Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Extractie van niet-eiwit aminozuren uit cyanobacteriën voor vloeistofchromatografie- tandem massaspectrometrieanalyse

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

Het huidige protocol beschrijft de extractie van niet-eiwitaminozuren uit biologische matrices via trichloorazijnzuur (TCA) eiwitprecipitatie en zure hydrolyse vóór analyse met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Abstract

Niet-eiwit aminozuren (NPAAs) zijn een grote klasse aminozuren (AAs) die niet genetisch gecodeerd zijn voor vertaling in eiwitten. De analyse van NPAAs kan cruciale informatie opleveren over cellulaire opname en / of functie, metabole routes en potentiële toxiciteit. β-methylamino-L-alanine (BMAA) is een neurotoxische NPAA geproduceerd door verschillende algensoorten en wordt geassocieerd met een verhoogd risico op neurodegeneratieve ziekten, wat heeft geleid tot aanzienlijke onderzoeksinteresse. Er zijn talloze manieren om AA's te extraheren voor analyse, waarbij vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie de meest voorkomende is, waarvoor eiwitprecipitatie vereist is, gevolgd door zure hydrolyse van de eiwitpellet. Studies naar de aanwezigheid van BMAA bij algensoorten leveren tegenstrijdige resultaten op, waarbij het gebruik van niet-gevalideerde monstervoorbereiding/extractie en analyse een primaire oorzaak is. Zoals de meeste NPAAs is eiwitprecipitatie in 10% waterige TCA en hydrolyse met dampende HCl de meest geschikte vorm van extractie voor BMAA en zijn isomeren aminoethylglycine (AEG) en 2,4-diaminobutyrinezuur (2,4-DAB). Het huidige protocol beschrijft de stappen in een gevalideerde NPAA-extractiemethode die vaak wordt gebruikt in onderzoeks- en onderwijslaboratoria.

Introduction

Aminozuren zijn chemische verbindingen die ten minste één amine- en carbonfunctiegroep bevatten. Sommige aminozuren bevatten ook een iminogroep, een andere functionele zuurgroep dan carbon; andere aminozuren hebben aminegroepen die niet gehecht zijn aan de α-koolstofgroep1. Er zijn meer dan 500 aminozuren2, waarvan er 22 bekend staan als eiwitaminozuren die worden gebruikt voor genetische codering in ribosomale eiwitsynthese3. Deze 22 aminozuren kunnen verder worden onderverdeeld in essentiële en niet-essentiële. Essentiële aminozuren zijn noodzakelijk voor een organisme om goed te functioneren en kunnen alleen worden verkregen door externe bronnen. Niet-essentiële aminozuren kunnen in het organisme worden gesynthetiseerd. De indeling van de 22 aminozuren in essentieel/niet-essentieel is uniek voor individuele soorten. Alle andere aminozuren zijn niet-eiwit aminozuren (NPAAs) die niet zijn gecodeerd voor eiwitsynthese. Aminozuren, of ze nu eiwitten of niet-eiwitten zijn, kunnen ook een signaalrol spelen binnen een organisme en fungeren als metabole tussenpersonen4. Vanwege hun belangrijke en variërende rollen kunnen aminozuurniveaus inzicht geven in de toestand, functionaliteit en metabole routes van het organisme, enz. Er zijn twee hoofdmechanismen waarmee aminozuren kunnen worden opgenomen in een polypeptideketen: ribosomale eiwitsynthese, die de 22 aminozuren gebruikt bij het coderen, en niet-ribosomale peptidesynthese, die, naast eiwitaminozuren, het gebruik van sommige NPAAs bij de synthese mogelijk maakt. Bepaalde NPAAs kunnen eiwitaminozuren nabootsen, wat mogelijk leidt tot hun misincorporatie in peptiden en eiwitten. De misincorporatie veroorzaakt een misvouwing van eiwitten, wat op zijn beurt schadelijke effecten heeft5, zoals de misincorporatie van de NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) in plaats van tyrosine, met een negatieve invloed op de cellulaire functie en gezondheid 6,7. Een extra bron van opgenomen NPAAs is door de post-translationele modificatie (PTM) van aminozuurresiduen. Aminozuurresiduen worden om verschillende redenen gewijzigd, waaronder veranderingen in peptide- of eiwitconformatie, stabiliteit en functionaliteit. Bij hydrolyse van PTM-bevattende eiwitten of peptiden komen deze gemodificeerde aminozuurresiduen vrij in hun vrije NPAA-vorm 8,9.

De NPAA-β-methylamino-L-alanine (BMAA) geproduceerd door cyanobacteriën, diatomeeën en dinoflagellaten10 is een vermoedelijk neurotoxine dat betrokken is als een bijdragende factor aan verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose / parkinsonisme-dementiecomplex (ALS-PDC)11,12, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Alzheimer13 . Er wordt gesuggereerd dat BMAA ten onrechte is opgenomen in de polypeptideketen van eiwitten in plaats van L-serine14 en / of andere eiwitaminozuren. De misincorporatie van BMAA kan leiden tot het verkeerd vouwen van eiwitten, wat resulteert in de afzetting van eiwitaggregaten in neuronen14. In het afgelopen decennium is de belangstelling voor BMAA aanzienlijk toegenomen. Een breed scala aan cyanobacteriële soorten uit zoetwater-, mariene en brakke omgevingen is ontdekt om BMAA15 te produceren, wat leidt tot hun wijdverspreide verspreiding in verschillende ecosystemen16,17. Bovendien is aangetoond dat BMAA biomagnificeert via de voedselketen naar het menselijke voedselweb18,19. Vanwege de mogelijke gezondheidseffecten, het gebrek aan begrip en de incongruenties van BMAA-toxiciteit, is het noodzakelijk om verder onderzoek voort te zetten totdat de toxiciteit van BMAA uiteindelijk wordt begrepen of BMAA als veilig wordt beschouwd20,21.

De analyse van aminozuren in biologische monsters kan worden onderverdeeld in vier hoofdstappen: monstervoorbereiding, aminozuurderivatisatie, scheiding en detectie, en identificatie en kwantificering. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) is de voorkeursanalysemethode omdat het een gerichte en reproduceerbare scheiding en analyse van aminozuren biedt.

Monstervoorbereidingstechnieken voor het analyseren van cyanobacteriële en andere algenmonsters omvatten voornamelijk een extractiemethode voor aminozuren in hun vrije en eiwitgebonden vormen. In de loop der jaren zijn de extractiemethoden relatief consistent gebleven met gemeenschappelijke elementen, waaronder de desolvatie van het monster om de vrije aminozuren van hun gebonden vorm te scheiden, gevolgd door eiwitprecipitatie en het vrijkomen van de gebonden aminozuren door hydrolyse met zoutzuur (HCl) bij verhoogde temperaturen22 . Deze extractievorm is geoptimaliseerd voor eiwitaminozuren en gebruikt voor NPAAs. De detectie en kwantificering van BMAA en zijn isomeren (figuur 1), aminoethylglycine (AEG) en 2,4-diaminobutyrinezuur (2,4-DAB) bij dezelfde soort cyanobacteriën hebben echter inconsistente resultaten in de literatuur laten zien, met een mogelijke verklaring die ligt in verschillen in de groeiomstandigheden en/of de stam van algen die verschillende of geen hoeveelheden BMAA23 produceren . Er is betoogd dat een meer waarschijnlijke verklaring voor de inconsistenties in de detectie en kwantificering van BMAA en zijn isomeren te wijten is aan niet-gevalideerde experimentele protocollen, het gebruik van een breed scala aan analytische technieken en onvoldoende experimentele details in de gerapporteerde methoden16,24 die leiden tot onherleidbare interlaboratoriumgegevens. Glover et al.25 en Banack26 hebben echter onlangs een analytische techniek ontwikkeld en gevalideerd voor de detectie en kwantificering van BMAA en zijn isomeren met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC)-MS / MS in overeenstemming met de International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia en FDA-richtlijnen die nodig zijn voor validatie in één laboratorium.

Deze validatie-experimenten richtten zich op de scheiding en detectie van BMAA en zijn isomeren en gingen niet in op de inconsistenties in monstervoorbereidingsprotocollen. Lage et al.27 vergeleken de prestaties van drie gangbare extractiemethoden voor het kwantificeren van BMAA en zijn isomeren in cyanobacteriële monsters via LC-MS/MS: vaste fase extractie (SPE) van vrije aminozuren28,29; een eiwitprecipitatiemethode met methanolextractie en acetonprecipitatie30; en de meest gebruikte extractiemethode voor BMAA, eiwitprecipitatie met trichloorazijnzuur (TCA)31. Ze concludeerden dat de TCA-eiwitprecipitatie het optimale protocol was, wat hogere BMAA-concentraties in de testmonsters opleverde in vergelijking met de andere extractiemethoden. Hun studie valideerde TCA-extractie met derivatisatie van BMAA met behulp van 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamaat (AQC) in een cyanobacteriënmatrix, wat een gevestigde gids biedt voor het bereiken van betrouwbare en reproduceerbare BMAA-gegevens. TCA-aminozuurextractie is een geaccepteerde en veel voorkomende monstervoorbereidingstechniek die ook op andere matrices kan worden toegepast. De stabiliteit van het aminozuur tijdens hydrolyse moet echter worden overwogen om afbraak of oxidatie te voorkomen, wat kan worden overwonnen met het gebruik van chemische modificatoren en reductiemiddelen32. TCA-extractie wordt routinematig gebruikt en onderwezen aan nieuwe onderzoeksstudenten, en hoewel het protocol op grote schaal wordt gerapporteerd, is een visueel hulpmiddel bij de toepassing van deze methode een waardevolle bron, die zorgt voor een goede en consistente uitvoering.

Omgekeerde fasechromatografie wordt vaak gebruikt om aminozuren te scheiden, waarvoor een derivatisatiestap voorafgaand aan analyses vereist is. De derivatisatie van aminozuren zoals BMAA zorgt voor chromatografische retentie en kan de resolutie tussen isomeren verhogen. Het verhoogt ook de moleculaire massa en verbetert de ionisatie in de massaspectrometer. Verschillende derivatiserende reagentia zijn gebruikt voor de analyse van aminozuren via LC-MS/MS, waaronder propylchloorformine (PCF)33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamaat (AQC)27, 9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC)34 en dansylchloride (DC)35. De enige gevalideerde technieken voor het analyseren van BMAA gebruikten echter PCF36 of AQC 24,26,37 als hun derivatiserende reagens.

De reikwijdte van dit protocol is gericht op de TCA-extractie van NPAAs uit cyanobacteriële matrices. Het is een arbeidsintensieve methode die routinematig wordt gebruikt en onderwezen in academische en industriële onderzoekslaboratoria op basis van manuscripten die mogelijk weinig details bevatten; daarom geeft dit protocol details over de procedure en technieken die betrokken zijn bij het voorbereiden van monsters voor de analyse van vrije en gebonden BMAA als het modelaminozuur.

Protocol

De cyanobacteriënsoort Merismopedia werd gebruikt voor de huidige studie38.

1. Voorbereiding van het ruwe monster

  1. Verzamel het algenschuim uit de aquatische bron van belang of uit een cyanobacteriële gekweekte kolf en plaats het in centrifugebuis38 van 50 ml.
    OPMERKING: Het monster moet worden ingevroren bij −20 °C voor latere extracties en worden ontdooid vóór de volgende stap.
  2. Centrifugeer de buizen met het monster bij 3.500 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C. Decanteer het supernatant in een afvalcontainer en gooi het weg in biologisch afval.
    OPMERKING: Het supernatant kan worden gereserveerd voor toekomstige analyse van het exosoom.
  3. Bedek de buis met de monsterkorrel stevig met een afdichtingsfilm (zie Materiaaltabel) en prik een paar gaten in de film met een scherp, lang neuspincet. Bewaar de buis rechtop bij −80 °C gedurende 30 minuten.
  4. Zet de vriesdroger aan en balanceer op 0,1 mbar en −80 °C (~30 min).
    OPMERKING: De parameters (stap 1.4) zijn geoptimaliseerd voor de vriesdroger die voor dit onderzoek wordt gebruikt (zie materiaaltabel). Volg de standaard bedrijfsprocedures volgens het vriesdrogermodel dat beschikbaar is in het laboratorium of stel de laagst mogelijke temperatuur in als het vriesdrogermodel niet zo laag gaat als −80 °C.
    1. Plaats de centrifugebuis(en) rechtop in een glazen container met vriesdroger en plaats deze gedurende 5 minuten in de vriezer van −80 °C om de pot af te koelen.
    2. Haal de glazen container uit de vriezer en bevestig het rubberen deksel.
    3. Zorg ervoor dat het handvat op de rubberen klepuitlaat van de vriesdroger naar de atmosfeer wordt geventileerd (naar boven gericht) en bevestig de glazen container stevig.
    4. Draai het handvat van de rubberen klepuitlaat heel langzaam naar de naar beneden wijzende positie om de pot bloot te stellen aan het vacuüm en laat tot 24 uur vriesdrogen toe om de sublimatie van alle vloeistof te garanderen.
    5. Om het vacuüm in de pot vrij te maken, draait u het handvat naar boven, maakt u de glazen container los en verwijdert u de gevriesdroogde monsters.
  5. Gebruik een analytische balans om 15-50 mg gedroogde monsterpellets in een centrifugebuis van 15 ml te wegen.
    OPMERKING: De monsters kunnen in −80 °C-opslag worden geplaatst als ze in dit stadium niet verder worden verwerkt.

2. Celllysing en fractionering van vrije NPAAs

  1. Voeg 100 μL van 100 ng/ml D5-2,4-DAB (zie materiaaltabel) standaard met behulp van een micropipette toe aan de monsterbuis (optioneel).
  2. Voeg 300-600 μL van respectievelijk 10% m/v waterig trichloorazijnzuur (TCA, zie Materiaaltabel) of 300-600 μL van 11,7%-13,3% TCA toe als u de D5-2,4-DAB-standaard toevoegt.
    OPMERKING: Kies een volume waterige TCA dat de pellet volledig bedekt.
  3. Plaats de monsterbuizen in een container gevuld met gemalen ijs.
  4. Gebruik een sonde sonicator (zie Materiaaltabel) met een middelhoog vermogen (70%) en laat het monster gedurende 1 minuut lyseren volgens de onderstaande stappen.
    LET OP: Zorg voor de juiste PBM's met het gebruik van ruisonderdrukkende oorkappen.
    1. Volg de juiste veiligheidsprotocollen ter voorbereiding op het gebruik van de sonde sonicator door in gebruik zijnde bewegwijzering op de deur te plaatsen, ultrasoonapparaat in de zuurkast uit te voeren en ruisonderdrukkende oorkappen te gebruiken.
    2. Schakel de sonicator in en voer de volgende parameters in: amplitude, 70%; tijd, 1 min.
    3. Spuit 70% ethanol op een pluisvrij papierdoekje (zie Materiaaltabel) en veeg de sonde schoon.
    4. Dompel het uiteinde van de sonde volledig onder in het monster en druk op start.
    5. Wanneer de sonde sonicator stopt, plaatst u de centrifugebuis met het monster gedurende 1 minuut op ijs.
    6. Om ervoor te zorgen dat de cellen worden gelyseerd, herhaalt u stap 2.4.3-2.4.5 nogmaals.
  5. Plaats het monster in een koelkast bij 4 °C gedurende 12-24 uur om eiwitprecipitatie mogelijk te maken.
  6. Centrifugeer het 10% waterige TCA-monster bij 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 8 °C.
  7. Gebruik een micropipette om het supernatant over te brengen naar een buis van 2 ml met het label "Vrije fractie".
  8. Micropipette 400 μL van 10% waterige TCA in de centrifugebuis met de resterende monsterpellet en breek de pellet op door vortexbeweging of met de micropipettepunt.
  9. Herhaal stap 2.6-2.7 en breng het supernatant over naar dezelfde 2 ml "Vrije Fractie" -buis.
  10. Micropipette 400 μL van 10% TCA/aceton in de centrifugebuis met de resterende pellet en breek de pellet op met vortexing of de micropipettepunt.
  11. Centrifugeer het 10% TCA/acetonmonster bij 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 8 °C. Gebruik een micropipette om het supernatant over te brengen naar de buis van 2 ml met het label "Vrije fractie".
  12. Plaats de buis "Vrije Fractie" met het deksel open in een centrifugale verdamper (zie Materiaaltabel) totdat alle vluchtige vloeistoffen zijn verwijderd (ten minste 1 uur).
  13. Zodra het monster vrij is van vluchtige vloeistoffen, bedekt u de buis stevig met afdichtingsfilm en doorboort u de film met een paar gaten met een scherp, lang neuspincet. Plaats het monster in een -80 °C vriezer.
  14. Vriesdroog het monster "Vrije fractie" door alle stappen in stap 1.4 te herhalen.
  15. Micropipette 200 μL van 20 mM zoutzuur (HCl) in de buis "Vrije Fractie" om het gevriesdroogde monster te reconstitueren en in de vriescel van −80 °C te plaatsen.
    OPMERKING: De "Vrije Fractie" van het monster is klaar voor filtratie in stap 4. De resterende pellet zal verder worden verwerkt in de volgende stappen voor eiwitfractionering.

3. Fractionering van de eiwitgebonden NPAAs

  1. Gebruik een glasgraveerder om glazen flacons te labelen met de monsterdetails voor identificatie.
    OPMERKING: Sterk zuur kan de etikettering van inkt dissiperen; daarom wordt het graveren van de etiketten op glas aanbevolen.
  2. Micropipette 100 μL van 100 ng/ml D5-2,4-DAB standaard op de monsterpellet (optioneel).
  3. Micropipette 400 μL van 100% aceton op de monsterpellet en breek de pellet af met behulp van vortexbeweging of de micropipettepunt.
  4. Gebruik een micropipette van 1 ml op 1.000 μL om de gewassen en geresuspendeerde pellet over te brengen naar de overeenkomstige glazen injectieflacon.
    OPMERKING: Nog eens 400 μL van 100% aceton kan worden toegevoegd aan de geagiteerde pellet om te helpen bij de volledige overdracht van de pellet in de glazen injectieflacon. Dit kan indien nodig een derde keer worden herhaald.
  5. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C en decanteer de vloeistof in biologisch afval.
  6. Plaats de resterende pellet in een centrifugale verdamper totdat alle vloeistof is verwijderd en de pellet droog is (~ 1 uur).
  7. Bereid de vacuümhydrolyseflacon voor door 1 ml 6 M HCl toe te voegen aan de bodem van de hydrolyseflacon.
  8. Gebruik een pincet om de gelabelde injectieflacons met de gedroogde monsters voorzichtig in de hydrolyseflacon te steken, zodat een rechtopstaande, stabiele positie wordt gegarandeerd.
    OPMERKING: Injectieflacons met lege omhulsels kunnen worden gebruikt om de injectieflacons met het monster rechtop te houden als het aantal monsters kleiner is dan de capaciteit van de hydrolyseflacon.
  9. Bevestig het deksel op de hydrolyseflacon en druk op de rode knop op het deksel om de klep te sluiten.
  10. Zet de vacuümpomp aan, bevestig de vacuümbuis aan de kop van het deksel van de hydrolyseflacon en druk op de groene knop op het deksel om de klep te openen.
  11. Laat de vacuümpomp (zie Materiaaltabel) de lucht gedurende 1 minuut uit de injectieflacon verwijderen.
  12. Sluit de injectieflacon door de rode knop op het deksel van de hydrolyseflacon in te drukken, zet de vacuümpomp uit en verwijder de vacuümbuis.
  13. Bevestig een rubberen buis aan de stikstofgaskraan op de laboratoriumbank en open de kraan iets. Plaats de duim aan het uiteinde van de buis, sluit deze af en tel totdat het gas begint te ontsnappen als de druk toeneemt. Dit zal het tijdsbestek zijn voor de volgende stap. Pas de gasstroom aan op een geschikt tijdsbestek.
  14. Bevestig het andere uiteinde van de rubberen buis aan de kop van het deksel van de hydrolyseflacon en druk onmiddellijk op de groene knop van het deksel. Tel tot de tijd bepaald in stap 3.13 en druk snel op de rode knop op het deksel en verwijder de rubberen buis.
  15. Herhaal stap 3.10-3.14 tweemaal om ervoor te zorgen dat de glazen hydrolyseflacon vrij is van lucht en gevuld is met stikstofgas.
  16. Plaats de injectieflacon met hydrolyse gedurende 16-18 uur in een voorverwarmde oven op 110 °C.
  17. Gebruik ovenhandschoenen om de glazen hydrolyseflacon uit de oven te halen en laat deze gedurende 10 minuten afkoelen in de zuurkast. In de zuurkast, terwijl je hem van je af kijkt, druk je op de groene knop om druk en gas los te laten.
  18. Gebruik een pincet om de injectieflacons van de hydrolyseflacon te verwijderen.
  19. Reconstitueer de gehydrolyseerde monsterpellets door 200 μL van 20 mM HCl in de injectieflacon in de schaal te pipetteren. Zorg ervoor dat de pellet wordt geresuspendeerd door vortexing of met behulp van een pipetpunt.
  20. Centrifugeer de injectieflacons in de schaal met de gereconstitueerde monsterpellets gedurende 2 minuten bij 5.300 x g en 25 °C.

4. Voorbeeldfiltering

  1. Label 2 ml filterbuizen (zie materiaaltabel) met 0,2 μm poriemembraanfilters als "Vrije fractie" en "Eiwitfractie".
  2. Breng de gereconstitueerde monsters uit stap 2.15 (vrije fractie) en stap 3.20 (eiwitfractie) over in de overeenkomstige filterbuizen.
  3. Plaats ze in de centrifuge gedurende 30 minuten bij 5.000 x g en 25 °C.
  4. Verwijder de filters uit de filterbuizen en sluit ze af. De monsters zijn nu klaar voor aminozuurontgivatisatie in stap 5.
    OPMERKING: De monsters kunnen in de -80 °C vriezer worden geplaatst voor opslag voor latere derivatisatie en analyse.

5. Aminozuur derivatisatie

  1. Derivatiseer de monsters met behulp van propylchloorhopaat (PCF)39 of 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamaat (AQC)40 volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).

Representative Results

Een illustratie van het extractieprotocol is opgenomen in figuur 2 als een samengevatte naslaggids. De resultaten verkregen door Violi et al.38 werden gekozen om een positief resultaat uit dit extractieprotocol weer te geven voor de analyse van BMAA-isomeren uit cyanobacteriën. Negentien enkele soorten cyanobacteriën werden gekweekt uit 11 Oost-Australische zoetwaterlocaties. Met behulp van hetzelfde protocol werden de BMAA-isomeren geëxtraheerd in vrije en eiwitfracties, gederivatiseerd met PCF en geanalyseerd met behulp van LC-MS / MS. Zeventien van de cyanobacteriële isolaten waren positief voor BMAA en alle 19 bevatten het 2,4-DAB-isomeer. Een positief resultaat wordt bevestigd door een gevalideerde LC-MS/MS-methode te gebruiken en ten minste drie mrm-overgangen (multiple reaction monitoring) waar te nemen, één als kwantorion en twee als kwalificatie-ionen op de verwachte retentietijd. Een representatief MRM-chromatogram van een standaard met BMAA en zijn isomeren, aangegeven door de kleurgecodeerde lijnen, is weergegeven in figuur 3. De aanwezigheid en concentratie van BMAA en isomeren in alle 19 monsters, gesegmenteerd om de BMAA- en isomeerconcentratie in de vrije en gebonden fracties weer te geven, is samengevat in tabel 1. Een positieve detectie voor alle drie de isomeren werd waargenomen in de vrije fractie van de Merismopedia-soorten verzameld uit Lake Liddell (NSW, Australië), waar de vrije fractie een BMAA-concentratie van 68,38 μg / g drooggewicht (DW) bevatte ± 2,25 μg / g DW, 2,4-DAB met een concentratie van 1.223,98 μg / g DW ± 20,7 μg / g DW, en AEG met een concentratie van 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. De chromatografische MRM's zijn weergegeven in figuur 4. Om een negatief resultaat voor BMAA en zijn isomeren in een monster te illustreren, wordt de gebonden fractie van de Microcystis flos-aquae-soorten verzameld bij Walka Water Works (NSW, Australië) chromatografisch weergegeven in figuur 5. Hoewel de gebonden fractie geen BMAA, 2,4-DAB en/of AEG bevatte, bevatte de vrije fractie alle drie de isomeren, met concentraties van respectievelijk 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW en 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.

Door het gebruik van dit protocol bevestigden Violi et al.38 dus de aanwezigheid van BMAA-isomeren in oost-Australische zoetwatercyanobacteriën en bepaalden welke cyanobacteriën toxineproducerende capaciteiten hadden.

Figure 1
Figuur 1: De chemische structuur van BMAA en zijn isomeren 2,4-DAB en AEG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Samengevat referentiediagram van het extractieprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: LC-MS/MS-chromatogram van een kalibratiestandaard die D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA en AEG bevat voor isomeeridentificatie op basis van retentie, aangegeven door de gemarkeerde pieken. Sleutel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bij 6,4 min (rood), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bij 6,4 min (groen), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bij 7,4 min (oranje) en BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bij 7,8 min (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: LC-MS/MS chromatogram voor het detecteren van D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA en AEG in Merismopedia soorten verzameld uit Lake Liddell (NSW, Australië), aangegeven door de gemarkeerde pieken. Sleutel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bij 6,4 min (rood), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bij 6,4 min (groen), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bij 7,4 min (oranje) en BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bij 7,8 min (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: LC-MS/MS chromatogram van een negatieve controle voor 2,4-DAB, BMAA en AEG in een gebonden fractie van Microcystis flos-aquae soorten verzameld bij Walka Water Works (NSW, Australië). Sleutel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bij 6,4 min (rood - piek gemarkeerd), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bij 6,4 min (groen), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bij 7,4 min (oranje) en BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bij 7,8 min (blauw). De stippellijnen vertegenwoordigen de bewaartijden voor ontbrekende 2,4-DAB, AEG en BMAA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: BMAA, AEG en 2,4-DAB concentraties in cyanobacteriële isolaten. Concentraties ± standaardfout van het gemiddelde (n = 3). ND geeft aan dat er geen detectie is. De hoogste concentratie van elk gedetecteerd isomeer wordt groen gemarkeerd. De tabel is een aangepaste versie van Violi et al.38. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Het extractieprotocol dat hier wordt beschreven voor de analyse van NPAAs is van toepassing op het analyseren van aminozuren in biologische monsters. Voor gidsen over het isoleren en kweken van cyanobacteriële stammen kan men verwijzen naar de methoden die in de studie van Violi et al.38 worden gepresenteerd. De eerste stap in het protocol brengt het monster naar een punt waar normalisatie tussen monsters tegen het droge gewicht kan worden bereikt. De tweede stap is cellyse om de analyten vrij te geven en kan worden uitgevoerd met behulp van een reeks technieken, waaronder mechanische verstoringen / lyses zoals sonde-sonicatie zoals beschreven in dit protocol, vries- / dooicycli, malen en kraalfrezen, en niet-mechanische verstoringen zoals enzymatische, detergentische en / of chemische lysis. Het is bekend dat mechanische verstoring voordelig is ten opzichte van niet-mechanische, omdat het een grotere capaciteit van het monster mogelijk maakt om te lyseren, terwijl de intracellulaire bindingen en eiwitten intact blijven41, hoewel de monstermatrix de optimale methode voor cellyseren kan dicteren.

Eiwitprecipitatie is de kritieke derde stap van dit protocol bij het extraheren van aminozuren voor analyse. TCA is het meest gebruikte oplosmiddel; perchloorzuur, aceton, methyltert-butylether (MTBE), methanol en/of acetonitril 8,42 zijn echter ook gebruikt, waarbij elk extractieoplosmiddel bedoeld is om verschillende substraten te extraheren en neer te slaan. Het hier beschreven model haalt de NPAA BMAA en zijn isomeren uit een cyanobacteriële matrix, en hoewel een reeks verschillende oplosmiddelen zijn gebruikt, zijn de twee meest voorkomende 10% TCA in water (waterig) en 10% TCA in aceton. Over het algemeen wordt eiwitprecipitatie met TCA vaak gebruikt om aminozuren te extraheren om vrije aminozuren uit de eiwitgebonden aminozuren te fractioneren. Bovendien maakt TCA-extractie het mogelijk om het totale eiwitgehalte te bepalen, verontreinigingen voor de vrije fractie te verminderen en de activiteit van proteasen te verminderen met minimale eiwitafbraak43. De TCA-extractie van de vrije fractie werkt door in eerste instantie organisch oplosbare stoffen uit te spoelen, waarbij eiwitten en onoplosbare verbindingen zoals celwandresten in het neerslag achterblijven, wat vervolgens wordt gevolgd door thermische hydrolyse-extractie van de eiwitgebonden aminozuren (gebonden fractie) met behulp van een sterk zuur.

De fractionering van de vrije fractie met 10% waterige TCA plus ultrasoonapparaat produceert de meest uitgebreide eiwitprecipitatie in vergelijking met andere organische oplosmiddelen44 en de beste aminozuurterugwinningen42. Sommige studies kiezen ervoor om een zuur te gebruiken in combinatie met een organisch oplosmiddel (d.w.z. 10% -20% TCA in aceton43) om meer moleculen neer te slaan, waaronder kleinere peptiden / biomoleculen, eiwitafbraak te minimaliseren en verontreinigingen zoals zoutente verminderen 43. Een ander voordeel van 10% TCA in aceton is de snellere droogsnelheid bij de bereiding van de pellet voor hydrolyse, waardoor vochtresten worden geminimaliseerd om aminozuurmodificatie te voorkomen. 10% waterige TCA plus ultrasoonapparaat heeft echter een betere extractie-efficiëntie van vrije aminozuren in vergelijking met 10% TCA in aceton44 alleen. Bovendien heeft 10% waterige TCA-precipitatie beperkingen zoals een lange droogtijd, niet in staat zijn om alle eiwitten of kleine peptiden / biomoleculen neer te slaan, en afhankelijk van de analyt van belang (d.w.z. eiwitten of aminozuren), waarvoor additieven en reductiemiddelen nodig zijn om oxidatie en afbraak te voorkomen45,46.

Dit protocol maakt gebruik van een combinatie van 10% waterige TCA en 10% TCA in aceton om eiwitprecipitatie te verhogen, ervoor te zorgen dat kleinere peptiden / biomoleculen worden neergeslagen, snellere pelletdroogtijden mogelijk te maken en de extractie-efficiëntie te verhogen, gebruikmakend van beide oplosmiddelextractie-eigenschappen. De combinatie van 10% waterige TCA en 10% TCA in aceton kan echter kleine peptiden/biomoleculen in de vrije fractie neerslaan nadat de 10% TCA in aceton supernatant is gecombineerd met de waterige vrije fractie. In dit geval moeten de neerslagen worden overgebracht naar de gebonden fractie voor hydrolyse.

De tweede helft van dit protocol omvat het vrijkomen van aminozuren (d.w.z. BMAA) uit de eiwitpellet via zuurdamphydrolyse bij verhoogde temperaturen in een zuurstofvrije omgeving. De overwegend beperkende factor voor de hydrolysestap is dat het tijdrovend en arbeidsintensief is om te bereiden. De nachtelijke incubatie voorkomt een snelle en tijdefficiënte monstervoorbereiding en -analyse. Bovendien is de kwantitatieve overdracht van de pellet van een centrifugebuis naar een injectieflacon (stap 3.4) een moeizaam proces dat toewijding en geduld vereist om een nauwkeurig normalisatiepunt voor het droge gewicht te garanderen. Mogelijke problemen waarmee de gebruiker te maken kan krijgen, zijn de onvolledige overdracht van de pellet, natte neergeslagen eiwitten die aan pipetpunten en de originele buis kleven, en vaste deeltjes van de pellet die de pipetpunt blokkeren. Een praktische suggestie om een gemakkelijkere overdracht van de pellet te vergemakkelijken, is om ongeveer 0,3-0,5 mm van het uiteinde van de pipetpunt te verwijderen met een schaar, waardoor grotere pelletdeeltjes kunnen worden getrokken en in de injectieflacon van de schaal kunnen worden vrijgegeven. Deze overdrachtsmethode is gebruikelijk voor eiwitextractie voor alle aminozuuranalyses. Er moeten echter wijzigingen worden onderzocht om de efficiëntie en nauwkeurigheid van het kwantitatief overbrengen van de pellet in de injectieflacon in de schaal te verbeteren.

Twee vormen van hydrolysetechnieken kunnen worden gebruikt om aminozuren vrij te maken uit hun eiwitgebonden toestand: vloeibare fasehydrolyse en zuurdamphydrolyse. Vloeistoffasehydrolyse, waarbij 6 M HCl aan het monster wordt toegevoegd, dat vervolgens 's nachts in een oven van 110 °C wordt geplaatst, is een alternatief voor de zuurdamphydrolyse die in dit protocol wordt beschreven. Extractietechnieken die hydrolyse in vloeibare fase gebruiken, kunnen verdere verwerking vereisen, zoals ontzilting, vooral als AQC-derivatisatie wordt gekozen, omdat het basisvoorwaarden vereist voor het labelenvan 40. Zuurdamphydrolyse vermijdt ontzilting en geeft de gebruiker de vrijheid om de derivatisatietechniek te kiezen bij reconstitutie van de uiteindelijke pellet vóór filtratie. Bovendien kunnen de monsters, onafhankelijk van de gekozen hydrolysemethode, verdere verwerking vereisen, zoals SPE voor matrixzuivering en concentratie 29,47,48, afhankelijk van de keuze van de derivatisatietechniek en/of analytische analyse (bijv. omgekeerde fase LC-MS/MS versus hydrofiele interactievloeistofchromatografie [HILIC] LC-MS/MS 37 ). De reconstitutie van de uiteindelijke pellet in 20 mM HCl in dit protocol is geschikt voor derivatisatie met behulp van PCF-reagentia48via een in de handel verkrijgbare aminozuurhydrolysekit39 (zie Materiaaltabel). Zowel AQC als PCF zullen alle aminozuren, eiwitten en niet-eiwitten in oorsprong in het monster derivatiseren, en de selectiviteit van de analyten wordt verkregen door het gebruik van LC-MS / MS en de combinatie van retentietijdmatching en zorgvuldige selectie van de kwantor en kwalificatie-MRM's38. 

De huidige hydrolyseprotocollen zijn niet geoptimaliseerd voor de afgifte van BMAA, 2,4-DAB en AEG, maar voor de 22 eiwitaminozuren op basis van bestaande methoden voor eiwithydrolyse32, waarbij incubatie gedurende langer dan 18 uur resulteert in de afbraak en wijziging van bepaalde aminozuren, wat van invloed is op de LC-MS / MS-analyse en dus de verkregen concentraties32. Beach et al.49 onderzochten hydrolyse in de loop van de tijd (0,5-120 uur) om de hydrolyse te optimaliseren voor het analyseren van BMAA en de proteïnogene aminozuren. Ze ontdekten dat hoewel er een vroege snelle afgifte van BMAA was tijdens de eerste 0,5 uur van de hydrolyse, de BMAA-niveaus bleven toenemen naarmate de hydrolysetijd toenam, zonder degradatie, zelfs na 5 dagen49. Er zijn ook nog steeds verschillende opvattingen en vragen over de ware aard van gebonden BMAA en zijn isomeren, waarbij sommige studies suggereren dat in plaats van BMAA-binding50,51 of misincorporatie in eiwitten14, BMAA-eiwitassociatie oppervlakkig is52. De huidige consensus in de analyse van "gebonden" BMAA vereist echter de gevalideerde en algemeen aanvaarde hydrolysestap die peptiden / eiwitten uit elkaar haalt om aminozuren en dus BMAA en zijn isomeren vrij te maken.

De herstelpercentages van 20 eiwitaminozuren werden bepaald in een studie door Sedgwick et al.42 met behulp van TCA-extractie, wat resulteerde in ongeveer 100% herstel. In het geval van BMAA en zijn isomeren uit algenmatrices, hebben studies die de efficiëntie van BMAA-extractie met behulp van verschillende extractiemiddelen vergelijken, aangetoond dat 10% TCA het meest efficiënt is voor gratis BMAA27. De herstelpercentages voor eiwitgebonden BMAA geëxtraheerd met behulp van vloeibare fasehydrolyse werden vastgesteld in studies door Glover et al.25 en door Faassen et al.53, waarbij de nauwkeurigheid werd bepaald door spiked recovery-methoden, met een gemiddeld BMAA-herstelpercentage van respectievelijk 108,6% en 70%. Faassen et al. beschreven procedures voor spike-recovery experimenten en illustreerden hoe het herstel verschilt afhankelijk van het stadium van het extractieproces waarin de spike werd gemaakt53. Faassen et al. bepaalden bovendien de efficiëntie van het hier gepresenteerde zuur-dampprotocol, met herstelpercentages van 83,6% voor de BMAA-isomeren die piekten voorafgaand aan extractie en 68,6% voor degenen die piekten vóór hydrolyse24. Deze herstelbewerkingen, extractiemethoden en analyses werden verder gevalideerd door Banack26, met herstelpercentages van 94% -106% voor BMAA in een cyanobacteriële matrix en een %relatieve standaarddeviatie (% RSD) tussen 5,6% en 20%, die voldoen aan de FDA-criteria voor nauwkeurigheid54. Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium in eerste instantie zijn herstelpercentages en nauwkeurigheid vaststelt voordat dit protocol wordt gebruikt via spike-herstelexperimenten. De herstelmethoden in Faassen et al.53 en Glover et al.25 kunnen als leidraad worden gevolgd.

Alternatieve vormen van hydrolysetechnieken kunnen worden gebruikt in plaats van nachtelijke ovenhydrolyse voor snellere eiwitgebonden extractie van de analyt. Een magnetronafzuiging kan bijvoorbeeld de hydrolysetijd aanzienlijk verkorten van 24 uur tot slechts 10 minuten55. Microgolfhydrolyse voor aminozuren gebruikt dezelfde principes als de conventionele thermische methode, waarbij een handschoenenkastje wordt gebruikt om het microgolfvat in een zuurstofvrije omgeving te bereiden en te assembleren en 6 M HCl wordt toegevoegd. Eenmaal luchtdicht, ondergaat het vat dat het monster bevat microgolfstraling. Microgolfhydrolyse is gebruikt om aminozuren te extraheren uit verschillende monstermatrices 56,57,58; microgolfhydrolyse moet echter nog worden ontwikkeld en gevalideerd voor de analyse van BMAA.

Kortom, 10% waterige TCA-eiwitprecipitatie is de optimale methode om vrije niet-eiwitaminozuren uit cyanobacteriële matrices27 te extraheren, en thermische hydrolyse zorgt voor een betrouwbare en reproduceerbare extractie van de eiwitgebonden fractie. Dit protocol om de NPAA BMAA en zijn isomeren uit cyanobacteriën te extraheren, is gevalideerd en algemeen aanvaard. Toekomstige aanwijzingen om de extractie van BMAA verder te optimaliseren, zullen zich richten op de hydrolysestap, die wordt uitgevoerd volgens de specificaties van de 22 eiwitaminozuren. Het hier gepresenteerde extractieprotocol moet echter nog steeds als efficiënt en effectief worden beschouwd voor het analyseren van BMAA en zijn isomeren via LC-MS / MS.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

D.P.B., K.J.R. en S.M.M. worden ondersteund door The Ian Potter Foundation en J.P.V. is de ontvanger van een Australian Government Research Training Program, Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, P. O. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. Miflin, B. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 225-269 (1980).
  2. Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
  3. Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
  4. Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. , Academic Press. Cambridge, MA. 21-29 (2015).
  5. Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
  6. Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson's disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
  7. Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
  8. Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
  9. Hashiguchi, A., Komatsu, S. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. Shukla, A. K. , Academic Press. Cambridge, MA. 97-113 (2017).
  10. Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
  11. Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
  12. Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
  13. Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer's disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
  14. Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
  15. Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
  16. Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
  17. Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
  18. Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
  19. Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
  20. Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
  21. Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
  22. Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
  23. Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
  24. Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
  25. Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
  26. Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
  27. Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
  28. Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
  29. Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
  30. Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
  31. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
  32. Davidson, I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. Smith, B. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 111-122 (2003).
  33. Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
  34. Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
  35. Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
  36. Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
  37. Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
  38. Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
  39. Phenomenex. EZ:faast For Amino Acid Analysis of Protein Hydroysates by LC-MS. User's Manual. , Available from: http://phx.phenomenex.com/lib/3882_L6_LC_MS.pdf (2005).
  40. AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters. , Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014).
  41. D'Hondt, E., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 133-154 (2017).
  42. Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
  43. Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
  44. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  45. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  46. Novák, P., Havlíček, V. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). Ciborowski, P., Silberring, J. , Elsevier. 51-62 (2016).
  47. Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
  48. Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
  49. Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
  50. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
  51. Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
  52. van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
  53. Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
  54. Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
  55. Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
  56. Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
  57. Chen, S. -T., Chiou, S. -H., Chu, Y. -H., Wang, K. -T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
  58. Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).

Tags

Chemie Nummer 190 Aminozuur eiwitprecipitatie trichloorazijnzuur (TCA) niet-eiwit aminozuur BMAA cyanobacteriën
Extractie van niet-eiwit aminozuren uit cyanobacteriën voor vloeistofchromatografie- tandem massaspectrometrieanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P.,… More

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Rodgers, K. J., Bishop, D. Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (190), e63779, doi:10.3791/63779 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter