd en uitgelijnd. Herhaal dit voor extra kanalen.
5. Klik in het schakelvenster Acquisitiemodus onder Afbeeldingsgrootte op SR (superresolutie-beperkt aantal pixels) om de mogelijkheden van de detector te maximaliseren. Hiermee wordt de framegrootte automatisch aangepast.
6. Houd het gemiddelde op Geen omdat het meestal niet nodig is, en dit zal de scantijd verkorten. In sommige gevallen kan een gemiddelde van 2x de signaal-ruisverhouding verbeteren.
7. Verzamel onbewerkte gegevens met 8-bits gegevensdiepten. Klik op Snap om een afbeelding te verkrijgen. Volg stap 6.3 om een z-stack te verkrijgen.
8. Voer beeldverwerking uit zoals hieronder beschreven. Dit levert een 16-bits afbeelding op.
   1. Zodra de afbeelding of z-stack is verkregen, klikt u op de Processing > Method en selecteert u Airyscan Processing.
   2. Voer om te beginnen automatisch filteren uit en voer verdere handmatige verwerking uit door de SR-waarde te wijzigen om de beste resultaten voor het monster te verkrijgen. Zodra de optimale SR-waarde is bepaald, klikt u op Toepassen om een verwerkte afbeelding te genereren. In het geval van z-stack-afbeeldingen, verwerk u als één z-slice (Current Image [2D]) of als de hele z-stack door op het vak 3D-verwerking te klikken.

8. Beeldverwerking en data-analyse (orthogonale projectie, 3D-reconstructie en intensiteitsprofiel)

OPMERKING: Voor deze methode worden de stappen beschreven die worden gebruikt om orthogonale projecties, 3D-reconstructies en intensiteitsprofielen te genereren voor de Zen-software (zie Materiaaltabel). Soortgelijke data-analyses kunnen ook worden uitgevoerd met ImageJ-software⁵⁶.

1. Orthogonale projectie uitvoeren zoals hieronder beschreven (figuur 4).
   1. Zodra een z-stack is verkregen met behulp van confocale of superresolutiemicroscopie, genereert u een orthogonale projectie om de blaasjes in de z-as van de cel in een 2D-weergave te bekijken (vergeleken met 3D-reconstructie). Klik hiervoor op de verwerkingsmethode > en selecteer Orthogonale projectie.
   2. Selecteer onder parameters het vereiste projectievlak. Voor een projectie van de z-as (z-stack) selecteert u het frontale (XY) vlak. Selecteer onder Methode de optie Maximum om te resulteren in de projectie van de hoogste kwaliteit.
   3. Bepaal vervolgens de dikte van de projectie door de beginpositie te selecteren (beginnende z-slice) en bepaal de dikte (totaal aantal z-slices) in de projectie. Het is ideaal om de dikte te selecteren die gelijk is aan die van één cel in de z-as.
   4. Zodra de parameters zijn ingesteld, klikt u op Toepassen om de projectie van de z-stack op een XY-vlakmanier te maken.
      OPMERKING: Bij het maken van orthogonale projecties van meerdere z-stacks om de hoeveelheid van een bepaald interessant object te vergelijken, is het noodzakelijk om de dikte van de projectie hetzelfde (of zo dicht mogelijk) te houden voor gegevensnauwkeurigheid.
2. Voer een 3D-reconstructie uit zoals hieronder beschreven (figuur 5).
   1. Maak 3D-reconstructies van z-stacks om de lokalisatie en vorm van structuren te observeren. Doe dit voor z-stacks die zijn verkregen met behulp van confocale en superresolutiebenaderingen. Verwerk z-stacks met superresolutie eerst met behulp van 3D-verwerking zoals in stap 7.8 voor 3D-reconstructie.
   2. Om een 3D-afbeelding te genereren, klikt u op het 3D-pictogram in het voorbeeldvenster. Eenmaal aangeklikt, verschijnt er een 3D-tabblad in het gedeelte weergavebeheer in de onderste helft van het scherm. 3D-weergaven, zoals Transparantie, Volume, Maximum, Oppervlak en Gemengd, zijn zichtbaar. Gebruik Surface- of Gemengde weergaven bij het bekijken van de structuur van blaasjes (bij voorkeur).
   3. Voor de afbeelding van de hoogste kwaliteit selecteert u de instelling Nauwkeurig , omdat de snelste instelling minder nauwkeurig is en leidt tot een slechte 3D-weergave.
   4. Zodra de afbeelding is gegenereerd, manipuleert u deze door te roteren en in te zoomen om scherp te stellen op een voorkeurslocatie om de interessante objecten te bekijken. Manipuleer de 3D-afbeelding op het tabblad Vormgeving .
   5. Zodra een bevredigend beeld is verkregen, selecteert u onder het tabblad 3D de optie Weergegeven resolutie en klikt u vervolgens op Afbeelding maken. Hiermee wordt een momentopname van de afbeelding gemaakt in dezelfde richting als deze werd bekeken en kan deze worden opgeslagen en geëxporteerd in verschillende bestandsindelingen.
3. Genereer een intensiteitsprofiel zoals hieronder beschreven (figuur 7).
   OPMERKING: De verdelings- en intensiteitsprofielen van de pixels die zijn gekoppeld aan de verschillende fluorescerende signalen kunnen worden bekeken als een overlayafbeelding om hun colocalisatie te bepalen.
   1. Zodra een optimaal beeld is verkregen via confocale of superresolutie beeldvorming, klikt u in het deelvenster Weergave van het voorbeeldvenster op Profiel. In het voorbeeldvenster verschijnt een histogram dat het intensiteitsprofiel weergeeft als functie van de afstand, evenals een tabel met afstanden en intensiteitswaarden.
   2. Klik in het gebied met weergavebesturingselementen onder aan het scherm op het gereedschap Pijl op het tabblad Profieldefinitie . Teken een pijl langs de lengte van het object waarvoor het intensiteitsprofiel van de verschillende pixels moet worden beoordeeld. Als u de pijl wilt tekenen, zoomt u in op de afbeelding.
   3. Het intensiteitsprofiel verschijnt aan de linkerkant van het afbeeldingsvoorbeeld, waar de afstand en de bijbehorende pieken langs het pad van de pijl worden weergegeven. Als u het histogram wilt verwijderen dat op de afbeelding zelf wordt weergegeven, schakelt u het selectievakje Profiel weergeven in afbeeldingen uit .
   4. Schakel op het tabblad Dimensies in het weergavebesturingselementgebied de selectie uit alle kanalen die niet in het intensiteitsprofiel mogen worden opgenomen.
   5. Dubbelklik op het tabblad Afbeeldingen op Profiel dat wordt weergegeven onder het vak Annotaties/Metingen om het pop-upvenster Grafische elementen opmaken te openen. Gebruik dit om de kleur van de pijl en de stijl en lijndikte te wijzigen. Sluit het vak nadat u de gewenste instellingen hebt geselecteerd.
   6. Klik op het tabblad Profielweergave . Klik in het nieuwe afbeeldingsgedeelte op Huidige weergave en vervolgens op Opslaan als om het bestand op te slaan. Het wordt aanbevolen om het bestand op te slaan als een .tif bestand om gegevenscompressie en -verlies te voorkomen.

Representative Results

De hierin beschreven methoden kunnen worden gebruikt om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen, zoals de FE van de Drosophila-eierstok , efficiënt en nauwkeurig in beeld te brengen en te karakteriseren. Vervolgens bieden we verwachte resultaten die zijn verkregen met behulp van de beschreven methoden, evenals nuttig advies en mogelijke valkuilen. Om dit te doen, wordt Vkg-GFP, een endogeen gelabelde Vkg (Drosophila Col IV) gebruikt. Dezelfde resultaten kunnen echter worden bereikt met andere endogeen gelabelde BM-eiwitten zoals Pcan-GFP.

Optimale acquisitieparameters instellen (figuur 2)
Om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten, zoals Vkg en Pcan, in epitheelcellen nauwkeurig te karakteriseren, is het van cruciaal belang om de acquisitieparameters van de confocale microscoop goed in te stellen zoals beschreven in de meegeleverde methoden.

Met behulp van confocale microscopie kan de intracellulaire lokalisatie van Vkg-GFP worden gedetecteerd voordat deze wordt uitgescheiden en basaal in de FE wordt afgezet (figuur 2A). Het is aangetoond dat Coll IV na translatie in de ER naar de Golgi wordt getransporteerd voordat het wordt verpakt in intracellulaire exocytaire blaasjes. Met behulp van deze beeldvormingsbenadering zien we dat Vkg-GFP zich ophoopt in intracellulaire compartimenten met verschillende vormen, die mogelijk verschillende organellen, endosomale compartimenten en blaasjestypen vertegenwoordigen (figuur 2A, pijlen). In exocytaire blaasjes is Coll IV al geassembleerd tot fibrillen die bestaan uit drie polypeptiden: twee α1-ketens en één α2-keten (Vkg in Drosophila), wat leidt tot de vorming van uitgerekte blaasjes die ook kunnen worden gevisualiseerd met behulp van confocale beeldvorming (figuur 2A, pijlen). Vervolgens wordt Coll IV specifiek basaal uitgescheiden uit epitheelcellen waar het wordt afgezet in de BM (figuur 2, pijlpunten).

Als de acquisitieparameters niet goed zijn ingesteld, is het niet mogelijk om de verschillende morfologieën en posities nauwkeurig waar te nemen tijdens de intracellulaire handel van BM-eiwitten (figuur 2B,C). Als de acquisitieparameters bijvoorbeeld zijn geoptimaliseerd om de extracellulaire BM te visualiseren en niet de intracellulaire structuren, lijken de BM-eiwithoudende endosomale compartimenten en blaasjes (hier gemarkeerd door Vkg-GFP) zwak of niet zichtbaar (figuur 2B). Omgekeerd, als de detectoren oververzadigd zijn, kan de intracellulaire lokalisatie van Vkg-GFP worden gedetecteerd als in de optimale conditie (vergelijk figuur 2A en figuur 2C), maar een toename van achtergrondfluorescentieruis maakt interpretatie van de BM-eiwitlokalisatie moeilijker, met name voor colocalisatie-experimenten (zie figuur 7 ). Over het algemeen illustreren deze gegevens het belang van de juiste acquisitieparameters om een nauwkeurige lokalisatie van BM-eiwitten in het epitheel te bereiken.

Optimale superresolutie- en deconvolutieparameters instellen (figuur 3)
Zoals geïllustreerd voor confocale beeldacquisitie, is het ook van cruciaal belang om de acquisitieparameters goed in te stellen bij het gebruik van superresolutiemicroscopie om onder- of oververzadiging te voorkomen. Deze superresolutiebeeldvormingsbenadering omvat ook de zorgvuldige configuratie van deconvolutieparameters om beeldvorming met superresolutie te bereiken (figuur 3). Wanneer deconvolutieverwerking optimaal is geconfigureerd, verhoogt beeldvorming met superresolutie de resolutie van intracellulaire structuren die BM-eiwitten bevatten (figuur 3A, pijlen), zoals blaasjes of Golgi-structuren (figuur 3A en figuur 7C), de BM zelf (figuur 3A, pijlpunten) aanzienlijk en verbetert de signaal-ruisverhouding⁴⁵ . Superresolutiemicroscopie leidt tot een ~ 2x hogere resolutie in alle drie de ruimtelijke dimensies in vergelijking met confocale microscopie. Deze toename in resolutie wordt duidelijk geïllustreerd door de beter gedefinieerde beelden van de intracellulaire handel in BM-eiwitten en de BM genomen met behulp van superresolutiebeelden in vergelijking met die genomen met standaard CSLM (vergelijk figuur 2A en figuur 3A).

Als deconvolutieparameters niet goed zijn ingesteld, wordt de superresolutie niet optimaal bereikt en gaat de toename van de resolutie verloren. Onderverwerking van beelden met superresolutie leidt tot wazige beelden, wat resulteert in de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten die zwak en niet zo goed gedefinieerd lijken als onder optimale omstandigheden (vergelijk figuur 3B met figuur 3A). Omgekeerd leidt oververwerking van de beelden tot korrelige beelden, waarbij de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten gepixeld lijkt (figuur 3C). Deze gegevens benadrukken het belang van het gebruik van de juiste deconvolutieparameters om zinvolle en representatieve beelden te verkrijgen die de intracellulaire verdeling van BM-eiwitten weerspiegelen.

Al met al tonen en benadrukken deze gegevens duidelijk de verbeterde resolutie van intracellulaire handel in BM-eiwitten met behulp van superresolutie beeldverwerking in vergelijking met confocale microscopie. In het bijzonder maakt deze aanpak een betere visualisatie mogelijk van de intracellulaire handel in BM-eiwitten door de resolutie van de betrokken intracellulaire structuren te verbeteren. Dit maakt de vergelijking van verschillende maten en vormen van structuren mogelijk om nieuwe factoren die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten in de FE beter te identificeren en te karakteriseren.

Orthogonale projectie en 3D-reconstructie van optische z-secties (z-stack) door de FE om de visualisatie van de intracellulaire verdeling van BM-eiwitten te verbeteren (figuur 4 en figuur 5)
Aangezien de intracellulaire verdeling van BM-eiwitten aanwezig is in de FE in 3D (x-, y- en z-assen), kan orthogonale projectie en/of 3D-reconstructie van optische z-secties door de FE, met behulp van superresolutie of confocale microscopie, worden gebruikt om de lokalisatie en de verdeling van BM-eiwitten in wildtype of mutante cellen te beoordelen (bijvoorbeeld in figuur 4 en figuur 5).

Orthogonale projectie maakt het mogelijk om alle verworven z-secties in één vlak te projecteren. Deze methode is met name nuttig om de totale verdeling van blaasjes en compartimenten met BM-eiwitten in één afbeelding weer te geven met behulp van confocale (figuur 4A) of superresolutie (figuur 4B) beeldvorming. Een significant betere resolutie en minder achtergrondruis resulteren echter bij het gebruik van superresolutiemicroscopie dan confocale microscopie (vergelijk figuur 4B en figuur 4A).

Een andere benadering om de totale verdeling van BM-bevattende compartimenten en blaasjes te visualiseren, is het genereren van een 3D-reconstructie door een stapel optische z-secties samen te stellen die zijn genomen door confocale (figuur 5A) of superresolutie (figuur 5B) beeldvorming. Deze aanpak kan ook zeer efficiënt zijn om de lokalisatie en distributie van intracellulaire BM-eiwitten en de vorm van compartimenten en blaasjes met Vkg-GFP te beoordelen, vooral bij gebruik van superresolutiemicroscopie (figuur 5). Traditionele confocale microscopie (figuur 5A) resulteert in een hogere achtergrondruis in vergelijking met superresolutie (figuur 5B), wat bij 3D-rendering kan resulteren in artefacten. Bovendien resulteert de lagere resolutie van confocal er ook in dat de gemaakte beelden minder vloeiend en gedefinieerd zijn dan die gegenereerd door superresolutie (vergelijk figuur 5A en figuur 5B).

Karakterisering van de fenotypen geassocieerd met het verlies van componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde secretie van BM-eiwitten met behulp van superresolutie beeldvorming (figuur 6)
Zoals tot nu toe is aangetoond (figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5), kunnen microscopie en beeldverwerking met superresolutie worden gebruikt om de intracellulaire lokalisatie en distributie van BM-eiwitten in het wildtype FE van de Drosophila-eierstok te beoordelen. Bovendien kan deze benadering ook worden gebruikt om de lokalisatie van BM-eiwitten in mutante of knockdown-omstandigheden te bepalen en te vergelijken. Dit is daarmee een efficiënte methode om de rol (en) van nieuw geïdentificeerde componenten te karakteriseren die zijn gewijd aan de gepolariseerde intracellulaire handel, secretie en afzetting van BM-eiwitten.

Van de GTPase-uitwisselingsfactor (GEF) Crag is aangetoond dat het een belangrijk onderdeel is van een biologische route die zich toelegt op de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten²⁸. In Crag knockdown FCs accumuleren BM-eiwitten zich zowel apisch als basaal, wat aangeeft dat Crag de gepolariseerde secretie van BM-eiwitten zoals Vkg-GFP regelt (figuur 6). Het gebruik van superresolutiemicroscopie zorgt voor een betere karakterisering van het fenotype als gevolg van het verlies van Crag. Een sterke apicale accumulatie van BM-eiwitten, evenals de organisatie van de ectopische apicale BM, wordt bijvoorbeeld waargenomen in Crag-knockdown FCs (figuur 6B, pijlpunten). Bovendien, wanneer het fenotype minder afwijkend is, wordt BM-membraan gedetecteerd dat zich apisch ophoopt in kleine vlekken in FCs (figuur 6B, pijlen). Al met al illustreren deze gegevens dat superresolutiemicroscopie kan worden gebruikt om mutante fenotypen te karakteriseren om de rollen van componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM beter te begrijpen.

Colocalisatie-experiment met antilichamen en endogene gelabelde BM-eiwitten afgebeeld met confocale en superresolutiemicroscopie (figuur 7)
Ten slotte kan het gebruik van antilichamen tegen specifieke intracellulaire markers of nieuw geïdentificeerde componenten in combinatie met endogene gelabelde BM-eiwitten worden gebruikt om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in het gepolariseerde epitheel beter te karakteriseren. GM-130, een cis-Golgi marker, wordt gebruikt om dit punt te illustreren. Voordat coll IV in afscheidingsblaasjes wordt verpakt, wordt het naar de Golgi vervoerd. Wanneer de subcellulaire verdeling van Vkg-GFP wordt beoordeeld met behulp van confocale (figuur 7A, B) of superresolutie (figuur 7C, D) beeldvorming, tonen beide benaderingen aan dat Vkg-GFP gedeeltelijk co-lokaliseert met GM-130, wat bevestigt dat Coll IV vóór secretie naar de Golgi wordt gesorteerd. Een toename van de signaal-ruisverhouding en een betere resolutie van de colocalisatie tussen Vkg-GFP en GM130 wordt echter waargenomen bij het gebruik van beeldvorming met superresolutie (vergelijk figuur 7A met figuur 7C).

Bovendien, wanneer de ruimtelijke verdeling en niveaus van groene (Vkg-GFP) en rode (GM-130) pixels worden gekwantificeerd door de fluorescentie-intensiteit van een optische sectie door FCs te meten die zijn genomen met confocale (figuur 7B) en superresolutie (figuur 7D) microscopie, wordt de colocalisatie van Vkg-GFP en GM-130 waargenomen. De verdeling van Vkg-GFP en GM-130 pixels wordt uitgezet in histogrammen waarin overlappingen van de Vkg-GFP en GM-130 pieken hun colocalisatie aangeven (Figuur 7B',D'). Met behulp van deze beeldanalysetool kan dus de locatie van Vkg-GFP in specifieke intracellulaire compartimenten nauwkeurig worden bepaald. De vergelijking van histogrammen gegenereerd op basis van confocale beelden (figuur 7B') met superresolutiebeelden (figuur 7D') bevestigt echter dat superresolutiemicroscopie betere resultaten oplevert, zoals te zien is aan de hogere intensiteit van pieken en verminderde achtergrondruis die worden weergegeven door het ontbreken van kleinere pieken (vergelijk figuur 7B' en figuur 7D' ) in verband met door superresolutie gegenereerde histogrammen. Al met al benadrukken deze gegevens dat hoewel confocale microscopie kan worden gebruikt om colocalisatie te kwantificeren, superresolutie een krachtigere benadering is, wat leidt tot een efficiëntere en preciezere kwantificering van de lokalisatie.

Figuur 1: Het folliculaire epitheel (FE) van de Drosophila-eierstok : een modelsysteem om de gepolariseerde afzetting van keldermembraan (BM) eiwitten te bestuderen. (A) Afbeelding van intacte eierstokken na dissectie en excisie genomen met een fluorescentie stereomicroscoop. Eierstokken brengen een endogene GFP-gelabelde BM-eiwit (Vkg-GFP) tot expressie. Schaalbalk = 1 mm. (A') Aan de eileider zijn twee eierstokken van een vrouwelijke vlieg bevestigd. Elke eierstok bevat 16-20 ovarioles. Een enkele ovariole is omlijnd (rechthoek). Schaalbalk = 1 mm. (B) Longitudinale sectie, genomen met een confocale microscoop, door een ovariole die Vkg-GFP tot expressie brengt en gekleurd voor DNA (blauw) en F-Actine (rood). Ovarioles bestaan uit eikamers in verschillende stadia. Eikamers zijn samengesteld uit een monolaag folliculair epitheel (FE) dat de kiembaancellen (GC's) omringt. De FE synthetiseert en scheidt basaal BM-eiwitten af (bijv. Pcan en Vkg). Schaalbalk = 100 μm. (C) Schema van de FE. De FE is een klassiek epitheel met een duidelijke apicale-basale polariteit waarbij het apicale domein tegenover de kiembaancellen staat en het basale domein tegenover de BM (groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Beeldvorming van de intracellulaire handel van BM-eiwitten met behulp van confocale beeldvorming. (A-C) Longitudinale sectie door een eikamer die Vkg-GFP (groen) en gekleurd voor DNA (blauw) en F-Actine (rood) tot expressie brengt. (A'-C') Intracellulaire compartimenten en blaasjes met Vkg-GFP (pijlen) en de basaal en extracellulair afgezette BM (pijlpunten) worden weergegeven met behulp van confocale microscopie. (A) Optimaal verkregen beeld waarvoor de intracellulaire handel van Vkg-GFP zichtbaar is. (A') Vkg-GFP is gelokaliseerd in het cytoplasma van FCs in verschillende cellulaire compartimenten (bijv. Golgi) en in blaasjes. Vanwege de fibril-organisatie van Collageen IV lijken Vkg-GFP-bevattende blaasjes langwerpig (pijlen). (B) Onderbelicht beeld waarvoor de acquisitieparameters zijn geoptimaliseerd om de extracellulaire BM te visualiseren en niet de intracellulaire verdeling van BM-eiwitten. Vkg-GFP (groen) lijkt zwak in het cytoplasma (B'), wat resulteert in niet-detecteerbare Vkg-GFP-bevattende blaasjes in vergelijking met (A). (C) Overbelicht beeld waarvoor de GFP-detector verzadigd is, wat resulteert in een toename van achtergrondfluorescentie. Hoewel de intracellulaire verdeling van Vkg-GFP (groen) gelokaliseerd kan worden gezien in het cytoplasma van de FCs (pijlen), resulteert overbelichting in beeldvormingsartefacten waarbij de intracellulaire structuren groter lijken dan ze zijn, zoals in (A-A'). Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Beeldvorming van de intracellulaire handel van BM-eiwitten met behulp van beeldvorming en verwerking met superresolutie. (A-C) Longitudinale sectie door een eikamer die Vkg-GFP (groen) en gekleurd voor DNA (blauw) en F-Actine (rood) tot expressie brengt. (A) Optimaal verwerkt superresolutiebeeld, waarin de intracellulaire handel van Vkg-GFP duidelijk wordt waargenomen. (A') Vkg-GFP is gelokaliseerd in het cytoplasma van de FCs in verschillende cellulaire compartimenten (bijv. Golgi) en blaasjes (pijlen) en bij de BM (pijlpunten). (B) Onderbewerkt beeld, wat resulteert in een hogere achtergrondfluorescentie dan in (A). De intracellulaire lokalisatie van Vkg-GFP (groen) lijkt zwak en minder gedefinieerd (vergelijk B met A). (C) Overbewerkte afbeelding resulterend in een afbeelding waarbij de intracellulaire lokalisatie van Vkg-GFP korrelig en korrelig lijkt. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Orthogonale projectie van een z-stack verkregen en verwerkt met behulp van confocale en superresolutie microscopiebenaderingen. (A-B) Orthogonale projectie van optische z-secties door een eierkamer die Vkg-GFP (groen) uitdrukt en gekleurd voor DNA (blauw) en F-Actine (rood) met behulp van confocale (A) of superresolutie (B) microscopie. (A) Projectie van een z-stack verkregen met behulp van optimale confocale parameters. De intracellulaire lokalisatie van Vkg-GFP kan worden waargenomen in de z-as in de FCs (A', pijlen). De BM is ook zichtbaar en ziet er zeer helder uit (A', pijlpunten). (B) Projectie van een z-stack verkregen met behulp van optimale superresolutieverwerking. Goed gedefinieerde intracellulaire compartimenten en blaasjes met Vkg-GFP kunnen worden waargenomen in de z-as in de FCs (B', pijlen). De BM is ook zeer goed gedefinieerd (B', pijlpunten). Het verschil tussen standaard confocale beeldvorming en beeldvorming met superresolutie is duidelijk, omdat de intracellulaire lokalisatie van Vkg-GFP en de BM significant meer gedefinieerd is bij gebruik van superresolutie dan standaard confocale microscopie. Bovendien heeft het beeld dat met confocale microscopie is gemaakt een hogere achtergrondfluorescentie. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: 3D-reconstructie van een z-stack verkregen en verwerkt met behulp van confocale en superresolutie microscopiebenaderingen. (A-B) 3D-weergave van z-stacks (gemengd beeld) van eikamers die Vkg-GFP (groen) en gekleurd voor DNA (blauw) en F-actine (rood) uitdrukken. (A) 3D-weergave van een z-stack verkregen via confocale microscopie. De locatie en vorm van compartimenten en blaasjes die Vkg-GFP bevatten, zijn overal in de cellen (A') te zien. (B) 3D-weergave van een z-stack verkregen via optimale superresolutieverwerking. De locatie en vorm van compartimenten en blaasjes die Vkg-GFP bevatten, zijn zichtbaar (B'). De vorm van blaasjes, evenals de BM en de kernen, zijn soepel gedefinieerd en de resolutie is hoger in vergelijking met die van confocale microscopie (vergeleken B' en A'). De vorm en grootte van de compartimenten en blaasjes die Vkg-GFP bevatten, kunnen ook beter worden bepaald met behulp van superresolutiemicroscopie (vergeleken B' en A'). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Karakterisering van Vkg-GFP-lokalisatie in Crag heeft FCs neergehaald. (A-B) Longitudinale sectie door een eikamer die Vkg-GFP (groen) tot expressie brengt, gekleurd voor DNA (blauw) en F-Actine (rood) en verkregen via optimale superresolutieverwerking. (A) Controlelijn die wildtype Crag tot expressie brengt, een eiwit dat van cruciaal belang is voor een goede BM-depositie. De FE toont typische BM-eiwitlokalisatie, waarbij Vkg-GFP intracellulair wordt verdeeld en basaal wordt afgezet in de FE (A'). (B) Transgene Drosophila-lijn die RNAi voor Crag in de FE uitdrukt, resulterend in een Crag knockdown. Het verlies van Crag leidt tot de mislokalisatie van BM-eiwitten (bijv. Vkg-GFP) apisch in de FE (B', pijlen en pijlpunten). Superresolutiebeeld wordt gebruikt om de BM-mislokalisatiefenotypen te karakteriseren die geassocieerd zijn met het verlies van Crag. In het bijzonder vertonen sommige Crag RNAi FCs een sterke apicale mislokalisatie van BM-eiwitten (B', pijlpunten), terwijl andere Crag RNAi FCs een zwakkere apicale mislokalisatie (B', pijlen) vertonen. Beeldvorming met superresolutie onthult duidelijk de fenotypen die geassocieerd zijn met het verlies van Crag (B', pijlpunten versus pijlen). Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Colocalisatie van Vkg-GFP en GM-130 (Golgi-marker) met behulp van confocale en superresolutiemicroscopiebenaderingen. (A-D) Longitudinale secties door eikamers die Vkg-GFP tot expressie brengen en immunostained voor een cis-Golgi-marker (GM-130, rood), afgebeeld met confocale (A, B) of superresolutie (C, D) microscopie. (A,B) Confocale beeldvorming toont aan dat intracellulaire Vkg-GFP gedeeltelijk colocaliseert met een cis-Golgi marker (A, pijlpunt). (B) Ingezoomd gebied van (A). De verdelingen van groene (Vkg-GFP) en rode (GM-130) pixels langs de witte pijl worden uitgezet in een histogram (B'). De x-as van het histogram vertegenwoordigt de afstand (μm) langs de pijl, terwijl de y-as de pixelintensiteit vertegenwoordigt. De overlappende groene en rode pieken (*) laten zien waar Vkg-GFP en GM-130 colocaliseren. (C,D) Superresolutie beeldvorming laat ook zien dat intracellulaire Vkg-GFP gedeeltelijk colocaliseert met een cis-Golgi marker (C, pijlpunt). (D) Ingezoomd gebied van (C). De verdelingen van groene (Vkg-GFP) en rode (GM-130) pixels langs de witte pijl worden uitgezet in een histogram (D'). De x-as van het histogram vertegenwoordigt de afstand (μm) langs de pijl, terwijl de y-as de pixelintensiteit vertegenwoordigt. De overlappende groene en rode pieken (*) laten zien waar Vkg-GFP en GM-130 colocaliseren. Deze gegevens tonen aan dat beeldvorming met superresolutie een efficiëntere en preciezere benadering is dan confocale beeldvorming om colocalisatie te karakteriseren en te kwantificeren. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: Confocale en superresolutie microscopie acquisitie- en verwerkingsparameters voor de representatieve beelden. Alle belangrijke beeldparameters zijn samengesteld voor de verstrekte representatieve beelden. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De BM is van cruciaal belang voor embryonale en orgaanmorfogenese en fysiologische functies bij volwassenen. Bovendien fungeert de BM als een signaleringsplatform voor het vaststellen en onderhouden van epitheliale polariteit en biedt weefsels ondersteuning². Toch zijn de mechanismen die de juiste plaatsing van BM-eiwitten reguleren slecht begrepen. Een beter begrip van de biologische routes gewijd aan de intracellulaire handel en gepolariseerde secretie van BM-eiwitten vereist een zorgvuldige analyse van de componenten van deze routes en hun rol in BM-verwerking. Een manier om dit te bereiken is door confocale en superresolutie beeldvorming te gebruiken. Hier beschreven we methoden voor de bereiding en kleuring of immunostaining van Drosophila-eierstokken om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in de FE efficiënt in beeld te brengen met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Voordelen van eiwitval en endogene gelabelde eiwitten om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in wildtype en mutante omstandigheden te visualiseren
Het meegeleverde protocol maakt optimaal gebruik van eiwitvallen en endogene gelabelde BM-eiwitten (bijv. Vkg-GFP en Pcan-GFP) om de lokalisatie en distributie van BM-eiwitten in de FE in wildtype (controle) en mutante omstandigheden in beeld te brengen en te beoordelen. Deze lijnen hebben belangrijke voordelen ten opzichte van het gebruik van antilichamen tegen BM-eiwitten. Ten eerste zijn antilichamen tegen specifieke eiwitten van belang vaak zeldzaam en in lage overvloed. Bovendien zijn er vaak problemen met weefselpenetratie geassocieerd met antilichamen die kunnen leiden tot onnauwkeurige observatie en beoordeling van het eiwit van belang. Bovendien kunnen eiwitvallijnen worden ingevoegd in verschillende genetica-achtergronden die worden gebruikt om de functies te bepalen van factoren die nodig zijn voor de juiste afzetting van de BM, zoals (i) methoden om genexpressie te manipuleren (bijv. UAS / Gal4), (ii) mutanten en (iii) RNA-interferentie (RNAi) -lijnen. Ten slotte kunnen deze eiwitvallen worden gebruikt om de lokalisatie en functie van BM te visualiseren met behulp van live imaging⁵⁷.

De fusie van een fluorescerende tag tot een eiwit van belang kan echter interfereren met de lokalisatie en functies ervan. Het is dus van cruciaal belang om eventuele afwijkende effecten van de tag op het eiwit te evalueren. Een manier om ervoor te zorgen dat de toevoeging van een fluorescerende tag de functie en lokalisatie van BM-eiwitten niet verstoort, is door te bepalen of de transgene Drosophila-lijn homozygoot levensvatbaar is. Zowel de Vkg-GFP- als de Pcan-GFP-lijnen die worden gebruikt in de verschillende experimenten die hier en eerder zijn beschreven, zijn homozygoot levensvatbaar, wat aangeeft dat de toevoeging van een GFP-tag de functie van deze essentiële eiwitten niet verstoort^29,30.

Belang van weefselvoorbereiding, fixatie en kleuring voor beeldvorming
Om de FE efficiënt en nauwkeurig in beeld te brengen, is het van cruciaal belang om het eierstokweefsel goed voor te bereiden, te fixeren en te kleuren zoals voorgeschreven in deze methode. Verwijder eerst na dissectie zorgvuldig alle andere organen en vliegresten voordat ze worden gefixeerd. Het gebruik van paraformaldehyde (PFA) om weefsel te fixeren wordt aanbevolen, omdat het leidt tot heldere GFP-fluorescentie en compatibel is met de meeste antilichamen. PFA is echter mogelijk niet compatibel met alle antilichamen; sommige kunnen glutaaraldehyde of methanolfixatie vereisen. Bovendien, om achtergrondfluorescentie als gevolg van niet-specifieke binding van het primaire antilichaam te voorkomen, moet het eierstokweefsel gedurende ten minste 1 uur in blokoplossing worden geïncubeerd op een nutating platform rocker en meerdere keren uitgebreid worden gewassen na primaire en secundaire antilichaamincubatie zoals beschreven in het protocol. Ten slotte is een goede montage van het eierstokweefsel essentieel om een optimale beeldvorming te bereiken. Dit vereist een zorgvuldige scheiding van individuele eierkamers om te voorkomen dat ze op elkaar stapelen. Het is ook belangrijk om het montagemedium volledig te laten polymeriseren voordat het wordt afgebeeld om te voorkomen dat het weefsel onder de afdekkingslip zweeft. Hierdoor kunnen de montagemedia hun optimale reflecterende index bereiken, wat erg belangrijk is voor beeldvorming met superresolutie. Als u dit niet doet, heeft dit invloed op de beeldkwaliteit. Bovendien kunnen de voorbereide dia's tot 1 maand bij 4 °C worden bewaard, voordat de fluorescentie wordt geblust. Naast het meegeleverde protocol zijn er verschillende andere protocollen beschikbaar voor ovariële dissectie en kleuring 53,54,55.

Het gebruik van de juiste acquisitie- en verwerkingsparameters is van cruciaal belang voor optimale beeldvorming en om de lokalisatie van BM-eiwitten te beoordelen met behulp van confocale en superresolutiebeeldvorming
Zoals eerder beschreven, is het van cruciaal belang om de acquisitieparameters voor confocale en superresolutie beeldvorming goed in te stellen om optimale beelden van het specimen te verkrijgen. Voor beeldacquisitie moet de ROI zorgvuldig worden geselecteerd met behulp van de zoomfunctie en vervolgens de framegrootte en acquisitiesnelheid optimaal instellen. Bovendien is het, zoals geïllustreerd in figuur 2, van cruciaal belang om het laservermogen en de detectorwinst op de juiste manier aan te passen om intracellulaire handel te visualiseren zonder de detectoren te verzadigen. Deze parameters moeten zeer zorgvuldig worden ingesteld om onderbelichte of overbelichte afbeeldingen te voorkomen (figuur 2). Onderbelichte beelden zullen resulteren in beelden met een lage resolutie, waarbij de intracellulaire structuren moeilijk te visualiseren en te karakteriseren zullen zijn (figuur 2B). Overbelichte beelden als gevolg van de verzadiging van de detector leiden tot verkeerde interpretatie van gegevens en colocalisatieartefacten (figuur 2C). Als het doel is om de vesiculaire lokalisatie van endogene gelabelde BM-eiwitten te bepalen, verzadigt de fluorescentie van GFP-gelabelde eiwitten (bijv. Vkg-GFP en Pcan-GFP) in de basale BM de detector snel. Blaasjes met minder GFP-gelabelde BM-eiwitten zullen echter zwak lijken. Daarom is het belangrijk om de beeldgevoeligheid in te stellen met behulp van de BM-bevattende intracellulaire structuren (bijv. Blaasjes) en niet op de BM (figuur 2). Het selecteren van de grootte van het gaatje is ook erg belangrijk. Idealiter moet een pinhole-grootte van 1 AU voor elk kanaal worden geselecteerd voor afbeeldingen van de beste kwaliteit, vooral wanneer de resolutie in de z-as belangrijk is. De kleinere pinhole-grootte is optimaal voor dunnere optische secties. Wanneer echter geen optimale z-asresolutie vereist is of een z-stack niet wordt vastgelegd, kan de pinhole-grootte worden vergroot om fotobleaching te voorkomen. Bovendien kan voor zeer zwakke signalen het vergroten van de pinhole-grootte helpen vanwege een hogere signaal-ruisverhouding en het vastleggen van meer fotonen, wat helpt bij de interpretatie van gegevens.

Voor beeldvorming met superresolutie moet bijzondere aandacht worden besteed aan deconvolutieverwerking om te voorkomen dat onder- of overbewerkte beelden worden gegenereerd die slecht zijn opgelost, zoals geïllustreerd in figuur 3. Ten slotte, om een optimale 3D-reconstructie te bereiken, wordt het instellen van het beste interval dat door de software wordt bepaald, sterk aanbevolen. Een te groot interval tussen z-secties (d.w.z. hoger dan 0,5 μm) zal leiden tot slechte 3D-rendering en zal de daaropvolgende analyse van het fenotype beïnvloeden.

Voordeel van superresolutie ten opzichte van traditionele confocale microscopie bij beeldvorming van BM intracellulaire smokkel
Zoals geïllustreerd in de resultatensectie, hoewel de lokalisatie en distributie van BM-eiwitten nauwkeurig kan worden beoordeeld met behulp van confocale beeldvorming, genereert de beschreven superresolutiebenadering nauwkeurigere beeldvormingsgegevens met een significante toename van de resolutie van intracellulaire structuren die BM-eiwitten bevatten, evenals een verbeterde signaal-ruisverhouding. Bovendien is deze superresolutiemicroscopietechniek relatief eenvoudig te gebruiken. Aangezien beeldvorming met superresolutie de resolutie aanzienlijk verhoogt in vergelijking met confocale microscopie, tot 120 nm in de x- en y-as en 350 nm in de z-as, zal deze benadering een grote invloed hebben op ons begrip van de gepolariseerde afzetting van BM door de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in epitheelcellen zoals de FCs nauwkeuriger te karakteriseren.

Bovendien zijn een andere benadering van beeldvorming met superresolutie (Structured Illumination Microscopy, SIM) en het gebruik van deconvolutie-algoritmen die zijn ontworpen voor confocale microscopie met puntscanning (d.w.z. Nikon's softwaremodule met verbeterde resolutie) eerder gebruikt om de rol van factoren die betrokken zijn bij BM-depositie²⁹ te karakteriseren. De verhoogde resolutie in verband met deze technieken heeft ons inzicht gegeven in ons begrip van de intracellulaire handel in BM-eiwitten en de organisatie van de BM. Deze benaderingen vertonen echter enkele beperkingen in vergelijking met Airyscan-microscopie. SIM is bijvoorbeeld niet erg efficiënt in het verkrijgen van optimale beelden bij het verkrijgen van optische z-secties diep in het weefsel. Dit maakt SIM moeilijk te gebruiken bij het screenen op nieuwe componenten die betrokken zijn bij BM-depositie. Bovendien bereikt het gebruik van deconvolutie-algoritmen die worden toegepast op confocale afbeeldingen niet hetzelfde niveau van superresolutie. Over het algemeen is Airyscan superresolutie beeldvorming op vast weefsel een krachtige en superieure benadering om BM intracellulaire handel en afzetting te bestuderen.

Echter, zoals met elke andere superresolutie microscopie, zijn er ook een paar ongemakken verbonden aan deze aanpak en moeten ze in aanmerking worden genomen bij het fotograferen. Ten eerste vereist de superresolutiemodus meestal een langere acquisitietijd van het monster dan de confocale modus. De acquisitieparameters en de interesseregio moeten dus zorgvuldig worden ingesteld om fotobleaching van het monster te minimaliseren. Bovendien zijn afbeeldingsbestanden die worden gegenereerd door microscopie met superresolutie veel groter dan bestanden die zijn gegenereerd door confocale microscopie en hebben ze mogelijk gespecialiseerde computers of servers nodig voor beeldverwerking en opslag.

Ten slotte is live beeldvorming van de BM-eiwitten tijdens Drosophila oogenese gebruikt om nieuwe factoren te karakteriseren die betrokken zijn bij BM-polariteit⁵⁷. Deze aanpak heeft echter beperkingen, met name in de resolutie van intracellulaire structuren tijdens bm-eiwithandel. Superresolutiemicroscopie is een krachtige benadering om te gebruiken in combinatie met live beeldvorming om de rollen van geïdentificeerde factoren in de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten nauwkeurig te bepalen.

Andere toepassingen van deze methode om de lokalisatie van intracellulaire componenten gewijd aan vesiculaire handel te bestuderen met behulp van endogene gelabelde eiwitten en beeldvorming met superresolutie
De oprichting en het onderhoud van weefsels en organen tijdens de ontwikkeling en in een volwassen organisme zijn gedeeltelijk afhankelijk van cel-tot-cel signalering en cellulaire spanning en adhesie. Deze processen zijn afhankelijk van intracellulaire handel, endocytose, exocytose en secretie van specifieke eiwitten. De hierin beschreven methoden om de intracellulaire handel in BM te ontcijferen met behulp van endogene gelabelde eiwitten en confocale en superresolutiemicroscopie kunnen dus gemakkelijk worden aangepast om elk proces te bestuderen. Bovendien maakt het gebruiksgemak van CRISPR/Cas9-gemedieerde genetische bewerking om endogene gelabelde eiwitten te genereren deze aanpak nog veelzijdiger en krachtiger⁵⁸.

Concluderend hebben we methoden beschreven voor de bereiding en beeldvorming van BM-eiwitten in de FE van de Drosophila-eierstok met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie. Deze protocollen kunnen worden toegepast voor high-throughput screening om nieuwe componenten te identificeren die zijn gewijd aan de juiste plaatsing van BM-eiwitten. Ten slotte heeft het gebruik van deze methodologie het potentieel om een belangrijke bijdrage te leveren aan ons begrip van hoe epitheelcellen de gepolariseerde secretie van BM-eiwitten beheersen, een belangrijk proces bij het vaststellen en onderhouden van epitheliale architectuur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing