Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Extraktion av icke-proteinaminosyror från cyanobakterier för vätskekromatografi-tandemmasspektrometrianalys

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

Detta protokoll beskriver extraktionen av icke-proteinaminosyror från biologiska matriser via triklorättiksyra (TCA) proteinutfällning och syrahydrolys före analys med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri.

Abstract

Icke-proteinaminosyror (NPAA) är en stor klass av aminosyror (AA) som inte är genetiskt kodade för översättning till proteiner. Analysen av NPAA kan ge viktig information om cellulärt upptag och/eller funktion, metaboliska vägar och potentiell toxicitet. β-metylamino-L-alanin (BMAA) är en neurotoxisk NPAA som produceras av olika algarter och är förknippad med en ökad risk för neurodegenerativa sjukdomar, vilket har lett till betydande forskningsintresse. Det finns många sätt att extrahera AA för analys, med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri som den vanligaste, vilket kräver proteinutfällning följt av sur hydrolys av proteinpelleten. Studier av förekomsten av BMAA hos algarter ger motstridiga resultat, med användning av ovaliderad provberedning/extraktion och analys som en primär orsak. Liksom de flesta NPAA är proteinutfällning i 10% vattenhaltig TCA och hydrolys med rökande HCl den mest lämpliga formen av extraktion för BMAA och dess isomerer aminoetylglycin (AEG) och 2,4-diaminosmörsyra (2,4-DAB). Detta protokoll beskriver stegen i en validerad NPAA-extraktionsmetod som vanligtvis används i forsknings- och undervisningslaboratorier.

Introduction

Aminosyror är kemiska föreningar som innehåller minst en amin- och karboxylfunktionell grupp. Vissa aminosyror innehåller också en iminogrupp, en annan funktionell syragrupp än karboxylsyra; Andra aminosyror har amingrupper som inte är bundna till α-kolgrupp1. Det finns över 500 aminosyror2, varav 22 är kända som proteinaminosyror som används för genetisk kodning i ribosomal proteinsyntes3. Dessa 22 aminosyror kan vidare delas in i essentiella och icke-essentiella. Essentiella aminosyror är nödvändiga för att en organism ska fungera korrekt och kan endast förvärvas av externa källor. Icke-essentiella aminosyror kan syntetiseras i organismen. Klassificeringen av de 22 aminosyrorna i essentiella/icke-essentiella är unik för enskilda arter. Alla andra aminosyror är icke-proteinaminosyror (NPAA) som inte kodas för proteinsyntes. Aminosyror, oavsett om de är protein eller icke-protein, kan också spela en signalerande roll i en organism och fungera som metaboliska mellanhänder4. På grund av deras viktiga och varierande roller kan aminosyranivåer ge en inblick i organismens tillstånd, funktionalitet och metaboliska vägar etc. Det finns två huvudmekanismer genom vilka aminosyror kan införlivas i en polypeptidkedja: ribosomal proteinsyntes, som använder de 22 aminosyrorna vid kodning, och icke-ribosomal peptidsyntes, som tillsammans med proteinaminosyror möjliggör användning av vissa NPAA i syntes. Vissa NPAA kan efterlikna proteinaminosyror, vilket kan leda till att de felaktigt införlivas i peptider och proteiner. Misinkorporeringen orsakar en felveckning av proteiner, vilket i sin tur har skadliga effekter5, såsom felaktig införlivande av NPAA L-3,4 dihydroxifenylalanin (L-DOPA) i stället för tyrosin, vilket negativt påverkar cellulär funktion och hälsa 6,7. En ytterligare källa till införlivade NPAA är genom post-translationell modifiering (PTM) av aminosyrarester. Aminosyrarester modifieras av olika skäl, inklusive förändringar i peptid- eller proteinkonformation, stabilitet och funktionalitet. Vid hydrolys av PTM-innehållande protein eller peptider frigörs dessa modifierade aminosyrarester i sin fria NPAA-form 8,9.

NPAA-β-metylamino-L-alanin (BMAA) som produceras av cyanobakterier, kiselalger och dinoflagellater10 är ett misstänkt neurotoxin som är inblandat som en bidragande faktor till olika neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateralskleros / parkinsonism-demenskomplex (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateralskleros och Alzheimers sjukdom 13 . Det föreslås att BMAA felaktigt införlivas i polypeptidkedjan av proteiner i stället för L-serin14 och/eller andra proteinaminosyror. Misinkorporering av BMAA kan leda till felveckning av proteiner, vilket resulterar i avsättning av proteinaggregat i neuroner14. Under det senaste decenniet har intresset för BMAA ökat avsevärt. Ett brett spektrum av cyanobakteriella arter från sötvatten, marina och bräckta miljöer har upptäckts för att producera BMAA15, vilket leder till deras utbredda utbredning i olika ekosystem16,17. Dessutom har BMAA visat sig biomagnifiera genom livsmedelskedjan till den mänskliga födoväven18,19. På grund av de potentiella hälsoeffekterna, bristen på förståelse och inkongruenser av BMAA-toxicitet är det absolut nödvändigt att fortsätta ytterligare forskning tills antingen toxiciteten hos BMAA slutligen förstås eller BMAA anses vara säker20,21.

Analysen av aminosyror i biologiska prover kan delas in i fyra huvudsteg: provberedning, aminosyraderivatisering, separation och detektion samt identifiering och kvantifiering. Vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) är den föredragna analysmetoden eftersom den ger en riktad och reproducerbar separation och analys av aminosyror.

Provberedningstekniker för analys av cyanobakteriella och andra algprover involverar huvudsakligen en extraktionsmetod för aminosyror i deras fria och proteinbundna former. Under årens lopp har extraktionsmetoderna förblivit relativt förenliga med vanliga element, inklusive upplösningen av provet för att separera de fria aminosyrorna från deras bundna form, följt av proteinutfällning och frisättning av de bundna aminosyrorna genom hydrolys med saltsyra (HCl) vid förhöjda temperaturer22 . Denna extraktionsform har optimerats för proteinaminosyror och används för NPAA. Detektion och kvantifiering av BMAA och dess isomerer (figur 1), aminoetylglycin (AEG) och 2,4-diaminosmörsyra (2,4-DAB) hos samma art av cyanobakterier har dock visat inkonsekventa resultat i litteraturen, med en möjlig förklaring som ligger i skillnader i tillväxtförhållanden och/eller stam av alger som producerar varierande eller inga mängder BMAA23 . Det har hävdats att en mer sannolik förklaring till inkonsekvenserna i detektionen och kvantifieringen av BMAA och dess isomerer beror på icke-validerade experimentella protokoll, användningen av ett brett spektrum av analystekniker och otillräcklig experimentell detalj i de rapporterade metoderna16,24 som leder till irreproducerbara data mellan laboratorier. Glover et al.25 och Banack 26 har dock nyligen utvecklat och validerat en analytisk teknik för detektion och kvantifiering av BMAA och dess isomerer med hjälp av ultraprestanda vätskekromatografi (UPLC) -MS / MS i enlighet med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia och FDA-riktlinjer som är nödvändiga för validering av ett laboratorium.

Dessa valideringsexperiment fokuserade på separation och detektion av BMAA och dess isomerer och tog inte upp inkonsekvenserna i provberedningsprotokoll. Lage et al.27 jämförde prestandan hos tre vanliga extraktionsmetoder för kvantifiering av BMAA och dess isomerer i cyanobakteriella prover via LC-MS/MS: fastfasextraktion (SPE) av fria aminosyror28,29; En proteinutfällningsmetod som inbegriper en metanolextraktion och acetonutfällning30. och den vanligaste extraktionsmetoden för BMAA, proteinutfällning med triklorättiksyra (TCA)31. De drog slutsatsen att TCA-proteinutfällningen var det optimala protokollet, vilket gav högre BMAA-koncentrationer i testproverna jämfört med de andra extraktionsmetoderna. Deras studie validerade TCA-extraktion med derivatisering av BMAA med användning av 6-aminokinolyl-N-hydroxisuccinimidylkarbamat (AQC) i en cyanobakteriematris, vilket gav en etablerad guide för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara BMAA-data. TCA-aminosyraextraktion är en accepterad och vanlig provberedningsteknik som också kan tillämpas på andra matriser. Aminosyrans stabilitet under hydrolys måste emellertid beaktas för att förhindra nedbrytning eller oxidation, vilket kan övervinnas med användning av kemiska modifierare och reduktionsmedel32. TCA-extraktion används rutinmässigt och lärs ut till nya forskarstudenter, och även om protokollet rapporteras allmänt är ett visuellt hjälpmedel vid tillämpningen av denna metod en värdefull resurs, vilket säkerställer korrekt och konsekvent utförande.

Omvänd faskromatografi används vanligtvis för att separera aminosyror, vilket kräver ett derivatiseringssteg före analyser. Härledningen av aminosyror såsom BMAA möjliggör kromatografisk retention och kan öka upplösningen mellan isomerer. Det ökar också molekylmassan och förbättrar joniseringen i masspektrometern. Flera derivatiserande reagenser har använts för analys av aminosyror via LC-MS/MS, inklusive propylkloroformat (PCF)33, 6-aminokinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC)27, 9-fluorenylmetylkloroformat (FMOC)34 och dansylklorid (DC)35. De enda validerade teknikerna för att analysera BMAA använde dock antingen PCF 36 eller AQC24,26,37 som sitt derivatiserande reagens.

Omfattningen av detta protokoll är inriktat på TCA-extraktion av NPAA från cyanobakteriella matriser. Det är en arbetsintensiv metod som rutinmässigt används och lärs ut i akademiska och industriella forskningslaboratorier baserade på manuskript som kan vara korta på detaljer; Därför ger detta protokoll detaljer om proceduren och teknikerna som är involverade i att förbereda prover för analys av fri och bunden BMAA som modellaminosyra.

Protocol

Cyanobakteriearten Merismopedia användes för den aktuella studien38.

1. Beredning av råprov

  1. Samla algskummet från den vattenlevande källan av intresse eller från en cyanobakteriell odlad kolv och placera den i 50 ml centrifugrör38.
    Anmärkning: Provet måste frysas vid −20 °C för senare extraktioner och tinas före följande steg.
  2. Centrifugera rören som innehåller provet vid 3 500 x g i 10 minuter vid 25 °C. Dekantera supernatanten i en avfallsbehållare och kasta den i biologiskt avfall.
    OBS: Supernatanten kan vara reserverad för framtida analys av exosomen.
  3. Täck röret som innehåller provpelleten ordentligt med en tätningsfilm (se materialtabell) och genomborra några hål i filmen med en vass, lång näspincett. Förvara röret i upprätt läge vid −80 °C i 30 minuter.
  4. Slå på och jämna ut frystorken vid 0,1 mbar och −80 °C (~30 min).
    OBS: Parametrarna (steg 1.4) är optimerade för frystorken som används för denna studie (se Materialförteckning). Följ standardrutiner enligt frystorksmodellen som finns i laboratoriet eller ställ in lägsta möjliga temperatur om frystorkmodellen inte går så lågt som −80 °C.
    1. Placera centrifugröret eller centrifugrören upprätt i en frystorkglasbehållare och placera det i frysen −80 °C i 5 minuter för att kyla burken.
    2. Ta bort glasbehållaren från frysen och fäst gummilocket.
    3. Se till att handtaget på frystorkens gummiventilutlopp ventileras till atmosfären (pekar uppåt) och fäst glasbehållaren ordentligt.
    4. Vrid handtaget på gummiventilutloppet mycket långsamt till pekläget nedåt för att utsätta burken för vakuumet och tillåt upp till 24 timmars frystorkning för att säkerställa sublimering av all vätska.
    5. För att släppa vakuumet i burken, vrid handtaget till pekläget uppåt, lossa glasbehållaren och ta bort de frystorkade proverna.
  5. Använd en analysvåg för att väga in 15–50 mg torkade provpellets i ett 15 ml centrifugrör.
    Anmärkning: Proverna får placeras i −80 °C om de inte bearbetas ytterligare i detta skede.

2. Celllysering och fraktionering av fria NPAA

  1. Tillsätt 100 μl 100 ng/ml D5-2,4-DAB-standard (se materialförteckning) med hjälp av en mikropipett till provröret (valfritt).
  2. Tillsätt 300–600 μl 10 % vattenhaltigt triklorättiksyra (TCA, se materialtabell) respektive 300–600 μl 11,7–13,3 % TCA om D5-2,4-DAB-standarden läggs till.
    OBS: Välj en volym vattenhaltig TCA som helt täcker pelleten.
  3. Placera provrören i en behållare fylld med krossad is.
  4. Använd en sondsonicator (se materialtabell) vid medelhög effekt (70%) och lyse provet i 1 min enligt stegen nedan.
    VARNING: Se till att personlig skyddsutrustning är korrekt med hjälp av brusreducerande hörselkåpor.
    1. Följ lämpliga säkerhetsprotokoll som förberedelse för användning av sonden sonicator genom att placera i bruk skyltar på dörren, utföra ultraljudsbehandling i dragskåpet och använda brusreducerande hörselkåpor.
    2. Slå på sonicator och ange följande parametrar: amplitud, 70%; tid, 1 min.
    3. Spraya 70 % etanol på en luddfri papperstork (se Materialförteckning) och torka av sonden.
    4. Sänk ner sondens ände helt i provet och tryck på start.
    5. När sondsonicator stannar, placera centrifugröret som innehåller provet på is i 1 min.
    6. För att säkerställa att cellerna lyserar, upprepa steg 2.4.3-2.4.5 en gång till.
  5. Ställ provet i kylskåp vid 4 °C i 12–24 timmar för att möjliggöra proteinutfällning.
  6. Centrifugera det 10 % vattenhaltiga TCA-provet vid 3 500 x g i 15 minuter vid 8 °C.
  7. Använd en mikropipett för att överföra supernatanten till ett 2 ml rör märkt "Free Fraction".
  8. Mikropipettera 400 μl 10% vattenhaltig TCA i centrifugröret som innehåller den återstående provpelleten och bryt upp pelleten antingen genom virvelomrörning eller med mikropipettspetsen.
  9. Upprepa steg 2.6-2.7 och överför supernatanten till samma 2 ml "Free Fraction" -rör.
  10. Mikropipettera 400 μl 10% TCA/aceton i centrifugröret med den återstående pelleten och bryt upp pelleten med virvel eller mikropipettspetsen.
  11. Centrifugera 10 % TCA/acetonprovet vid 3 500 x g i 15 minuter vid 8 °C. Använd en mikropipett för att överföra supernatanten till 2 ml röret märkt "Free Fraction".
  12. Placera röret "Free Fraction" med locket öppet i en centrifugalindunstare (se materialförteckning) tills alla flyktiga vätskor har tagits bort (minst 1 h).
  13. När provet är fritt från flyktiga vätskor, täck röret ordentligt med tätningsfilm och genomborra filmen med några hål med en skarp, lång näspincett. Placera provet i en frys på −80 °C.
  14. Frystorka provet "Free Fraction" genom att upprepa alla steg i steg 1.4.
  15. Mikropipettera 200 μl 20 mM saltsyra (HCl) i röret "Free Fraction" för att rekonstituera det frystorkade provet och placera det i −80 °C frysförvaring.
    OBS: Den "fria fraktionen" av provet är klar för filtrering i steg 4. Den återstående pelleten kommer att bearbetas ytterligare i följande steg för proteinfraktionering.

3. Fraktionering av de proteinbundna NPAA:erna

  1. Använd en glasgraverare för att märka flaskor med glasskal med provdetaljerna för identifiering.
    OBS: Stark syra kan sprida bläckmärkning; Därför rekommenderas gravering av etiketterna på glas.
  2. Mikropipett 100 μL 100 ng/ml D5-2,4-DAB-standard på provpelleten (valfritt).
  3. Mikropipettera 400 μl 100% aceton på provpelleten och bryt upp pelleten med antingen virvelomrörning eller mikropipettspetsen.
  4. Använd en 1 ml mikropipett inställd på 1 000 μl för att överföra den tvättade och återsuspenderade pelleten till motsvarande injektionsflaska med glasskal.
    OBS: Ytterligare 400 μl 100% aceton kan tillsättas till den omrörda pelleten för att hjälpa till med fullständig överföring av pelleten till injektionsflaskan med glasskal. Detta kan upprepas en tredje gång om det behövs.
  5. Centrifugera vid 8 000 x g i 5 minuter vid 25 °C och dekantera vätskan till biologiskt avfall.
  6. Placera den återstående pelleten i en centrifugalindunstare tills all vätska har tagits bort och pelleten är torr (~ 1 h).
  7. Bered injektionsflaskan med vakuumhydrolys genom att tillsätta 1 ml 6 M HCl i botten av hydrolysflaskan.
  8. Använd pincett för att försiktigt föra in de märkta injektionsflaskorna med skal som innehåller de torkade proverna i hydrolysflaskan, vilket säkerställer en upprätt, stabil position.
    OBS: Injektionsflaskor med tom skal kan användas för att hålla provflaskorna upprätt om antalet prover är mindre än kapaciteten hos hydrolysflaskan.
  9. Fäst locket på hydrolysflaskan och tryck på den röda ratten på locket för att stänga ventilen.
  10. Slå på vakuumpumpen, fäst vakuumröret på huvudet på hydrolysflaskans lock och tryck på den gröna ratten på locket för att öppna ventilen.
  11. Låt vakuumpumpen (se materialförteckningen) ta bort luften från injektionsflaskan i 1 min.
  12. Stäng injektionsflaskan genom att trycka ner den röda vredet på locket till hydrolysflaskan, stäng av vakuumpumpen och ta bort vakuumröret.
  13. Fäst ett gummirör på kvävgaskranen på laboratoriebänken och öppna kranen något. Placera tummen vid rörets ände, försegla den och räkna tills gasen börjar fly när trycket byggs upp. Detta kommer att vara tidsramen för nästa steg. Justera gasflödet till en lämplig tidsram.
  14. Fäst den andra änden av gummiröret på huvudet på hydrolysflaskans lock och tryck sedan omedelbart på lockets gröna vred. Räkna till den tid som bestäms i steg 3.13 och tryck snabbt på den röda ratten på locket och ta bort gummiröret.
  15. Upprepa steg 3.10-3.14 två gånger för att säkerställa att injektionsflaskan med hydrolys av glas är fri från luft och fylld med kvävgas.
  16. Placera hydrolysflaskan i en förvärmd ugn inställd på 110 ° C i 16-18 timmar.
  17. Använd ugnshandskar för att ta bort flaskan med hydrolys av glas från ugnen och låt den svalna inuti dragskåpet i 10 minuter. Inuti dragskåpet, medan du vänder den bort från dig, tryck på den gröna ratten för att släppa ut tryck och gas.
  18. Använd pincett för att ta bort skalflaskorna från hydrolysflaskan.
  19. Rekonstituera de hydrolyserade provpelletsen genom mikropipettering av 200 μl 20 mM HCl i injektionsflaskan med skal. Se till att pelleten återsuspenderas genom att antingen virvla eller använda en pipettspets.
  20. Centrifugera injektionsflaskorna med skalet som innehåller de färdigberedda pelarna i 2 minuter vid 5 300 x g och 25 °C.

4. Exempel på filtrering

  1. Märk 2 ml filterrör (se materialtabell) som innehåller 0,2 μm pormembranfilter som "Free Fraction" och "Protein Fraction".
  2. Överför de färdigberedda proverna från steg 2.15 (fri fraktion) och steg 3.20 (proteinfraktion) till motsvarande filterrör.
  3. Placera dem i centrifugen i 30 minuter vid 5 000 x g och 25 °C.
  4. Ta bort filtren från filterrören och täck dem. Proverna är nu klara för aminosyraderivatisering i steg 5.
    OBS: Proverna kan placeras i −80 °C frysen för förvaring för senare derivatisering och analys.

5. Aminosyra derivatisering

  1. Härled proverna med propylkloroformate (PCF)39 eller 6-aminokinolyl-N-hydrosysuccinimidylkarbamat (AQC)40 enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning).

Representative Results

En illustration av extraktionsprotokollet finns i figur 2 som en sammanfattad referensguide. Resultaten erhållna av Violi et al.38 valdes för att representera ett positivt resultat från detta extraktionsprotokoll för analys av BMAA-isomerer från cyanobakterier. Nitton enskilda arter av cyanobakterier odlades från 11 östra australiensiska sötvattenplatser. Med samma protokoll extraherades BMAA-isomererna till fria och proteinfraktioner, derivatiserades med PCF och analyserades med LC-MS / MS. Sjutton av de cyanobakteriella isolaten var positiva för BMAA, och alla 19 innehöll 2,4-DAB-isomeren. Ett positivt resultat bekräftas genom att använda en validerad LC-MS/MS-metod och observera minst tre övergångar för multipel reaktionsövervakning (MRM), en som kvantifierarjon och två som kvalificerande joner vid den förväntade retentionstiden. Ett representativt MRM-kromatogram av en standard som innehåller BMAA och dess isomerer, som indikeras av de färgkodade linjerna, visas i figur 3. Närvaron och koncentrationen av BMAA och isomerer i alla 19 prover, uppdelade för att visa BMAA- och isomerkoncentrationen i de fria och bundna fraktionerna, sammanfattas i tabell 1. En positiv detektion för alla tre isomererna observerades i den fria fraktionen av Merismopedia-arterna som samlats in från Liddellsjön (NSW, Australien), där den fria fraktionen innehöll en BMAA-koncentration på 68,38 μg/g torrvikt (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB med en koncentration på 1 223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, och AEG med en koncentration på 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. De kromatografiska MRM-värdena visas i figur 4. För att illustrera ett negativt resultat för BMAA och dess isomerer i ett prov presenteras den bundna fraktionen av Microcystis flos-aquae-arterna som samlats in från Walka Water Works (NSW, Australien) kromatografiskt i figur 5. Medan den bundna fraktionen inte innehöll någon BMAA, 2,4-DAB och/eller AEG, innehöll dess fria fraktion alla tre isomererna, med koncentrationer på 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1 156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW respektive 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.

Således, genom användningen av detta protokoll, bekräftade Violi et al.38 närvaron av BMAA-isomerer i östra australiensiska sötvattencyanobakterier och bestämde vilka cyanobakterier som hade toxinproducerande kapacitet.

Figure 1
Figur 1: Den kemiska strukturen hos BMAA och dess isomerer 2,4-DAB och AEG. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Sammanfattat referensdiagram över extraktionsprotokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: LC-MS/MS-kromatogram av en kalibreringsstandard som innehåller D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA och AEG för isomeridentifiering baserad på retention, indikerat av de markerade topparna. Nyckel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z vid 6,4 min (röd), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z vid 6,4 min (grön), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z vid 7,4 min (orange) och BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z vid 7,8 min (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: LC-MS/MS-kromatogram för detektion av D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA och AEG i Merismopedia-arter som samlats in från Liddellsjön (NSW, Australien), indikerat av de markerade topparna. Nyckel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z vid 6,4 min (röd), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z vid 6,4 min (grön), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z vid 7,4 min (orange) och BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z vid 7,8 min (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: LC-MS/MS-kromatogram för en negativ kontroll för 2,4-DAB, BMAA och AEG i en bunden fraktion av Microcystis flos-aquae-arter som samlats in från Walka Water Works (NSW, Australien). Nyckel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z vid 6,4 min (röd - topp markerad), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z vid 6,4 min (grön), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z vid 7,4 min (orange) och BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z vid 7,8 min (blå). De streckade linjerna representerar kvarhållningstiderna för saknade 2,4-DAB, AEG och BMAA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: BMAA-, AEG- och 2,4-DAB-koncentrationer i cyanobakteriella isolat. Koncentrationer ± medelmåttans standardfel (n = 3). ND betecknar inte detekterad. Den högsta koncentrationen av varje isomer som detekteras markeras med grönt. Tabellen är en modifierad version från Violi et al.38. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Extraktionsprotokollet som beskrivs här för analys av NPAA gäller för att analysera aminosyror i biologiska prover. För guider om isolering och odling av cyanobakteriella stammar kan man hänvisa till de metoder som presenteras i studien av Violi et al.38. Det första steget i protokollet tar provet till en punkt där normalisering mellan proverna mot torrvikten kan uppnås. Det andra steget är celllys för att frigöra analyterna och kan utföras med hjälp av en rad tekniker, inklusive mekaniska störningar / lyser såsom sondsljudsbehandling som beskrivs i detta protokoll, frysning / tina cykler, slipning och pärlfräsning och icke-mekaniska störningar såsom enzymatisk, tvättmedel och / eller kemisk lys. Mekanisk störning är känd för att vara fördelaktig jämfört med icke-mekanisk eftersom det möjliggör en större kapacitet hos provet att lysera samtidigt som de intracellulära bindningarna och proteinerna kan förbli intakta41, även om provmatrisen kan diktera den optimala metoden för celllysering.

Proteinutfällning är det kritiska tredje steget i detta protokoll vid extraktion av aminosyror för analys. TCA är det vanligaste lösningsmedlet; Perklorsyra, aceton, metyltertbutyleter (MTBE), metanol och/eller acetonitril 8,42 har emellertid också använts, där varje extraktionsmedel är avsett att extrahera och fälla ut olika substrat. Modellen som beskrivs här extraherar NPAA BMAA och dess isomerer från en cyanobakteriell matris, och även om en rad olika lösningsmedel har använts, är de två vanligaste 10% TCA i vatten (vattenhaltigt) och 10% TCA i aceton. I allmänhet används proteinutfällning med TCA vanligtvis för att extrahera aminosyror för att fraktionera fria aminosyror från de proteinbundna aminosyrorna. Dessutom möjliggör TCA-extraktion att bestämma det totala proteininnehållet, minska föroreningar för den fria fraktionen och minska aktiviteten hos proteaser med minimal proteinnedbrytning43. TCA-extraktionen av den fria fraktionen fungerar genom att initialt skölja ut organiskt lösliga ämnen och lämna efter sig proteiner och olösliga föreningar såsom cellväggsrester i fällningen, som sedan följs av termisk hydrolysextraktion av de proteinbundna aminosyrorna (bunden fraktion) med användning av en stark syra.

Fraktioneringen av den fria fraktionen med 10% vattenhaltig TCA plus ultraljudsbehandling ger den mest omfattande proteinutfällningen jämfört med andra organiska lösningsmedel44 och den bästa aminosyran återvinner42. Vissa studier väljer att använda en syra i kombination med ett organiskt lösningsmedel (dvs. 10% -20% TCA i aceton 43) för att fälla ut fler molekyler, inklusive mindre peptider / biomolekyler, minimera proteinnedbrytning och minska föroreningar som salter43. En annan fördel med 10% TCA i aceton är dess snabbare torkningshastighet vid framställning av pelleten för hydrolys, vilket minimerar fuktrester för att förhindra aminosyramodifiering. Emellertid, 10% vattenhaltiga TCA plus ultraljudsbehandling har bättre extraktion effektivitet av fria aminosyror jämfört med 10% TCA i aceton44 ensam. Dessutom har 10% vattenhaltig TCA-utfällning begränsningar som en lång torkningstid, att inte kunna fälla ut alla proteiner eller små peptider / biomolekyler, och beroende på analyten av intresse (dvs. proteiner eller aminosyror), vilket kräver tillsatser och reduktionsmedel för att förhindra oxidation och nedbrytning45,46.

Detta protokoll använder en kombination av 10% vattenhaltig TCA och 10% TCA i aceton för att öka proteinutfällningen, säkerställa att mindre peptider / biomolekyler fälls ut, möjliggöra snabbare pelletstorkningstider och öka extraktionseffektiviteten och dra nytta av båda lösningsmedelsextraktionsegenskaperna. Kombinationen av 10% vattenhaltig TCA och 10% TCA i aceton kan dock fälla ut små peptider/biomolekyler i den fria fraktionen efter att 10% TCA i acetonsupernatant kombineras med den vattenfria fraktionen. I detta fall bör utfällningarna överföras till den bundna fraktionen för hydrolys.

Den andra halvan av detta protokoll involverar frisättning av aminosyror (dvs BMAA) från proteinpelleten via syra-ånghydrolys vid förhöjda temperaturer i en syrefri miljö. Den övervägande begränsande faktorn för hydrolyssteget är att det är tidskrävande och mödosamt att förbereda. Inkubationen över natten förhindrar snabb och tidseffektiv provberedning och analys. Dessutom är den kvantitativa överföringen av pelleten från ett centrifugrör till en skalflaska (steg 3.4) en mödosam process som kräver noggrannhet och tålamod för att säkerställa en korrekt normaliseringspunkt till torrvikten. Möjliga problem som användaren kan möta är den ofullständiga överföringen av pelleten, våtfällda proteiner som fastnar på pipettspetsar och det ursprungliga röret och fasta partiklar av pelleten som blockerar pipettspetsen. Ett praktiskt förslag för att underlätta överföringen av pelleten är att ta bort cirka 0,3-0,5 mm från pipettspetsens ände med en sax, så att större pelletspartiklar kan dras och släppas ut i skalflaskan. Denna överföringsmetod är vanlig för proteinextraktion för alla aminosyraanalyser. Ändringar för att förbättra effektiviteten och noggrannheten vid kvantitativ överföring av pelleten till injektionsflaskan med skal bör dock undersökas.

Två former av hydrolystekniker kan användas för att frigöra aminosyror från deras proteinbundna tillstånd: vätskefashydrolys och syra-ånghydrolys. Vätskefashydrolys, som innebär tillsats av 6 M HCl på provet, som sedan placeras i en ugn på 110 °C över natten, är ett alternativ till den syra-ånghydrolys som beskrivs i detta protokoll. Extraktionstekniker som använder vätskefashydrolys kan kräva ytterligare bearbetning, såsom avsaltning, särskilt om AQC-derivatisering väljs, eftersom det kräver grundläggande villkor för märkningav 40. Syra-ånghydrolys undviker avsaltning och ger användaren friheten att välja derivatiseringsteknik vid rekonstituering av den slutliga pelleten före filtrering. Oberoende av den valda hydrolysmetoden kan proverna dessutom kräva ytterligare bearbetning, såsom SPE för matrisrening och koncentration 29,47,48, beroende på valet av derivatiseringsteknik och/eller analytisk analys (t.ex. omvänd fas LC-MS/MS kontra hydrofil interaktion vätskekromatografi [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Rekonstitueringen av den slutliga pelleten i 20 mM HCl i detta protokoll är lämplig för derivatisering med PCF-reagenser48via ett kommersiellt tillgängligt aminosyrahydrolyssats39 (se materialtabell). Både AQC och PCF kommer att derivatisera alla aminosyror, protein och icke-protein i ursprung som finns i provet, och selektiviteten hos analyterna erhålls genom användning av LC-MS / MS och dess kombination av retentionstidsmatchning och noggrant urval av kvantifieraren och kvalificeraren MRM38. 

Nuvarande hydrolysprotokoll är inte optimerade för frisättning av BMAA, 2,4-DAB och AEG utan för de 22 proteinaminosyrorna baserade på befintliga metoder för proteinhydrolys 32, där inkubation längre än 18 timmar resulterar i nedbrytning och modifiering av vissa aminosyror, vilket påverkar LC-MS/MS-analysen och därmed de erhållna koncentrationerna32. Beach et al.49 undersökte hydrolys över tid (0,5-120 h) för att optimera hydrolys för att analysera BMAA och de proteinogena aminosyrorna. De fann att även om det fanns en tidig snabb frisättning av BMAA under de första 0,5 timmarna av hydrolysen, fortsatte BMAA-nivåerna att öka när hydrolystiden ökade, utan nedbrytning, även efter 5 dagar49. Det finns också fortfarande olika åsikter och frågor om den sanna naturen hos bunden BMAA och dess isomerer, med vissa studier som tyder på att snarare än BMAA-bindning 50,51 eller felaktig införlivande i proteiner14, är BMAA-proteinassociation ytlig52. Det nuvarande samförståndet i analysen av "bunden" BMAA kräver emellertid det validerade och allmänt accepterade hydrolyssteget som bryter isär peptider / proteiner för att frigöra aminosyror och därmed BMAA och dess isomerer.

Återvinningsgraden för 20 proteinaminosyror bestämdes i en studie av Sedgwick et al.42 med hjälp av TCA-extraktion, vilket resulterade i cirka 100% återhämtning. När det gäller BMAA och dess isomerer från algmatriser har studier som jämför effektiviteten av BMAA-extraktion med olika extraktionsmedel funnit att 10% TCA är det mest effektiva för gratis BMAA27. Återvinningsgraden för proteinbunden BMAA extraherad med vätskefashydrolys fastställdes i studier av Glover et al.25 och av Faassen et al.53, där noggrannheten bestämdes av spikade återvinningsmetoder, med en genomsnittlig BMAA-återvinningsgrad på 108,6% respektive 70%. beskrev procedurer för spikåtervinningsexperiment och illustrerade hur återhämtningen skiljer sig beroende på skedet i extraktionsprocessen som spetsen gjordes53. bestämde dessutom effektiviteten hos syra-ångprotokollet som presenteras här, med återvinningshastigheter på 83,6% för BMAA-isomererna spikade före extraktion och 68,6% för de som spikades före hydrolys24. Dessa återvinningar, extraktionsmetoder och analyser validerades ytterligare av Banack 26, med återvinningsgrader på 94% -106% för BMAA i en cyanobakteriell matris och en% relativ standardavvikelse (% RSD) mellan 5.6% och20%, som uppfyller FDA: s kriterier för noggrannhet54. Det rekommenderas att varje laboratorium initialt fastställer dess återhämtningshastigheter och noggrannhet innan detta protokoll används via spikåterställningsexperiment. De återvinningsmetoder som presenteras i Faassen et al.53 och Glover et al.25 kan följas som vägledning.

Alternativa former av hydrolystekniker kan utnyttjas istället för ugnshydrolys över natten för snabbare proteinbunden extraktion av analyten. Till exempel kan en mikrovågsugare avsevärt minska hydrolystiden från 24 timmar till så lite som 10 min55. Mikrovågshydrolys för aminosyror använder samma principer som den konventionella termiska metoden, med hjälp av en handskfack för att förbereda och montera mikrovågskärlet i en syrefri miljö och tillsätta 6 M HCl. När det är lufttätt genomgår kärlet som innehåller provet mikrovågsstrålning. Mikrovågshydrolys har använts för att extrahera aminosyror från olika provmatriser56,57,58; mikrovågshydrolys har dock ännu inte utvecklats och validerats för analys av BMAA.

Sammanfattningsvis är 10% vattenhaltig TCA-proteinutfällning den optimala metoden för att extrahera fria icke-proteinaminosyror från cyanobakteriella matriser27, och termisk hydrolys ger en pålitlig och reproducerbar extraktion av den proteinbundna fraktionen. Detta protokoll för att extrahera NPAA BMAA och dess isomerer från cyanobakterier är validerat och allmänt accepterat. Framtida riktningar för att ytterligare optimera extraktionen av BMAA kommer att fokusera på hydrolyssteget, som utförs enligt specifikationerna för de 22 proteinaminosyrorna. Extraktionsprotokollet som presenteras här bör dock fortfarande betraktas som effektivt och effektivt för att analysera BMAA och dess isomerer via LC-MS / MS.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

D.P.B., K.J.R. och S.M.M. stöds av The Ian Potter Foundation, och J.P.V. är mottagare av ett australiensiskt regeringsforskningsutbildningsprogram, Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, P. O. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. Miflin, B. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 225-269 (1980).
  2. Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
  3. Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
  4. Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. , Academic Press. Cambridge, MA. 21-29 (2015).
  5. Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
  6. Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson's disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
  7. Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
  8. Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
  9. Hashiguchi, A., Komatsu, S. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. Shukla, A. K. , Academic Press. Cambridge, MA. 97-113 (2017).
  10. Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
  11. Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
  12. Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
  13. Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer's disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
  14. Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
  15. Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
  16. Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
  17. Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
  18. Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
  19. Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
  20. Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
  21. Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
  22. Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
  23. Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
  24. Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
  25. Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
  26. Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
  27. Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
  28. Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
  29. Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
  30. Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
  31. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
  32. Davidson, I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. Smith, B. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 111-122 (2003).
  33. Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
  34. Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
  35. Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
  36. Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
  37. Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
  38. Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
  39. Phenomenex. EZ:faast For Amino Acid Analysis of Protein Hydroysates by LC-MS. User's Manual. , Available from: http://phx.phenomenex.com/lib/3882_L6_LC_MS.pdf (2005).
  40. AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters. , Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014).
  41. D'Hondt, E., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 133-154 (2017).
  42. Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
  43. Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
  44. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  45. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  46. Novák, P., Havlíček, V. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). Ciborowski, P., Silberring, J. , Elsevier. 51-62 (2016).
  47. Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
  48. Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
  49. Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
  50. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
  51. Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
  52. van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
  53. Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
  54. Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
  55. Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
  56. Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
  57. Chen, S. -T., Chiou, S. -H., Chu, Y. -H., Wang, K. -T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
  58. Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).

Tags

Kemi utgåva 190 aminosyra proteinutfällning triklorättiksyra (TCA) icke-proteinaminosyra BMAA cyanobakterier
Extraktion av icke-proteinaminosyror från cyanobakterier för vätskekromatografi-tandemmasspektrometrianalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P.,… More

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Rodgers, K. J., Bishop, D. Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (190), e63779, doi:10.3791/63779 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter