Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Konfokal og superopløsningsbilleddannelse af polariseret intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner under Drosophila oogenese

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63778
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

Summary

Kældermembranen er afgørende for vævs- og organmorfogenese under udvikling. For bedre at forstå de mekanismer, der fører til korrekt placering af denne struktur, beskriver den præsenterede protokol metoder til at visualisere og karakterisere intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner i epitelceller ved hjælp af konfokal og superopløsningsmikroskopi.

Abstract

Kældermembranen (BM) - et specialiseret ark ekstracellulær matrix til stede på den basale side af epitelceller - er afgørende for etablering og vedligeholdelse af epitelvævsmorfologi og organmorfogenese. Desuden er BM afgørende for vævsmodellering, der fungerer som en signalplatform og giver eksterne kræfter til at forme væv og organer. På trods af de mange vigtige roller, som BM spiller under normal udvikling og patologiske tilstande, er de biologiske veje, der styrer den intracellulære handel med BM-holdige vesikler, og hvordan basal sekretion fører til polariseret aflejring af BM-proteiner, dårligt forstået. Drosophila-æggestokkens follikulære epitel er et fremragende modelsystem til at studere den basale aflejring af BM-membranproteiner, da det producerer og udskiller alle hovedkomponenter i BM. Konfokal og superopløsningsbilleddannelse kombineret med billedbehandling i faste væv muliggør identifikation og karakterisering af cellulære faktorer, der specifikt er involveret i intracellulær handel og aflejring af BM-proteiner. Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol til farvning og billeddannelse af BM-holdige vesikler og deponeret BM ved hjælp af endogent mærkede proteiner i follikulært epitel i Drosophila-æggestokken . Denne protokol kan anvendes til at løse både kvalitative og kvantitative spørgsmål, og den blev udviklet til at imødekomme screening med høj kapacitet, hvilket muliggør hurtig og effektiv identifikation af faktorer involveret i polariseret intracellulær handel og udskillelse af vesikler under epitelvævsudvikling.

Introduction

Kældermembranen (BM) er et tyndt ark af lagdelt celleadhærent ekstracellulær matrix (ECM), der er kritisk for epitelstruktur og morfogenese1. Det består af ~ 50 proteiner og findes allestedsnærværende underliggende epitel- og endotelcellerne og indhyller skelet-, glatte- og hjertemuskelceller og adipocytter 1,2,3. De tre hovedkomponenter i BM på den basale side af epitelcellerne er kollagen IV, perlecan og lamininer. BM ligger til grund for epitelcellerne og er ansvarlig for mange funktioner, herunder vævsseparation og barriere, vækst og støtte og cellepolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dens rolle som signalplatform regulerer morfologien og differentieringen af epitelceller og væv under udvikling 3,13,14. Desuden er misregulering af BM og / eller et brud på dets integritet de primære årsager til mange patologiske tilstande, herunder tumormetastase 2,15,16. På trods af de væsentlige funktioner, der udføres af BM under vævs- og organmorfogenese, er komponenterne i den biologiske vej (er) dedikeret til polariseret intracellulær handel og sekretion af BM-proteiner vagt kendt.

For at studere den intracellulære handel med BM-holdige vesikler og udskillelsen af BM-proteiner af epitelceller er follikulært epitel (FE) i Drosophila-æggestokken et kraftfuldt modelsystem (figur 1). En Drosophila æggestok består af 16-20 lange, rørlignende strukturer, kaldet ovarioler (figur 1A,B)17,18,19. Hver ovariole kan betragtes som et æg samlebånd, med alder progression af ægkamre (som hver giver anledning til et æg), der begynder i den forreste ende og bevæger sig bagud, indtil det modne æg går ud gennem ovidukten. Hvert ægkammer er indkapslet af FE, et monolag af somatiske follikelceller (FC'er), der omgiver de centrale kimlinjeceller (GC'er). FE er stærkt polariseret med en tydelig apikal-basal polaritet, hvor det apikale domæne vender mod kimlinjen, og BM-proteinerne udskilles basalt 18,19. FCs udskiller aktivt alle de vigtigste komponenter i BM, herunder Collagen IV, Perlecan og Laminins20,21. I epitelceller såsom FC'er produceres BM-komponenterne og kræver en specialiseret polariseret sekretionsvej til deres aflejring ekstracellulært. For eksempel i tilfælde af den mest rigelige komponent i BM, Collagen IV (Coll IV), er detaljerne omkring dens polariserede intracellulære handel og sekretion vage på trods af at dens produktion og aflejring er fokus for mange undersøgelser. Coll IV oversættes i det endoplasmatiske retikulum (ER), hvilket også er hvor hver fibril - sammensat af tre polypeptider (to α1-kæder og en α2-kæde) - samles i en tredobbelt helix22. Korrekt Coll IV-foldning og funktion kræver ER-chaperoner og enzymer, herunder lysyl- og prolylhydroxylaser såsom Plod og PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Disse posttranslationelle enzymer regulerer ER-sorteringen af Coll IV, da tabet af hver forårsager, at Coll IV bliver fanget i basal ER 20,23,24,25,26. Derefter forlader nyligt syntetiseret Coll IV ER for Golgi i COPII-belagte vesikler. Lastreceptoren Tango1 hjælper med at pakke kollagener i betydelige Golgi-bundne vesikler, der kan rumme store multimere proteiner20,27. Når Coll IV er pakket i intracellulære eksocytiske vesikler, udskilles det specifikt basalt fra epitelceller. For at lede BM-aflejring til basalsiden kræver epitelceller et andet sæt faktorer, der specifikt er dedikeret til polariseret BM-sekretion. Ved hjælp af FE af Drosophila æggestokken er nogle få komponenter i denne nye cellulære proces blevet karakteriseret, herunder nukleotidudvekslingsfaktorerne (GEFs) Crag og Stratum, GTPaserne Rab8 og Rab10 samt niveauerne af phosphoinositide PI (4,5) P2 og Kinesin 1 og 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Disse komponenter er afgørende for at sikre den polariserede fordeling af BM-proteiner.

For at overvåge den intracellulære lokalisering af BM-proteiner i FE kan endogent mærkede kældermembranproteiner (proteinfælder), såsom Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) og Perlecan-GFP (Pcan-GFP) anvendes32,33. Disse proteinfældelinjer har vist sig nøjagtigt at afspejle den endogene fordeling af BM-proteiner og muliggøre mere følsom påvisning af vesikulær handel28,30. Komponenterne involveret i den polariserede aflejring af BM i FE blev først karakteriseret ved hjælp af proteinfældelinjer til Vkg-GFP og Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfælder kan bruges i forskellige genetiske baggrunde, herunder mutanter og Gal4 linjer34. Desuden kan proteinfælder anvendes i kombination med fluorescerende farvestoffer og/eller fluorescensimmunopstaining, hvilket muliggør præcis karakterisering af lokaliseringen af BM-proteiner, når man sammenligner vildtype og mutantbetingelser35.

For nøjagtigt og effektivt at vurdere distributionen og lokaliseringen af BM-proteinholdige vesikler udgør konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) og billeddannelsesteknikker med superopløsning en betydelig fordel for andre billeddannelsesmetoder. Disse tilgange kobler billedbehandling i høj opløsning med relativ brugervenlighed. CLSM er en mikroskopiteknik, der giver mulighed for en forbedret optisk opløsning ved at scanne prøven med en laser på en rasterscannings måde ved hjælp af galvanometre. Pinhole blænden er en kernekomponent i et konfokalt mikroskop. Ved at blokere de ude af fokussignaler, der kommer ovenfra eller under brændplanet, resulterer pinhole-blænden i en meget overlegen opløsning i z-aksen36. Dette gør det også muligt at opnå en række billeder i z-planet, kaldet en z-stak, svarende til en række optiske sektioner. z-stacks skaber efterfølgende et 3D-billede af prøven via 3D-rekonstruktion ved hjælp af billedbehandlingssoftware. Konventionelle epifluorescensmikroskoper (widefield), i modsætning til konfokale mikroskoper, tillader lys uden for fokus at bidrage til billedkvalitet, faldende billedopløsning og kontrast36,37. Dette gør epifluorescensmikroskopi til en mindre attraktiv kandidat, når man studerer proteinlokalisering eller kolonisering.

Selvom CLSM er en passende tilgang til forskellige applikationer, herunder billeddannelse og karakterisering af den intracellulære handel med BM-proteiner, udgør det stadig et problem, når der afbildes prøver under Abbes diffraktionsgrænse for lys (200-250 nm). Ved billeddannelse af sådanne prøver kan konfokal mikroskopi, især ved brug af et oliemål, resultere i høj opløsning. Superopløsningsteknikker overstiger imidlertid grænsen for konfokal mikroskopi. Der er forskellige tilgange til at opnå superopløsningsmikroskopi, hver med specifikke opløsningsgrænser, og hver passende til forskellige analyser. Disse tilgange omfatter fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi (STED), struktureret belysningsmikroskopi (SIM) og Airyscan (superopløsning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Selvom Airyscan har en grovere opløsning end PALM/STORM, STED og SIM, kan den stadig opnå en opløsning på op til ~120 nm (ca. det dobbelte af CLSM's opløsning). Desuden har denne superopløsningsmikroskopimetode vist sig at have en fordel i forhold til SIM og andre superopløsningsteknikker ved billeddannelse af tykke prøver og prøver med et lavt signal/støj-forhold 47,48.

Airyscan er en relativt ny superopløsning konfokal mikroskopiteknologi46. I modsætning til traditionelle CLSM'er, der bruger pinhole- og enkeltpunktsdetektorer til at afvise lys, der er ude af fokus, bruger denne superopløsningsmetode en 32-kanals galliumarsenidphosphid (GaAsP) fotomultiplierrørområdedetektor, der samler alt lyset ved hver scanningsposition45. Hver af de 32 detektorer fungerer som et lille pinhole, hvilket reducerer pinhole-størrelsen fra den traditionelle 1.0 Airy Unit (A.U.) til en forbedret 0.2 A.U., hvilket muliggør en endnu højere opløsning og signal-støj-forhold, samtidig med at effektiviteten af en 1.25 A.U. diameter45 opretholdes. Desuden resulterer den lineære dekonvolution, der anvendes af Airyscan, i op til en 2x stigning i opløsning45. Under hensyntagen til dette er CLSM, og specifikt superopløsningsmikroskopi, velegnet til at studere BM-proteiner og proteiner, der regulerer den basale aflejring af BM-proteiner, da de kan producere billeder i meget høj opløsning til lokaliserings- og koloniseringsundersøgelser og derved give ny indsigt i de rumlige, tidsmæssige og molekylære begivenheder, der styrer disse processer.

En alternativ tilgang til konfokal mikroskopi, der kan bruges til at udføre lokaliseringseksperimenter, er billeddekonvolution. Da widefield-mikroskopi gør det muligt for lys, der ikke er i fokus, at nå detektorerne, kan matematiske og beregningsmæssige dekonvolutionsalgoritmer anvendes til at fjerne eller omfordele lys uden for fokus fra billeder opnået ved widefield-mikroskopi og derved forbedre billedets opløsning og kontrast49. Dekonvolutionsalgoritmer kan også anvendes på konfokale billeder for yderligere at øge opløsning og kontrast, hvilket producerer endelige billeder, der næsten kan sammenlignes med superopløsningsmikroskopi50. Airyscan gør brug af Weiner filterbaseret dekonvolution sammen med Sheppards pixelomplacering, hvilket resulterer i en stærkt forbedret rumlig opløsning og signal-støj-forhold. Sammenlignet med konfokal mikroskopi observeres en stigning på 2x i opløsning i alle tre rumlige dimensioner (120 nm i x og y og 350 nm i z) ved anvendelse af denne superopløsningsmikroskopiteknik45,51.

Dette manuskript giver detaljerede og optimerede protokoller til at plette, erhverve og visualisere den intracellulære handel og aflejring af BM-proteiner ved hjælp af FE af Drosophila-æggestokken som et modelsystem kombineret med konfokal og superopløsningsmikroskopi. Drosophila-linjer , der udtrykker endogent mærkede kældermembranproteiner, fx Vkg-GFP og Pcan-GFP, er effektive og nøjagtige værktøjer til at visualisere BM-proteinhandel og sekretion. Derudover kan de let bruges i forskellige genetiske baggrunde, herunder mutant og Gal4 / UAS linjer34. Selvom endogent mærkede kældermembranproteiner anbefales, er brugen af antistoffer mod specifikke BM-proteiner også kompatibel med de beskrevne protokoller. Disse protokoller er især nyttige for forskere, der er interesserede i at studere intracellulær handel og udskillelsen af BM-proteiner i intakt epitelvæv ved hjælp af konfokal og superopløsningsbilleddannelse. Desuden gør evnen til at kombinere epitelvævsanalyse med de ekspansive værktøjer i Drosophila genetik denne tilgang særlig kraftfuld. Endelig kunne disse protokoller let tilpasses til at studere vesikulær handel og sortering af andre proteiner af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Flyv forberedelse til æggestokkens dissektioner

  1. Sæt 10-15 Drosophila melanogaster hunfluer (1-2 dage gamle) af den ønskede genotype i et smalt hætteglas indeholdende ~ 8 ml Drosophila fluesmedium drysset med en lille mængde granuleret bagergær 2-3 dage før dissektion ved 25 ° C. Tilføjelse af et par hanner til hætteglasset kan øge ægkammerets udbytte. Sørg dog for, at det samlede antal fluer ikke overstiger 20, da dette kan påvirke æggestokkenes udvikling negativt.
    BEMÆRK: Beskrivelse af Drosophila mænd og kvinder, og nyttige tips og råd til forskere uden forudgående Drosophila erfaring kan findes i de citerede artikler34,52. Tilsætning af gær vil stimulere ægproduktionen og generere æggestokke med forskellige stadier repræsenteret. Desuden vil det også opfedre æggestokkene og gøre dem lettere at punktafgifter. Våd gær kan også bruges i stedet for granuleret gær, men for svagere lagre kan fluerne sidde fast og dø.

2. Ovariedissektion og fiksering

BEMÆRK: For yderligere ressourcer om dissektion og farvning af æggestokke henvises læserne til de citerede protokoller 53,54,55.

  1. På dissektionsdagen fremstilles frisk fikseringsopløsning med en slutkoncentration på 4% paraformaldehyd (PFA) ved fortynding af PFA-stamopløsningen i 1x phosphatbuffersalin (PBS).
  2. Bedøv fluerne ved hjælp af CO2 og læg dem på en fluepude. Hold fluerne bedøvet indtil dissektion. Overvej fluer korrekt bedøvet, når deres bevægelser er ophørt, hvilket normalt tager 10-20 s.
    BEMÆRK: Selvom det anbefales at bruge CO2 som en sikrere og hurtigere mulighed, kan fluer bedøves ved hjælp af is.
  3. Placer et glaskonkavt dias eller farvningsskål med lavtryksbrønde under et dissekeringsmikroskop og fyld brøndene med 1x PBS.
  4. Tag fat i en hunflue ved den nederste brystkasse ved hjælp af et par tang. Sørg for fluernes køn ved fravær af mandlige kønsorganer i den bageste ende af maven og fraværet af kønskamme på deres forben som en sekundær egenskab52. Disseker fluer individuelt ved hjælp af et andet par tang (trin 2.5), mens de nedsænkes i brønde fyldt med 1x PBS under dissekeringsmikroskopet (20x forstørrelse anbefales).
  5. Mens du kigger gennem dissekeringsmikroskopet, skal du bruge et andet par tang til at trække i den bageste del af flyveunderlivet, hvilket gør de indre organer (f.eks. Æggestokke, tarm) synlige.
  6. Klem forsigtigt den forreste del af flyvemaven (som med et rør tandpasta) for at tvinge æggestokkene ud af maven. Denne metode skal holde æggestokkene intakte. Fjern og fjern forsigtigt andre organer og flyve snavs.
  7. Brug pincet eller dissekeringsnåle til at adskille æggestokkens ovarioler, mens du holder den overordnede ovariestruktur intakt. Formålet med dette trin er at bryde muskelkappen, der dækker æggestokkene og give mulighed for en mere effektiv og homogen farvning.
  8. Overfør hurtigt æggestokkene til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1x PBS og hold røret på is, indtil alle fluerne er dissekeret. Opbevar ikke røret på is, hvis mikrotubuli eller mikrofilamenter (eller vesikler, der handles af disse cytoskeletale komponenter) skal visualiseres, da dette kan forårsage depolymerisering.
  9. Når alle æggestokkene er dissekeret og overført til et mikrocentrifugerør, skal du lade dem synke til bunden af røret og fjerne alle undtagen ~ 50 μL af PBS. Tilsæt 1 ml 4% PFA og læg den på en nøddeplatform vippe i 15 min. Det er vigtigt at kontrollere, om æggestokkene bevæger sig frem og tilbage i fikseringsløsningen for at muliggøre korrekt fiksering, da ufuldstændig fiksering kan føre til farvnings- og billeddannelsesproblemer.
    BEMÆRK: Møtrikkens hastighed er ikke afgørende. Mens nogle nøddeapparater har en hastighedskontrol, kommer andre med en forudindstillet hastighed. Den forudindstillede hastighed er tilstrækkelig, og hvis den kan justeres, indstilles den til 40-50 o / min.
  10. Fikseringsopløsningen fjernes (som i trin 2.9), og der udføres derefter to hurtige vaske med 1 ml 1x PBS indeholdende 0,1% Triton-X 100 (1x PBST) ved forsigtigt at invertere mikrofugerørene 5-6 gange. Fortsæt derefter med fire 10-15 minutters vask (lang vask) med 1 ml 1x PBST (40-60 minutter i alt).
    BEMÆRK: Det anbefales at bruge 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 til vask, da øget procentdel af vaskemiddel kan resultere i GFP-denaturering, hvilket fører til nedsat fluorescens og påvisning af GFP-mærkede BM-proteiner.
  11. For farvning af farvestof, f.eks. DNA- og F-actinfarvning, fortsæt til trin 3. For immunstaining, fortsæt til trin 4. Æggestokkene kan opbevares i 1x PBST ved 4 °C i op til 24 timer, før de fortsætter.

3. Standard DNA / F-Actin farvning

  1. Efter fiksering og vask fjernes PBST. Tilsæt 500 μL DNA og F-Actin farvningsopløsning. For at forberede DNA/F-Actin-opløsningen blandes Hoechst (DNA-plet; 1:1000 fortynding af 1 mg/ml stamopløsning) og fluorophore-mærket phalloidin (F-actin-plet; 1:500 fortynding for Alexa Fluor 546 eller 1:100 fortynding for Alexa Fluor 647, hver af 66 μM stamopløsning) i 500 μL PBST.
  2. Dæk rørene med aluminiumsfolie for at holde æggestokkene og farvestofferne i mørke for at opretholde fluorescensen til effektiv billeddannelse og inkubere på en nutating platform vippe i 15 minutter.
  3. Efter inkubation fjernes DNA/F-Actin-opløsningen (som i trin 2.9). Udfør to hurtige vaske og tre lange (10-15 min) vaske i 1x PBST som beskrevet i trin 2.10. Fortsæt til montering som beskrevet i trin 5.

4. Fluorescens immunstaining

BEMÆRK: Dette er en standard immunstaining protokol til fluorescerende billeddannelse og er kompatibel med de fleste primære antistoffer.

  1. Blokering og primær antistof immunstaining (dag 1)
    1. Efter fiksering og vask fjernes PBST som beskrevet i trin 2.9. Tilsæt 1 ml blokeringsopløsning (PBS + 5% BSA) og bloker æggestokkene på en nutating platform vippe i mindst 1 time.
      BEMÆRK: Ud over BSA kan føtalt bovint serum (FBS) eller normalt gedeserum (NGS) tilsættes til blokeringsopløsningen. Alternativt kan æggestokkene blokeres natten over på en nøddeplatform vippe ved 4 °C.
    2. Blokeringsopløsningen fjernes som i trin 2.9, og der tilsættes 300 μL primær antistofopløsning indeholdende primære antistoffer fortyndet i deres passende koncentrationer (specifikke for det anvendte antistof) i blokeringsopløsningen. Inkuberes natten over på en nutating platform vippe ved 4 °C. Den næste dag skal du fjerne den primære antistofopløsning og fortsætte til sekundær antistofimmunostaining.
      BEMÆRK: Nogle primære antistoffer kan gemmes og genbruges. I nogle tilfælde kan genbrugte primære antistoffer reducere baggrundsfarvning, hvilket resulterer i bedre billeddannelse. Genbrug bør dog testes for hvert antistof for at sikre effektivitet.
  2. Sekundær antistof immunstaining (dag 2)
    1. Når den primære antistofopløsning er fjernet, udføres to hurtige vaske og fire lange (10-15 min)vaske som i trin 2.10. Omhyggeligt udførte gentagne vaske ved hjælp af frisk 1x PBST vil reducere uspecifik baggrund og føre til optimal billeddannelse.
    2. PBST fjernes som i trin 2.9, og der tilsættes 500 μL sekundær antistofopløsning indeholdende fluorescerende sekundære antistoffer, som detekterer de primære antistoffer, der anvendes. Beskyt røret mod lys ved at dække det i aluminiumsfolie fra dette tidspunkt for optimal bevarelse af fluorescens, hvilket er afgørende for billedoptagelse og analyse.
      BEMÆRK: Den sekundære antistofopløsning skal indeholde sekundære antistoffer konjugeret med fluorophorer, der ikke overlapper med endogent mærkede proteiner. For eksempel, hvis du bruger GFP-mærkede proteiner, anbefales det at bruge Alexa Fluor sekundære antistoffer ved røde eller langt røde bølgelængder (f.eks. 546, 568 eller 647 nm). Fluorescerende farvestoffer, såsom Hoechst og Alexa Fluor 546 eller 647 konjugeret phalloidin, kan tilsættes til den sekundære opløsning. Disse pletter kan være nyttige til at markere den overordnede cellestruktur (dvs. kerner og F-Actin). Se trin 3.1 for koncentrationerne.
    3. Inkuber æggestokkene i den sekundære antistofopløsning på en nutating platform vippe i 2 timer ved stuetemperatur. Udfør to hurtige vaske og fire lange (10-15 min) vaske i 1x PBST som i trin 2.10. Fortsæt til montering som i trin 5.

5. Montering af farvede æggestokke

BEMÆRK: Denne metode fungerer meget godt, hvis æggestokkene er veludviklede og rigelige. Omhyggelig montering af æggestokkene på diaset er afgørende for optimal billeddannelse.

  1. Efter den sidste vask skal du bruge en p1000 pipette til forsigtigt at pipettere æggestokkene op og ned i røret for at adskille ægkamrene. Lad ægkamrene synke til bunds ved at holde røret i opretstående stilling i 5-10 min. Omhyggelig adskillelse af individuelle ægkamre er afgørende for at opnå optimal billedoptagelse.
  2. Fjern PBST ved hjælp af et Pasteur-pipette, og efterlad ~50 μL. Fjern så meget af den resterende PBST som muligt ved hjælp af en p200-pipette. Tilsæt to dråber monteringsmedium, nok til at fordele jævnt på en 22 mm x 22 mm dækslip. Æggestokke kan opbevares i monteringsmedium i mikrocentrifugerør ved 4 °C i op til 1 måned før montering.
    BEMÆRK: Flere forskellige monteringsmedier er tilgængelige kommercielt; Brug af hårdt indstillede monteringsmidler, såsom Aqua-Poly / Mount eller ProLong Glass Antifade Mountant, anbefales for at opnå optimale billeddannelsesforhold. Brugen af glycerol som monteringsmedium frarådes, da det kan føre til dårlige billeddannelsesforhold (f.eks. Fluorophore ustabilitet). Til montering af medier, der ikke polymeriserer, forsegles dækslen ved hjælp af et dækslipforseglingsmiddel / neglelak for at fastgøre det på plads.
  3. Mærk et glasglas, og tør det af med blødt, støvfrit papir for at fjerne støv og fingeraftryk. Skær enden af en p200 pipettespids af for at gøre det nemt at overføre det viskøse monteringsmedium til diaset fra mikrocentrifugerøret. Derefter overføres langsomt alle ægkamrene i monteringsmediet til glasglasset, hvilket sikrer, at der ikke dannes bobler.
  4. Under et dissekeringsmikroskop spredes forsigtigt monteringsmediet og adskilte ægkamre ved hjælp af en ny p200-spids eller tang for at dække et område, der er omtrent på størrelse med dækslippen.
  5. Brug pincet til forsigtigt at placere dækslippen (rengøres med støvfrit papir) på ægkamrene i en vinkel for at undgå bobler.
  6. Opbevar diaset ved stuetemperatur på en plan overflade i mørke i 2 dage for at polymerisere. Når monteringsmediet er hærdet, kan diaset opbevares ved 4 ° C i mørke i et par uger til billeddannelse.
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at monteringsmediet med hård indstilling polymeriserer før billeddannelse. Hvis mediet endnu ikke er polymeriseret, vil æggestokkene flyde under dækslippen, hvilket påvirker billedoptagelsen. Desuden opnås det optimale reflekterende indeks for monteringsmedier først, når det er helt indstillet (se producentens oplysninger for detaljer).
  7. Alternativ monteringsmetode: Denne metode anbefales til at reducere vævstab, hvis æggestokke ikke er rigelige. I denne metode (beskrevet nedenfor) adskilles ovariolerne og ægkamrene på diaset under montering i stedet for at adskille dem i et mikrocentrifugerør ved pipettering som beskrevet i trin 5.1.
    1. Efter den sidste vask fjernes alle undtagen ~ 100 μL af vaskeopløsningen. Brug en Pasteur-pipette eller p1000-pipette til at overføre de intakte æggestokke i PBS til diaset. Brug en p200-pipette til forsigtigt at fjerne så meget PBST fra diaset som muligt. Brug et støvfrit papir til at tørre PBST'en af, hvis det er nødvendigt. Rør ikke æggestokkene.
    2. Tilsæt to dråber monteringsmedier. Adskil forsigtigt ovariolerne og ægkamrene ved hjælp af pincet eller dissekeringsnåle. Fjern og kassér fremmed væv, og spred derefter ægkamrene og ovariolerne i monteringsmediet. Fortsæt til trin 5.5-5.6.

6. Konfokal billedoptagelse

BEMÆRK: Dette afsnit indeholder nøgleparametre for at opnå optimal billedoptagelse ved hjælp af ethvert konfokalt mikroskop (figur 2).

  1. Sæt mikroskopet op, og find prøven som beskrevet nedenfor.
    1. Før billeddannelse er det afgørende at lokalisere interesseområdet (ROI) ved hjælp af fluorescensmikroskopets okular. Brug et lavt forstørrelsesmål (20x) eller det mål, der skal bruges til billedoptagelse (dvs. 40x eller 63x). Vælg et ægkammer til billede.
      BEMÆRK: Til billedoptagelse anbefales det at bruge høje forstørrelsesmål som 40x eller 63x (se 6.2.1).
    2. Når ROI er valgt, skal du fortsætte til billedoptagelse; fortsæt til trin 6.2 for konfokal billeddannelse og trin 7 for billeddannelse i superopløsning.
  2. Vælg nøgleparametrene for optimal billedoptagelse som beskrevet nedenfor (eksempler på nøgleparametre for de repræsentative billeder er angivet i tabel 1).
    1. Valg af et mål: Til konfokal billedoptagelse af intracellulær handel og sekretion af BM-proteiner i FE skal du bruge et 40x eller 63x mål.
      BEMÆRK: For at opnå den bedst mulige opløsning anbefales det stærkt at bruge Plan-Apochromat-mål med høj numerisk blænde (NA), der giver den højeste akromatiske korrektion.
    2. Valg af lasere for hver kanal/spor: For GFP skal du bruge laser 488 nm; for DAPI eller Hoechst, brug laser 405 nm; til Alexa Fluor 546 eller 568, brug laser 561 nm; og til Alexa Fluor 647 skal du bruge laser 640 nm.
      BEMÆRK: Hvert laservalg vil resultere i en anden kanal/ spordannelse. Her refererer udtrykket kanal til billedet dannet af den registrerede intensitetsfordeling for exciterede fluorophorer for den valgte ROI ved den specifikke bølgelængde for hver kanal.
    3. Pinhole-indstilling: For at reducere lys, der ikke er i fokus under billedoptagelse, skal du indstille pinhole for hver kanal til 1 AU.
    4. Indstillinger for laserintensitet og detektorforstærkning: For at finjustere billedfølsomheden skal du bruge både detektormasterforstærkningen og laserkraften. For at indstille billedfølsomheden korrekt anbefales en rækkeviddeindikator. Indstil både masterforstærkningen og lasereffekten til at have en korrekt følsomhed, hvor de interessante strukturer (f.eks. BM-holdige vesikler) er tydeligt synlige, samtidig med at detektormætning undgås.
      BEMÆRK: For at undgå fotobleaching skal du bruge den minimale lasereffekt, der er nødvendig. Det anbefales at øge detektorforstærkningen først, mens du bruger den lavest mulige lasereffekt. Hvis en stigning i detektorforstærkningen ikke kan opnå den ønskede intensitet, skal du øge lasereffekten. Lasereffektintensitet mellem 0,5% -1,2% anbefales.
    5. Rammestørrelse: Det anbefales at bruge den optimale billedstørrelse bestemt af anskaffelsessoftwaren. Til de fleste applikationer skal du bruge en maksimal opløsning på 1024 x 1024. Højere opløsning vil øge anskaffelsestiden betydeligt.
    6. Scanningshastighed: Brug en scanningshastighed mellem 6-9, hvilket er sikkert for de fleste prøver. Hvis prøven er støjende, skal du bruge en langsommere scanningshastighed til at forbedre signal/støj-forholdet. Lave scanningshastigheder øger dog fotoblegnings- og anskaffelsestiden.
    7. Gennemsnitlig intensitetsgennemsnit: For at forbedre billedkvaliteten skal du bruge gennemsnitlig intensitet i gennemsnit via successive scanninger med identiske indstillinger. I de fleste tilfælde skal du bruge et gennemsnit på to for at forbedre signal-støj-forholdet uden at fotobleaching prøven.
    8. Zoom: Juster scanningsområdet ved hjælp af zoomfunktionen. Brug en zoom mellem 2x-4x med både 40x og 63x mål som den mest effektive værdi til klart at visualisere BM-holdige vesikler i FE. Vælg omhyggeligt det minimale investeringsafkast for at reducere anskaffelsestiden.
  3. For at erhverve en z-stack ved hjælp af Zeiss Zen-software skal du bruge følgende Z-sektioneringsparametre og indstille dem som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Vesikler og andre intracellulære strukturer indeholdende BM-proteiner er 3-dimensionelle (3D) strukturer. Anskaffelse af en z-stack gennem FE vil forbedre billedkvaliteten og opløsningen betydeligt. Normalt er et interval, der spænder over vævets tykkelse / dybde, tilstrækkeligt til effektivt at visualisere intracellulær lokalisering. For optimal 3D-rekonstruktion anbefales det at bruge det optimale interval, der bestemmes af softwaren. For 40x og 63x mål skal du undgå intervaller højere end 0,5 μm mellem hver z-sektion for at muliggøre optimal 3D-rekonstruktion.
    1. Klik på afkrydsningsfeltet z-Stack i hovedområdet under fanen Anskaffelse . Vælg scanningstilstanden Alle spor pr. udsnit for z-stakken. Dette vil resultere i en ændring i kanalspor for hvert z-positions udsnit.
    2. Vælg den ønskede kanal for at observere prøven, og klik på Live for at starte en live scanning. Brug af den kanal, der er nødvendig for at detektere det GFP-mærkede BM-protein, anbefales.
    3. Angiv et interval for z-stakken som beskrevet. Brug finjusteringsknappen på mikroskopet til at finde z-placeringen for den ene ende af prøven og klikke på Indstil først. På samme måde skal du finde z-placeringen for den anden ende af prøven og klikke på Sæt sidst.
    4. For hver placering i z-stakken skal du klikke på hver kanal separat med den valgte afstandsindikator og justere laserens intensitet og masterforstærkningen efter behov som beskrevet i trin 6.2.4.
    5. Indstil intervallet for z-stakken for at tildele trinstørrelsen som anbefalet i NOTE nedenfor trin 6.3. Klik på Start eksperiment for at starte z-stack erhvervelse.

7. Billedoptagelse i superopløsning

  1. Vælg en Airyscan-kompatibel målsætning. For at visualisere den intracellulære lokalisering af BM-protein er brugen af et 63x oliemål optimal (figur 3). Sæt målet til 63x, og læg forsigtigt en dråbe nedsænkningsolie på linsen. Placer diaset på målet med dækslip vendt mod målet for at lokalisere prøven.
  2. Vælg en konfiguration med passende indstillinger for fluoroforen til billedet som beskrevet nedenfor.
    1. Klik på knappen Smart opsætning på fanen Anskaffelse for at konfigurere et nyt eksperiment. Vælg Airyscan (superopløsning); når dette er valgt, kræves der et yderligere valg mellem Opløsning (Airyscan SR), SNR/følsomhed (Airyscan Confocal) og Hastighed (Multiplex SR-2Y). For fast væv skal du vælge Opløsning , da det vil resultere i den bedste erhvervelse.
    2. Klik på + i feltet Konfigurer dit eksperiment for at tilføje spor/kanaler. Vælg sporene til specifikke farvestoffer fra Farvestofdatabasen. For et flerkanalseksperiment skal du tilføje hvert spor efter behov ved at vælge de relevante farvestoffer.
    3. Når alle sporene er tilføjet, skal du vælge et af eksperimentforslagene fra softwaren. Til dette eksperiment skal du bruge Best Signal, for selvom hastigheden vil være lidt langsommere sammenlignet med Smartest (Line) -forslaget, vil det skabe de bedste hardwareindstillinger for hvert farvestof, hvilket resulterer i maksimal signalforøgelse og minimal emissionskrydstale. Når eksperimentet er indstillet og indlæst, vises det i vinduet Billedopsætning under fanen Anskaffelse.
    4. Når en smart opsætning er valgt, vælges bølgelængdeområdet for detektoren GaAsP-PMT automatisk. Juster området ved at flytte rullepanelet nederst for at øge eller formindske området eller helt flytte området til et andet område efter behov. Brug dette til at sikre, at intervallerne for to forskellige kanaler ikke overlapper hinanden for at undgå krydstale. Gem konfigurationen for at genbruge i fremtiden.
  3. Når konfigurationen er indstillet, skal du fortsætte med at justere zoom- og scanningsområdet som i trin 6.2.8. Optimer scanningsområdet for at fokusere på interesseområdet for at reducere scanningstid og lagerplads. Fortsæt med at erhverve billeder.
  4. For hver enkelt kanal skal du vælge et spor under Kanal og klikke på Live. Hovedforstærkningen og lasereffekten justeres ved hjælp af afstandsindikatorværktøjet som beskrevet i trin 6.2.4, og følg alle de beskrevne retningslinjer for at undgå mættede pixel. Bekræft, at den sekskantede detektorvisning er centreret og justeret, ved at klikke på knappen Airyscan Detector View . I de fleste tilfælde centreres og justeres den sekskantede detektorvisning automatisk. Gentag for yderligere kanaler.
  5. I vinduet Til/fra-tilstand under Billedstørrelse skal du klikke på SR (superopløsningsbegrænset pixelantal) for at maksimere detektorens muligheder. Dette justerer rammestørrelsen automatisk.
  6. Hold gennemsnittet til Ingen, da det normalt ikke er nødvendigt, og dette vil reducere scanningstiden. I nogle tilfælde kan et gennemsnit på 2x forbedre signal/støj-forholdet.
  7. Indsaml rådata med 8-bit datadybder. Klik på Snap for at få et billede. Følg trin 6.3 for at anskaffe en z-stack.
  8. Udfør billedbehandling som beskrevet nedenfor. Dette vil producere et 16-bit billede.
    1. Når billedet eller z-stakken er opnået, skal du klikke på Behandlingsmetoden > og vælge Airyscan Processing.
    2. Udfør automatisk filtrering til at begynde med, og udfør yderligere manuel behandling ved at ændre SR-værdien for at opnå de bedste resultater for prøven. Når den optimale SR-værdi er bestemt, skal du klikke på Anvend for at generere et behandlet billede. I tilfælde af z-stack-billeder skal du behandle enten som en z-slice (Current Image [2D]) eller som hele z-stack ved at klikke på boksen 3D-behandling .

8. Billedbehandling og dataanalyse (ortogonal projektion, 3D-rekonstruktion og intensitetsprofil)

BEMÆRK: For denne metode er de trin, der bruges til at generere ortogonale fremskrivninger, 3D-rekonstruktioner og intensitetsprofiler, beskrevet for Zen-softwaren (se Materialetabel). Lignende dataanalyser kan også udføres med ImageJ software56.

  1. Udfør ortogonal projektion som beskrevet nedenfor (figur 4).
    1. Når en z-stak er opnået ved hjælp af konfokal eller superopløsningsmikroskopi, skal du generere en ortogonal projektion for at se vesiklerne i cellens z-akse i en 2D-visning (sammenlignet med 3D-rekonstruktion). For at gøre dette skal du klikke på behandlingsmetoden > og vælge Ortogonal projektion.
    2. Under parametre skal du vælge det ønskede projektionsplan. For en projektion af z-aksen (z-stakken) skal du vælge frontalplanet (XY). Under Metode skal du vælge Maksimum for at opnå projektion af højeste kvalitet.
    3. Bestem derefter tykkelsen af projektionen ved at vælge startpositionen (start z-skive), og bestem tykkelsen (det samlede antal z-skiver) i projektionen. Det er ideelt at vælge tykkelsen svarende til tykkelsen af en celle i z-aksen.
    4. Når parametrene er indstillet, skal du klikke på Anvend for at oprette projektionen af z-stakken på en XY-plan måde.
      BEMÆRK: Når du opretter ortogonale fremskrivninger af flere z-stakke for at sammenligne mængden af et bestemt objekt af interesse, er det bydende nødvendigt at holde tykkelsen af projektionen den samme (eller så tæt som muligt) for datanøjagtighed.
  2. Udfør 3D-rekonstruktion som beskrevet nedenfor (figur 5).
    1. Opret 3D-rekonstruktioner af z-stakke for at observere lokalisering og form af strukturer. Gør dette for z-stakke erhvervet ved hjælp af konfokale og superopløsningsmetoder. Behandl z-stakke med superopløsning først ved hjælp af 3D-behandling som i trin 7.8 til 3D-rekonstruktion.
    2. For at generere et 3D-billede skal du klikke på 3D-ikonet i eksempelvinduet. Når der er klikket, vises en 3D-fane i displaykontrolsektionen i den nederste halvdel af skærmen. 3D-visninger, f.eks. Gennemsigtighed, Lydstyrke, Maksimum, Overflade og Blandet, vil være synlige. Brug surface eller mixed views, når du ser strukturen af vesikler (foretrækkes).
    3. For billede af højeste kvalitet skal du vælge indstillingen Præcis , da den hurtigste indstilling vil være mindre nøjagtig og føre til dårlig 3D-gengivelse.
    4. Når billedet er genereret, skal du manipulere det ved at rotere og zoome for at fokusere på et foretrukket sted for at se objekterne af interesse. Manipuler 3D-billedet under fanen Udseende .
    5. Når der er opnået en tilfredsstillende visning, skal du vælge Vist opløsning under fanen 3D og derefter klikke på Opret billede. Dette vil skabe et øjebliksbillede af billedet i samme retning som det blev set og kan gemmes og eksporteres i forskellige filformater.
  3. Opret en intensitetsprofil som beskrevet nedenfor (Figur 7).
    BEMÆRK: Fordelings- og intensitetsprofilerne for de pixels, der er knyttet til de forskellige fluorescerende signaler, kan ses som et overlejringsbillede for at bestemme deres kolonisering.
    1. Når et optimalt billede er erhvervet via konfokal eller superopløsningsbilleddannelse, skal du klikke på Profil i panelet Vis i eksempelvinduet. I eksempelvinduet vises et histogram, der viser intensitetsprofilen som en funktion af afstanden, samt en tabel, der viser afstande og intensitetsværdier.
    2. I displaykontrolområdet nederst på skærmen skal du klikke på pileværktøjet på fanen Profildefinition . Tegn en pil langs længden af objektet, som intensitetsprofilen for de forskellige pixels skal vurderes for. For at tegne pilen skal du zoome ind på billedet.
    3. Intensitetsprofilen vises til venstre for billedeksemplet, hvor afstanden og de tilsvarende toppe langs pilens sti vises. Hvis du vil fjerne det histogram, der vises på selve billedet, skal du fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet Vis profil i grafik .
    4. Under fanen Dimensioner i kontrolområdet for visning skal du fravælge de kanaler, der ikke skal medtages i intensitetsprofilen.
    5. På fanen Grafik skal du dobbeltklikke på Profil vist under feltet Anmærkninger/målinger for at åbne pop op-boksen Formatér grafiske elementer . Brug dette til at ændre pilens farve samt dens stil og stregtykkelse. Luk boksen, når du har valgt de ønskede indstillinger.
    6. Klik på fanen Profilvisning . I afsnittet Nyt billede skal du klikke på Aktuel visning og derefter på Gem som for at gemme filen. Det anbefales at gemme filen som en .tif fil for at undgå datakomprimering og tab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De metoder, der er beskrevet heri, kan bruges til effektivt og præcist at afbilde og karakterisere den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner i polariserede epitelceller, såsom FE i Drosophila-æggestokken . Dernæst giver vi forventede resultater opnået ved hjælp af de beskrevne metoder samt nyttige råd og potentielle faldgruber. For at gøre dette anvendes Vkg-GFP, en endogent mærket Vkg (Drosophila Col IV). Imidlertid kan de samme resultater opnås med andre endogent mærkede BM-proteiner såsom Pcan-GFP.

Indstilling af optimale anskaffelsesparametre (Figur 2)
For nøjagtigt at karakterisere den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner, såsom Vkg og Pcan, i epitelceller, er det afgørende at indstille erhvervelsesparametrene for det konfokale mikroskop korrekt som beskrevet i de medfølgende metoder.

Ved hjælp af konfokal mikroskopi kan den intracellulære lokalisering af Vkg-GFP detekteres, før den udskilles og deponeres basalt i FE (figur 2A). Det har vist sig, at Coll IV efter oversættelse i ER transporteres til Golgi, inden den pakkes i intracellulære exocytiske vesikler. Ved hjælp af denne billeddannelsesmetode observerer vi, at Vkg-GFP akkumuleres i intracellulære rum med forskellige former, der potentielt repræsenterer forskellige organeller, endosomale rum og vesikeltyper (figur 2A, pile). I exocytiske vesikler er Coll IV allerede samlet i fibriller sammensat af tre polypeptider: to α1-kæder og en α2-kæde (Vkg i Drosophila), hvilket fører til dannelsen af strakte vesikler, der også kan visualiseres ved hjælp af konfokal billeddannelse (figur 2A, pile). Derefter udskilles Coll IV specifikt basalt fra epitelceller, hvor den deponeres i BM (figur 2, pilespidser).

Hvis erhvervelsesparametrene ikke er indstillet korrekt, er det ikke muligt præcist at observere de forskellige morfologier og positioner under den intracellulære handel med BM-proteiner (figur 2B, C). For eksempel, hvis erhvervelsesparametrene er optimeret til at visualisere de ekstracellulære BM og ikke intracellulære strukturer, vises de BM-proteinholdige endosomale rum og vesikler (her markeret med Vkg-GFP) svage eller er ikke synlige (figur 2B). Omvendt, hvis detektorerne er alt for mættede, kan den intracellulære lokalisering af Vkg-GFP detekteres som i den optimale tilstand (sammenlign figur 2A og figur 2C), men en stigning i baggrundsfluorescenstøj gør fortolkningen af BM-proteinlokalisering vanskeligere, især for koloniseringseksperimenter (se figur 7 ). Samlet set illustrerer disse data vigtigheden af korrekte erhvervelsesparametre for at opnå nøjagtig lokalisering af BM-proteiner i epitelet.

Indstilling af optimale parametre for superopløsning og dekonvolution (figur 3)
Som illustreret for konfokal billedoptagelse er det også vigtigt at indstille anskaffelsesparametrene korrekt, når du bruger superopløsningsmikroskopi for at undgå under- eller overmætning. Denne billeddannelsesmetode med superopløsning involverer også omhyggelig konfiguration af dekonvolutionsparametre for at opnå billeddannelse med superopløsning (figur 3). Når dekonvolutionsbehandling er optimalt konfigureret, øger billeddannelse med superopløsning signifikant opløsningen af intracellulære strukturer indeholdende BM-proteiner (figur 3A, pile), såsom vesikler eller Golgi-strukturer (figur 3A og figur 7C), selve BM'en (figur 3A, pilespidser) og forbedrer signal-støj-forholdet45 . Superopløsningsmikroskopi fører til en ~ 2x stigning i opløsning i alle tre rumlige dimensioner sammenlignet med konfokal mikroskopi. Denne stigning i opløsning illustreres tydeligt af de bedre definerede billeder af den intracellulære handel med BM-proteiner og BM taget ved hjælp af superopløsningsbilleddannelse sammenlignet med dem, der er taget med standard CSLM (sammenlign figur 2A og figur 3A).

Hvis dekonvolutionsparametre ikke er indstillet korrekt, opnås superopløsning ikke optimalt, og stigningen i opløsning går tabt. Underbehandling af billeder i superopløsning fører til slørede billeder, hvilket resulterer i, at intracellulær lokalisering af BM-proteiner forekommer svage og ikke så veldefinerede som under optimale forhold (sammenlign figur 3B med figur 3A). Omvendt fører overbehandling af billederne til kornede billeder, hvor den intracellulære lokalisering af BM-proteiner fremstår pixeleret (figur 3C). Disse data fremhæver vigtigheden af at bruge korrekte dekonvolutionsparametre for at opnå meningsfulde og repræsentative billeder, der afspejler den intracellulære fordeling af BM-proteiner.

Alt i alt viser og fremhæver disse data tydeligt den forbedrede opløsning af intracellulær handel med BM-proteiner ved hjælp af billedbehandling i superopløsning sammenlignet med konfokal mikroskopi. Specifikt giver denne tilgang mulighed for bedre visualisering af den intracellulære handel med BM-proteiner ved at forbedre opløsningen af de involverede intracellulære strukturer. Dette gør det muligt at sammenligne forskellige størrelser og former af strukturer for bedre at identificere og karakterisere nye faktorer involveret i den polariserede aflejring af BM-proteiner i FE.

Ortogonal projektion og 3D-rekonstruktion af optiske z-sektioner (z-stak) gennem FE for at forbedre visualiseringen af den intracellulære fordeling af BM-proteiner (figur 4 og figur 5)
Da den intracellulære fordeling af BM-proteiner er til stede i hele FE i 3D (x-, y- og z-akser), kan ortogonal projektion og / eller 3D-rekonstruktion af optiske z-sektioner gennem FE ved hjælp af enten superopløsning eller konfokal mikroskopi bruges til at vurdere lokaliseringen og fordelingen af BM-proteiner inde i vildtype- eller mutantceller (f.eks . i figur 4 og figur 5).

Ortogonal projektion gør det muligt at projicere alle de erhvervede z-sektioner i et enkelt plan. Denne metode er især nyttig til at vise den samlede fordeling af vesikler og rum indeholdende BM-proteiner i et enkelt billede ved hjælp af konfokal (figur 4A) eller superopløsning (figur 4B) billeddannelse. Imidlertid en signifikant bedre opløsning og mindre baggrundsstøj ved brug af superopløsningsmikroskopi end konfokal mikroskopi (sammenlign figur 4B og figur 4A).

En anden tilgang til at visualisere den overordnede fordeling af BM-holdige rum og vesikler er at generere en 3D-rekonstruktion ved at samle en stak optiske z-sektioner taget af konfokal (figur 5A) eller superopløsning (figur 5B) billeddannelse. Denne tilgang kan også være meget effektiv til at vurdere lokalisering og distribution af intracellulære BM-proteiner og formen af rum og vesikler indeholdende Vkg-GFP, især ved anvendelse af superopløsningsmikroskopi (figur 5). Traditionel konfokal mikroskopi (figur 5A) resulterer i højere baggrundsstøj sammenlignet med superopløsning (figur 5B), hvilket, når der tages højde for i 3D-gengivelse, kan resultere i artefakter. Desuden resulterer den lavere opløsning af confocal også i, at de skabte billeder er mindre glatte og definerede end dem, der genereres af superopløsning (sammenlign figur 5A og figur 5B).

Karakterisering af fænotyper forbundet med tabet af komponenter involveret i den polariserede sekretion af BM-proteiner ved hjælp af superopløsningsbilleddannelse (figur 6)
Som vist hidtil (figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5) kan superopløsningsmikroskopi og billedbehandling bruges til at vurdere den intracellulære lokalisering og fordeling af BM-proteiner i vildtypen FE af Drosophila-æggestokken . Desuden kan denne tilgang også bruges til at bestemme og sammenligne lokaliseringen af BM-proteiner under mutante eller knockdown-forhold. Dette er derved en effektiv metode til at karakterisere rollen (e) af nyligt identificerede komponenter dedikeret til polariseret intracellulær handel, sekretion og aflejring af BM-proteiner.

GTPase-udvekslingsfaktoren (GEF) Crag har vist sig at være en nøglekomponent i en biologisk vej dedikeret til den polariserede aflejring af BM-proteiner28. I Crag knockdown FCs akkumuleres BM-proteiner både apikalt og basalt, hvilket indikerer, at Crag styrer den polariserede sekretion af BM-proteiner såsom Vkg-GFP (figur 6). Anvendelsen af superopløsningsmikroskopi giver mulighed for bedre karakterisering af fænotypen som følge af tabet af Crag. For eksempel observeres en stærk apikal akkumulering af BM-proteiner såvel som organisationen af den ektopiske apikale BM i Crag-knockdown FCs (figur 6B, pilespidser). Når fænotypen er mindre afvigende, detekteres BM-membran, der akkumuleres apikalt i små pletter i FCs (figur 6B, pile). Alt i alt illustrerer disse data, at superopløsningsmikroskopi kan bruges til at karakterisere mutante fænotyper for bedre at forstå rollerne for komponenter involveret i den polariserede aflejring af BM.

Colocalization eksperiment ved hjælp af antistoffer og endogent mærkede BM proteiner afbildet ved hjælp af konfokal og superopløsningsmikroskopi (figur 7)
Endelig kan brugen af antistoffer mod specifikke intracellulære markører eller nyligt identificerede komponenter kombineret med endogent mærkede BM-proteiner bruges til bedre at karakterisere den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner i det polariserede epitel. GM-130, en cis-Golgi-markør, bruges til at illustrere dette punkt. Før Coll IV pakkes i sekretionsvesikler, transporteres Coll IV til Golgi. Når den subcellulære fordeling af Vkg-GFP vurderes ved hjælp af konfokal (figur 7A, B) eller superopløsning (figur 7C, D) billeddannelse, viser begge tilgange, at Vkg-GFP delvist lokaliserer med GM-130, hvilket bekræfter, at Coll IV sorteres til Golgi før sekretion. Imidlertid observeres en stigning i signal-støj-forholdet og en bedre opløsning af koloniseringen mellem Vkg-GFP og GM130 ved anvendelse af superopløsningsbilleddannelse (sammenlign figur 7A med figur 7C).

Når den rumlige fordeling og niveauerne af grønne (Vkg-GFP) og røde (GM-130) pixels kvantificeres ved at måle fluorescensintensiteten af en optisk sektion gennem FC'er taget med konfokal (figur 7B) og superopløsning (figur 7D) mikroskopi, observeres koloraliseringen af Vkg-GFP og GM-130. Fordelingen af Vkg-GFP og GM-130 pixels er plottet i histogrammer, hvor overlapninger af Vkg-GFP og GM-130 toppe angiver deres kolonisering (figur 7B', D'). Ved hjælp af dette billedanalyseværktøj kan placeringen af Vkg-GFP i specifikke intracellulære rum således bestemmes præcist. Sammenligningen af histogrammer genereret af konfokale billeder (figur 7B') med billeder med superopløsning (figur 7D') bekræfter imidlertid, at mikroskopi med superopløsning giver bedre resultater, hvilket kan ses af den højere intensitet af toppe og reduceret baggrundsstøj repræsenteret ved manglen på mindre toppe (sammenlign figur 7B' og figur 7D' ) i forbindelse med histogrammer med superopløsning. Alt i alt fremhæver disse data, at selvom konfokal mikroskopi kan bruges til at kvantificere kolonisering, er superopløsning en mere kraftfuld tilgang, hvilket fører til en mere effektiv og præcis kvantificering af lokaliseringen.

Figure 1
Figur 1: Det follikulære epitel (FE) af Drosophila-æggestokken : et modelsystem til undersøgelse af den polariserede aflejring af kældermembranproteiner (BM). (A) Billede af intakte æggestokke efter dissektion og udskæring taget med et fluorescensstereomikroskop. Æggestokke udtrykker et endogent GFP-mærket BM-protein (Vkg-GFP). Skalabjælke = 1 mm. (A') To æggestokke af en kvindelig flue er fastgjort ved ovidukten. Hver æggestok indeholder 16-20 ovarioler. En enkelt ovariol er skitseret (rektangel). Skalabjælke = 1 mm. (B) Langsgående sektion, taget med et konfokalt mikroskop, gennem en ovariol, der udtrykker Vkg-GFP og farvet for DNA (blå) og F-Actin (rød). Ovarioles består af ægkamre på forskellige stadier. Ægkamre består af et monolag follikulært epitel (FE), der omgiver kimlinjecellerne (GC'er). FE syntetiserer og udskiller basalt BM-proteiner (f.eks. Pcan og Vkg). Skalalinje = 100 μm. (C) Skematisk af FE. FE er et klassisk epitel med en tydelig apikal-basal polaritet, hvor det apikale domæne vender mod kimlinjecellerne, og basaldomænet vender mod BM (grøn). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Billeddannelse af intracellulær handel med BM-proteiner ved hjælp af konfokal billeddannelse. (A-C) Langsgående sektion gennem et ægkammer, der udtrykker Vkg-GFP (grøn) og farvet for DNA (blå) og F-Actin (rød). (A'-C') Intracellulære rum og vesikler indeholdende Vkg-GFP (pile) og den basalt og ekstracellulært deponerede BM (pilespidser) vises ved hjælp af konfokal mikroskopi. (A) Optimalt erhvervet billede, for hvilket den intracellulære handel med Vkg-GFP er synlig. (A') Vkg-GFP er lokaliseret i hele cytoplasmaet af FCs i forskellige cellulære rum (f.eks. Golgi) og i vesikler. På grund af fibrilorganisationen af kollagen IV forekommer Vkg-GFP-holdige vesikler aflange (pile). (B) Undereksponeret billede, for hvilket erhvervelsesparametrene er optimeret til at visualisere den ekstracellulære BM og ikke den intracellulære fordeling af BM-proteiner. Vkg-GFP (grøn) vises svag i hele cytoplasmaet (B'), hvilket resulterer i uopdagelige Vkg-GFP-holdige vesikler sammenlignet med (A). (C) Overeksponeret billede, for hvilket GFP-detektoren er mættet, hvilket resulterer i en stigning i baggrundsfluorescens. Selvom den intracellulære fordeling af Vkg-GFP (grøn) kan ses lokaliseret gennem cytoplasmaet af FCs (pile), resulterer overeksponering i billeddannelsesartefakter, hvor de intracellulære strukturer ser større ud end de er, som i (A-A'). Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Billeddannelse af intracellulær handel med BM-proteiner ved hjælp af billeddannelse og behandling i superopløsning. (A-C) Langsgående sektion gennem et ægkammer, der udtrykker Vkg-GFP (grøn) og farvet for DNA (blå) og F-Actin (rød). (A) Optimalt behandlet superopløsningsbillede, hvor den intracellulære handel med Vkg-GFP tydeligt observeres. (A') Vkg-GFP er lokaliseret i hele cytoplasmaet af FCs i forskellige cellulære rum (f.eks. Golgi) og vesikler (pile) og ved BM (pilespidser). (B) Underbehandlet billede, hvilket resulterer i højere baggrundsfluorescens end i (A). Den intracellulære lokalisering af Vkg-GFP (grøn) vises svag og mindre defineret (sammenlign B med A). (C) Overbehandlet billede, der resulterer i et billede, hvor den intracellulære lokalisering af Vkg-GFP vises pixeleret og kornet. Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Ortogonal projektion af en z-stak erhvervet og behandlet ved hjælp af konfokale og superopløsningsmikroskopimetoder. (A-B) Ortogonal projektion af optiske z-sektioner gennem et ægkammer, der udtrykker Vkg-GFP (grøn) og farvet for DNA (blå) og F-Actin (rød) ved hjælp af konfokal (A) eller superopløsning (B) mikroskopi. (A) Projektion af en z-stak erhvervet ved hjælp af optimale konfokale parametre. Den intracellulære lokalisering af Vkg-GFP kan observeres i hele z-aksen i FCs (A', pile). BM er også synlig og fremstår meget lys (A', pilespidser). (B) Projektion af en z-stak erhvervet ved hjælp af optimal superopløsningsbehandling. Veldefinerede intracellulære rum og vesikler indeholdende Vkg-GFP kan observeres i hele z-aksen i FCs (B', pile). BM er også meget veldefineret (B', pilespidser). Forskellen mellem standard konfokal billeddannelse og superopløsningsbilleddannelse er tydelig, da den intracellulære lokalisering af Vkg-GFP og BM er signifikant mere defineret ved anvendelse af superopløsning end standard konfokal mikroskopi. Desuden har billedet taget ved konfokal mikroskopi højere baggrundsfluorescens. Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: 3D-rekonstruktion af en z-stak erhvervet og behandlet ved hjælp af konfokale og superopløsningsmikroskopimetoder. (A-B) 3D-gengivelse af z-stakke (blandet visning) af ægkamre, der udtrykker Vkg-GFP (grøn) og farvet for DNA (blå) og F-actin (rød). (A) 3D-gengivelse af en z-stak erhvervet via konfokal mikroskopi. Placeringen og formen af rum og vesikler indeholdende Vkg-GFP kan ses i cellerne (A'). (B) 3D-gengivelse af en z-stack erhvervet via optimal superopløsningsbehandling. Placeringen og formen af rum og vesikler, der indeholder Vkg-GFP, kan ses (B'). Formen af vesikler såvel som BM og kernerne er glat defineret, og opløsningen er højere sammenlignet med konfokal mikroskopi (sammenlignet med B 'og A'). Formen og størrelsen af de rum og vesikler, der indeholder Vkg-GFP, kan også bedre bestemmes ved hjælp af superopløsningsmikroskopi (sammenlignet med B'og A'). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering af Vkg-GFP lokalisering i Crag slog FCs ned. (A-B) Langsgående sektion gennem et ægkammer, der udtrykker Vkg-GFP (grøn), farvet til DNA (blå) og F-Actin (rød) og erhvervet via optimal superopløsningsbehandling. (A) Kontrolledning, der udtrykker vildtype Crag, et protein, der er kritisk for korrekt BM-aflejring. FE viser typisk BM-proteinlokalisering, hvor Vkg-GFP er intracellulært fordelt og deponeret basalt i FE (A'). (B) Transgen Drosophila-linje, der udtrykker RNAi for Crag i FE, hvilket resulterer i en Crag-knockdown. Tabet af Crag fører til fejllokalisering af BM-proteiner (f.eks. Vkg-GFP) apikalt i FE (B', pile og pilespidser). Superopløsningsbillede bruges til at karakterisere BM-fejllokaliseringsfænotyperne forbundet med tabet af Crag. Specifikt viser nogle Crag RNAi FC'er en stærk apikal fejllokalisering af BM-proteiner (B', pilespidser), mens andre Crag RNAi-FC'er præsenterer en svagere apikal fejllokalisering (B', pile). Billeddannelse i superopløsning afslører tydeligt de fænotyper, der er forbundet med tabet af Crag (B', pilespidser vs pile). Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Koloralisering af Vkg-GFP og GM-130 (Golgi-markør) ved hjælp af konfokale og superopløsningsmikroskopimetoder. (A-D) Langsgående sektioner gennem ægkamre, der udtrykker Vkg-GFP og immunostained til en cis-Golgi-markør (GM-130, rød), afbildet ved hjælp af konfokal (A, B) eller superopløsning (C, D) mikroskopi. (A,B) Konfokal billeddannelse viser, at intracellulær Vkg-GFP delvist kolokaliserer med en cis-Golgi-markør (A, pilespids). (B) Zoomet område af (A). Fordelingen af grønne (Vkg-GFP) og røde (GM-130) pixels langs den hvide pil er plottet i et histogram (B'). Histogrammets x-akse repræsenterer afstanden (μm) langs pilen, mens y-aksen repræsenterer pixelintensitet. De overlappende grønne og røde toppe (*) viser, hvor Vkg-GFP og GM-130 kolocaliserer. (C,D) Superopløsningsbilleddannelse viser også, at intracellulær Vkg-GFP delvist kolokaliserer med en cis-Golgi-markør (C, pilespids). (D) Zoomet område af (C). Fordelingen af grønne (Vkg-GFP) og røde (GM-130) pixels langs den hvide pil er plottet i et histogram (D'). Histogrammets x-akse repræsenterer afstanden (μm) langs pilen, mens y-aksen repræsenterer pixelintensitet. De overlappende grønne og røde toppe (*) viser, hvor Vkg-GFP og GM-130 kolocaliserer. Disse data viser, at billeddannelse med superopløsning er en mere effektiv og præcis tilgang end konfokal billeddannelse til at karakterisere og kvantificere kolonisering. Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Konfokal og superopløsning mikroskopi erhvervelse og behandling parametre for de repræsentative billeder. Alle de vigtigste billedparametre er kompileret til de medfølgende repræsentative billeder. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BM er kritisk for embryonal og organmorfogenese og voksne fysiologiske funktioner. Desuden fungerer BM som en signalplatform til etablering og vedligeholdelse af epitelpolaritet og giver væv støtte2. Alligevel er de mekanismer, der regulerer den korrekte placering af BM-proteiner, dårligt forstået. En bedre forståelse af de biologiske veje dedikeret til intracellulær handel og polariseret sekretion af BM-proteiner kræver en omhyggelig analyse af komponenterne i disse veje og deres roller i BM-behandling. En måde at opnå dette på er at bruge konfokal og superopløsningsbilleddannelse. Her beskrev vi metoder til fremstilling og farvning eller immunostaining af Drosophila æggestokke for effektivt at afbilde den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner i FE ved hjælp af konfokal og superopløsningsmikroskopi.

Fordele ved proteinfælde og endogent mærkede proteiner til at visualisere intracellulær handel og sekretion af BM-proteiner under vildtype og mutante forhold
Den medfølgende protokol drager fuld fordel af proteinfælder og endogent mærkede BM-proteiner (f.eks. Vkg-GFP og Pcan-GFP) til at afbilde og vurdere lokalisering og fordeling af BM-proteiner i FE i vildtype (kontrol) og mutantforhold. Disse linjer har vigtige fordele i forhold til brugen af antistoffer mod BM-proteiner. For det første er antistoffer mod specifikke proteiner af interesse ofte sjældne og i lav overflod. Derudover er der ofte problemer med vævspenetrance forbundet med antistoffer, som kan føre til unøjagtig observation og vurdering af proteinet af interesse. Desuden kan proteinfældelinjer indsættes i forskellige genetiske baggrunde, der bruges til at bestemme funktionerne af faktorer, der kræves for korrekt aflejring af BM, såsom (i) metoder til at manipulere genekspression (f.eks. UAS / Gal4), (ii) mutanter og (iii) RNA-interferens (RNAi) linjer. Endelig kan disse proteinfælder bruges til at visualisere lokaliseringen og funktionen af BM ved hjælp af levende billeddannelse57.

Imidlertid kan fusionen af et fluorescerende mærke til et protein af interesse forstyrre dets lokalisering og funktioner. Det er således afgørende at evaluere eventuelle afvigende virkninger af mærket på proteinet. En måde at sikre, at tilsætningen af et fluorescerende mærke ikke forstyrrer funktionen og lokaliseringen af BM-proteiner, er at afgøre, om den transgene Drosophila-linje er homozygot levedygtig. Både Vkg-GFP- og Pcan-GFP-linjerne, der anvendes i de forskellige eksperimenter, der er beskrevet her og tidligere, er homozygote levedygtige, hvilket indikerer, at tilføjelsen af et GFP-mærke ikke forstyrrer funktionen af disse essentielle proteiner29,30.

Betydningen af vævsforberedelse, fiksering og farvning til billeddannelse
For effektivt og præcist at afbilde FE er det afgørende at forberede, fikse og plette ovarievævet korrekt som anvist i denne metode. Først efter dissektion skal du forsigtigt fjerne alle andre organer og flyve snavs før fiksering. Brug af paraformaldehyd (PFA) til at fiksere væv anbefales, da det fører til lys GFP-fluorescens og er kompatibel med de fleste antistoffer. PFA er dog muligvis ikke kompatibel med alle antistoffer; nogle kan kræve glutaraldehyd eller methanolfiksering. For at undgå baggrundsfluorescens på grund af ikke-specifik binding af det primære antistof skal ovarievævet desuden inkuberes på en nutating platform vippe i mindst 1 time i blokerende opløsning og vaskes i vid udstrækning flere gange efter primær og sekundær antistofinkubation som beskrevet i protokollen. Endelig er korrekt montering af ovarievævet afgørende for at opnå optimal billeddannelse. Dette kræver omhyggelig adskillelse af individuelle ægkamre for at undgå, at de stables oven på hinanden. Det er også vigtigt at lade monteringsmediet polymerisere fuldt ud før billeddannelse for at undgå, at vævet flyder under dækslippen. Dette gør det yderligere muligt for monteringsmediet at nå sit optimale reflekterende indeks, hvilket er meget vigtigt for billeddannelse i superopløsning. Hvis du ikke gør det, vil det påvirke billedkvaliteten. Desuden kan de tilberedte dias opbevares i op til 1 måned ved 4 °C, før fluorescensen slukkes. Ud over den medfølgende protokol er flere andre protokoller tilgængelige til ovariedissektion og farvning 53,54,55.

Brugen af korrekte opsamlings- og behandlingsparametre er afgørende for optimal billeddannelse og for at vurdere lokaliseringen af BM-proteiner ved hjælp af konfokal og superopløsningsbilleddannelse
Som beskrevet tidligere er det afgørende at indstille anskaffelsesparametrene korrekt for konfokal og superopløsningsbilleddannelse for at opnå optimale billeder af prøven. Til billedoptagelse skal ROI vælges omhyggeligt ved hjælp af zoomfunktionen og derefter indstille rammestørrelsen og optagelseshastigheden optimalt. Som illustreret i figur 2 er det desuden afgørende at justere lasereffekten og detektorforstærkningen korrekt for at visualisere intracellulær handel uden at mætte detektorerne. Disse parametre skal indstilles meget omhyggeligt for at undgå undereksponerede eller overeksponerede billeder (figur 2). Undereksponerede billeder vil resultere i billeder med lav opløsning, hvor de intracellulære strukturer vil være vanskelige at visualisere og karakterisere (figur 2B). Overeksponerede billeder på grund af mætning af detektoren fører til fejlfortolkning af data og kolonialiseringsartefakter (figur 2C). Hvis målet er at bestemme den vesikulære lokalisering af endogent mærkede BM-proteiner, mætter fluorescensen fra GFP-mærkede proteiner (f.eks. Vkg-GFP og Pcan-GFP) i basal BM hurtigt detektoren. Vesikler, der indeholder mindre GFP-mærkede BM-proteiner, vil dog virke svage. Derfor er det vigtigt at indstille billedfølsomheden ved hjælp af de BM-holdige intracellulære strukturer (f.eks. Vesikler) og ikke på BM (figur 2). Valg af pinhole størrelse er også meget vigtigt. Ideelt set bør der vælges en pinhole-størrelse på 1 AU for hver kanal for billeder af bedste kvalitet, især når opløsningen i z-aksen er vigtig. Den mindre pinhole størrelse er optimal til tyndere optiske sektioner. Men når optimal z-akseopløsning ikke er påkrævet, eller en z-stak ikke fanges, kan pinhole-størrelsen øges for at undgå fotobleaching. For meget svage signaler kan det desuden hjælpe at øge pinhole-størrelsen på grund af et højere signal-støj-forhold og optagelse af flere fotoner, hvilket hjælper med datafortolkning.

I forbindelse med billeddannelse i superopløsning bør der lægges særlig vægt på dekonvolutionsbehandling for at undgå at generere under- eller overbehandlede billeder, der er dårligt løst, som illustreret i figur 3. Endelig anbefales det kraftigt at indstille det bedste interval bestemt af softwaren for at opnå en optimal 3D-rekonstruktion. Et interval for stort mellem z-sektioner (dvs. højere end 0,5 μm) vil føre til dårlig 3D-gengivelse og vil påvirke den efterfølgende analyse af fænotypen.

Fordel ved superopløsning i forhold til traditionel konfokal mikroskopi ved billeddannelse af BM intracellulær handel
Som illustreret i resultatafsnittet, selvom lokalisering og distribution af BM-proteiner kan vurderes nøjagtigt ved hjælp af konfokal billeddannelse, genererer den beskrevne superopløsningsmetode mere præcise billeddata med en signifikant stigning i opløsningen af intracellulære strukturer indeholdende BM-proteiner samt et forbedret signal-støj-forhold. Desuden er denne superopløsningsmikroskopiteknik relativt nem at bruge. Da billeddannelse med superopløsning signifikant øger opløsningen sammenlignet med konfokal mikroskopi, op til 120 nm i x- og y-akserne og 350 nm i z-aksen, vil denne tilgang i høj grad påvirke vores forståelse af den polariserede aflejring af BM ved mere præcist at karakterisere den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner i epitelceller såsom FCs.

Desuden er en anden billedbehandlingsmetode med superopløsning (Structured Illumination Microscopy, SIM) og brugen af dekonvolutionsalgoritmer designet til punktscanning konfokal mikroskopi (dvs. Nikons softwaremodul med forbedret opløsning) tidligere blevet brugt til at karakterisere rollen som faktorer involveret i BM-deponering29. Den øgede opløsning forbundet med disse teknikker har givet vigtig indsigt i vores forståelse af den intracellulære handel med BM-proteiner og organisationen af BM. Disse tilgange har dog nogle begrænsninger sammenlignet med Airyscan mikroskopi. For eksempel er SIM ikke særlig effektiv til at erhverve optimale billeder, når der opnås optiske z-sektioner dybt i vævet. Dette gør SIM vanskeligt at bruge ved screening for nye komponenter involveret i BM-deponering. Derudover opnår brugen af dekonvolutionsalgoritmer anvendt på konfokale billeder ikke det samme niveau af superopløsning. Samlet set er Airyscan superopløsningsbilleddannelse på fast væv en kraftfuld og overlegen tilgang til undersøgelse af BM intracellulær handel og aflejring.

Men som med enhver anden superopløsningsmikroskopi er der også et par ulemper forbundet med denne tilgang og skal tages i betragtning under billeddannelse. For det første kræver superopløsningstilstanden normalt længere anskaffelsestid for prøven end konfokal tilstand. Således skal erhvervelsesparametrene og interesseområdet indstilles omhyggeligt for at minimere fotobleaching af prøven. Desuden er billedfiler genereret af superopløsningsmikroskopi meget større end filer genereret af konfokal mikroskopi og kan have brug for specialiserede computere eller servere til billedbehandling og opbevaring.

Endelig er levende billeddannelse af BM-proteinerne under Drosophila-oogenese blevet brugt til at karakterisere nye faktorer involveret i BM-polaritet57. Denne tilgang har imidlertid begrænsninger, specifikt i opløsningen af intracellulære strukturer under BM-proteinhandel. Superopløsningsmikroskopi er en kraftfuld tilgang til brug sammen med levende billeddannelse for præcist at bestemme rollerne for identificerede faktorer i den polariserede aflejring af BM-proteiner.

Andre anvendelser af denne metode til at studere lokaliseringen af intracellulære komponenter dedikeret til vesikulær handel ved hjælp af endogent mærkede proteiner og superopløsningsbilleddannelse
Etablering og vedligeholdelse af væv og organer under udvikling og i en voksen organisme er delvis afhængig af celle-til-celle-signalering og cellulær spænding og adhæsion. Disse processer afhænger af intracellulær handel, endocytose, exocytose og udskillelse af specifikke proteiner. Således kunne de metoder, der er beskrevet heri til at dechiffrere den intracellulære handel med BM ved hjælp af endogent mærkede proteiner og konfokal og superopløsningsmikroskopi, let tilpasses til at studere hver proces. Desuden gør brugervenligheden af CRISPR/Cas9-medieret genetisk redigering til at generere endogent mærkede proteiner denne tilgang endnu mere alsidig og kraftfuld58.

Afslutningsvis har vi beskrevet metoder til fremstilling og billeddannelse af BM-proteiner i FE af Drosophila-æggestokken ved anvendelse af konfokal og superopløsningsmikroskopi. Disse protokoller kan anvendes til screening med høj kapacitet for at identificere nye komponenter dedikeret til korrekt placering af BM-proteiner. Endelig har anvendelsen af denne metode potentialet til at yde betydelige bidrag til vores forståelse af, hvordan epitelceller styrer den polariserede sekretion af BM-proteiner, en nøgleproces i etablering og vedligeholdelse af epitelarkitektur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er julie Merkle taknemmelige for hendes nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH-bevilling R15GM137236 til O.D. De konfokale og superopløsningsbilleder blev erhvervet ved hjælp af en Zeiss LSM 900 med Airyscan 2, købt med NSF MR-tilskud 2018748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 183 kældermembran Drosophila Æggestok Epitel Konfokal mikroskopi Superopløsningsmikroskopi Menneskehandel
Konfokal og superopløsningsbilleddannelse af polariseret intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner under <em>Drosophila</em> oogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal… More

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter