Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

استخراج الأحماض الأمينية غير البروتينية من البكتيريا الزرقاء لتحليل الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

يصف هذا البروتوكول استخلاص الأحماض الأمينية غير البروتينية من المصفوفات البيولوجية عن طريق ترسيب بروتين حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) والتحلل المائي الحمضي قبل التحليل باستخدام مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل.

Abstract

الأحماض الأمينية غير البروتينية (NPAAs) هي فئة كبيرة من الأحماض الأمينية (AAs) التي لم يتم ترميزها وراثيا لترجمتها إلى بروتينات. يمكن أن يوفر تحليل NPAAs معلومات مهمة حول امتصاص الخلايا و / أو وظيفتها ، ومسارات التمثيل الغذائي ، والسمية المحتملة. β-methylamino-L-alanine (BMAA) هو NPAA السمية العصبية التي تنتجها أنواع الطحالب المختلفة ويرتبط بزيادة خطر الإصابة بالأمراض التنكسية العصبية ، مما أدى إلى اهتمام بحثي كبير. هناك العديد من الطرق لاستخراج AAs للتحليل ، مع كون قياس الطيف الكتلي الترادفي اللوني السائل هو الأكثر شيوعا ، مما يتطلب ترسيب البروتين متبوعا بالتحلل المائي الحمضي لحبيبات البروتين. تقدم الدراسات حول وجود BMAA في أنواع الطحالب نتائج متناقضة ، مع استخدام إعداد / استخراج العينات غير المصدق عليها وتحليلها كسبب رئيسي. مثل معظم NPAAs ، فإن ترسيب البروتين في 10٪ TCA المائي والتحلل المائي مع دخان حمض الهيدروكلوريك هو أنسب شكل من أشكال الاستخراج ل BMAA وأيزومراته أمينو إيثيل جليسين (AEG) وحمض 2,4-ديامينوبوتيريك (2,4-DAB). يصف البروتوكول الحالي الخطوات في طريقة استخراج NPAA التي تم التحقق من صحتها والتي يشيع استخدامها في مختبرات البحث والتدريس.

Introduction

الأحماض الأمينية هي مركبات كيميائية تحتوي على مجموعة وظيفية واحدة على الأقل من الأمين والكربوكسيلية. تحتوي بعض الأحماض الأمينية أيضا على مجموعة إيمينو ، وهي مجموعة حمض وظيفية غير الكربوكسيلية. تحتوي الأحماض الأمينية الأخرى على مجموعات أمين غير مرتبطة بمجموعة الكربونα 1. هناك أكثر من 500 حمض أميني2 ، 22 منها تعرف باسم الأحماض الأمينية البروتينية المستخدمة في الترميز الوراثي في تخليق البروتين الريبوسومي3. يمكن تقسيم هذه الأحماض الأمينية ال 22 إلى أساسية وغير أساسية. الأحماض الأمينية الأساسية ضرورية للكائن الحي ليعمل بشكل صحيح ولا يمكن الحصول عليها إلا من مصادر خارجية. يمكن تصنيع الأحماض الأمينية غير الأساسية داخل الكائن الحي. تصنيف الأحماض الأمينية ال 22 إلى أساسية / غير أساسية فريد من نوعه بالنسبة للأنواع الفردية. جميع الأحماض الأمينية الأخرى هي أحماض أمينية غير بروتينية (NPAAs) غير مشفرة لتخليق البروتين. يمكن للأحماض الأمينية ، سواء كانت بروتينية أو غير بروتينية ، أن تلعب أيضا دورا في الإشارة داخل الكائن الحي وتعمل كوسطاء أيضيين4. نظرا لأدوارها المهمة والمتنوعة ، يمكن أن توفر مستويات الأحماض الأمينية نظرة ثاقبة لحالة الكائن الحي ووظائفه ومسارات التمثيل الغذائي ، وما إلى ذلك. هناك آليتان رئيسيتان يمكن من خلالهما دمج الأحماض الأمينية في سلسلة عديد الببتيد: تخليق البروتين الريبوسومي ، الذي يستخدم 22 من الأحماض الأمينية في الترميز ، وتخليق الببتيد غير الريبوسومي ، والذي يسمح ، إلى جانب الأحماض الأمينية البروتينية ، باستخدام بعض NPAAs في التوليف. يمكن لبعض NPAAs تقليد الأحماض الأمينية البروتينية ، مما قد يؤدي إلى دمجها بشكل خاطئ في الببتيدات والبروتينات. يتسبب الدمج الخاطئ في اختلال البروتينات ، والذي بدوره له آثار ضارة5 ، مثل سوء دمج NPAA L-3،4 ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (L-DOPA) بدلا من التيروزين ، مما يؤثر سلبا على الوظيفة الخلوية والصحة 6,7. مصدر إضافي ل NPAAs المدمجة هو من خلال التعديل اللاحق للترجمة (PTM) لبقايا الأحماض الأمينية. يتم تعديل بقايا الأحماض الأمينية لأسباب مختلفة ، بما في ذلك التغييرات في تشكيل الببتيد أو البروتين والاستقرار والوظائف. عند التحلل المائي للبروتين أو الببتيدات المحتوية على PTM ، يتم إطلاق بقايا الأحماض الأمينية المعدلة هذه في شكل NPAA المجاني 8,9.

NPAA β-methylamino-L-alanine (BMAA) التي تنتجها البكتيريا الزرقاء والدياتومات والدينوفلاجيلات10 هي سم عصبي مشتبه به متورط كعامل مساهم في العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري / مجمع باركنسون والخرف (ALS-PDC) 11،12 ، والتصلب الجانبي الضموري ، ومرض الزهايمر 13 . يقترح أن يتم دمج BMAA عن طريق الخطأ في سلسلة البروتينات عديد الببتيد بدلا من L-serine14 و / أو الأحماض الأمينية البروتينية الأخرى. يمكن أن يؤدي سوء دمج BMAA إلى اختلال البروتينات ، مما يؤدي إلى ترسب مجاميع البروتين في الخلايا العصبية14. في العقد الماضي ، زاد الاهتمام ب BMAA بشكل كبير. تم اكتشاف مجموعة واسعة من أنواع البكتيريا الزرقاء من المياه العذبة والبيئات البحرية والمالحة لإنتاج BMAA15 ، مما أدى إلى توزيعها على نطاق واسع في مختلف النظم البيئية16،17. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن BMAA يتضخم بيولوجيا من خلال السلسلة الغذائية إلى شبكة الغذاء البشري18,19. نظرا للآثار الصحية المحتملة ، وعدم الفهم ، وعدم التناقض في سمية BMAA ، من الضروري مواصلة المزيد من البحث حتى يتم فهم سمية BMAA في النهاية أو يعتبر BMAA آمنا20,21.

يمكن تقسيم تحليل الأحماض الأمينية في العينات البيولوجية إلى أربع خطوات رئيسية: تحضير العينة ، واشتقاق الأحماض الأمينية ، والفصل والكشف ، والتحديد والقياس الكمي. يعد قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) طريقة التحليل المفضلة لأنه يوفر فصلا وتحليلا مستهدفا وقابلا للتكرار للأحماض الأمينية.

تتضمن تقنيات تحضير العينات لتحليل عينات البكتيريا الزرقاء والطحالب الأخرى في الغالب طريقة استخراج الأحماض الأمينية في أشكالها الحرة والمرتبطة بالبروتين. على مر السنين ، ظلت طرق الاستخراج متسقة نسبيا مع العناصر المشتركة ، بما في ذلك إذابة العينة لفصل الأحماض الأمينية الحرة عن شكلها المرتبط ، يليها ترسيب البروتين وإطلاق الأحماض الأمينية المرتبطة من خلال التحلل المائي مع حمض الهيدروكلوريك (HCl) عند درجات حرارة مرتفعة22 . تم تحسين شكل الاستخراج هذا للأحماض الأمينية البروتينية واستخدامه في NPAAs. ومع ذلك ، فإن الكشف عن BMAA وأيزومراته وقياسها الكمي (الشكل 1) ، وأمينو إيثيل جليسين (AEG) وحمض 2،4-ديامينوبوتيريك (2،4-DAB) ، في نفس النوع من البكتيريا الزرقاء قد أظهر نتائج غير متسقة في الأدبيات ، مع تفسير محتمل يكمن في الاختلافات في ظروف النمو و / أو سلالة الطحالب التي تنتج كميات متفاوتة أو معدومة من BMAA23 . وقد قيل إن التفسير الأكثر ترجيحا لعدم الاتساق في الكشف عن BMAA وأيزومراته وتحديدها كميا يرجع إلى البروتوكولات التجريبية غير المؤكدة ، واستخدام مجموعة واسعة من التقنيات التحليلية ، وعدم كفاية التفاصيل التجريبية في الطرق المبلغ عنها16,24 مما يؤدي إلى بيانات بين المختبرات غير قابلة للتكرار. ومع ذلك ، قام Glover et al.25 و Banack26 مؤخرا بتطوير والتحقق من صحة تقنية تحليلية للكشف عن BMAA وأيزومراته وتحديدها باستخدام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UPLC) -MS / MS وفقا للجمعية الدولية للكيميائيين التحليليين (AOAC) ، دستور الأدوية الأمريكي ، وإرشادات إدارة الغذاء والدواء اللازمة للتحقق من صحة مختبر واحد.

ركزت تجارب التحقق هذه على فصل واكتشاف BMAA وأيزومراته ولم تعالج التناقضات في بروتوكولات تحضير العينات. قارن Lage et al.27 أداء ثلاث طرق استخراج شائعة لقياس BMAA وأيزومراته في عينات البكتيريا الزرقاء عبر LC-MS / MS: استخراج الطور الصلب (SPE) للأحماض الأمينية الحرة28,29; طريقة ترسيب البروتين التي تنطوي على استخراج الميثانول وترسيب الأسيتون30 ؛ وطريقة الاستخراج الأكثر استخداما ل BMAA ، ترسيب البروتين مع حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA)31. وخلصوا إلى أن ترسيب بروتين TCA كان البروتوكول الأمثل ، مما أدى إلى تركيزات BMAA أعلى في عينات الاختبار مقارنة بطرق الاستخراج الأخرى. أثبتت دراستهم صحة استخراج TCA مع اشتقاق BMAA باستخدام 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) في مصفوفة البكتيريا الزرقاء ، مما يوفر دليلا راسخا لتحقيق بيانات BMAA موثوقة وقابلة للتكرار. استخراج الأحماض الأمينية TCA هو تقنية تحضير عينة مقبولة وشائعة يمكن تطبيقها أيضا على مصفوفات أخرى. ومع ذلك ، يجب مراعاة استقرار الأحماض الأمينية أثناء التحلل المائي لمنع التدهور أو الأكسدة ، والتي يمكن التغلب عليها باستخدام المعدلات الكيميائية وعوامل الاختزال32. يتم استخدام استخراج TCA بشكل روتيني وتدريسه لطلاب الأبحاث الجدد ، وعلى الرغم من الإبلاغ عن البروتوكول على نطاق واسع ، إلا أن المساعدة البصرية في تطبيق هذه الطريقة تعد موردا قيما ، مما يضمن التنفيذ السليم والمتسقة.

يشيع استخدام كروماتوغرافيا المرحلة العكسية لفصل الأحماض الأمينية ، مما يتطلب خطوة اشتقاق قبل التحليلات. يسمح اشتقاق الأحماض الأمينية مثل BMAA بالاحتفاظ الكروماتوجرافي ويمكن أن يزيد من الدقة بين الأيزومرات. كما أنه يزيد من الكتلة الجزيئية ويحسن التأين في مطياف الكتلة. تم استخدام العديد من الكواشف المشتقة لتحليل الأحماض الأمينية عبر LC-MS / MS ، بما في ذلك بروبيل كلوروفورمات (PCF) 33 ، 6-أمينوكينوليل-N-هيدروسيسينيميديل كاربامات (AQC) 27 ، 9-فلورينيل ميثيل كلوروفورمات (FMOC) 34 ، وكلوريد دانسيل (DC) 35. ومع ذلك ، فإن التقنيات الوحيدة التي تم التحقق من صحتها لتحليل BMAA استخدمت إما PCF 36 أو AQC24،26،37 ككاشف مشتق لها.

يركز نطاق هذا البروتوكول على استخراج TCA من NPAAs من مصفوفات البكتيريا الزرقاء. إنها طريقة كثيفة العمالة يتم استخدامها وتدريسها بشكل روتيني في مختبرات البحوث الأكاديمية والصناعية بناء على مخطوطات قد تكون قصيرة في التفاصيل. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول تفاصيل عن الإجراء والتقنيات المستخدمة في إعداد العينات لتحليل BMAA الحر والمرتبط كنموذج للحمض الأميني .

Protocol

تم استخدام أنواع البكتيريا الزرقاء Merismopedia للدراسة الحالية38.

1. إعداد عينة الخام

  1. اجمع حثالة الطحالب من مصدر الاهتمام المائي أو من دورق مستزرع بالبكتيريا الزرقاء وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل38.
    ملاحظة: يجب تجميد العينة عند -20 درجة مئوية لاستخراجها لاحقا وإذابتها قبل الخطوة التالية.
  2. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب التي تحتوي على العينة عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. صب المادة الطافية في حاوية نفايات وتخلص منها في النفايات البيولوجية.
    ملاحظة: قد يتم حجز الطافي للتحليل المستقبلي للإكسوسوم.
  3. قم بتغطية الأنبوب الذي يحتوي على عينة الحبيبات بإحكام باستخدام فيلم مانع للتسرب (انظر جدول المواد) واخترق بعض الثقوب في الفيلم باستخدام ملقط أنف حاد وطويل. قم بتخزين الأنبوب في وضع رأسي عند -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بتشغيل وموازنة مجفف التجميد عند 0.1 ملي بار و -80 درجة مئوية (~ 30 دقيقة).
    ملاحظة: تم تحسين المعلمات (الخطوة 1.4) لمجفف التجميد المستخدم في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). اتبع إجراءات التشغيل القياسية وفقا لطراز المجفف بالتجميد المتوفر في المختبر أو اضبط أدنى درجة حرارة ممكنة إذا كان طراز المجفف بالتجميد لا يصل إلى -80 درجة مئوية.
    1. ضع أنبوب (أنابيب) جهاز الطرد المركزي في وضع مستقيم في وعاء زجاجي مجفف بالتجميد وضعه داخل الفريزر −80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتبريد البرطمان.
    2. أخرج الحاوية الزجاجية من الثلاجة وأرفق الغطاء المطاطي.
    3. تأكد من تهوية المقبض الموجود على مخرج الصمام المطاطي لمجفف التجميد في الغلاف الجوي (مشيرا لأعلى) وقم بتوصيل الحاوية الزجاجية بإحكام.
    4. أدر مقبض مخرج الصمام المطاطي ببطء شديد إلى وضع الإشارة لأسفل لتعريض الجرة للفراغ والسماح بما يصل إلى 24 ساعة من التجفيف بالتجميد لضمان تسامي كل السائل.
    5. لتحرير الفراغ في الجرة ، أدر المقبض إلى الوضع التصاعدي ، وافصل الحاوية الزجاجية ، وقم بإزالة العينات المجففة بالتجميد.
  5. استخدم ميزانا تحليليا لوزن 15-50 مجم من كريات العينات المجففة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    ملاحظة: يمكن وضع العينات في تخزين -80 درجة مئوية إذا لم تتم معالجتها مرة أخرى في هذه المرحلة.

2. تحلل الخلايا وتجزئة NPAAs الحرة

  1. أضف 100 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل من معيار D5-2,4-DAB (انظر جدول المواد) باستخدام ماصة دقيقة إلى أنبوب العينة (اختياري).
  2. أضف 300-600 ميكرولتر من 10٪ وزن / فولت ثلاثي كلورو الخليك المائي (TCA ، انظر جدول المواد) أو 300-600 ميكرولتر من 11.7٪ -13.3٪ TCA ، على التوالي ، في حالة إضافة معيار D5-2،4-DAB.
    ملاحظة: اختر حجما من TCA المائي الذي يغطي الحبيبات بالكامل.
  3. ضع أنابيب العينة في وعاء مملوء بالثلج المجروش.
  4. استخدم سونيكاتور مسبار (انظر جدول المواد) بقوة متوسطة عالية (70٪) وقم بتحليل العينة لمدة 1 دقيقة باتباع الخطوات أدناه.
    تنبيه: تأكد من معدات الوقاية الشخصية المناسبة باستخدام غطاء الأذن المانع للضوضاء.
    1. اتبع بروتوكولات السلامة المناسبة استعدادا لاستخدام مسبار صوتي عن طريق وضع لافتات قيد الاستخدام على الباب ، وإجراء صوتنة في غطاء الدخان ، واستخدام غطاء للأذنين لإلغاء الضوضاء.
    2. قم بتشغيل الصوتنة وأدخل المعلمات التالية: السعة ، 70٪ ؛ الوقت، 1 دقيقة.
    3. رش 70٪ من الإيثانول على منديل ورقي خال من النسالة (انظر جدول المواد) وامسح المسبار.
    4. اغمر نهاية المسبار بالكامل في العينة ، واضغط على ابدأ.
    5. عندما يتوقف صوتي المسبار ، ضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على العينة على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    6. للتأكد من تحلل الخلايا ، كرر الخطوات 2.4.3-2.4.5 مرة أخرى.
  5. ضع العينة في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 12-24 ساعة للسماح بترسيب البروتين.
  6. جهاز طرد مركزي لعينة TCA المائية بنسبة 10٪ عند 3500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 8 درجات مئوية.
  7. استخدم ماصة دقيقة لنقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 2 مل يسمى "الكسر الحر".
  8. Micropipette 400 μL من TCA المائي بنسبة 10٪ في أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على حبيبات العينة المتبقية وتفتيت الحبيبات إما عن طريق تحريك الدوامة أو بطرف الماصة الدقيقة.
  9. كرر الخطوات 2.6-2.7 ، ونقل الطافت إلى نفس أنبوب "الكسر الحر" سعة 2 مل.
  10. Micropipette 400 μL من 10٪ TCA / الأسيتون في أنبوب الطرد المركزي مع الحبيبات المتبقية وتفتيت الحبيبات مع الدوامة أو طرف الماصة الدقيقة.
  11. جهاز طرد مركزي لعينة TCA / الأسيتون بنسبة 10٪ عند 3500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 8 درجات مئوية. استخدم ماصة دقيقة لنقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 2 مل المسمى "الكسر الحر".
  12. ضع أنبوب "الجزء الحر" مع فتح الغطاء في مبخر الطرد المركزي (انظر جدول المواد) حتى تتم إزالة جميع السوائل المتطايرة (1 ساعة على الأقل).
  13. بمجرد أن تصبح العينة خالية من السوائل المتطايرة ، قم بتغطية الأنبوب بإحكام بغشاء مانع للتسرب واخترق الفيلم ببضع ثقوب باستخدام ملقط أنف حاد وطويل. ضع العينة في فريزر -80 درجة مئوية.
  14. قم بتجميد عينة "الكسر الحر" عن طريق تكرار جميع الخطوات في الخطوة 1.4.
  15. Micropipette 200 μL من 20 mM حمض الهيدروكلوريك (HCl) في أنبوب "الجزء الحر" لإعادة تكوين العينة المجففة بالتجميد ووضعها في تخزين الفريزر −80 درجة مئوية.
    ملاحظة: "الكسر الحر" للعينة جاهز للترشيح في الخطوة 4. ستتم معالجة الحبيبات المتبقية بشكل أكبر في الخطوات التالية لتجزئة البروتين.

3. تجزئة NPAAs المرتبطة بالبروتين

  1. استخدم حفارة زجاجية لتسمية قوارير الغلاف الزجاجي بتفاصيل العينة لتحديد الهوية.
    ملاحظة: قد يبدد الحمض القوي وضع العلامات على الحبر ؛ لذلك ، يوصى بنقش الملصقات على الزجاج.
  2. Micropipette 100 μL من 100 نانوغرام / مل D5-2،4-DAB قياسي على عينة بيليه (اختياري).
  3. Micropipette 400 μL من الأسيتون 100٪ على حبيبات العينة وتفتيت الحبيبات باستخدام تحريض الدوامة أو طرف الماصة الدقيقة.
  4. استخدم ماصة دقيقة سعة 1 مل مضبوطة على 1000 ميكرولتر لنقل الحبيبات المغسولة والمعاد تعليقها إلى قارورة الغلاف الزجاجي المقابلة.
    ملاحظة: يمكن إضافة 400 ميكرولتر أخرى من الأسيتون بنسبة 100٪ إلى الحبيبات المهتاجة للمساعدة في النقل الكامل للحبيبات إلى قارورة الغلاف الزجاجي. يمكن تكرار هذا مرة ثالثة إذا لزم الأمر.
  5. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وصب السائل في النفايات البيولوجية.
  6. ضع الحبيبات المتبقية في مبخر طرد مركزي حتى تتم إزالة السائل بالكامل وتجف الحبيبات (~ 1 ساعة).
  7. تحضير قارورة التحلل المائي الفراغي بإضافة 1 مل من 6 M حمض الهيدروكلوريك في قاع قارورة التحلل المائي.
  8. استخدم الملقط لإدخال قوارير الصدفة الموسومة التي تحتوي على العينات المجففة بعناية في قارورة التحلل المائي ، مما يضمن وضعا مستقيما ومستقرا.
    ملاحظة: يمكن استخدام قوارير الغلاف الفارغة للمساعدة في الحفاظ على قوارير العينة في وضع مستقيم إذا كان عدد العينات أقل من سعة قارورة التحلل المائي.
  9. قم بتوصيل الغطاء بقارورة التحلل المائي وادفع المقبض الأحمر على الغطاء لإغلاق الصمام.
  10. قم بتشغيل مضخة التفريغ ، وقم بتوصيل أنبوب التفريغ برأس غطاء قارورة التحلل المائي ، واضغط على المقبض الأخضر على الغطاء لفتح الصمام.
  11. اسمح لمضخة التفريغ (انظر جدول المواد) بإزالة الهواء من القارورة لمدة 1 دقيقة.
  12. أغلق القارورة عن طريق الضغط على المقبض الأحمر الموجود على غطاء قارورة التحلل المائي ، وأوقف تشغيل مضخة التفريغ ، وقم بإزالة الأنبوب المفرغ.
  13. قم بتوصيل أنبوب مطاطي بصنبور غاز النيتروجين على طاولة المختبر وافتح الصنبور قليلا. ضع الإبهام في نهاية الأنبوب ، وأغلقه ، وعد حتى يبدأ الغاز في الهروب مع تراكم الضغط. سيكون هذا هو الإطار الزمني للخطوة التالية. اضبط تدفق الغاز على إطار زمني مناسب.
  14. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب المطاطي برأس غطاء قارورة التحلل المائي ثم ادفع المقبض الأخضر للغطاء على الفور. عد إلى الوقت المحدد في الخطوة 3.13 وادفع المقبض الأحمر بسرعة على الغطاء وأزل الأنبوب المطاطي.
  15. كرر الخطوات 3.10-3.14 مرتين للتأكد من خلو قارورة التحلل المائي الزجاجية من الهواء ومليئة بغاز النيتروجين.
  16. ضع قارورة التحلل المائي في فرن محمى على حرارة 110 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  17. استخدم قفازات الفرن لإزالة قارورة التحلل المائي الزجاجية من الفرن واتركها تبرد داخل غطاء الدخان لمدة 10 دقائق. داخل غطاء الدخان ، أثناء مواجهته بعيدا عنك ، ادفع المقبض الأخضر لتحرير الضغط والغاز.
  18. استخدم الملقط لإزالة قوارير القشرة من قارورة التحلل المائي.
  19. أعد تكوين كريات العينة المتحللة بالماء عن طريق ماصة صغيرة 200 ميكرولتر من 20 مللي متر حمض الهيدروكلوريك في قارورة القشرة. تأكد من إعادة تعليق الحبيبات إما عن طريق الدوامة أو باستخدام طرف ماصة.
  20. أجهزة الطرد المركزي قوارير قذيفة تحتوي على كريات العينة المعاد تشكيلها لمدة 2 دقيقة عند 5300 × جم و 25 درجة مئوية.

4. تصفية العينة

  1. أنابيب مرشح الملصق 2 مل (انظر جدول المواد) التي تحتوي على مرشحات غشاء المسام 0.2 ميكرومتر باسم "الجزء الحر" و "جزء البروتين".
  2. انقل العينات المعاد تشكيلها من الخطوة 2.15 (الكسر الحر) والخطوة 3.20 (جزء البروتين) إلى أنابيب المرشح المقابلة.
  3. ضعها في جهاز الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 5000 × جم و 25 درجة مئوية.
  4. قم بإزالة المرشحات من أنابيب المرشح وقم بتغطيتها. العينات جاهزة الآن لاشتقاق الأحماض الأمينية في الخطوة 5.
    ملاحظة: يمكن وضع العينات في الفريزر −80 درجة مئوية للتخزين لاشتقاقها وتحليلها لاحقا.

5. اشتقاق الأحماض الأمينية

  1. اشتقاق العينات باستخدام بروبيل كلوروفورمات (PCF)39 أو 6-أمينوكينوليل-N-هيدروسيسينيميديل كاربامات (AQC)40 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر جدول المواد).

Representative Results

ويرد رسم توضيحي لبروتوكول الاستخراج في الشكل 2 كدليل مرجعي موجز. تم اختيار النتائج التي حصل عليها Violi et al.38 لتمثيل نتيجة إيجابية من بروتوكول الاستخراج هذا لتحليل أيزومرات BMAA من البكتيريا الزرقاء. تم استزراع تسعة عشر نوعا منفردا من البكتيريا الزرقاء من 11 موقعا للمياه العذبة في شرق أستراليا. باستخدام نفس البروتوكول ، تم استخراج أيزومرات BMAA إلى أجزاء حرة وبروتينية ، مشتقة باستخدام PCF ، وتحليلها باستخدام LC-MS / MS. كانت سبعة عشر من عزلات البكتيريا الزرقاء إيجابية ل BMAA ، وتحتوي جميع ال 19 على أيزومر 2,4-DAB. يتم تأكيد النتيجة الإيجابية باستخدام طريقة LC-MS / MS التي تم التحقق من صحتها ومراقبة ما لا يقل عن ثلاثة انتقالات لمراقبة التفاعل المتعدد (MRM) ، واحدة كأيون كمي واثنتان كأيونات مؤهلة في وقت الاحتفاظ المتوقع. يظهر الشكل 3 مخطط كروماتوجرام MRM تمثيلي لمعيار يحتوي على BMAA وأيزومراته ، المشار إليه بالخطوط المرمزة بالألوان. ويلخص الجدول 1 وجود وتركيز BMAA والأيزومرات في جميع العينات ال 19 ، مقسمة لإظهار تركيز BMAA والأيزومر في الكسور الحرة والمقيدة. لوحظ اكتشاف إيجابي لجميع الأيزومرات الثلاثة في الجزء الحر من أنواع Merismopedia التي تم جمعها من بحيرة ليدل (نيو ساوث ويلز ، أستراليا) ، حيث احتوى الجزء الحر على تركيز BMAA يبلغ 68.38 ميكروغرام / غرام من الوزن الجاف (DW) ± 2.25 ميكروغرام / غرام DW ، 2,4-DAB بتركيز 1,223.98 ميكروغرام / غرام DW ± 20.7 ميكروغرام / غرام DW ، و AEG بتركيز 125.27 ميكروغرام/غرام DW ± 4.19 ميكروغرام/غرام DW. تظهر MRMs الكروماتوغرافية في الشكل 4. لتوضيح نتيجة سلبية ل BMAA وأيزومراته في عينة ، يتم عرض الجزء المرتبط من أنواع Microcystis flos-aquae التي تم جمعها من Walka Water Works (نيو ساوث ويلز ، أستراليا) كروماتوغرافيا في الشكل 5. في حين أن الجزء المرتبط لا يحتوي على BMAA و 2,4-DAB و / أو AEG ، فإن جزئه الحر يحتوي على جميع الأيزومرات الثلاثة ، بتركيزات 79.86 ميكروغرام / غرام DW ± 1.59 ميكروغرام / غرام DW ، 1,156.15 ميكروغرام / غرام DW ± 8.46 ميكروغرام / غرام DW ، و 433.83 ميكروغرام / غرام DW ± 8.92 ميكروغرام / غرام DW ، على التوالي.

وهكذا ، من خلال استخدام هذا البروتوكول ، أكد Violi et al.38 وجود أيزومرات BMAA في البكتيريا الزرقاء للمياه العذبة في شرق أستراليا وحدد البكتيريا الزرقاء التي لديها قدرات على إنتاج السموم.

Figure 1
الشكل 1: التركيب الكيميائي ل BMAA وأيزومراته 2،4-DAB و AEG. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مخطط مرجعي موجز لبروتوكول الاستخراج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: كروماتوجرام LC-MS/MS لمعيار معايرة يحتوي على D5-2,4-DAB و 2,4-DAB و BMAA و AEG لتحديد الأيزومر بناء على الاحتفاظ ، المشار إليه بالقمم المميزة. مفتاح: D5-2،4-DAB 338.01 م / z > 278.10 م / z عند 6.4 دقيقة (أحمر) ، 2،4-DAB 333.01 م / z > 273.10 م / z عند 6.4 دقيقة (أخضر) ، AEG 333.01 م / z > 88.00 م / z عند 7.4 دقيقة (برتقالي) ، و BMAA 333.01 م / z > 187.10 م / z في 7.8 دقيقة (أزرق). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: كروماتوجرام LC-MS / MS للكشف عن D5-2،4-DAB و 2،4-DAB و BMAA و AEG في أنواع Merismopedia التي تم جمعها من بحيرة Liddell (نيو ساوث ويلز ، أستراليا) ، المشار إليها بالقمم المميزة. مفتاح: D5-2،4-DAB 338.01 م / z > 278.10 م / z عند 6.4 دقيقة (أحمر) ، 2،4-DAB 333.01 م / z > 273.10 م / z عند 6.4 دقيقة (أخضر) ، AEG 333.01 م / z > 88.00 م / z عند 7.4 دقيقة (برتقالي) ، و BMAA 333.01 م / z > 187.10 م / z في 7.8 دقيقة (أزرق). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: مخطط كروماتوجرام LC-MS / MS للتحكم السلبي ل 2،4-DAB و BMAA و AEG في جزء منضم من أنواع Microcystis flos-aquae التي تم جمعها من Walka Water Works (نيو ساوث ويلز ، أستراليا). مفتاح: D5-2،4-DAB 338.01 م / z > 278.10 م / z عند 6.4 دقيقة (أحمر - ذروة مميزة) ، 2,4-DAB 333.01 م / z > 273.10 م / z عند 6.4 دقيقة (أخضر) ، AEG 333.01 م / z > 88.00 م / z عند 7.4 دقيقة (برتقالي) ، و BMAA 333.01 م / z > 187.10 م / z عند 7.8 دقيقة (أزرق). تمثل الخطوط المتقطعة أوقات الاحتفاظ ب 2,4-DAB و AEG و BMAA المفقودة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تركيزات BMAA و AEG و 2,4-DAB في عزلات البكتيريا الزرقاء. التركيزات ± الخطأ المعياري للمتوسط (ن = 3). ND يدل على لم يتم اكتشافها. يتم تمييز أعلى تركيز لكل أيزومر تم اكتشافه باللون الأخضر. الجدول هو نسخة معدلة من Violi et al.38. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

ينطبق بروتوكول الاستخراج الموضح هنا لتحليل NPAAs على تحليل أي أحماض أمينية في العينات البيولوجية. للحصول على أدلة حول عزل سلالات البكتيريا الزرقاء واستزراعها ، يمكن للمرء الرجوع إلى الطرق المقدمة في الدراسة التي أجراها Violi et al.38. تأخذ الخطوة الأولى في البروتوكول العينة إلى نقطة يمكن فيها تحقيق التطبيع بين العينات مقابل الوزن الجاف. الخطوة الثانية هي تحلل الخلايا لإطلاق التحليلات ويمكن إجراؤها باستخدام مجموعة من التقنيات ، بما في ذلك الاضطرابات / المحللات الميكانيكية مثل صوتنة المسبار كما هو موضح في هذا البروتوكول ، ودورات التجميد / الذوبان ، والطحن والطحن بالخرز ، والاضطرابات غير الميكانيكية مثل التحلل الأنزيمي و / أو المنظفات و / أو التحلل الكيميائي. من المعروف أن الاضطراب الميكانيكي مفيد على غير الميكانيكي لأنه يسمح بقدرة أكبر للعينة على التحلل مع السماح للروابط داخل الخلايا والبروتينات بالبقاء سليمة41 ، على الرغم من أن مصفوفة العينة قد تملي الطريقة المثلى لتحلل الخلية.

ترسيب البروتين هو الخطوة الثالثة الحاسمة في هذا البروتوكول عند استخراج الأحماض الأمينية للتحليل. TCA هو المذيب الأكثر استخداما. ومع ذلك ، تم أيضا استخدام حمض البيركلوريك ، والأسيتون ، وميثيل ثلاثي بوتيل الأثير (MTBE) ، والميثانول ، و / أو الأسيتونيتريل 8,42 ، حيث يهدف كل مذيب استخراج إلى استخراج وترسب ركائز مختلفة. يستخرج النموذج الموصوف هنا NPAA BMAA وأيزومراته من مصفوفة البكتيريا الزرقاء ، وعلى الرغم من استخدام مجموعة من المذيبات المختلفة ، فإن المذيبين الأكثر شيوعا هما 10٪ TCA في الماء (مائي) و 10٪ TCA في الأسيتون. بشكل عام ، يستخدم ترسيب البروتين مع TCA بشكل شائع لاستخراج الأحماض الأمينية لتجزئة الأحماض الأمينية الحرة من الأحماض الأمينية المرتبطة بالبروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استخراج TCA بتحديد إجمالي محتوى البروتين ، وتقليل الملوثات للجزء الحر ، وتقليل نشاط البروتياز مع الحد الأدنى من تدهور البروتين43. يعمل استخراج TCA للجزء الحر عن طريق شطف المواد القابلة للذوبان العضوي في البداية ، تاركا وراءه البروتينات والمركبات غير القابلة للذوبان مثل بقايا جدار الخلية في الراسب ، والذي يتبعه بعد ذلك استخراج التحلل الحراري للأحماض الأمينية المرتبطة بالبروتين (الجزء المرتبط) باستخدام حمض قوي.

ينتج عن تجزئة الجزء الحر مع 10٪ TCA المائي بالإضافة إلى صوتنة ترسيب البروتين الأكثر شمولا مقارنة بالمذيبات العضوية الأخرى44 وأفضل عمليات استرداد الأحماض الأمينية42. تختار بعض الدراسات استخدام حمض ممزوج بمذيب عضوي (أي 10٪ -20٪ TCA في الأسيتون 43) لترسيب المزيد من الجزيئات ، بما في ذلك الببتيدات / الجزيئات الحيوية الأصغر ، وتقليل تدهور البروتين ، وتقليل الملوثات مثل الأملاح43. ميزة أخرى ل 10٪ TCA في الأسيتون هي معدل التجفيف الأسرع في تحضير الحبيبات للتحلل المائي ، مما يقلل من بقايا الرطوبة لمنع تعديل الأحماض الأمينية. ومع ذلك ، فإن 10٪ TCA المائي بالإضافة إلى صوتنة لديها كفاءات استخراج أفضل للأحماض الأمينية الحرة بالمقارنة مع 10٪ TCA في الأسيتون44 وحده. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ترسيب TCA المائي بنسبة 10٪ له قيود مثل وقت التجفيف الطويل ، وعدم القدرة على ترسيب جميع البروتينات أو الببتيدات / الجزيئات الحيوية الصغيرة ، واعتمادا على التحليل محل الاهتمام (أي البروتينات أو الأحماض الأمينية) ، مما يتطلب إضافات وعوامل اختزال لمنع الأكسدة والتحلل45,46.

يستخدم هذا البروتوكول مزيجا من 10٪ TCA مائي و 10٪ TCA في الأسيتون لزيادة ترسيب البروتين ، وضمان ترسيب الببتيدات / الجزيئات الحيوية الأصغر ، والسماح بأوقات تجفيف الحبيبات بشكل أسرع ، وزيادة كفاءة الاستخراج ، والاستفادة من كل من خصائص استخراج المذيبات. ومع ذلك ، فإن الجمع بين 10٪ TCA المائي و 10٪ TCA في الأسيتون يمكن أن يترسب الببتيدات الصغيرة / الجزيئات الحيوية في الجزء الحر بعد دمج 10٪ TCA في طافت الأسيتون مع الجزء المائي الحر. في هذه الحالة ، يجب نقل الرواسب إلى الكسر المرتبط للتحلل المائي.

يتضمن النصف الثاني من هذا البروتوكول إطلاق الأحماض الأمينية (أي BMAA) من حبيبات البروتين عن طريق التحلل المائي للبخار الحمضي عند درجات حرارة مرتفعة في بيئة خالية من الأكسجين. العامل الذي يحد في الغالب من خطوة التحلل المائي هو أنه يستغرق وقتا طويلا وشاقا للتحضير. تمنع الحضانة الليلية إعداد العينات وتحليلها بسرعة وفعالية من حيث الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النقل الكمي للحبيبات من أنبوب الطرد المركزي إلى قارورة قذيفة (الخطوة 3.4) هو عملية شاقة تتطلب الاجتهاد والصبر لضمان نقطة تطبيع دقيقة للوزن الجاف. المشكلات المحتملة التي قد يواجهها المستخدم هي النقل غير الكامل للحبيبات ، والبروتينات المترسبة الرطبة الملتصقة بأطراف الماصة والأنبوب الأصلي ، والجزيئات الصلبة للحبيبات التي تسد طرف الماصة. اقتراح عملي للمساعدة في نقل أسهل للحبيبات هو إزالة حوالي 0.3-0.5 مم من نهاية طرف الماصة بمقص ، مما يسمح بسحب جزيئات الحبيبات الأكبر وإطلاقها في قارورة الصدفة. طريقة النقل هذه هي ممارسة شائعة لاستخراج البروتين لجميع تحليلات الأحماض الأمينية. ومع ذلك ، ينبغي التحقيق في التعديلات لتحسين كفاءة ودقة نقل الحبيبات كميا إلى قارورة الصدفة.

يمكن استخدام شكلين من تقنيات التحلل المائي لإطلاق الأحماض الأمينية من حالتها المرتبطة بالبروتين: التحلل المائي في المرحلة السائلة والتحلل المائي للبخار الحمضي. يعد التحلل المائي للمرحلة السائلة ، والذي يتضمن إضافة 6 م حمض الهيدروكلوريك إلى العينة ، والتي يتم وضعها بعد ذلك في فرن 110 درجة مئوية طوال الليل ، بديلا للتحلل المائي بالبخار الحمضي الموصوف في هذا البروتوكول. قد تتطلب تقنيات الاستخراج التي تستخدم التحلل المائي للمرحلة السائلة مزيدا من المعالجة ، مثل تحلية المياه ، خاصة إذا تم اختيار اشتقاق AQC ، لأنها تتطلب شروطا أساسية لوضع علامة40. يتجنب التحلل المائي بالبخار الحمضي تحلية المياه ويتيح للمستخدم حرية اختيار تقنية الاشتقاق عند إعادة تكوين الحبيبات النهائية قبل الترشيح. علاوة على ذلك ، بغض النظر عن طريقة التحلل المائي المختارة ، قد تتطلب العينات مزيدا من المعالجة ، مثل SPE لتنقية المصفوفة وتركيزها29،47،48 ، اعتمادا على اختيار تقنية الاشتقاق و / أو التحليل التحليلي (على سبيل المثال ، المرحلة العكسية LC-MS / MS مقابل كروماتوغرافيا السائل للتفاعل المحب للماء [HILIC] LC-MS / MS 37 ). إعادة تكوين الحبيبات النهائية في 20 mM HCl في هذا البروتوكول مناسبة للاشتقاق باستخدام كواشف PCF48عبر مجموعة التحلل المائيللأحماض الأمينية المتاحة تجاريا 39 (انظر جدول المواد). سيقوم كل من AQC و PCF باشتقاق جميع الأحماض الأمينية والبروتين وغير البروتيني في الأصل الموجود في العينة ، ويتم الحصول على انتقائية التحليلات من خلال استخدام LC-MS / MS ومزيجها من مطابقة وقت الاحتفاظ والاختيار الدقيق للكمي والمؤهل MRMs38. 

لم يتم تحسين بروتوكولات التحلل المائي الحالية لإطلاق BMAA و 2,4-DAB و AEG ولكن للأحماض الأمينية البروتينية 22 بناء على الطرق الحالية للتحلل المائيللبروتين 32 ، حيث تؤدي الحضانة لمدة تزيد عن 18 ساعة إلى تدهور وتعديل بعض الأحماض الأمينية ، مما يؤثر على تحليل LC-MS / MS ، وبالتالي ، التركيزات التي تم الحصول عليها32. قام Beach et al.49 بالتحقيق في التحلل المائي بمرور الوقت (0.5-120 ساعة) لتحسين التحلل المائي لتحليل BMAA والأحماض الأمينية البروتينية. وجدوا أنه على الرغم من وجود إطلاق سريع مبكر ل BMAA خلال أول 0.5 ساعة من التحلل المائي ، استمرت مستويات BMAA في الزيادة مع زيادة وقت التحلل المائي ، دون تدهور ، حتى بعد 5 أيام49. لا تزال هناك أيضا وجهات نظر وأسئلة مختلفة حول الطبيعة الحقيقية ل BMAA المرتبط وأيزومراته ، حيث تشير بعض الدراسات إلى أنه بدلا من ربط BMAA 50,51 أو الاندماج الخاطئ في البروتينات14 ، فإن ارتباط بروتين BMAA سطحي52. ومع ذلك ، فإن الإجماع الحالي في تحليل BMAA "المرتبط" يتطلب خطوة التحلل المائي التي تم التحقق من صحتها والمقبولة على نطاق واسع والتي تفصل الببتيدات / البروتينات لإطلاق الأحماض الأمينية ، وبالتالي ، BMAA وأيزومراتها.

تم تحديد معدلات استرداد 20 من الأحماض الأمينية البروتينية في دراسة أجراها Sedgwick et al.42 باستخدام استخراج TCA ، مما أدى إلى استرداد 100٪ تقريبا. في حالة BMAA وأيزومراته من مصفوفات الطحالب ، وجدت الدراسات التي تقارن كفاءة استخراج BMAA باستخدام مذيبات استخلاص مختلفة أن 10٪ TCA هو الأكثر كفاءة ل BMAA27 مجانا. تم تحديد معدلات الاسترداد ل BMAA المرتبط بالبروتين المستخرج باستخدام التحلل المائي للطور السائل في الدراسات التي أجراها Glover et al.25 و Faassen et al.53 ، حيث تم تحديد الدقة من خلال طرق الاسترداد المسننة ، بمتوسط معدل استرداد BMAA يبلغ 108.6٪ و 70٪ على التوالي. وصف Faassen et al. إجراءات تجارب استعادة السنبلة وأوضحوا كيف يختلف الاسترداد اعتمادا على مرحلة عملية الاستخراج التي تم فيها إجراء السنبلة53. بالإضافة إلى ذلك ، حدد Faassen et al. كفاءة بروتوكول بخار الحمض المعروض هنا ، مع ارتفاع معدلات الاسترداد بنسبة 83.6٪ لأيزومرات BMAA قبل الاستخراج و 68.6٪ لتلك التي ارتفعت قبل التحلل المائي24. تم التحقق من صحة عمليات الاسترداد وطرق الاستخراج والتحليلات هذه من قبل Banack 26 ، مع معدلات استرداد 94٪ -106٪ ل BMAA في مصفوفة البكتيريا الزرقاء و ٪ الانحراف المعياري النسبي (٪ RSD) بين 5.6٪ و20٪ ، وتلبية معايير إدارة الغذاء والدواء للدقة54. يوصى بأن يحدد كل مختبر في البداية معدلات الاسترداد والدقة قبل استخدام هذا البروتوكول عبر تجارب استعادة السنبلة. يمكن اتباع طرق الاسترداد المقدمة في Faassen et al.53 و Glover et al.25 كدليل.

يمكن استخدام أشكال بديلة من تقنيات التحلل المائي بدلا من التحلل المائي في الفرن طوال الليل لاستخراج المادة المراد تحليلها بشكل أسرع مرتبط بالبروتين. على سبيل المثال ، يمكن لمستخرج الميكروويف أن يقلل بشكل كبير من وقت التحلل المائي من 24 ساعة إلى أقل من 10 دقائق55. يستخدم التحلل المائي بالموجات الدقيقة للأحماض الأمينية نفس مبادئ الطريقة الحرارية التقليدية ، باستخدام صندوق قفازات لإعداد وتجميع وعاء الميكروويف في بيئة خالية من الأكسجين وإضافة 6 M HCl. بمجرد إحكام الهواء ، يخضع الوعاء الذي يحتوي على العينة لإشعاع الميكروويف. تم استخدام التحلل المائي بالموجات الدقيقة لاستخراج الأحماض الأمينية من مصفوفات العينات المختلفة56،57،58 ؛ ومع ذلك ، لم يتم بعد تطوير التحلل المائي بالموجات الدقيقة والتحقق من صحته لتحليل BMAA.

في الختام ، فإن ترسيب بروتين TCA المائي بنسبة 10٪ هو الطريقة المثلى لاستخراج الأحماض الأمينية غير البروتينية الحرة من مصفوفات البكتيريا الزرقاء27 ، ويوفر التحلل الحراري استخراجا موثوقا وقابلا للتكرار للجزء المرتبط بالبروتين. تم التحقق من صحة هذا البروتوكول لاستخراج NPAA BMAA وأيزومراته من البكتيريا الزرقاء وقبوله على نطاق واسع. ستركز الاتجاهات المستقبلية لزيادة تحسين استخراج BMAA على خطوة التحلل المائي ، والتي يتم إجراؤها وفقا لمواصفات الأحماض الأمينية البروتينية البالغ عددها 22. ومع ذلك ، لا يزال ينبغي اعتبار بروتوكول الاستخراج المقدم هنا فعالا وفعالا لتحليل BMAA وأيزومراته عبر LC-MS / MS.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يتم دعم D.P.B. ، K.J.R. ، و S.M.M. من قبل مؤسسة إيان بوتر ، و JPV هو المستفيد من برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية ، Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, P. O. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. Miflin, B. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 225-269 (1980).
  2. Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
  3. Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
  4. Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. , Academic Press. Cambridge, MA. 21-29 (2015).
  5. Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
  6. Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson's disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
  7. Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
  8. Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
  9. Hashiguchi, A., Komatsu, S. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. Shukla, A. K. , Academic Press. Cambridge, MA. 97-113 (2017).
  10. Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
  11. Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
  12. Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
  13. Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer's disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
  14. Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
  15. Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
  16. Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
  17. Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
  18. Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
  19. Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
  20. Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
  21. Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
  22. Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
  23. Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
  24. Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
  25. Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
  26. Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
  27. Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
  28. Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
  29. Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
  30. Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
  31. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
  32. Davidson, I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. Smith, B. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 111-122 (2003).
  33. Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
  34. Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
  35. Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
  36. Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
  37. Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
  38. Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
  39. Phenomenex. EZ:faast For Amino Acid Analysis of Protein Hydroysates by LC-MS. User's Manual. , Available from: http://phx.phenomenex.com/lib/3882_L6_LC_MS.pdf (2005).
  40. AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters. , Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014).
  41. D'Hondt, E., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 133-154 (2017).
  42. Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
  43. Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
  44. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  45. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  46. Novák, P., Havlíček, V. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). Ciborowski, P., Silberring, J. , Elsevier. 51-62 (2016).
  47. Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
  48. Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
  49. Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
  50. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
  51. Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
  52. van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
  53. Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
  54. Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
  55. Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
  56. Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
  57. Chen, S. -T., Chiou, S. -H., Chu, Y. -H., Wang, K. -T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
  58. Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).

Tags

كيمياء، العدد 190، الأحماض الأمينية، ترسيب البروتين، حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA)، الأحماض الأمينية غير البروتينية، BMAA، البكتيريا الزرقاء
استخراج الأحماض الأمينية غير البروتينية من البكتيريا الزرقاء لتحليل الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P.,… More

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Rodgers, K. J., Bishop, D. Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (190), e63779, doi:10.3791/63779 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter