Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיצוי של חומצות אמינו שאינן חלבוניות ממטריצות ביולוגיות באמצעות משקעי חלבון חומצה טריכלורואצטית (TCA) והידרוליזה חומצית לפני ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם.

Abstract

חומצות אמינו שאינן חלבוניות (NPAAs) הן קבוצה גדולה של חומצות אמינו (AAs) שאינן מקודדות גנטית לתרגום לחלבונים. הניתוח של NPAAs יכול לספק מידע חיוני על ספיגה ו/או תפקוד של תאים, מסלולים מטבוליים ורעילות פוטנציאלית. β-מתילאמינו-L-אלנין (BMAA) הוא NPAA נוירוטוקסי המיוצר על ידי מיני אצות שונים ונקשר לסיכון מוגבר למחלות נוירודגנרטיביות, מה שהוביל להתעניינות מחקרית משמעותית. ישנן דרכים רבות לחלץ AAs לניתוח, כאשר ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית היא הנפוצה ביותר, ודורשת משקעי חלבון ואחריה הידרוליזה חומצית של גלולת החלבון. מחקרים על נוכחות של BMAA במיני אצות מספקים תוצאות סותרות, כאשר השימוש בהכנה/מיצוי וניתוח של דגימות לא מוערכים הוא הגורם העיקרי. כמו רוב ה-NPAA, משקעי חלבון ב-10% TCA מימי והידרוליזה עם HCl מתפוצץ הם צורת המיצוי המתאימה ביותר ל-BMAA ולאיזומרים שלו אמינואתיל-גליצין (AEG) ו-2,4-חומצה דיאמינובוטירית (2,4-DAB). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים בשיטת מיצוי NPAA מאומתת המשמשת בדרך כלל במעבדות מחקר והוראה.

Introduction

חומצות אמינו הן תרכובות כימיות המכילות לפחות אמין אחד וקבוצה תפקודית קרבוקסילית. חומצות אמינו מסוימות מכילות גם קבוצת imino, קבוצת חומצה פונקציונלית שאינה קרבוקסילית; לחומצות אמינו אחרות יש קבוצות אמין שאינן מחוברות לקבוצת α-פחמן1. ישנן מעל 500 חומצות אמינו2, 22 מהן ידועות כחומצות אמינו חלבוניות המשמשות לקידוד גנטי בסינתזת חלבונים ריבוזומליים3. 22 חומצות אמינו אלה ניתנות לחלוקה נוספת לחיוניות ולא חיוניות. חומצות אמינו חיוניות נחוצות לאורגניזם כדי לתפקד כראוי וניתן לרכוש אותן רק על ידי מקורות חיצוניים. חומצות אמינו לא חיוניות ניתן לסנתז בתוך האורגניזם. הסיווג של 22 חומצות האמינו לחיוניות/לא חיוניות הוא ייחודי למינים בודדים. כל חומצות האמינו האחרות הן חומצות אמינו שאינן חלבוניות (NPAA) שאינן מקודדות לסינתזת חלבונים. חומצות אמינו, בין אם הן חלבוניות או שאינן חלבון, יכולות גם הן למלא תפקיד איתות בתוך אורגניזם ולפעול כמתווכות מטבוליות4. בשל תפקידיהם החשובים והמשתנים, רמות חומצות האמינו יכולות לספק תובנה לגבי מצב האורגניזם, תפקודו, מסלולי חילוף החומרים וכו'. ישנם שני מנגנונים עיקריים שבאמצעותם ניתן לשלב חומצות אמינו בשרשרת פוליפפטידים: סינתזת חלבונים ריבוזומלית, המנצלת את 22 חומצות האמינו בקידוד, וסינתזה פפטידית לא ריבוזומלית, אשר, לצד חומצות אמינו חלבוניות, מאפשרת שימוש בחלק מה- NPAAs בסינתזה. NPAAs מסוימים יכולים לחקות חומצות אמינו חלבוניות, מה שעלול להוביל לשילוב שגוי שלהם בפפטידים ובחלבונים. המיסאינקורפורציה גורמת לקיפול שגוי של חלבונים, אשר, בתורו, יש השפעות מזיקות5, כגון misincorporation של NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) במקום טירוזין, השפעה שלילית על תפקוד התאים ובריאות 6,7. מקור נוסף של NPAAs משולבים הוא באמצעות שינוי לאחר תרגום (PTM) של שאריות חומצות אמינו. שאריות חומצות אמינו משתנות מסיבות שונות, כולל שינויים בקונפורמציה של פפטידים או חלבונים, יציבות ופונקציונליות. לאחר הידרוליזה של חלבון או פפטידים המכילים PTM, שאריות חומצות אמינו מותאמות אלה משתחררות לצורת NPAAהחופשית שלהם 8,9.

NPAA β-מתילאמינו-L-אלנין (BMAA) המיוצר על ידי ציאנובקטריה, דיאטום ודינופלגלטים10 הוא חשד לנוירוטוקסין המעורב כגורם תורם למחלות נוירודגנרטיביות שונות כגון טרשת אמיוטרופית צידית / קומפלקס פרקינסון-דמנציה (ALS-PDC)11,12, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת אלצהיימר 13 . ההשערה היא ש-BMAA משולב בטעות בשרשרת החלבונים הפוליפפטידים במקום L-serine14 ו/או חומצות אמינו חלבוניות אחרות. שילוב שגוי של BMAA יכול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, וכתוצאה מכך לתצהיר של אגרגטים של חלבונים בנוירונים14. בעשור האחרון, העניין ב- BMAA גדל באופן משמעותי. מגוון רחב של מינים ציאנובקטריאליים מסביבות מים מתוקים, ימיים ומליחים התגלו כמייצרים BMAA15, מה שמוביל לתפוצתם הנרחבת למערכות אקולוגיות שונות16,17. בנוסף, הוכח כי BMAA מתמזג דרך שרשרת המזון אל מארג המזון האנושי18,19. בשל ההשפעות הבריאותיות הפוטנציאליות, חוסר ההבנה וחוסר ההתאמה של רעילות BMAA, חובה להמשיך במחקר נוסף עד שהרעילות של BMAA תובן בסופו של דבר או ש-BMAA ייחשב בטוח20,21.

ניתן לחלק את ניתוח חומצות האמינו בדגימות ביולוגיות לארבעה שלבים עיקריים: הכנת הדגימה, גזירת חומצות אמינו, הפרדה וזיהוי, וזיהוי וכימות. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS/MS) היא שיטת הניתוח המועדפת מכיוון שהיא מספקת הפרדה וניתוח ממוקדים וניתנים לשחזור של חומצות אמינו.

טכניקות הכנת דגימות לניתוח דגימות ציאנובקטריאליות ואצות אחרות כוללות בעיקר שיטת מיצוי של חומצות אמינו בצורתן החופשית והקשורה לחלבון. במהלך השנים, שיטות המיצוי נשארו עקביות יחסית עם אלמנטים נפוצים, כולל השממת הדגימה כדי להפריד את חומצות האמינו החופשיות מצורתן הכבולה, ולאחר מכן משקעי חלבון ושחרור חומצות אמינו קשורות באמצעות הידרוליזה עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בטמפרטורות גבוהות22 . צורת מיצוי זו עברה אופטימיזציה לחומצות אמינו חלבוניות ומשמשת ל-NPAA. עם זאת, הזיהוי והכימות של BMAA והאיזומרים שלו (איור 1), אמינואתילגליצין (AEG) וחומצה דיאמינו-בוטירית 2,4-(2,4-DAB), באותו מין של ציאנובקטריה, הראו תוצאות לא עקביות בספרות, כאשר הסבר אפשרי טמון בהבדלים בתנאי הגידול ו/או בזן האצות המייצרות כמויות משתנות או ללא צריכה של BMAA23 . נטען כי הסבר סביר יותר לחוסר העקביות בזיהוי וכימות של BMAA והאיזומרים שלו נובע מפרוטוקולים ניסיוניים לא מוערכים, שימוש במגוון רחב של טכניקות אנליטיות, ופירוט ניסיוני לא מספיק בשיטות המדווחות16,24 המוביל לנתונים בין-מעבדתיים בלתי ניתנים לשחזור. עם זאת, Glover et al.25 ו- Banack 26 פיתחו לאחרונה ותקפו טכניקה אנליטית לזיהוי וכימות של BMAA והאיזומרים שלה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC)-MS/MS בהתאם לאיגוד הבינלאומי של כימאים אנליטיים (AOAC), הפרמקופיאה האמריקאית והנחיות ה- FDA הדרושות לאימות מעבדה אחת.

ניסויי תיקוף אלה התמקדו בהפרדה ובזיהוי של BMAA והאיזומרים שלו ולא התייחסו לחוסר העקביות בפרוטוקולים להכנת דגימות. Lage et al.27 השוו את הביצועים של שלוש שיטות מיצוי נפוצות לכימות BMAA והאיזומרים שלו בדגימות ציאנובקטריאליות באמצעות LC-MS/MS: מיצוי פאזה מוצקה (SPE) של חומצות אמינו חופשיות28,29; שיטת מיצוי חלבונים הכוללת מיצוי מתנול ומשקעי אצטון30; ושיטת המיצוי הנפוצה ביותר עבור BMAA, משקעי חלבון עם חומצה טריכלורואצטית (TCA)31. הם הגיעו למסקנה כי משקעי החלבון TCA הם הפרוטוקול האופטימלי, והניב ריכוזי BMAA גבוהים יותר בדגימות הבדיקה בהשוואה לשיטות המיצוי האחרות. המחקר שלהם אימת מיצוי TCA עם נגזרת של BMAA באמצעות 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוקסיסוקינימידיל קרבמט (AQC) במטריצת ציאנובקטריה, וסיפק מדריך מבוסס להשגת נתוני BMAA אמינים וניתנים לשחזור. מיצוי חומצות אמינו TCA הוא טכניקת הכנת דגימות מקובלת ונפוצה שניתן ליישם גם על מטריצות אחרות. עם זאת, היציבות של חומצת האמינו במהלך הידרוליזה צריך להיחשב כדי למנוע השפלה או חמצון, אשר ניתן להתגבר עם השימוש של משנים כימיים וחומרים מחזרים32. מיצוי TCA משמש באופן שגרתי ונלמד לתלמידי מחקר חדשים, ולמרות שהפרוטוקול מדווח בהרחבה, סיוע חזותי ביישום שיטה זו הוא משאב יקר ערך, המבטיח ביצוע תקין ועקבי.

כרומטוגרפיה בפאזה הפוכה משמשת בדרך כלל להפרדת חומצות אמינו, הדורשת שלב נגזרת לפני ניתוחים. הנגזרת של חומצות אמינו כגון BMAA מאפשרת שימור כרומטוגרפי ויכולה להגדיל את הרזולוציה בין איזומרים. זה גם מגדיל את המסה המולקולרית ומשפר את היינון בספקטרומטר המסה. מספר ריאגנטים נגזרים שימשו לניתוח חומצות אמינו באמצעות LC-MS/MS, כולל פרופיל כלורופורמט (PCF)33, 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוסיסוקסינימידיל קרבמט (AQC)27, 9-פלואורנילמתיל כלורופורמט (FMOC)34, ודנסיל כלוריד (DC)35. עם זאת, הטכניקות המאומתות היחידות לניתוח BMAA השתמשו ב- PCF 36 או ב- AQC24,26,37 כמגיב הנגזר שלהם.

היקף פרוטוקול זה מתמקד במיצוי TCA של NPAAs ממטריצות ציאנובקטריאליות. זוהי שיטה עתירת עבודה שנעשה בה שימוש שגרתי ונלמדת במעבדות מחקר אקדמיות ותעשייתיות המבוססות על כתבי יד שעשויים להיות קצרים בפרטים; לכן, פרוטוקול זה מספק פרטים על ההליך והטכניקות הכרוכות בהכנת דגימות לניתוח של BMAA חופשי ומאוגד כחומצת אמינו מודל.

Protocol

המין ציאנובקטריה מריסמופדיה שימש למחקר הנוכחי38.

1. הכנת מדגם גולמי

  1. לאסוף את חלאת האצות ממקור העניין הימי או מבקבוקון מתורבת ציאנובקטריאלי ולהניח אותו לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל38.
    הערה: יש להקפיא את הדגימה בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לצורך עקירות מאוחרות יותר ולהפשיר אותה לפני השלב הבא.
  2. צנטריפוגה הצינורות המכילים את הדגימה ב 3,500 x גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. מזרימים את הסופר-נטנט לתוך מיכל פסולת ומשליכים אותו לפסולת ביולוגית.
    הערה: הסופרנטנט עשוי להיות שמור לניתוח עתידי של האקסוזום.
  3. מכסים היטב את הצינור המכיל את כדור הדגימה בסרט איטום (ראו טבלת חומרים) וחודרים כמה חורים בסרט באמצעות פינצב אף חד וארוך. אחסן את הצינור במצב זקוף בטמפרטורה של −80 °C למשך 30 דקות.
  4. הפעילו את מייבש ההקפאה והפעילו אותו בטמפרטורה של 0.1 mbar ו-−80°C (~30 דקות).
    הערה: הפרמטרים (שלב 1.4) מותאמים למייבש ההקפאה המשמש למחקר הנוכחי (ראו טבלת חומרים). עקוב אחר נהלי ההפעלה הסטנדרטיים בהתאם לדגם מייבש ההקפאה הזמין במעבדה או הגדר את הטמפרטורה הנמוכה ביותר האפשרית אם דגם מייבש ההקפאה אינו יורד עד 80°C-.
    1. הכניסו את צינורות הצנטריפוגה זקופים למיכל זכוכית של מייבש הקפאה והניחו אותם בתוך מקפיא של 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לקרר את הצנצנת.
    2. מוציאים את מיכל הזכוכית מהמקפיא ומחברים את מכסה הגומי.
    3. ודאו שהידית בשקע שסתום הגומי של מייבש ההקפאה מאווררת לאווירה (מצביעה כלפי מעלה) וחברו את מיכל הזכוכית בחוזקה.
    4. סובבו את הידית של שקע שסתום הגומי באיטיות רבה למצב הצבעה כלפי מטה כדי לחשוף את הצנצנת לוואקום ואפשרו עד 24 שעות של ייבוש בהקפאה כדי להבטיח סובלימציה של כל הנוזלים.
    5. כדי לשחרר את השואב בצנצנת, סובבו את הידית למצב הצבעה כלפי מעלה, נתקו את מיכל הזכוכית והסירו את הדגימות המיובשות בהקפאה.
  5. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 15-50 מ"ג של כדורי דגימה מיובשים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    הערה: ניתן להכניס את הדגימות לאחסון של −80 מעלות צלזיוס אם לא יעובדו בשלב זה.

2. שכיבה של תאים ופיצול של NPAAs חופשיים

  1. הוסף 100 μL של 100 ננוגרם/מ"ל של D5-2,4-DAB (ראה טבלת חומרים) סטנדרטי באמצעות מיקרופיפט לצינור הדגימה (אופציונלי).
  2. הוסף 300-600 μL של 10% עם טריכלורואצטי מימי (TCA, ראה טבלת חומרים) או 300-600 μL של 11.7%-13.3% TCA, בהתאמה, אם מוסיפים את תקן D5-2,4-DAB.
    הערה: בחר נפח של TCA מימי המכסה באופן מלא את הכדור.
  3. מניחים את צינורות הדגימה במיכל מלא בקרח כתוש.
  4. השתמש ב-sonicator של בדיקה (ראה טבלת חומרים) בהספק בינוני-גבוה (70%) ו-lyse את הדגימה במשך דקה אחת בהתאם לשלבים הבאים.
    התראה: הקפידו על הגנה מספקת על איכות ה-PPE באמצעות אוזניות מבטלות רעשים.
    1. עקוב אחר פרוטוקולי הבטיחות המתאימים כהכנה לשימוש בסוניקטור הבדיקה על ידי הצבת שילוט בשימוש על הדלת, ביצוע סוניקציה במכסה האדים ושימוש באוזניות מבטלות רעשים.
    2. הפעל את הסוניקטור והזן את הפרמטרים הבאים: משרעת, 70%; זמן, דקה אחת.
    3. יש לרסס 70% אתנול על מגבון נייר ללא מוך (ראו טבלת חומרים) ולנגב את הבדיקה.
    4. היסחף באופן מלא את קצה הבדיקה לתוך הדגימה ולחץ על start.
    5. כאשר הסוניקטור של הגשושית נעצר, הנח את צינור הצנטריפוגה המכיל את הדגימה על קרח למשך דקה אחת.
    6. כדי להבטיח שהתאים מומים, חזור על שלבים 2.4.3-2.4.5 פעם נוספת.
  5. הכניסו את הדגימה למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות כדי לאפשר שקיעת חלבון.
  6. צנטריפוגה דגימת TCA מימית של 10% ב-3,500 x גרם למשך 15 דקות ב-8 מעלות צלזיוס.
  7. השתמש במיקרופיפט כדי להעביר את הסופר-נאטנט לצינור 2 מ"ל שכותרתו "שבר חופשי".
  8. Micropipette 400 μL של 10% TCA מימי לתוך צינור צנטריפוגה המכיל את גלולת הדגימה הנותרת ולפרק את הכדור או על ידי תסיסה מערבולת או עם קצה micropipette.
  9. חזור על שלבים 2.6-2.7, העברת supernatant לאותו 2 מ"ל "שבר חופשי" צינור.
  10. מיקרופיפט 400 μL של 10% TCA/אצטון לתוך צינור צנטריפוגה עם הכדור הנותר ולפרק את הכדור עם מערבולת או קצה micropipette.
  11. צנטריפוגה של דגימת 10% TCA/אצטון ב-3,500 x גרם למשך 15 דקות ב-8 מעלות צלזיוס. השתמש במיקרופיפטה כדי להעביר את הסופר-נאטנט לצינור 2 מ"ל שכותרתו "שבר חופשי".
  12. מניחים את צינור "השבר החופשי" כשהמכסה פתוח לתוך מאייד צנטריפוגלי (ראו טבלת חומרים) עד להסרת כל הנוזלים הנדיפים (לפחות שעה אחת).
  13. לאחר שהדגימה נקייה מנוזלים נדיפים, מכסים היטב את הצינור בסרט איטום וחודרים את הסרט בכמה חורים באמצעות פינצב אף חד וארוך. הכניסו את הדגימה למקפיא של −80 מעלות צלזיוס.
  14. הקפיא יבש את הדוגמה "שבר חופשי" על ידי חזרה על כל השלבים בשלב 1.4.
  15. Micropipette 200 μL של 20 mM חומצה הידרוכלורית (HCl) לתוך צינור "שבר חופשי" כדי לשחזר את הדגימה מיובשת בהקפאה ולמקם אותו ב -80 מעלות צלזיוס אחסון מקפיא.
    הערה: "השבר החופשי" של הדגימה מוכן לסינון בשלב 4. הגלולה הנותרת תעובד בהמשך בשלבים הבאים לפיצול חלבון.

3. פיצול של NPAAs הקשורים לחלבון

  1. השתמש בחרט זכוכית כדי לסמן בקבוקוני מעטפת זכוכית עם פרטי הדגימה לזיהוי.
    הערה: חומצה חזקה עלולה לפזר את תיוג הדיו; לכן, מומלץ לחרוט את התוויות על זכוכית.
  2. מיקרופיפט 100 μL של 100 ng/mL D5-2,4-DAB סטנדרטי על גלולת הדגימה (אופציונלי).
  3. Micropipette 400 μL של 100% אצטון על כדור הדגימה ולפרק את הכדור באמצעות תסיסה מערבולת או קצה micropipette.
  4. השתמש במיקרופיפטה של 1 מ"ל שנקבעה ב-1,000 μL כדי להעביר את הכדור השטוף והמוחזר לבקבוקון מעטפת הזכוכית המתאים.
    הערה: ניתן להוסיף עוד 400 μL של 100% אצטון לכדור נסער כדי לסייע בהעברה מלאה של הכדור לתוך בקבוקון קליפת הזכוכית. ניתן לחזור על כך בפעם השלישית במידת הצורך.
  5. צנטריפוגה בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ומפזרת את הנוזל לפסולת ביולוגית.
  6. מניחים את הכדור הנותר לתוך מאייד צנטריפוגלי עד שכל הנוזל מוסר והכדור יבש (~1 שעות).
  7. הכן את בקבוקון ההידרוליזה בוואקום על ידי הוספת 1 מ"ל של 6 M HCl לתחתית בקבוקון ההידרוליזה.
  8. השתמשו בפינצטה כדי להכניס בזהירות את בקבוקוני הקליפה המסומנים המכילים את הדגימות המיובשות לתוך בקבוקון ההידרוליזה, מה שמבטיח מיקום זקוף ויציב.
    הערה: ניתן להשתמש בבקבוקוני קליפה ריקה כדי לסייע בשמירה על בקבוקוני הדגימה זקופים אם מספר הדגימות קטן מהקיבולת של בקבוקון ההידרוליזה.
  9. חבר את המכסה לבקבוקון ההידרוליזה ולחץ את הידית האדומה על המכסה כדי לסגור את השסתום.
  10. הפעל את משאבת הוואקום, חבר את שפופרת הוואקום לראש מכסה בקבוקון ההידרוליזה ולחץ על הידית הירוקה במכסה כדי לפתוח את השסתום.
  11. אפשרו למשאבת הוואקום (ראו טבלת חומרים) להוציא את האוויר מהבקבוקון למשך דקה אחת.
  12. סגור את הבקבוקון על ידי לחיצה על הידית האדומה במכסה בקבוקון ההידרוליזה, כבה את משאבת הוואקום והסר את שפופרת הוואקום.
  13. חברו צינור גומי לברז גז החנקן על ספסל המעבדה ופתחו מעט את הברז. הניחו את האגודל בקצה הצינור, אטמו אותו וספרו עד שהגז מתחיל לברוח כשהלחץ מצטבר. זו תהיה מסגרת הזמן לשלב הבא. התאם את זרימת הגז למסגרת זמן מתאימה.
  14. חבר את הקצה השני של צינור הגומי לראש מכסה בקבוקון הידרוליזה ולאחר מכן מיד לדחוף את הידית הירוקה של המכסה. ספרו את הזמן שנקבע בשלב 3.13 ודחפו במהירות את הידית האדומה על המכסה והסירו את צינור הגומי.
  15. חזור על שלבים 3.10-3.14 פעמיים כדי להבטיח שבקבוקון ההידרוליזה מזכוכית נקי מאוויר ומלא בגז חנקן.
  16. הכניסו את בקבוקון ההידרוליזה לתנור שחומם מראש בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות.
  17. השתמשו בכפפות התנור כדי להסיר את בקבוקון ההידרוליזה מהזכוכית מהתנור ולאפשר לו להתקרר בתוך קולט האדים למשך 10 דקות. בתוך מכסה המנוע, כשאתה פונה אליו הרחק ממך, לחץ על הידית הירוקה כדי לשחרר לחץ וגז.
  18. השתמש בפינצטה כדי להסיר את בקבוקוני הקליפה מבקבוקון ההידרוליזה.
  19. שחזרו את כדורי הדגימה שעברו הידרוליזה על ידי מיקרו-פיפטינג של 200 מיקרו-ליטר של 20 mM HCl לתוך בקבוקון הקליפה. ודא שהכדור עובר החייאה על ידי מערבולת או באמצעות קצה פיפטה.
  20. צנטריפוגה של בקבוקוני הקונכייה המכילים את כדורי הדגימה המשוחזרים למשך 2 דקות ב 5,300 x g ו 25 °C.

4. סינון לדוגמה

  1. תייג צינורות מסנן 2 מ"ל (ראה טבלת חומרים) המכילים מסנני קרום נקבוביות 0.2 מיקרומטר כ"שבר חופשי " ו"שבר חלבון ".
  2. העבר את הדגימות המשוחזרות משלב 2.15 (שבר חופשי) ושלב 3.20 (שבר חלבון) לצינורות הסינון המתאימים.
  3. מניחים אותם בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב 5,000 x גרם ו 25 מעלות צלזיוס.
  4. הסר את המסננים מצינורות המסנן וסגור אותם. הדגימות מוכנות כעת להפקת חומצות אמינו בשלב 5.
    הערה: ניתן להכניס את הדגימות למקפיא −80 מעלות צלזיוס לאחסון לצורך נגזרת וניתוח מאוחרים יותר.

5. נגזרת חומצת אמינו

  1. לגזור את הדגימות באמצעות פרופיל כלורופורמט (PCF)39 או 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוסיסוקסינימידיל קרבמט (AQC)40 בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

Representative Results

המחשה של פרוטוקול החילוץ מופיעה באיור 2 כמדריך עזר מסוכם. התוצאות שהתקבלו על ידי Violi et al.38 נבחרו כדי לייצג תוצאה חיובית מפרוטוקול מיצוי זה לניתוח איזומרים של BMAA מציאנובקטריה. 19 מינים בודדים של ציאנובקטריה גודלו בתרבית מ-11 אתרי מים מתוקים במזרח אוסטרליה. באמצעות אותו פרוטוקול, האיזומרים של BMAA חולצו לשברים חופשיים ולחלבונים, נגזרו באמצעות PCF, ונותחו באמצעות LC-MS/MS. 17 מהאיזולטים הציאנובקטריאליים היו חיוביים ל-BMAA, וכל 19 הכילו את האיזומר 2,4-DAB. תוצאה חיובית מאושרת על ידי שימוש בשיטת LC-MS/MS מאומתת וצפייה בלפחות שלושה מעברים לניטור תגובות מרובות (MRM), אחד כיון קוונטיפייר ושניים כיונים מזהים בזמן השמירה הצפוי. כרומטוגרמה מייצגת של MRM של תקן המכיל BMAA והאיזומרים שלו, המסומנת על-ידי הקווים המקודדים בצבע, מוצגת באיור 3. הנוכחות והריכוז של BMAA ואיזומרים בכל 19 הדגימות, שנחתכו כדי להראות את ריכוז ה-BMAA והאיזומרים בשברים החופשיים והמאוגדים, מסוכמים בטבלה 1. זיהוי חיובי של כל שלושת האיזומרים נצפה בחלק החופשי של מיני ה-Merismopedia שנאספו מאגם לידל (NSW, אוסטרליה), שם השבר החופשי הכיל ריכוז BMAA של 68.38 מיקרוגרם/גרם משקל יבש (DW) ± 2.25 מיקרוגרם/גרם DW, 2,4-DAB עם ריכוז של 1,223.98 מיקרוגרם/גרם DW ± 20.7 מיקרוגרם/גרם DW, ו-AEG בריכוז של 125.27 מיקרוגרם/גרם DW ± 4.19 מיקרוגרם/גרם DW. ה-MRMs הכרומטוגרפיים מוצגים באיור 4. כדי להמחיש תוצאה שלילית עבור BMAA והאיזומרים שלו בדגימה, החלק המאוגד של המין Microcystis flos-aquae שנאסף מ-Walka Water Works (NSW, אוסטרליה) מוצג באופן כרומטוגרפי באיור 5. בעוד שהשבר המאוגד לא הכיל BMAA, 2,4-DAB ו/או AEG, השבר החופשי שלו הכיל את כל שלושת האיזומרים, עם ריכוזים של 79.86 מיקרוגרם/גרם DW ± 1.59 מיקרוגרם/גרם DW, 1,156.15 מיקרוגרם/גרם DW ± 8.46 מיקרוגרם/גרם DW ו-433.83 מיקרוגרם/גרם DW ± 8.92 מיקרוגרם/גרם DW, בהתאמה.

לפיכך, באמצעות שימוש בפרוטוקול זה, Violi et al.38 אישרו את נוכחותם של איזומרים של BMAA בציאנובקטריה של מים מתוקים במזרח אוסטרליה וקבעו לאילו ציאנובקטריה יש יכולות ייצור רעלנים.

Figure 1
איור 1: המבנה הכימי של BMAA והאיזומרים שלו 2,4-DAB ו-AEG. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת ייחוס מסוכמת של פרוטוקול החילוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כרומטוגרמה LC-MS/MS של תקן כיול המכיל D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA ו-AEG לזיהוי איזומרים על בסיס שמירה, המצוין על-ידי הפסגות המודגשות. מפתח: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z ב-6.4 דקות (אדום), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z ב-6.4 דקות (ירוק), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z ב-7.4 דקות (כתום), ו-BMAA 333.01 m/z > 187.10 m/z ב-7.8 דקות (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: כרומטוגרמה LC-MS/MS לזיהוי D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA ו-AEG במיני מריזמופדיה שנאספו מאגם לידל (NSW, אוסטרליה), המסומנים על-ידי הפסגות המודגשות. מפתח: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z ב-6.4 דקות (אדום), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z ב-6.4 דקות (ירוק), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z ב-7.4 דקות (כתום), ו-BMAA 333.01 m/z > 187.10 m/z ב-7.8 דקות (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: כרומטוגרמה LC-MS/MS של בקרה שלילית עבור 2,4-DAB, BMAA ו-AEG בחלק מאוגד של מיני Microcystis flos-aquae שנאספו מ-Walka Water Works (NSW, אוסטרליה). מפתח: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z ב-6.4 דקות (אדום - שיא מודגש), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z ב-6.4 דקות (ירוק), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z ב-7.4 דקות (כתום), ו-BMAA 333.01 m/z > 187.10 m/z ב-7.8 דקות (כחול). הקווים המקווקווים מייצגים את זמני השמירה של 2,4-DAB חסרים, AEG ו-BMAA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: ריכוזי BMAA, AEG ו-2,4-DAB במבודדים ציאנובקטריאליים. ריכוזים ± שגיאת תקן של הממוצע (n = 3). ND מציין שלא זוהה. הריכוז הגבוה ביותר של כל איזומר שזוהה מודגש בירוק. הטבלה היא גרסה שונה של Violi et al.38. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

פרוטוקול המיצוי המתואר כאן לניתוח NPAAs חל על ניתוח חומצות אמינו בדגימות ביולוגיות. עבור מדריכים על בידוד וגידול זנים ציאנובקטריאליים, ניתן להתייחס לשיטות שהוצגו במחקר על ידי Violi et al.38. השלב הראשון בפרוטוקול לוקח את הדגימה לנקודה שבה ניתן להשיג נורמליזציה בין דגימות כנגד המשקל היבש. השלב השני הוא תזה תאית לשחרור האנליטים וניתן לבצעה באמצעות מגוון טכניקות, כולל שיבושים מכניים/ליזות כגון סוניקציית בדיקה כמתואר בפרוטוקול זה, מחזורי הקפאה/הפשרה, שחיקה וכרסום חרוזים, ושיבושים לא מכניים כגון אנזימטי, דטרגנט ו/או תזה כימית. שיבוש מכני ידוע כיתרון על פני לא מכני מכיוון שהוא מאפשר קיבולת גדולה יותר של הדגימה לליזה תוך מתן אפשרות לקשרים ולחלבונים התוך-תאיים להישאר שלמים41, אם כי מטריצת הדגימה עשויה להכתיב את השיטה האופטימלית לליזה של התא.

משקעי חלבון הם השלב השלישי הקריטי של פרוטוקול זה בעת מיצוי חומצות אמינו לניתוח. TCA הוא הממס הנפוץ ביותר; עם זאת, נעשה שימוש גם בחומצה פרכלורית, אצטון, מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE), מתנול ו/או אצטוניטריל 8,42, כאשר כל ממס מיצוי נועד לחלץ ולזרז מצעים שונים. המודל המתואר כאן מחלץ את ה-NPAA BMAA ואת האיזומרים שלו ממטריצה ציאנובקטריאלית, ולמרות שנעשה שימוש במגוון ממסים שונים, שני הממסים הנפוצים ביותר הם 10% TCA במים (מימיים) ו-10% TCA באצטון. באופן כללי, משקעי חלבון עם TCA משמשים בדרך כלל למיצוי חומצות אמינו כדי לפרק חומצות אמינו חופשיות מחומצות האמינו הקשורות לחלבון. בנוסף, מיצוי TCA מאפשר לקבוע את תכולת החלבון הכוללת, להפחית מזהמים עבור החלק החופשי, ולהפחית את הפעילות של פרוטאזות עם השפלה מינימלית של חלבון43. מיצוי ה-TCA של השבר החופשי פועל על ידי שטיפה ראשונית של חומרים מסיסים אורגניים, תוך השארת חלבונים ותרכובות בלתי מסיסות כגון שרידי דופן התא במשקע, ולאחר מכן מיצוי הידרוליזה תרמית של חומצות האמינו הקשורות לחלבון (שבר קשור) באמצעות חומצה חזקה.

הפיצול של החלק החופשי עם 10% TCA מימי בתוספת סוניקציה מייצר את משקעי החלבון הנרחבים ביותר בהשוואה לממיסים אורגניים אחרים44 וחומצת האמינו הטובה ביותר מתאוששת42. מחקרים מסוימים בוחרים להשתמש בחומצה בשילוב עם ממס אורגני (כלומר, 10%-20% TCA באצטון 43) כדי לזרז יותר מולקולות, כולל פפטידים/ביומולקולות קטנות יותר, למזער את פירוק החלבון ולהפחית מזהמים כגון מלחים43. יתרון נוסף של 10% TCA באצטון הוא קצב הייבוש המהיר יותר שלו בהכנת הכדור להידרוליזה, תוך מזעור שאריות הלחות למניעת שינוי חומצות אמינו. עם זאת, 10% TCA מימי בתוספת סוניקציה הם בעלי יעילות מיצוי טובה יותר של חומצות אמינו חופשיות בהשוואה ל-10% TCA באצטון44 בלבד. בנוסף, למשקעי TCA מימיים של 10% יש מגבלות כגון זמן ייבוש ארוך, אי יכולת לזרז את כל החלבונים או פפטידים/ביומולקולות קטנות, ובהתאם לאנליטיט המעניין (כלומר, חלבונים או חומצות אמינו), הדורשים תוספים וחומרים מחזרים כדי למנוע חמצון ופירוק45,46.

פרוטוקול זה משתמש בשילוב של 10% TCA מימי ו-10% TCA באצטון כדי להגדיל את משקעי החלבון, להבטיח זירוז פפטידים/ביומולקולות קטנות יותר, לאפשר זמני ייבוש מהירים יותר של גלולות ולהגביר את יעילות המיצוי, תוך ניצול שתי תכונות מיצוי הממסים. עם זאת, השילוב של 10% TCA מימי ו-10% TCA באצטון יכול לזרז פפטידים/ביומולקולות קטנות בשבר החופשי לאחר ש-10% TCA בסופרנטנט אצטון משולב עם השבר החופשי המיימי. במקרה זה, יש להעביר את המשקעים לחלק המאוגד להידרוליזה.

המחצית השנייה של פרוטוקול זה כוללת שחרור של חומצות אמינו (כלומר, BMAA) מכדור החלבון באמצעות הידרוליזה של אדי חומצה בטמפרטורות גבוהות בסביבה נטולת חמצן. הגורם המגביל בעיקר לשלב ההידרוליזה הוא שזה גוזל זמן ומייגע להכין. הדגירה למשך הלילה מונעת הכנה וניתוח מהירים וחסכוניים בזמן של הדגימה. בנוסף, ההעברה הכמותית של הכדור מצינור צנטריפוגה לבקבוקון פגז (שלב 3.4) היא תהליך מפרך הדורש חריצות וסבלנות כדי להבטיח נקודה מדויקת של נורמליזציה למשקל היבש. בעיות אפשריות שהמשתמש עלול להתמודד איתן הן העברה לא שלמה של הכדור, חלבונים רטובים הנדבקים לקצות הפיפטה ולצינור המקורי, וחלקיקים מוצקים של הכדור החוסמים את קצה הפיפטה. הצעה מעשית בסיוע להעברה קלה יותר של הכדור היא להסיר כ-0.3-0.5 מ"מ מקצה קצה הפיפטה בעזרת זוג מספריים, מה שיאפשר למשוך חלקיקי גלולה גדולים יותר ולשחררם לתוך בקבוקון הקליפה. שיטת העברה זו מקובלת למיצוי חלבונים עבור כל ניתוחי חומצות האמינו. עם זאת, יש לחקור שינויים לשיפור היעילות והדיוק של העברה כמותית של הכדור לתוך בקבוקון הקליפה.

ניתן להשתמש בשתי צורות של טכניקות הידרוליזה כדי לשחרר חומצות אמינו ממצבן הקשור לחלבון: הידרוליזה בפאזה נוזלית והידרוליזה של אדי חומצה. הידרוליזה בפאזה נוזלית, הכוללת תוספת של 6 M HCl על הדגימה, אשר ממוקמת לאחר מכן בתנור של 110 מעלות צלזיוס למשך הלילה, היא חלופה להידרוליזה של אדי חומצה המתוארת בפרוטוקול זה. טכניקות מיצוי המשתמשות בהידרוליזה בשלב נוזלי עשויות לדרוש עיבוד נוסף, כגון התפלה, במיוחד אם נבחרה נגזרת AQC, מכיוון שהיא דורשת תנאים בסיסיים לתיוג40. הידרוליזה של אדי חומצה מונעת התפלה ומאפשרת למשתמש את החופש לבחור בטכניקת הנגזרת עם שחזור הכדור הסופי לפני הסינון. יתר על כן, ללא תלות בשיטת ההידרוליזה שנבחרה, הדגימות עשויות לדרוש עיבוד נוסף, כגון SPE לטיהור מטריצה וריכוז 29,47,48, בהתאם לבחירת טכניקת הנגזרת ו/או ניתוח אנליטי (למשל, LC-MS/MS בפאזה הפוכה לעומת כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית [HILIC] LC-MS/MS 37 ). שחזור הכדור הסופי ב-20 mM HCl בפרוטוקול זה מתאים לגזירה באמצעות ריאגנטים PCF48באמצעות ערכת הידרוליזה של חומצת אמינו זמינה מסחרית39 (ראו טבלת חומרים). הן AQC והן PCF יפיקו את כל חומצות האמינו, החלבון והלא-חלבונים שמקורם בדגימה, והסלקטיביות של האנליטים מתקבלת באמצעות שימוש ב-LC-MS/MS והשילוב של התאמת זמן שמירה ובחירה זהירה של ה-MRMs38 הקוונטיפייר והמאשר. 

פרוטוקולי ההידרוליזה הנוכחיים אינם מותאמים לשחרור BMAA, 2,4-DAB ו-AEG אלא ל-22 חומצות אמינו חלבוניות המבוססות על שיטות קיימות להידרוליזה של חלבונים 32, שבהן דגירה למשך יותר מ-18 שעות גורמת לפירוק ושינוי של חומצות אמינו מסוימות, המשפיעה על ניתוח LC-MS/MS, ולכן על הריכוזים המתקבלים32. Beach et al.49 חקרו הידרוליזה לאורך זמן (0.5-120 שעות) כדי לייעל הידרוליזה לניתוח BMAA וחומצות אמינו פרוטאינוגניות. הם מצאו שלמרות שהיה שחרור מהיר מוקדם של BMAA במהלך 0.5 השעות הראשונות של ההידרוליזה, רמות ה-BMAA המשיכו לעלות ככל שזמן ההידרוליזה עלה, ללא השפלה, גם לאחר 5 ימים49. ישנן גם השקפות ושאלות שונות לגבי האופי האמיתי של BMAA קשור והאיזומרים שלו, כאשר כמה מחקרים מציעים כי במקום BMAA קשר 50,51 או שילוב שגוי לתוך חלבונים14, BMAA-חלבון האגודה היא שטחית52. עם זאת, הקונצנזוס הנוכחי בניתוח של BMAA "כרוך" דורש את שלב ההידרוליזה המאומת והמקובל שמפרק פפטידים/חלבונים כדי לשחרר חומצות אמינו, ולכן, BMAA והאיזומרים שלו.

שיעורי ההתאוששות של 20 חומצות אמינו חלבוניות נקבעו במחקר של Sedgwick et al.42 באמצעות מיצוי TCA, וכתוצאה מכך כ-100% התאוששות. במקרה של BMAA והאיזומרים שלו ממטריצות אצות, מחקרים שהשוו את היעילות של מיצוי BMAA באמצעות ממיסים מיצוי שונים מצאו כי 10% TCA הוא היעיל ביותר עבור BMAA27 בחינם. שיעורי ההתאוששות של BMAA הקשור לחלבון שחולצו באמצעות הידרוליזה בפאזה נוזלית נקבעו במחקרים של Glover et al.25 ועל ידי Faassen et al.53, שם הדיוק נקבע על ידי שיטות התאוששות מחודדות, עם שיעור התאוששות BMAA ממוצע של 108.6% ו-70%, בהתאמה. Faassen et al. תיארו נהלים לניסויים בהתאוששות ספייק והדגימו כיצד ההתאוששות שונה בהתאם לשלב תהליך החילוץ של הספייקנעשה 53. Faassen et al. קבעו בנוסף את היעילות של פרוטוקול אדי החומצה שהוצג כאן, עם שיעורי התאוששות של 83.6% עבור איזומרים BMAA שעלו לפני מיצוי ו-68.6% עבור אלה שזינקו לפני הידרוליזה24. שחזורים, שיטות מיצוי וניתוחים אלה אומתו עוד יותר על ידי Banack 26, עם שיעורי התאוששות של 94%-106% עבור BMAA במטריצה ציאנובקטריאלית וסטיית תקן יחסית (%RSD) בין 5.6%ל-20%, העומדים בקריטריונים של ה-FDA לדיוק54. מומלץ שכל מעבדה תקבע תחילה את שיעורי ההתאוששות והדיוק שלה לפני שתשתמש בפרוטוקול זה באמצעות ניסויי התאוששות ספייק. ניתן לעקוב אחר שיטות השחזור המוצגות ב- Faassen et al.53 ו- Glover et al.25 כמדריך.

ניתן להשתמש בצורות חלופיות של טכניקות הידרוליזה במקום הידרוליזה בתנור לילה למיצוי מהיר יותר של האנליט הקשור לחלבון. לדוגמה, מחלץ מיקרוגל יכול להפחית באופן משמעותי את זמן ההידרוליזה מ-24 שעות ל-10 דקות55 בלבד. הידרוליזה במיקרוגל לחומצות אמינו משתמשת באותם עקרונות כמו השיטה התרמית הקונבנציונלית, באמצעות תא כפפות להכנת והרכבת כלי המיקרוגל בסביבה נטולת חמצן והוספת 6 M HCl. לאחר אטום לאוויר, כלי המכיל את הדגימה עובר קרינת מיקרוגל. הידרוליזה במיקרוגל שימשה לחילוץ חומצות אמינו ממטריצות דגימה שונות56,57,58; עם זאת, הידרוליזה של מיקרוגל טרם פותחה ואומתה לניתוח BMAA.

לסיכום, 10% משקעי חלבון TCA מימיים הם השיטה האופטימלית לחילוץ חומצות אמינו חופשיות שאינן חלבוניות ממטריצות ציאנובקטריאליות27, והידרוליזה תרמית מספקת מיצוי אמין וניתן לשחזור של החלק הקשור לחלבון. פרוטוקול זה לחילוץ NPAA BMAA והאיזומרים שלו מציאנובקטריה מאומת ומקובל. כיוונים עתידיים לייעול נוסף של מיצוי BMAA יתמקדו בשלב ההידרוליזה, המתבצע על פי המפרטים של 22 חומצות האמינו החלבון. עם זאת, פרוטוקול החילוץ המוצג כאן עדיין צריך להיחשב יעיל ואפקטיבי לניתוח BMAA והאיזומרים שלו באמצעות LC-MS/MS.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

D.P.B., K.J.R., ו-S.M.M. נתמכים על ידי קרן איאן פוטר, ו-J.P.V. זוכה בתוכנית הכשרה למחקר של ממשלת אוסטרליה, Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, P. O. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. Miflin, B. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 225-269 (1980).
  2. Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
  3. Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
  4. Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. , Academic Press. Cambridge, MA. 21-29 (2015).
  5. Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
  6. Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson's disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
  7. Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
  8. Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
  9. Hashiguchi, A., Komatsu, S. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. Shukla, A. K. , Academic Press. Cambridge, MA. 97-113 (2017).
  10. Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
  11. Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
  12. Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
  13. Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer's disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
  14. Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
  15. Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
  16. Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
  17. Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
  18. Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
  19. Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
  20. Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
  21. Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
  22. Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
  23. Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
  24. Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
  25. Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
  26. Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
  27. Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
  28. Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
  29. Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
  30. Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
  31. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
  32. Davidson, I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. Smith, B. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 111-122 (2003).
  33. Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
  34. Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
  35. Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
  36. Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
  37. Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
  38. Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
  39. Phenomenex. EZ:faast For Amino Acid Analysis of Protein Hydroysates by LC-MS. User's Manual. , Available from: http://phx.phenomenex.com/lib/3882_L6_LC_MS.pdf (2005).
  40. AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters. , Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014).
  41. D'Hondt, E., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 133-154 (2017).
  42. Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
  43. Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
  44. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  45. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  46. Novák, P., Havlíček, V. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). Ciborowski, P., Silberring, J. , Elsevier. 51-62 (2016).
  47. Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
  48. Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
  49. Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
  50. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
  51. Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
  52. van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
  53. Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
  54. Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
  55. Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
  56. Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
  57. Chen, S. -T., Chiou, S. -H., Chu, Y. -H., Wang, K. -T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
  58. Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).

Tags

כימיה גיליון מס' 190 חומצת אמינו משקעי חלבונים חומצה טריכלורואצטית (TCA) חומצת אמינו שאינה חלבונית BMAA ציאנובקטריה
מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P.,… More

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Rodgers, K. J., Bishop, D. Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (190), e63779, doi:10.3791/63779 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter