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Chemistry

तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए साइनोबैक्टीरिया से गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड का निष्कर्षण

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण से पहले ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) प्रोटीन वर्षा और एसिड हाइड्रोलिसिस के माध्यम से जैविक मैट्रिक्स से गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड के निष्कर्षण का वर्णन करता है।

Abstract

गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड (एनपीएए) अमीनो एसिड (एए) का एक बड़ा वर्ग है जो प्रोटीन में अनुवाद के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड नहीं हैं। एनपीएए का विश्लेषण सेलुलर अपटेक और / या फ़ंक्शन, चयापचय मार्गों और संभावित विषाक्तता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। β-मिथाइलएमिनो-एल-एलानिन (बीएमएए) विभिन्न शैवाल प्रजातियों द्वारा निर्मित एक न्यूरोटॉक्सिक एनपीएए है और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है, जिसने महत्वपूर्ण शोध रुचि पैदा की है। विश्लेषण के लिए एए निकालने के कई तरीके हैं, तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री सबसे आम है, प्रोटीन पेलेट के एसिड हाइड्रोलिसिस के बाद प्रोटीन वर्षा की आवश्यकता होती है। अल्गल प्रजातियों में बीएमएए की उपस्थिति पर अध्ययन विरोधाभासी परिणाम प्रदान करते हैं, जिसमें अमान्य नमूना तैयारी / निष्कर्षण और विश्लेषण का उपयोग एक प्राथमिक कारण है। अधिकांश एनपीएए की तरह, 10% जलीय टीसीए में प्रोटीन वर्षा और फ्यूमिंग एचसीएल के साथ हाइड्रोलिसिस बीएमएए और इसके आइसोमर्स एमिनोइथाइलग्लाइसिन (एईजी) और 2,4-डायमिनोब्यूट्रिक एसिड (2,4-डीएबी) के लिए निष्कर्षण का सबसे उपयुक्त रूप है। वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली एक मान्य एनपीएए निष्कर्षण विधि में चरणों का वर्णन करता है।

Introduction

अमीनो एसिड रासायनिक यौगिक होते हैं जिनमें कम से कम एक अमाइन और कार्बोक्जिलिक कार्यात्मक समूह होता है। कुछ अमीनो एसिड में एक इमिनो समूह भी होता है, कार्बोक्जिलिक के अलावा एक कार्यात्मक एसिड समूह; अन्य अमीनो एसिड में अमाइन समूह होते हैं जो α-कार्बन समूह1 से जुड़े नहीं होते हैं। 500 से अधिक अमीनो एसिड हैं2, जिनमें से 22 को राइबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण 3 में आनुवंशिक कोडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन अमीनो एसिड के रूप में जाना जाताहै। इन 22 अमीनो एसिड को आगे आवश्यक और गैर-आवश्यक में विभाजित किया जा सकता है। एक जीव को ठीक से काम करने के लिए आवश्यक अमीनो एसिड आवश्यक हैं और केवल बाहरी स्रोतों द्वारा प्राप्त किए जा सकते हैं। गैर-आवश्यक अमीनो एसिड जीव के भीतर संश्लेषित किया जा सकता है। 22 अमीनो एसिड का आवश्यक / गैर-आवश्यक में वर्गीकरण व्यक्तिगत प्रजातियों के लिए अद्वितीय है। अन्य सभी अमीनो एसिड गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड (एनपीएए) हैं जो प्रोटीन संश्लेषण के लिए एन्कोडेड नहीं हैं। अमीनो एसिड, चाहे प्रोटीन या गैर-प्रोटीन, एक जीव के भीतर एक सिग्नलिंग भूमिका भी निभा सकते हैं और चयापचयमध्यस्थों के रूप में कार्य कर सकते हैं। उनकी महत्वपूर्ण और अलग-अलग भूमिकाओं के कारण, अमीनो एसिड का स्तर जीव की स्थिति, कार्यक्षमता और चयापचय मार्गों आदि में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। दो मुख्य तंत्र हैं जिनके द्वारा अमीनो एसिड को पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में शामिल किया जा सकता है: राइबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण, जो एन्कोडिंग में 22 अमीनो एसिड का उपयोग करता है, और गैर-राइबोसोमल पेप्टाइड संश्लेषण, जो प्रोटीन अमीनो एसिड के साथ, संश्लेषण में कुछ एनपीएए के उपयोग की अनुमति देता है। कुछ एनपीएए प्रोटीन अमीनो एसिड की नकल कर सकते हैं, संभावित रूप से पेप्टाइड्स और प्रोटीन में उनके गलत समावेश का कारण बन सकते हैं। गलत निगमन प्रोटीन के मिसफोल्डिंग का कारण बनता है, जो बदले में, हानिकारक प्रभावडालता है, जैसे कि टायरोसिन के स्थान पर एनपीएए एल -3,4 डायहाइड्रोक्सीफेनिलएलनिन (एल-डोपा) का गलत निगमन, सेलुलर फ़ंक्शन और स्वास्थ्य 6,7 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। शामिल एनपीएए का एक अतिरिक्त स्रोत अमीनो एसिड अवशेषों के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) के माध्यम से है। अमीनो एसिड अवशेषों को विभिन्न कारणों से संशोधित किया जाता है, जिसमें पेप्टाइड या प्रोटीन रचना, स्थिरता और कार्यक्षमता में परिवर्तन शामिल हैं। पीटीएम युक्त प्रोटीन या पेप्टाइड्स के हाइड्रोलिसिस पर, इन संशोधित अमीनो एसिड अवशेषों को उनके मुक्त एनपीएए फॉर्म 8,9 में जारी किया जाता है।

साइनोबैक्टीरिया, डायटम और डाइनोफ्लैगलेट्स10 द्वारा निर्मित एनपीएए β-मिथाइलएमिनो-एल-एलेनिन (बीएमएए) एक संदिग्ध न्यूरोटॉक्सिन है जिसे विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस / पार्किंसनिज़्म-डिमेंशिया कॉम्प्लेक्स (एएलएस-पीडीसी) 11,12, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस और अल्जाइमर रोग13 के लिए एक योगदान कारक के रूप में फंसाया जाता है। . यह सुझाव दिया जाता है कि बीएमएए को गलती से एल-सेरीन14 और / या अन्य प्रोटीन अमीनो एसिड के स्थान पर प्रोटीन की पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में शामिल किया जाता है। बीएमएए के गलत निगमन से प्रोटीन की मिसफोल्डिंग हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स 14 में प्रोटीन समुच्चय का जमाव होसकता है। पिछले दशक में, बीएमएए में रुचि काफी बढ़ी है। मीठे पानी, समुद्री और खारे वातावरण से साइनोबैक्टीरियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला को बीएमएए15 का उत्पादन करने के लिए खोजा गया है, जिससे विभिन्न पारिस्थितिकतंत्रों में उनका व्यापक वितरण 16,17 हो गया है। इसके अतिरिक्त, बीएमएए को खाद्य श्रृंखला के माध्यम से मानव खाद्य वेब18,19 में बायोमैग्नेफाई करने के लिए दिखाया गया है। संभावित स्वास्थ्य प्रभावों, समझ की कमी और बीएमएए विषाक्तता की असंगतता के कारण, आगे के शोध को जारी रखना अनिवार्य है जब तक कि बीएमएए की विषाक्तता को अंततः समझा नहीं जाता है या बीएमएए को सुरक्षित माना जाता है।

जैविक नमूनों में अमीनो एसिड के विश्लेषण को चार मुख्य चरणों में विभाजित किया जा सकता है: नमूना तैयार करना, एमिनो एसिड व्युत्पन्न, पृथक्करण और पता लगाना, और पहचान और परिमाणीकरण। तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) पसंदीदा विश्लेषण विधि है क्योंकि यह अमीनो एसिड का लक्षित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पृथक्करण और विश्लेषण प्रदान करता है।

साइनोबैक्टीरियल और अन्य अल्गल नमूनों का विश्लेषण करने के लिए नमूना तैयारी तकनीकों में मुख्य रूप से अमीनो एसिड के लिए उनके मुक्त और प्रोटीन-बाध्य रूपों में एक निष्कर्षण विधि शामिल है। वर्षों से, निष्कर्षण विधियां सामान्य तत्वों के साथ अपेक्षाकृत सुसंगत रही हैं, जिसमें मुक्त अमीनो एसिड को उनके बाध्य रूप से अलग करने के लिए नमूने का विघटन शामिल है, इसके बाद प्रोटीन वर्षा और उच्च तापमान पर हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ हाइड्रोलिसिस के माध्यम से बाध्य अमीनो एसिड की रिहाईशामिल है। . इस निष्कर्षण रूप को प्रोटीन अमीनो एसिड के लिए अनुकूलित किया गया है और एनपीएए के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, सायनोबैक्टीरिया की एक ही प्रजाति में बीएमएए और इसके आइसोमर्स (चित्रा 1), एमिनोइथाइलग्लाइसिन (एईजी) और 2,4-डायमिनोब्यूट्रिक एसिड (2,4-डीएबी) का पता लगाने और परिमाणीकरण ने साहित्य में असंगत परिणाम दिखाए हैं, जिसमें विकास की स्थिति और / या शैवाल के तनाव में अंतर है जो बीएमएए23 की अलग-अलग या कोई मात्रा पैदा नहीं करता है। . यह तर्क दिया गया है कि बीएमएए और इसके आइसोमर्स का पता लगाने और परिमाणीकरण में विसंगतियों के लिए एक अधिक संभावित स्पष्टीकरण अमान्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, विश्लेषणात्मक तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग और रिपोर्ट किए गए तरीकों में अपर्याप्त प्रयोगात्मक विवरणके कारण है। हालांकि, ग्लोवर एट अल.25 और बैनैक26 ने हाल ही में इंटरनेशनल सोसाइटी ऑफ एनालिटिकल केमिस्ट्स (एओएसी), यूएस फार्माकोपिया और एकल-प्रयोगशाला सत्यापन के लिए आवश्यक एफडीए दिशानिर्देशों के अनुसार अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (यूपीएलसी)-एमएस/एमएस का उपयोग करके बीएमएए और इसके आइसोमर्स का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक विकसित और मान्य की है।

इन सत्यापन प्रयोगों ने बीएमएए और उसके आइसोमर्स के पृथक्करण और पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया और नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में विसंगतियों को संबोधित नहीं किया। एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से साइनोबैक्टीरियल नमूनों में बीएमएए और इसके आइसोमर्स को निर्धारित करने के लिए तीन सामान्य निष्कर्षण विधियों के प्रदर्शन की तुलना की: मुक्त अमीनो एसिड28,29 के ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई); मेथनॉल निष्कर्षण और एसीटोन वर्षा30 से जुड़ी एक प्रोटीन वर्षा विधि; और बीएमएए के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली निष्कर्षण विधि, ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) 31 के साथ प्रोटीन वर्षा। उन्होंने निष्कर्ष निकाला कि टीसीए प्रोटीन वर्षा इष्टतम प्रोटोकॉल था, जिससे अन्य निष्कर्षण विधियों की तुलना में परीक्षण नमूनों में उच्च बीएमएए सांद्रता प्राप्त हुई। उनके अध्ययन ने एक साइनोबैक्टीरिया मैट्रिक्स में 6-एमिनोक्विनोलिन-एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमिडिल कार्बामेट (एक्यूसी) का उपयोग करके बीएमएए के व्युत्पन्नीकरण के साथ टीसीए निष्कर्षण को मान्य किया, जो विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बीएमएए डेटा प्राप्त करने के लिए एक स्थापित मार्गदर्शिका प्रदान करता है। टीसीए एमिनो एसिड निष्कर्षण एक स्वीकृत और सामान्य नमूना तैयारी तकनीक है जिसे अन्य मैट्रिक्स पर भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, हाइड्रोलिसिस के दौरान अमीनो एसिड की स्थिरता को गिरावट या ऑक्सीकरण को रोकने के लिए विचार करने की आवश्यकता है, जिसे रासायनिक संशोधक के उपयोग और एजेंटों को कम करने के साथ दूर किया जा सकताहै। टीसीए निष्कर्षण नियमित रूप से नए शोध छात्रों को उपयोग और सिखाया जाता है, और हालांकि प्रोटोकॉल व्यापक रूप से रिपोर्ट किया जाता है, इस पद्धति के आवेदन में एक दृश्य सहायता एक मूल्यवान संसाधन है, जो उचित और सुसंगत निष्पादन सुनिश्चित करती है।

रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग आमतौर पर अमीनो एसिड को अलग करने के लिए किया जाता है, जिसके विश्लेषण से पहले एक व्युत्पन्न चरण की आवश्यकता होती है। बीएमएए जैसे अमीनो एसिड का अपघटन क्रोमैटोग्राफिक प्रतिधारण की अनुमति देता है और आइसोमर्स के बीच संकल्प बढ़ा सकता है। यह आणविक द्रव्यमान को भी बढ़ाता है और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में आयनीकरण में सुधार करता है। एमएस के माध्यम से अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए कई व्युत्पन्न अभिकर्मकों का उपयोग किया गया है, जिसमें प्रोपाइल क्लोरोफॉर्मेट (पीसीएफ) 33, 6-एमिनोक्विनोलिन-एन-हाइड्रोसिसुसिकिनिमिडिल कार्बामेट (एक्यूसी)27, 9-फ्लोरेनिलमिथाइलमिथाइल क्लोरोफॉर्मेट (एफएमओसी)34, और डैनसिल क्लोराइड (डीसी)35 शामिल हैं। हालांकि, बीएमएए का विश्लेषण करने के लिए एकमात्र मान्यतकनीकों ने पीसीएफ 36 या एक्यूसी 24,26,37 को अपने उपहास अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया।

इस प्रोटोकॉल का दायरा साइनोबैक्टीरियल मैट्रिसेस से एनपीएए के टीसीए निष्कर्षण पर केंद्रित है। यह एक श्रम-गहन विधि है जिसे नियमित रूप से अकादमिक और उद्योग अनुसंधान प्रयोगशालाओं में पांडुलिपियों के आधार पर उपयोग और पढ़ाया जाता है जो विस्तार से कम हो सकते हैं; इसलिए, यह प्रोटोकॉल मॉडल एमिनो एसिड के रूप में मुक्त और बाध्य बीएमएए के विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने में शामिल प्रक्रिया और तकनीकों का विवरण प्रदान करता है।

Protocol

सायनोबैक्टीरिया प्रजाति मेरिस्मोपेडिया का उपयोग वर्तमान अध्ययन38 के लिए किया गया था।

1. कच्चे नमूने की तैयारी

  1. एल्गल मैल को रुचि के जलीय स्रोत से या साइनोबैक्टीरियल सुसंस्कृत फ्लास्क से इकट्ठा करें और इसे 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब38 में रखें।
    नोट: नमूना बाद के निष्कर्षण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होना चाहिए और निम्नलिखित चरण से पहले पिघलना चाहिए।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,500 x g पर नमूना युक्त ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एक अपशिष्ट कंटेनर में डुबोएं और इसे जैविक कचरे में फेंक दें।
    नोट: सतह पर तैरने वाला एक्सोसोम के भविष्य के विश्लेषण के लिए आरक्षित हो सकता है।
  3. नमूना गोली युक्त ट्यूब को सीलिंग फिल्म के साथ सुरक्षित रूप से कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक तेज, लंबी नाक चिमटी का उपयोग करके फिल्म में कुछ छेद छेद करें। ट्यूब को 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सीधी स्थिति में स्टोर करें।
  4. फ्रीज ड्रायर को 0.1 एमबार और -80 डिग्री सेल्सियस (~ 30 मिनट) पर चालू और समतुल्य करें।
    नोट: पैरामीटर (चरण 1.4) वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्रीज ड्रायर के लिए अनुकूलित हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रयोगशाला में उपलब्ध फ्रीज ड्रायर मॉडल के अनुसार मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें या सबसे कम संभव तापमान सेट करें यदि फ्रीज ड्रायर मॉडल -80 डिग्री सेल्सियस जितना कम नहीं जाता है।
    1. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को फ्रीज ड्रायर ग्लास कंटेनर में सीधा रखें और जार को ठंडा करने के लिए 5 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के अंदर रखें।
    2. फ्रीजर से ग्लास कंटेनर निकालें और रबर का ढक्कन संलग्न करें।
    3. सुनिश्चित करें कि फ्रीज ड्रायर के रबर वाल्व आउटलेट पर हैंडल वायुमंडल में निकाला गया है (ऊपर की ओर इशारा करते हुए) और ग्लास कंटेनर को मजबूती से संलग्न करें।
    4. रबर वाल्व आउटलेट के हैंडल को वैक्यूम में उजागर करने के लिए बहुत धीरे-धीरे इंगित करने वाली स्थिति में घुमाएं और सभी तरल के उच्चीकरण को सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे तक फ्रीज-सुखाने की अनुमति दें।
    5. जार में वैक्यूम छोड़ने के लिए, हैंडल को ऊपर की ओर इशारा करने वाली स्थिति में घुमाएं, ग्लास कंटेनर को अलग करें, और फ्रीज-सूखे नमूने हटा दें।
  5. 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 15-50 मिलीग्राम सूखे नमूना छर्रों का वजन करने के लिए एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करें।
    नोट: नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में रखा जा सकता है यदि इस स्तर पर आगे संसाधित नहीं किया जाता है।

2. मुक्त एनपीएए का सेल लाइसिंग और फ्रैक्शनेशन

  1. नमूना ट्यूब (वैकल्पिक) में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके डी 5-2,4-डीएबी ( सामग्री की तालिका देखें) मानक के 100 एनजी / एमएल का 100 μL जोड़ें।
  2. डी5-2,4-डीएबी मानक को जोड़ते हुए, क्रमशः 10% w/v जलीय ट्राइक्लोरोएसिटिक (TCA, सामग्री की तालिका देखें) या 11.7% -13.3% TCA के 300-600 μL का 300-600 μL जोड़ें।
    नोट: जलीय टीसीए की मात्रा चुनें जो गोली को पूरी तरह से कवर करता है।
  3. नमूना ट्यूबों को कुचल बर्फ से भरे कंटेनर में रखें।
  4. मध्यम-उच्च शक्ति (70%) पर एक प्रोब सोनिकेटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए 1 मिनट के लिए नमूने को लाइस करें।
    सावधानी: शोर-रद्द करने वाले यरमफ के उपयोग के साथ उचित पीपीई सुनिश्चित करें।
    1. दरवाजे पर इन-यूज साइनेज लगाकर, फ्यूम हुड में सोनिकेशन करके और शोर-रद्द करने वाले इरमफ का उपयोग करके जांच सोनिकेटर के उपयोग की तैयारी में उचित सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. सोनिकेटर पर स्विच करें और निम्नलिखित पैरामीटर दर्ज करें: आयाम, 70%; समय, 1 मिनट।
    3. एक लिंट-फ्री पेपर वाइप पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें ( सामग्री की तालिका देखें) और जांच को मिटा दें।
    4. नमूने में जांच के अंत को पूरी तरह से डुबोएं, और शुरू करें।
    5. जब प्रोब सोनिकेटर बंद हो जाता है, तो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 1 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना रखें।
    6. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को अलग किया गया है, चरण 2.4.3-2.4.5 को एक बार फिर दोहराएं।
  5. प्रोटीन वर्षा की अनुमति देने के लिए नमूने को 12-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
  6. 8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3,500 x g पर 10% जलीय टीसीए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. "फ्री फ्रैक्शन" लेबल वाले 2 एमएल ट्यूब में सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
  8. माइक्रोपिपेट 400 μL 10% जलीय टीसीए को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालता है जिसमें शेष नमूना गोली होती है और पेलेट को भंवर आंदोलन या माइक्रोपिपेट टिप के साथ तोड़ देता है।
  9. चरण 2.6-2.7 दोहराएं, सुपरनैटेंट को उसी 2 एमएल "फ्री फ्रैक्शन" ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. एसीटोन के माइक्रोपिपेट 400 μL शेष गोली के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रवेश करते हैं और पेलेट को भंवर या माइक्रोपिपेट टिप के साथ तोड़ते हैं।
  11. एसीटोन नमूने को 3,500 x g पर 8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। "फ्री फ्रैक्शन" लेबल वाले 2 एमएल ट्यूब में सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
  12. ढक्कन के साथ "फ्री फ्रैक्शन" ट्यूब को एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरणकर्ता में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि सभी वाष्पशील तरल पदार्थ हटा नहीं दिए जाते (कम से कम 1 घंटे)।
  13. एक बार जब नमूना वाष्पशील तरल पदार्थ से मुक्त हो जाता है, तो ट्यूब को सीलिंग फिल्म के साथ सुरक्षित रूप से कवर करें और तेज, लंबी नाक चिमटी का उपयोग करके फिल्म को कुछ छेदों के साथ छेद दें। नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  14. चरण 1.4 में सभी चरणों को दोहराकर "फ्री फ्रैक्शन" नमूने को फ्रीज करें।
  15. फ्रीज-सूखे नमूने को पुनर्गठित करने और इसे -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भंडारण में रखने के लिए "फ्री फ्रैक्शन" ट्यूब में 20 एमएम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का माइक्रोपिपेट 200 μL।
    नोट: नमूना का "मुक्त अंश" चरण 4 में निस्पंदन के लिए तैयार है। शेष गोली को प्रोटीन फ्रैक्शनेशन के लिए निम्नलिखित चरणों में आगे संसाधित किया जाएगा।

3. प्रोटीन-बाध्य एनपीएए का विभाजन

  1. पहचान के लिए नमूना विवरण के साथ ग्लास शेल शीशियों को लेबल करने के लिए ग्लास उत्कीर्णक का उपयोग करें।
    नोट: मजबूत एसिड स्याही लेबलिंग को नष्ट कर सकता है; इसलिए, ग्लास पर लेबल को उत्कीर्ण करने की सिफारिश की जाती है।
  2. नमूना गोली (वैकल्पिक) पर 100 एनजी / एमएल डी 5-2,4-डीएबी मानक के माइक्रोपिपेट 100 μL।
  3. नमूना गोली पर 100% एसीटोन के माइक्रोपिपेट 400 μL और भंवर आंदोलन या माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके गोली को तोड़ दें।
  4. धुले हुए और पुन: निलंबित गोली को संबंधित ग्लास शेल शीशी में स्थानांतरित करने के लिए 1,000 μL पर 1 एमएल माइक्रोपिपेट सेट का उपयोग करें।
    नोट: कांच के खोल शीशी में गोली के पूर्ण हस्तांतरण में सहायता के लिए उत्तेजित गोली में 100% एसीटोन का एक और 400 μL जोड़ा जा सकता है। यदि आवश्यक हो तो इसे तीसरी बार दोहराया जा सकता है।
  5. सेंट्रीफ्यूज 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8,000 x g पर और तरल को जैविक अपशिष्ट में विभाजित करता है।
  6. शेष गोली को एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरणकर्ता में रखें जब तक कि सभी तरल हटा न जाएं और गोली सूख न जाए (~ 1 घंटे)।
  7. हाइड्रोलिसिस शीशी के तल में 6 एम एचसीएल के 1 एमएल जोड़कर वैक्यूम हाइड्रोलिसिस शीशी तैयार करें।
  8. सूखने वाले नमूनों वाले लेबल शेल शीशियों को हाइड्रोलिसिस शीशी में सावधानीपूर्वक डालने के लिए चिमटी का उपयोग करें, जिससे एक सीधी, स्थिर स्थिति सुनिश्चित हो सके।
    नोट: खाली शेल शीशियों का उपयोग नमूना शीशियों को सीधा रखने में मदद करने के लिए किया जा सकता है यदि नमूनों की संख्या हाइड्रोलिसिस शीशी की क्षमता से कम है।
  9. ढक्कन को हाइड्रोलिसिस शीशी से जोड़ें और वाल्व को बंद करने के लिए ढक्कन पर लाल घुंडी को धक्का दें।
  10. वैक्यूम पंप को चालू करें, वैक्यूम ट्यूब को हाइड्रोलिसिस शीशी ढक्कन के सिर से संलग्न करें, और वाल्व खोलने के लिए ढक्कन पर हरे नॉब को दबाएं।
  11. वैक्यूम पंप ( सामग्री की तालिका देखें) को 1 मिनट के लिए शीशी से हवा को हटाने की अनुमति दें।
  12. हाइड्रोलिसिस शीशी ढक्कन पर लाल घुंडी को निराश करके शीशी को बंद करें, वैक्यूम पंप को बंद करें, और वैक्यूम ट्यूब को हटा दें।
  13. प्रयोगशाला बेंच पर नाइट्रोजन गैस टैप के लिए एक रबर ट्यूब संलग्न करें और नल को थोड़ा खोलें। अंगूठे को ट्यूब के अंत में रखें, इसे सील करें, और तब तक गिनती करें जब तक कि दबाव बनने पर गैस बच न जाए। यह अगले कदम के लिए समय सीमा होगी। गैस प्रवाह को एक उपयुक्त समय सीमा में समायोजित करें।
  14. रबर ट्यूब के दूसरे छोर को हाइड्रोलिसिस शीशी ढक्कन के सिर से जोड़ें और फिर तुरंत ढक्कन के हरे घुंडी को धक्का दें। चरण 3.13 में निर्धारित समय की गणना करें और जल्दी से ढक्कन पर लाल घुंडी को धक्का दें और रबर ट्यूब को हटा दें।
  15. चरण 3.10-3.14 को दो बार दोहराएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ग्लास हाइड्रोलिसिस शीशी हवा से मुक्त है और नाइट्रोजन गैस से भरी हुई है।
  16. हाइड्रोलिसिस शीशी को 16-18 घंटे के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट ओवन सेट में रखें।
  17. ओवन से ग्लास हाइड्रोलिसिस शीशी को हटाने के लिए ओवन दस्ताने का उपयोग करें और इसे 10 मिनट के लिए फ्यूम हुड के अंदर ठंडा होने दें। फ्यूम हुड के अंदर, इसे आपसे दूर रखते हुए, दबाव और गैस छोड़ने के लिए हरे रंग की घुंडी को धक्का दें।
  18. हाइड्रोलिसिस शीशी से शेल शीशियों को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
  19. शेल शीशी में 20 mM HCl के 200 μL माइक्रो पाइपिंग द्वारा हाइड्रोलाइज्ड नमूना छर्रों का पुनर्गठन करें। सुनिश्चित करें कि गोली को या तो भंवर या पिपेट टिप का उपयोग करके पुन: निलंबित किया जाता है।
  20. शेल शीशियों को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें 5,300 x g और 25 °C पर 2 मिनट के लिए पुनर्गठित नमूना छर्रों होते हैं।

4. नमूना फ़िल्टरिंग

  1. लेबल 2 एमएल फिल्टर ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) जिसमें 0.2 μm छिद्र झिल्ली फिल्टर "मुक्त अंश" और "प्रोटीन अंश" के रूप में होते हैं।
  2. चरण 2.15 (मुक्त अंश) और चरण 3.20 (प्रोटीन अंश) से पुनर्गठित नमूनों को संबंधित फ़िल्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  3. उन्हें सेंट्रीफ्यूज में 30 मिनट के लिए 5,000 x g और 25 °C पर रखें।
  4. फ़िल्टर ट्यूबों से फ़िल्टर निकालें और उन्हें कैप करें। नमूने अब चरण 5 में अमीनो एसिड डेरीवेटाइजेशन के लिए तैयार हैं।
    नोट: नमूने को बाद में व्युत्पन्न और विश्लेषण के लिए भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है।

5. एमिनो एसिड डेरिवेटाइजेशन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोपाइल क्लोरोफॉर्मेट (पीसीएफ) 39 या 6-एमिनोक्विनोल-एन-हाइड्रोसिसुसिकिनिमिडिल कार्बामेट (एक्यूसी) 40 का उपयोग करके नमूनों को व्युत्पन्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

Representative Results

निष्कर्षण प्रोटोकॉल का एक चित्रण चित्र 2 में एक सारांशित संदर्भ गाइड के रूप में प्रदान किया गया है। वायोली एट अल .38 द्वारा प्राप्त परिणामों को साइनोबैक्टीरिया से बीएमएए आइसोमर्स के विश्लेषण के लिए इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल से सकारात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना गया था। साइनोबैक्टीरिया की उन्नीस एकल प्रजातियों को 11 पूर्वी ऑस्ट्रेलियाई मीठे पानी के स्थलों से सुसंस्कृत किया गया था। उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, बीएमएए आइसोमर्स को मुक्त और प्रोटीन अंशों में निकाला गया, पीसीएफ के साथ व्युत्पन्न किया गया, और एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। एमएस विधि का उपयोग करके और कम से कम तीन एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) संक्रमणों का अवलोकन करके एक सकारात्मक परिणाम की पुष्टि की जाती है, एक क्वांटिफायर आयन के रूप में और दो अपेक्षित अवधारण समय पर क्वालीफायर आयनों के रूप में। बीएमएए और उसके आइसोमर्स युक्त मानक का एक प्रतिनिधि एमआरएम क्रोमैटोग्राम, रंग-कोडित लाइनों द्वारा इंगित किया गया है, चित्र 3 में दिखाया गया है। सभी 19 नमूनों में बीएमएए और आइसोमर्स की उपस्थिति और एकाग्रता, मुक्त और बाध्य अंशों में बीएमएए और आइसोमर एकाग्रता दिखाने के लिए वर्गीकृत, तालिका 1 में संक्षेप ति है। सभी तीन आइसोमर्स के लिए एक सकारात्मक पहचान लिडेल झील (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए मेरिस्मोपेडिया प्रजातियों के मुक्त अंश में देखी गई, जहां मुक्त अंश में बीएमएए एकाग्रता 68.38 `g / g शुष्क वजन (DW) ± 2.25 μg / g DW, 2,4-DAB की सांद्रता के साथ 1,223.98 μg / g DW ± 20.7 μg / g DW थी। और 125.27 μg / g DW ± 4.19 μg / g DW की एकाग्रता के साथ AEG। क्रोमैटोग्राफिक एमआरएम चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। एक नमूने में बीएमएए और इसके आइसोमर्स के लिए एक नकारात्मक परिणाम को चित्रित करने के लिए, वाल्का वाटर वर्क्स (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए माइक्रोसिस्टिस फ्लोस-एक्वा प्रजातियों का बाध्य अंश चित्र 5 में क्रोमैटोग्राफिक रूप से प्रस्तुत किया गया है। जबकि बाध्य अंश में कोई बीएमएए, 2,4-डीएबी और / या एईजी नहीं था, इसके मुक्त अंश में सभी तीन आइसोमर्स शामिल थे, जिनकी सांद्रता क्रमशः 79.86 μg / g DW ± 1.59 μg / g DW, 1,156.15 μg / g DW ± 8.46 μg / g DW, और 433.83 μg / g DW ± 8.92 μg / g DW थी।

इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से, वियोली एट अल .38 ने पूर्वी ऑस्ट्रेलियाई मीठे पानी के साइनोबैक्टीरिया में बीएमएए आइसोमर्स की उपस्थिति की पुष्टि की और निर्धारित किया कि किस साइनोबैक्टीरिया में विष पैदा करने की क्षमता थी।

Figure 1
चित्रा 1: BMAA और इसके आइसोमर्स 2,4-DAB और AEG की रासायनिक संरचना। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: निष्कर्षण प्रोटोकॉल का सारांशित संदर्भ आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिधारण के आधार पर आइसोमर पहचान के लिए डी 5-2,4-डीएबी, 2,4-डीएबी, बीएमएए और एईजी युक्त अंशांकन मानक का एलसी-एमएस /एमएस क्रोमैटोग्राम, हाइलाइट किए गए चोटियों द्वारा इंगित किया गया है। कुंजी: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z 6.4 मिनट (लाल), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z पर 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 278.10 m/z > 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 7.4 मिनट (नारंगी) पर 88.00 m/z और BMAA 33.01 m/z 7.4 मिनट (नारंगी) पर >। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: झील लिडेल (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए मेरिस्मोपेडिया प्रजातियों में डी 5-2,4-डीएबी, 2,4-डीएबी, बीएमएए और एईजी का पता लगाने के लिए एलसी-एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम, हाइलाइट की गई चोटियों द्वारा इंगित किया गया है। कुंजी: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z 6.4 मिनट (लाल), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z पर 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 33.01 m/z पर 278.10 m/z > 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 7.4 मिनट (नारंगी) पर 88.00 m/z और BMAA 33.01 m/z 7.4 मिनट (नारंगी) पर >। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: वाल्का वाटर वर्क्स (एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) से एकत्र किए गए माइक्रोसिस्टिस फ्लोस-एक्वा प्रजातियों के एक बाध्य अंश में 2,4-डीएबी, बीएमएए और एईजी के लिए नकारात्मक नियंत्रण का एलसी-एमएस / एमएस क्रोमैटोग्राम। कुंजी: D5-2,4-DAB 338.01 m/z > 278.10 m/z 6.4 मिनट (लाल - शिखर हाइलाइट किया गया), 2,4-DAB 333.01 m/z > 273.10 m/z 6.4 मिनट (हरा), AEG 333.01 m/z > 88.00 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 333.01 m/z पर 7.4 मिनट (नारंगी), और BMAA 333.01 m/z पर 7.4 मिनट (नीला) > 18.01 m/z। धराशायी लाइनें लापता 2,4-डीएबी, एईजी और बीएमएए के लिए अवधारण समय का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: साइनोबैक्टीरियल आइसोलेट्स में बीएमएए, एईजी और 2,4-डीएबी सांद्रता। सांद्रता माध्य (एन = 3) की मानक त्रुटि ± है। एनडी का अर्थ है पता नहीं लगाया गया है। पाए गए प्रत्येक आइसोमर की उच्चतम सांद्रता हरे रंग में हाइलाइट की जाती है। तालिका वियोली एट अल .38 से एक संशोधित संस्करण है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एनपीएए के विश्लेषण के लिए यहां उल्लिखित निष्कर्षण प्रोटोकॉल जैविक नमूनों में किसी भी एमिनो एसिड का विश्लेषण करने पर लागू होता है। साइनोबैक्टीरियल उपभेदों को अलग करने और संवर्धन करने पर गाइड के लिए, कोई भी वियोली एट अल.38 द्वारा अध्ययन में प्रस्तुत तरीकों का उल्लेख कर सकता है। प्रोटोकॉल में पहला कदम नमूना को एक बिंदु पर ले जाता है जहां सूखे वजन के खिलाफ नमूनों के बीच सामान्यीकरण प्राप्त किया जा सकता है। दूसरा चरण विश्लेषणों को जारी करने के लिए सेल लाइसिस है और इसे तकनीकों की एक सरणी का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें यांत्रिक व्यवधान / लाइसिस जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित जांच सोनिकेशन, फ्रीज / पिघलना चक्र, पीसना और मोती मिलिंग, और गैर-यांत्रिक व्यवधान जैसे एंजाइमेटिक, डिटर्जेंट और / या रासायनिक लाइसिस शामिल हैं। यांत्रिक व्यवधान को गैर-यांत्रिक पर फायदेमंद माना जाता है क्योंकि यह इंट्रासेल्युलर बॉन्ड और प्रोटीनको बरकरार रखने की अनुमति देते हुए नमूने की अधिक क्षमता को लाइज़ करने की अनुमति देता है, हालांकि नमूना मैट्रिक्स सेल लाइसिंग के लिए इष्टतम विधि को निर्देशित कर सकता है।

विश्लेषण के लिए अमीनो एसिड निकालते समय प्रोटीन वर्षा इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण तीसरा चरण है। टीसीए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला विलायक है; हालांकि, परक्लोरिक एसिड, एसीटोन, मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर (एमटीबीई), मेथनॉल, और / या एसिटोनिट्राइल 8,42 का भी उपयोग किया गया है, जहां प्रत्येक निष्कर्षण विलायक का उद्देश्य विभिन्न सब्सट्रेट्स को निकालना और अवक्षेपित करना है। यहां वर्णित मॉडल एनपीएए बीएमएए और इसके आइसोमर्स को साइनोबैक्टीरियल मैट्रिक्स से निकालता है, और हालांकि विभिन्न सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला का उपयोग किया गया है, दो सबसे आम पानी (जलीय) में 10% टीसीए और एसीटोन में 10% टीसीए हैं। सामान्य तौर पर, टीसीए के साथ प्रोटीन वर्षा का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन-बाध्य अमीनो एसिड से मुक्त अमीनो एसिड को अलग करने के लिए अमीनो एसिड निकालने के लिए किया जाता है। इसके अतिरिक्त, टीसीए निष्कर्षण कुल प्रोटीन सामग्री का निर्धारण करने, मुक्त अंश के लिए दूषित पदार्थों को कम करने और न्यूनतम प्रोटीन गिरावट के साथ प्रोटीज की गतिविधि को कम करने की अनुमतिदेता है। मुक्त अंश का टीसीए निष्कर्षण शुरू में कार्बनिक घुलनशील पदार्थों को धोकर काम करता है, प्रोटीन और अघुलनशील यौगिकों जैसे कि अवक्षेप में सेल दीवार अवशेष ों को पीछे छोड़ देता है, जिसके बाद एक मजबूत एसिड का उपयोग करके प्रोटीन-बाध्य अमीनो एसिड (बाध्य अंश) का थर्मल हाइड्रोलिसिस निष्कर्षण होता है।

10% जलीय टीसीए प्लस सोनिकेशन के साथ मुक्त अंश का विभाजन अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स44 की तुलना में सबसे व्यापक प्रोटीन वर्षा पैदा करता है और सबसे अच्छा एमिनो एसिड रिकवरी42 है। कुछ अध्ययन एक कार्बनिक विलायक (यानी, एसीटोन43 में 10% -20% टीसीए) के साथ संयुक्त एसिड का उपयोग करने का विकल्प चुनते हैं, ताकि छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स सहित अधिक अणुओं को अवक्षेपित किया जा सके, प्रोटीन क्षरण को कम किया जा सके, और लवण43 जैसे दूषित पदार्थों को कम किया जा सके। एसीटोन में 10% टीसीए का एक और लाभ हाइड्रोलिसिस के लिए गोली की तैयारी में इसकी तेजी से सुखाने की दर है, एमिनो एसिड संशोधन को रोकने के लिए नमी अवशेषों को कम करना। हालांकि, अकेले एसीटोन44 में 10% टीसीए की तुलना में 10% जलीय टीसीए प्लस सोनिकेशन में मुक्त अमीनो एसिड की बेहतर निष्कर्षण क्षमता है। इसके अतिरिक्त, 10% जलीय टीसीए वर्षा की सीमाएं हैं जैसे कि लंबे समय तक सुखाने का समय, सभी प्रोटीन या छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स को अवक्षेपित करने में सक्षम नहीं होना, और रुचि के विश्लेषण (यानी, प्रोटीन या अमीनो एसिड) के आधार पर, ऑक्सीकरण और गिरावट को रोकने के लिए एडिटिव्स की आवश्यकता होती है और एजेंटों को कम करना45,46।

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन वर्षा बढ़ाने के लिए एसीटोन में 10% जलीय टीसीए और 10% टीसीए के संयोजन का उपयोग करता है, यह सुनिश्चित करता है कि छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स अवक्षेपित हों, तेजी से पेलेट सुखाने के समय की अनुमति दें, और निष्कर्षण क्षमता में वृद्धि करें, दोनों विलायक निष्कर्षण गुणों का लाभ उठाएं। हालांकि, एसीटोन में 10% जलीय टीसीए और 10% टीसीए का संयोजन मुक्त अंश में छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स को अवक्षेपित कर सकता है जब एसीटोन सुपरनैटेंट में 10% टीसीए जलीय मुक्त अंश के साथ जोड़ा जाता है। इस मामले में, अवक्षेप को हाइड्रोलिसिस के लिए बाध्य अंश में स्थानांतरित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में ऑक्सीजन मुक्त वातावरण में ऊंचे तापमान पर एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस के माध्यम से प्रोटीन गोली से अमीनो एसिड (यानी, बीएमएए) की रिहाई शामिल है। हाइड्रोलिसिस चरण के लिए मुख्य रूप से सीमित कारक यह है कि यह तैयार करने में समय लेने वाला और श्रमसाध्य है। रातोंरात इनक्यूबेशन तेजी से और समय-कुशल नमूना तैयारी और विश्लेषण को रोकता है। इसके अलावा, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से शेल शीशी (चरण 3.4) में गोली का मात्रात्मक हस्तांतरण एक कठिन प्रक्रिया है जिसके लिए सूखे वजन के सामान्यीकरण के सटीक बिंदु को सुनिश्चित करने के लिए परिश्रम और धैर्य की आवश्यकता होती है। उपयोगकर्ता को होने वाली संभावित समस्याओं में गोली का अधूरा हस्तांतरण, पिपेट युक्तियों और मूल ट्यूब से चिपके गीले अवक्षेपित प्रोटीन और पिपेट टिप को अवरुद्ध करने वाले गोली के ठोस कण शामिल हैं। पेलेट के आसान हस्तांतरण में सहायता करने में एक व्यावहारिक सुझाव कैंची की एक जोड़ी के साथ पिपेट टिप के अंत से लगभग 0.3-0.5 मिमी निकालना है, जिससे बड़े पेलेट कणों को खींचने और शेल शीशी में छोड़ने की अनुमति मिलती है। यह स्थानांतरण विधि सभी अमीनो एसिड विश्लेषणों के लिए प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सामान्य अभ्यास है। हालांकि, शेल शीशी में पेलेट को मात्रात्मक रूप से स्थानांतरित करने की दक्षता और सटीकता में सुधार के लिए संशोधनों की जांच की जानी चाहिए।

हाइड्रोलिसिस तकनीकों के दो रूपों को उनके प्रोटीन-बाध्य अवस्था से अमीनो एसिड जारी करने के लिए नियोजित किया जा सकता है: तरल-चरण हाइड्रोलिसिस और एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस। तरल-चरण हाइड्रोलिसिस, जिसमें नमूने पर 6 एम एचसीएल को जोड़ना शामिल है, जिसे बाद में रात भर 110 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखा जाता है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस का एक विकल्प है। निष्कर्षण तकनीक जो तरल-चरण हाइड्रोलिसिस को नियोजित करती हैं, उन्हें आगे के प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि विलवणीकरण, खासकर यदि एक्यूसी व्युत्पन्न को चुना जाता है, क्योंकिइसे टैग करने के लिए बुनियादी शर्तों की आवश्यकता होती है। एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस विलवणीकरण से बचता है और उपयोगकर्ता को निस्पंदन से पहले अंतिम गोली के पुनर्गठन पर व्युत्पन्न तकनीक चुनने की स्वतंत्रता देता है। इसके अलावा, चुने हुए हाइड्रोलिसिस विधि से स्वतंत्र, नमूनों को आगे के प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि मैट्रिक्स शुद्धिकरण और एकाग्रता 29,47,48 के लिए एसपीई, व्युत्पन्न तकनीक और / या विश्लेषणात्मक विश्लेषण (जैसे, रिवर्स चरण एलसी-एमएस / एमएस बनाम हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन तरल क्रोमैटोग्राफी [एचआईएलआईसी] एलसी-एमएस / एमएस37) की पसंद के आधार पर। ). इस प्रोटोकॉल में 20 एमएम एचसीएल में अंतिम गोली का पुनर्गठन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अमीनो एसिड हाइड्रोलिसिस किट39 के माध्यम से पीसीएफ अभिकर्मकों48 का उपयोग करके व्युत्पन्नीकरण के लिए उपयुक्त है (सामग्री की तालिका देखें)। AQC और PCF दोनों नमूने में मौजूद मूल रूप से सभी अमीनो एसिड, प्रोटीन और गैर-प्रोटीन को व्युत्पन्न करेंगे, और विश्लेषणों की चयनात्मकता एलसी-एमएस / एमएस के उपयोग और प्रतिधारण समय मिलान और क्वांटिफायर और क्वालीफायर एमआरएम38 के सावधानीपूर्वक चयन के संयोजन के माध्यम से प्राप्त की जाती है। 

वर्तमान हाइड्रोलिसिस प्रोटोकॉल बीएमएए, 2,4-डीएबी और एईजी की रिहाई के लिए अनुकूलित नहीं हैं, लेकिन प्रोटीन हाइड्रोलिसिस 32 के लिए मौजूदा तरीकों के आधार पर22 प्रोटीन अमीनो एसिड के लिए, जहां 18 घंटे से अधिक समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप कुछ अमीनो एसिड का क्षरण और संशोधन होता है, जो एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण को प्रभावित करता है और इस प्रकार, प्राप्त सांद्रता32 है। बीच एट अल .49 ने बीएमएए और प्रोटीनोजेनिक अमीनो एसिड का विश्लेषण करने के लिए हाइड्रोलिसिस को अनुकूलित करने के लिए समय (0.5-120 घंटे) के साथ हाइड्रोलिसिस की जांच की। उन्होंने पाया कि हालांकि हाइड्रोलिसिस के पहले 0.5 घंटे के दौरान बीएमएए की शुरुआती तेजी से रिहाई हुई थी, बीएमएए के स्तर में वृद्धि जारी रही क्योंकि हाइड्रोलिसिस समय में वृद्धि हुई, बिना गिरावट के, 5 दिनोंके बाद भी। बाध्य बीएमएए और उसके आइसोमर्स की वास्तविक प्रकृति के बारे में अभी भी अलग-अलग विचार और प्रश्न हैं, कुछ अध्ययनों से पता चलता है कि बीएमएएबॉन्डिंग 50,51 या प्रोटीन 14 में गलत समावेश के बजाय, बीएमएए-प्रोटीन एसोसिएशन सतही52 है। हालांकि, "बाध्य" बीएमएए के विश्लेषण में वर्तमान सहमति के लिए मान्य और व्यापक रूप से स्वीकृत हाइड्रोलिसिस चरण की आवश्यकता होती है जो अमीनो एसिड जारी करने के लिए पेप्टाइड्स / प्रोटीन को तोड़ता है और इस प्रकार, बीएमएए और इसके आइसोमर्स।

टीसीए निष्कर्षण का उपयोग करके सेडविक एट अल.42 द्वारा एक अध्ययन में 20 प्रोटीन अमीनो एसिड की वसूली दर निर्धारित की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 100% वसूली हुई। अल्गल मैट्रिसेस से बीएमएए और इसके आइसोमर्स के मामले में, विभिन्न निष्कर्षण सॉल्वैंट्स का उपयोग करके बीएमएए निष्कर्षण की दक्षता की तुलना करने वाले अध्ययनों ने 10% टीसीए को मुफ्त बीएमएए27 के लिए सबसे कुशल पाया है। तरल-चरण हाइड्रोलिसिस का उपयोग करके निकाले गए प्रोटीन-बाध्य बीएमएए के लिए वसूली दर ग्लोवर एट अल.25 और फासेन एट अल.53 द्वारा अध्ययनों में स्थापित की गई थी, जहां सटीकता क्रमशः 108.6% और 70% की औसत बीएमएए वसूली दर के साथ स्पाइक रिकवरी विधियों द्वारा निर्धारित की गई थी। फासेन एट अल ने स्पाइक-रिकवरी प्रयोगों के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया और बताया कि निष्कर्षण प्रक्रिया के चरण के आधार पर रिकवरी कैसे भिन्न होतीहै। फासेन एट अल ने यहां प्रस्तुत एसिड-वाष्प प्रोटोकॉल की दक्षता को भी निर्धारित किया, जिसमें निष्कर्षण से पहले बीएमएए आइसोमर्स के लिए 83.6% की वसूली दर और हाइड्रोलिसिस24 से पहले स्पाइक किए गए लोगों के लिए 68.6% थी। इन पुनर्प्राप्तियों, निष्कर्षण के तरीकों और विश्लेषणों को बैनैक26 द्वारा आगे मान्य किया गया, जिसमें साइनोबैक्टीरियल मैट्रिक्स में बीएमएए के लिए 94% -106% की वसूली दर और 5.6% और 20% के बीच % सापेक्ष मानक विचलन (% आरएसडी) था, जो सटीकता के लिए एफडीएमानदंडों को पूरा करता था। यह अनुशंसा की जाती है कि स्पाइक रिकवरी प्रयोगों के माध्यम से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले प्रत्येक प्रयोगशाला शुरू में अपनी वसूली दर और सटीकता स्थापित करे। फासेन एट अल.53 और ग्लोवर एट अल.25 में प्रस्तुत पुनर्प्राप्ति विधियों को एक गाइड के रूप में पालन किया जा सकता है।

विश्लेषण के तेजी से प्रोटीन-बाध्य निष्कर्षण के लिए रात भर ओवन हाइड्रोलिसिस के बजाय हाइड्रोलिसिस तकनीकों के वैकल्पिक रूपों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक माइक्रोवेव एक्सट्रैक्टर हाइड्रोलिसिस समय को 24 घंटे से 10 मिनट55 तक कम कर सकता है। अमीनो एसिड के लिए माइक्रोवेव हाइड्रोलिसिस पारंपरिक थर्मल विधि के समान सिद्धांतों का उपयोग करता है, ऑक्सीजन मुक्त वातावरण में माइक्रोवेव पोत को तैयार करने और इकट्ठा करने के लिए एक दस्ताने बॉक्स का उपयोग करता है और 6 एम एचसीएल जोड़ता है। एक बार एयर-टाइट होने के बाद, नमूना युक्त पोत माइक्रोवेव विकिरण से गुजरता है। माइक्रोवेव हाइड्रोलिसिस का उपयोग विभिन्न नमूना मैट्रिसेस56,57,58 से अमीनो एसिड निकालने के लिए किया गया है; हालांकि, माइक्रोवेव हाइड्रोलिसिस को अभी तक विकसित नहीं किया गया है और बीएमएए के विश्लेषण के लिए मान्य किया गया है।

निष्कर्ष में, 10% जलीय टीसीए प्रोटीन वर्षा साइनोबैक्टीरियल मैट्रिसेस27 से मुक्त गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड निकालने के लिए इष्टतम विधि है, और थर्मल हाइड्रोलिसिस प्रोटीन-बाध्य अंश का एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षण प्रदान करता है। साइनोबैक्टीरिया से एनपीएए बीएमएए और इसके आइसोमर्स निकालने के लिए यह प्रोटोकॉल मान्य और व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है। बीएमएए के निष्कर्षण को और अनुकूलित करने के लिए भविष्य के निर्देश हाइड्रोलिसिस चरण पर ध्यान केंद्रित करेंगे, जो 22 प्रोटीन अमीनो एसिड के विनिर्देशों के अनुसार किया जाता है। हालांकि, यहां प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल को अभी भी एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से बीएमएए और इसके आइसोमर्स का विश्लेषण करने के लिए कुशल और प्रभावी माना जाना चाहिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

डी.पी.बी., के.जे.आर., और एस.एम.एम. को द इयान पॉटर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया जाता है, और जे.पी.वी. एक ऑस्ट्रेलियाई सरकारी अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम, वजीफा के प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

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References

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