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Chemistry

Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus Cyanobakterien für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus biologischen Matrices mittels Trichloressigsäure (TCA)-Proteinfällung und Säurehydrolyse vor der Analyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie.

Abstract

Nicht-Protein-Aminosäuren (NPAAs) sind eine große Klasse von Aminosäuren (AAs), die nicht genetisch für die Übersetzung in Proteine kodiert sind. Die Analyse von NPAAs kann entscheidende Informationen über zelluläre Aufnahme und/oder Funktion, Stoffwechselwege und potenzielle Toxizität liefern. β-Methylamino-L-Alanin (BMAA) ist eine neurotoxische NPAA, die von verschiedenen Algenarten produziert wird und mit einem erhöhten Risiko für neurodegenerative Erkrankungen verbunden ist, was zu erheblichem Forschungsinteresse geführt hat. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, AAs für die Analyse zu extrahieren, wobei die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie am häufigsten ist und eine Proteinfällung gefolgt von einer sauren Hydrolyse des Proteinpellets erfordert. Studien über das Vorhandensein von BMAA in Algenarten liefern widersprüchliche Ergebnisse, wobei die Verwendung von nicht validierter Probenvorbereitung/-extraktion und -analyse eine Hauptursache ist. Wie bei den meisten NPAAs ist die Proteinfällung in 10% wässriger TCA und Hydrolyse mit rauchendem HCl die am besten geeignete Form der Extraktion für BMAA und seine Isomere Aminoethylglycin (AEG) und 2,4-Diaminobuttersäure (2,4-DAB). Das vorliegende Protokoll beschreibt die Schritte einer validierten NPAA-Extraktionsmethode, die üblicherweise in Forschungs- und Lehrlaboratorien verwendet wird.

Introduction

Aminosäuren sind chemische Verbindungen, die mindestens eine amin- und carbonsäurefunktionelle Gruppe enthalten. Einige Aminosäuren enthalten auch eine Iminogruppe, eine funktionelle Säuregruppe außer Carboxylsäure; Andere Aminosäuren haben Amingruppen, die nicht an die α-Kohlenstoff-Gruppe1 gebunden sind. Es gibt über 500 Aminosäuren2, von denen 22 als Proteinaminosäuren bekannt sind, die für die genetische Kodierung in der ribosomalen Proteinsynthese3 verwendet werden. Diese 22 Aminosäuren können weiter in essentielle und nicht-essentielle unterteilt werden. Essentielle Aminosäuren sind notwendig, damit ein Organismus richtig funktionieren kann und können nur durch externe Quellen erworben werden. Nicht-essentielle Aminosäuren können im Organismus synthetisiert werden. Die Klassifizierung der 22 Aminosäuren in essentielle/nicht-essentielle Aminosäuren ist einzigartig für einzelne Arten. Alle anderen Aminosäuren sind Nicht-Protein-Aminosäuren (NPAAs), die nicht für die Proteinsynthese kodiert sind. Aminosäuren, ob Protein oder Nicht-Protein, können auch eine Signalrolle innerhalb eines Organismus spielen und als metabolische Vermittler fungieren4. Aufgrund ihrer wichtigen und unterschiedlichen Rolle kann der Aminosäurespiegel einen Einblick in den Zustand, die Funktionalität und die Stoffwechselwege des Organismus usw. geben. Es gibt zwei Hauptmechanismen, durch die Aminosäuren in eine Polypeptidkette eingebaut werden können: die ribosomale Proteinsynthese, die die 22 Aminosäuren kodiert, und die nicht-ribosomale Peptidsynthese, die neben Proteinaminosäuren die Verwendung einiger NPAAs in der Synthese ermöglicht. Bestimmte NPAAs können Proteinaminosäuren nachahmen, was möglicherweise zu deren Fehleinbau in Peptide und Proteine führt. Die Fehlinkorporation verursacht eine Fehlfaltung von Proteinen, die wiederum schädliche Auswirkungen hat5, wie z. B. den falschen Einbau des NPAA L-3,4-Dihydroxyphenylalanins (L-DOPA) anstelle von Tyrosin, was sich negativ auf die Zellfunktion und die Gesundheit auswirkt 6,7. Eine zusätzliche Quelle für inkorporierte NPAAs ist die posttranslationale Modifikation (PTM) von Aminosäureresten. Aminosäurereste werden aus verschiedenen Gründen modifiziert, einschließlich Änderungen der Peptid- oder Proteinkonformation, Stabilität und Funktionalität. Bei der Hydrolyse von PTM-haltigen Proteinen oder Peptiden werden diese modifizierten Aminosäurereste in ihre freie NPAA-Form 8,9 freigesetzt.

Das NPAA-β-Methylamino-L-Alanin (BMAA), das von Cyanobakterien, Diatomeen und Dinoflagellaten produziert wird10, steht im Verdacht, dass es zu verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotropher Lateralsklerose/Parkinson-Demenz-Komplex (ALS-PDC)11,12, amyotropher Lateralsklerose und Alzheimer-Krankheit beiträgt 13 . Es wird vermutet, dass BMAA fälschlicherweise anstelle von L-Serin14 und / oder anderen Proteinaminosäuren in die Polypeptidkette von Proteinen eingebaut wird. Der Fehleinbau von BMAA kann zur Fehlfaltung von Proteinen führen, was zur Ablagerung von Proteinaggregaten in Neuronen führt14. In den letzten zehn Jahren hat das Interesse an BMAA deutlich zugenommen. Eine breite Palette von Cyanobakterienarten aus Süßwasser-, Meeres- und Brackwasserumgebungen wurde entdeckt, um BMAA15 zu produzieren, was zu ihrer weiten Verbreitung in verschiedenen Ökosystemen führt16,17. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass BMAA über die Nahrungskette zum menschlichen Nahrungsnetz biovergrößertwird 18,19. Aufgrund der möglichen gesundheitlichen Auswirkungen, des mangelnden Verständnisses und der Inkongruenzen der BMAA-Toxizität ist es unerlässlich, die weitere Forschung fortzusetzen, bis entweder die Toxizität von BMAA endgültig verstanden ist oder BMAA als sicher eingestuft wird20,21.

Die Analyse von Aminosäuren in biologischen Proben kann in vier Hauptschritte unterteilt werden: Probenvorbereitung, Aminosäurederivatisierung, Trennung und Nachweis sowie Identifizierung und Quantifizierung. Die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ist die bevorzugte Analysemethode, da sie eine gezielte und reproduzierbare Trennung und Analyse von Aminosäuren ermöglicht.

Probenvorbereitungstechniken zur Analyse von Cyanobakterien- und anderen Algenproben beinhalten überwiegend eine Extraktionsmethode für Aminosäuren in ihrer freien und proteingebundenen Form. Im Laufe der Jahre sind die Extraktionsmethoden relativ konsistent mit gemeinsamen Elementen geblieben, einschließlich der Auflösung der Probe, um die freien Aminosäuren von ihrer gebundenen Form zu trennen, gefolgt von Proteinfällung und der Freisetzung der gebundenen Aminosäuren durch Hydrolyse mit Salzsäure (HCl) bei erhöhten Temperaturen22 . Diese Extraktionsform wurde für Proteinaminosäuren optimiert und für NPAAs eingesetzt. Der Nachweis und die Quantifizierung von BMAA und seinen Isomeren (Abbildung 1), Aminoethylglycin (AEG) und 2,4-Diaminobuttersäure (2,4-DAB) in derselben Cyanobakterienart haben jedoch widersprüchliche Ergebnisse in der Literatur gezeigt, wobei eine mögliche Erklärung in Unterschieden in den Wachstumsbedingungen und/oder dem Algenstamm liegt, der unterschiedliche oder keine Mengen an BMAA produziert23 . Es wurde argumentiert, dass eine wahrscheinlichere Erklärung für die Inkonsistenzen beim Nachweis und der Quantifizierung von BMAA und seinen Isomeren auf nicht validierte experimentelle Protokolle, die Verwendung einer breiten Palette von Analysetechniken und unzureichende experimentelle Details in den berichteten Methoden zurückzuführenist 16,24, was zu nicht reproduzierbaren Ringversuchen führt. Glover et al.25 und Banack 26 haben jedoch kürzlich eine Analysetechnik zum Nachweis und zur Quantifizierung von BMAA und seinen Isomeren mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC)-MS/MS in Übereinstimmung mit den Richtlinien der International Society of Analytical Chemists (AOAC), der US Pharmacopeia und der FDA entwickelt und validiert, die für die Einzellaborvalidierung erforderlich sind.

Diese Validierungsexperimente konzentrierten sich auf die Trennung und Detektion von BMAA und seinen Isomeren und befassten sich nicht mit den Inkonsistenzen in Probenvorbereitungsprotokollen. Lage et al.27 verglichen die Leistung von drei gängigen Extraktionsmethoden zur Quantifizierung von BMAA und seinen Isomeren in cyanobakteriellen Proben mittels LC-MS/MS: Festphasenextraktion (SPE) von freien Aminosäuren28,29; ein Proteinfällungsverfahren mit Methanolextraktion und Acetonfällung30; und die am häufigsten verwendete Extraktionsmethode für BMAA, die Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA)31. Sie kamen zu dem Schluss, dass die TCA-Proteinfällung das optimale Protokoll war, das im Vergleich zu den anderen Extraktionsmethoden höhere BMAA-Konzentrationen in den Testproben ergab. Ihre Studie validierte die TCA-Extraktion mit Derivatisierung von BMAA unter Verwendung von 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC) in einer Cyanobakterienmatrix und lieferte einen etablierten Leitfaden zur Erzielung zuverlässiger und reproduzierbarer BMAA-Daten. Die TCA-Aminosäureextraktion ist eine anerkannte und gängige Probenvorbereitungstechnik, die auch auf andere Matrices angewendet werden kann. Die Stabilität der Aminosäure während der Hydrolyse muss jedoch berücksichtigt werden, um einen Abbau oder eine Oxidation zu verhindern, die durch den Einsatz chemischer Modifikatoren und Reduktionsmittel überwunden werden kann32. Die TCA-Extraktion wird routinemäßig verwendet und neuen Forschungsstudenten beigebracht, und obwohl das Protokoll weit verbreitet ist, ist eine visuelle Hilfe bei der Anwendung dieser Methode eine wertvolle Ressource, die eine ordnungsgemäße und konsistente Ausführung gewährleistet.

Die Umkehrphasenchromatographie wird häufig zur Trennung von Aminosäuren verwendet, was vor der Analyse einen Derivatisierungsschritt erfordert. Die Derivatisierung von Aminosäuren wie BMAA ermöglicht eine chromatographische Retention und kann die Auflösung zwischen Isomeren erhöhen. Es erhöht auch die Molekülmasse und verbessert die Ionisation im Massenspektrometer. Mehrere derivatisierende Reagenzien wurden für die Analyse von Aminosäuren mittels LC-MS/MS verwendet, darunter Propylchlorformiat (PCF)33, 6-Aminochinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamat (AQC)27, 9-Fluorenylmethylchlorformiat (FMOC)34 und Dansylchlorid (DC)35. Die einzigen validierten Techniken zur Analyse von BMAA verwendeten jedoch entweder PCF 36 oder AQC24,26,37 als Derivatisierungsreagenz.

Der Umfang dieses Protokolls konzentriert sich auf die TCA-Extraktion von NPAAs aus cyanobakteriellen Matrices. Es ist eine arbeitsintensive Methode, die routinemäßig in akademischen und industriellen Forschungslabors auf der Grundlage von Manuskripten verwendet und gelehrt wird, die möglicherweise wenig detailliert sind. Daher enthält dieses Protokoll Details zu den Verfahren und Techniken zur Vorbereitung von Proben für die Analyse von freiem und gebundenem BMAA als Modellaminosäure.

Protocol

Die Cyanobakterienart Merismopedia wurde für die vorliegende Studie38 verwendet.

1. Rohprobenvorbereitung

  1. Sammeln Sie den Algenschaum aus der aquatischen Quelle von Interesse oder aus einem Cyanobakterien-Kulturkolben und legen Sie ihn in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen38.
    HINWEIS: Die Probe muss für spätere Extraktionen bei −20 °C eingefroren und vor dem nächsten Schritt aufgetaut werden.
  2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit der Probe bei 3.500 x g für 10 min bei 25 °C. Dekantieren Sie den Überstand in einen Abfallbehälter und entsorgen Sie ihn in biologischen Abfall.
    HINWEIS: Der Überstand kann für zukünftige Analysen des Exosoms reserviert sein.
  3. Decken Sie das Röhrchen mit dem Probenpellet sicher mit einer Siegelfolie ab (siehe Materialtabelle) und stechen Sie mit einer scharfen, langen Pinzette einige Löcher in die Folie. Lagern Sie das Röhrchen aufrecht bei −80 °C für 30 min.
  4. Schalten Sie den Gefriertrockner ein und gleichen Sie ihn bei 0,1 mbar und −80 °C (~30 min) aus.
    HINWEIS: Die Parameter (Schritt 1.4) sind für den für die vorliegende Studie verwendeten Gefriertrockner optimiert (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie die Standardarbeitsanweisungen gemäß dem im Labor verfügbaren Gefriertrocknermodell oder stellen Sie die niedrigstmögliche Temperatur ein, wenn das Gefriertrocknermodell nicht so niedrig wie -80 °C ist.
    1. Legen Sie das/die Zentrifugenröhrchen(e) aufrecht in einen Gefriertrockner-Glasbehälter und legen Sie es für 5 min in den Gefrierschrank -80 °C, um das Glas zu kühlen.
    2. Nehmen Sie den Glasbehälter aus dem Gefrierschrank und befestigen Sie den Gummideckel.
    3. Stellen Sie sicher, dass der Griff am Gummiventilauslass des Gefriertrockners zur Atmosphäre hin entlüftet ist (nach oben zeigend) und befestigen Sie den Glasbehälter fest.
    4. Drehen Sie den Griff des Gummiventilauslasses sehr langsam in die nach unten zeigende Position, um das Glas dem Vakuum auszusetzen, und lassen Sie bis zu 24 Stunden Gefriertrocknung zu, um die Sublimation der gesamten Flüssigkeit sicherzustellen.
    5. Um das Vakuum im Glas freizugeben, drehen Sie den Griff in die nach oben zeigende Position, nehmen Sie den Glasbehälter ab und entfernen Sie die gefriergetrockneten Proben.
  5. Verwenden Sie eine Analysenwaage, um 15-50 mg getrocknete Probenpellets in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu wiegen.
    HINWEIS: Die Proben können gelagert werden, wenn sie zu diesem Zeitpunkt nicht weiterverarbeitet werden.

2. Zelllyse und Fraktionierung von freien NPAAs

  1. 100 μL 100 ng/ml D5-2,4-DAB standard (siehe Materialtabelle) mit einer Mikropipette in das Probenröhrchen geben (optional).
  2. Fügen Sie 300-600 μL 10% w/v wässriges Trichloressigsäure (TCA, siehe Materialtabelle) bzw. 300-600 μL 11,7%-13,3% TCA hinzu, wenn Sie den D5-2,4-DAB-Standard hinzufügen.
    HINWEIS: Wählen Sie ein Volumen wässriger TCA, das das Pellet vollständig bedeckt.
  3. Legen Sie die Probenröhrchen in einen mit zerstoßenem Eis gefüllten Behälter.
  4. Verwenden Sie einen Sondensonikator (siehe Materialtabelle) bei mittlerer bis hoher Leistung (70%) und lysieren Sie die Probe 1 Minute lang gemäß den folgenden Schritten.
    VORSICHT: Stellen Sie die richtige PSA mit geräuschunterdrückenden Ohrenschützern sicher.
    1. Befolgen Sie die entsprechenden Sicherheitsprotokolle in Vorbereitung auf die Verwendung des Sondensonikators, indem Sie Beschilderungen an der Tür anbringen, eine Beschallung im Abzug durchführen und Ohrenschützer mit Geräuschunterdrückung verwenden.
    2. Schalten Sie den Sonicator ein und geben Sie folgende Parameter ein: Amplitude, 70%; Zeit, 1 min.
    3. Sprühen Sie 70% Ethanol auf ein fusselfreies Papiertuch (siehe Materialtabelle) und wischen Sie die Sonde ab.
    4. Tauchen Sie das Ende der Sonde vollständig in die Probe ein und drücken Sie Start.
    5. Wenn der Sondenbeschaller stoppt, legen Sie das Zentrifugenröhrchen mit der Probe für 1 Minute auf Eis.
    6. Um sicherzustellen, dass die Zellen lysiert sind, wiederholen Sie die Schritte 2.4.3-2.4.5 noch einmal.
  5. Die Probe wird für 12-24 h bei 4 °C in einen Kühlschrank gestellt, um die Proteinfällung zu ermöglichen.
  6. Zentrifugieren Sie die 10% wässrige TCA-Probe bei 3.500 x g für 15 min bei 8 °C.
  7. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand in ein 2-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung "Free Fraction" zu übertragen.
  8. Mikropipette 400 μL 10% wässriger TCA in das Zentrifugenröhrchen mit dem verbleibenden Probenpellet und zerkleinert das Pellet entweder durch Wirbelrühren oder mit der Mikropipettenspitze.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.7 und übertragen Sie den Überstand in dasselbe 2-ml-Röhrchen "Free Fraction".
  10. Mikropipette 400 μL 10% TCA/Aceton in das Zentrifugenröhrchen mit dem restlichen Pellet und bricht das Pellet mit Wirbel oder der Mikropipettenspitze auf.
  11. Zentrifugieren Sie die 10%ige TCA/Acetonprobe bei 3.500 x g für 15 min bei 8 °C. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand in das 2-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung "Free Fraction" zu übertragen.
  12. Legen Sie das Röhrchen "Freie Fraktion" bei geöffnetem Deckel in einen Zentrifugalverdampfer (siehe Materialtabelle), bis alle flüchtigen Flüssigkeiten entfernt sind (mindestens 1 h).
  13. Sobald die Probe frei von flüchtigen Flüssigkeiten ist, decken Sie das Röhrchen sicher mit Siegelfolie ab und durchstechen Sie die Folie mit einer scharfen, langen Pinzette mit einigen Löchern. Die Probe in einen Gefrierschrank von −80 °C geben.
  14. Die Probe "Freie Fraktion" wird gefriergetrocknet, indem Sie alle Schritte in Schritt 1.4 wiederholen.
  15. Mikropipette 200 μL 20 mM Salzsäure (HCl) in das Röhrchen "Freie Fraktion", um die gefriergetrocknete Probe zu rekonstituieren und in einen Gefrierschrank von -80 °C zu legen.
    HINWEIS: Die "freie Fraktion" der Probe ist bereit für die Filtration in Schritt 4. Das verbleibende Pellet wird in den folgenden Schritten zur Proteinfraktionierung weiterverarbeitet.

3. Fraktionierung der proteingebundenen NPAAs

  1. Verwenden Sie einen Glasgravierer, um Glasschalenfläschchen mit den Probendetails zur Identifizierung zu beschriften.
    HINWEIS: Starke Säure kann die Tintenbeschriftung ableiten. Daher wird empfohlen, die Etiketten auf Glas zu gravieren.
  2. Mikropipette 100 μL 100 ng/ml D5-2,4-DAB standard auf das Probenpellet (optional).
  3. Mikropipette 400 μL 100% Aceton auf das Probenpellet und zerkleinert das Pellet entweder durch Wirbelrühren oder die Mikropipettenspitze.
  4. Verwenden Sie eine 1-ml-Mikropipette bei 1.000 μL, um das gewaschene und resuspendierte Pellet in die entsprechende Glashüllendurchstechflasche zu überführen.
    HINWEIS: Weitere 400 μL 100% Aceton können dem gerührten Pellet zugesetzt werden, um den vollständigen Transfer des Pellets in die Glashüllendurchstechflasche zu unterstützen. Dies kann bei Bedarf ein drittes Mal wiederholt werden.
  5. Bei 8.000 x g für 5 min bei 25 °C zentrifugieren und die Flüssigkeit in biologischen Abfall dekantieren.
  6. Das verbleibende Pellet in einen Zentrifugalverdampfer geben, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt und das Pellet trocken ist (~1 h).
  7. Bereiten Sie die Vakuumhydrolysedurchstechflasche vor, indem Sie 1 ml 6 M HCl in den Boden der Hydrolysedurchstechflasche geben.
  8. Verwenden Sie eine Pinzette, um die beschrifteten Schalenfläschchen mit den getrockneten Proben vorsichtig in die Hydrolysedurchstechflasche einzuführen, um eine aufrechte, stabile Position zu gewährleisten.
    HINWEIS: Durchstechflaschen mit leerer Hülle können verwendet werden, um die Probendurchstechflaschen aufrecht zu halten, wenn die Anzahl der Proben geringer ist als die Kapazität der Hydrolysedurchstechflasche.
  9. Befestigen Sie den Deckel an der Hydrolyseflasche und drücken Sie den roten Knopf am Deckel, um das Ventil zu schließen.
  10. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, befestigen Sie den Vakuumschlauch am Kopf des Deckels der Hydrolyseflasche und drücken Sie den grünen Knopf am Deckel, um das Ventil zu öffnen.
  11. Lassen Sie die Vakuumpumpe (siehe Materialtabelle) die Luft für 1 min aus der Durchstechflasche entfernen.
  12. Schließen Sie die Durchstechflasche, indem Sie den roten Knopf am Deckel der Hydrolysedurchstechflasche drücken, die Vakuumpumpe ausschalten und den Vakuumschlauch entfernen.
  13. Befestigen Sie einen Gummischlauch am Stickstoffgashahn auf dem Labortisch und öffnen Sie den Wasserhahn leicht. Legen Sie den Daumen an das Ende des Röhrchens, verschließen Sie es und zählen Sie, bis das Gas zu entweichen beginnt, wenn sich Druck aufbaut. Dies ist der Zeitrahmen für den nächsten Schritt. Stellen Sie den Gasfluss auf einen geeigneten Zeitrahmen ein.
  14. Befestigen Sie das andere Ende des Gummischlauchs am Kopf des Deckels der Hydrolysedurchstechflasche und drücken Sie dann sofort den grünen Knopf des Deckels. Zählen Sie bis zu der in Schritt 3.13 festgelegten Zeit und drücken Sie schnell den roten Knopf auf den Deckel und entfernen Sie den Gummischlauch.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 3.10-3.14 zweimal, um sicherzustellen, dass die Durchstechflasche mit Glashydrolyse frei von Luft und mit Stickstoffgas gefüllt ist.
  16. Die Durchstechflasche mit Hydrolyse für 16-18 h in einen vorgeheizten Ofen bei 110 °C geben.
  17. Verwenden Sie Ofenhandschuhe, um das Glashydrolysefläschchen aus dem Ofen zu nehmen und 10 Minuten im Abzug abkühlen zu lassen. Drücken Sie im Inneren des Abzugs den grünen Knopf, um Druck und Gas abzubauen, während Sie ihn von Ihnen weg zeigen.
  18. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Schalendurchstechflaschen aus der Hydrolysedurchstechflasche zu entfernen.
  19. Rekonstituieren Sie die hydrolysierten Probenpellets durch Mikropipettieren von 200 μL 20 mM HCl in die Hüllendurchstechflasche. Stellen Sie sicher, dass das Pellet entweder durch Wirbeln oder mit einer Pipettenspitze resuspendiert wird.
  20. Zentrifugieren Sie die Schalenfläschchen mit den rekonstituierten Probenpellets für 2 min bei 5.300 x g und 25 °C.

4. Probenfilterung

  1. Kennzeichnen Sie 2 mL Filterröhrchen (siehe Materialtabelle) mit 0,2 μm Porenmembranfiltern als "Freie Fraktion" und "Proteinfraktion".
  2. Die rekonstituierten Proben aus Schritt 2.15 (freie Fraktion) und Schritt 3.20 (Proteinfraktion) werden in die entsprechenden Filterröhrchen überführt.
  3. Legen Sie sie für 30 min bei 5.000 x g und 25 °C in die Zentrifuge.
  4. Entfernen Sie die Filter aus den Filterrohren und verschließen Sie sie. Die Proben sind nun bereit für die Aminosäurederivatisierung in Schritt 5.
    HINWEIS: Die Proben können zur späteren Derivatisierung und Analyse in den Gefrierschrank von −80 °C gegeben werden.

5. Aminosäure-Derivatisierung

  1. Derivatisieren Sie die Proben mit Propylchlorformiat (PCF)39 oder 6-Aminochinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamat (AQC)40 gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

Representative Results

Eine Abbildung des Extraktionsprotokolls ist in Abbildung 2 als zusammengefasstes Referenzhandbuch dargestellt. Die Ergebnisse von Violi et al.38 wurden ausgewählt, um ein positives Ergebnis dieses Extraktionsprotokolls für die Analyse von BMAA-Isomeren aus Cyanobakterien darzustellen. Neunzehn einzelne Arten von Cyanobakterien wurden aus 11 ostaustralischen Süßwasserstandorten kultiviert. Unter Verwendung des gleichen Protokolls wurden die BMAA-Isomere in freie und Proteinfraktionen extrahiert, mit PCF derivatisiert und mit LC-MS / MS analysiert. Siebzehn der Cyanobakterienisolate waren positiv für BMAA, und alle 19 enthielten das 2,4-DAB-Isomer. Ein positives Ergebnis wird durch die Verwendung einer validierten LC-MS/MS-Methode und die Beobachtung von mindestens drei Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Übergängen, einem als Quantifizierer-Ion und zwei als Qualifier-Ionen, zur erwarteten Retentionszeit bestätigt. Ein repräsentatives MRM-Chromatogramm eines Standards, der BMAA und seine Isomere enthält, dargestellt durch die farbcodierten Linien, ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Vorhandensein und die Konzentration von BMAA und Isomeren in allen 19 Proben, die so geschnitten sind, dass die BMAA- und Isomerenkonzentration in den freien und gebundenen Fraktionen angezeigt wird, ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Ein positiver Nachweis für alle drei Isomere wurde in der freien Fraktion der Merismopedia-Arten aus dem Lake Liddell (NSW, Australien) beobachtet, wo die freie Fraktion eine BMAA-Konzentration von 68,38 μg/g Trockengewicht (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB mit einer Konzentration von 1.223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW enthielt. und AEG mit einer Konzentration von 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. Die chromatographischen MRMs sind in Abbildung 4 dargestellt. Um ein negatives Ergebnis für BMAA und seine Isomere in einer Probe zu veranschaulichen, ist die gebundene Fraktion der Microcystis flos-aquae-Spezies aus Walka Water Works (NSW, Australien) chromatographisch in Abbildung 5 dargestellt. Während die gebundene Fraktion kein BMAA, 2,4-DAB und/oder AEG enthielt, enthielt ihre freie Fraktion alle drei Isomere mit Konzentrationen von 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW bzw. 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW.

So bestätigten Violi et al.38 durch die Verwendung dieses Protokolls das Vorhandensein von BMAA-Isomeren in ostaustralischen Süßwassercyanobakterien und bestimmten, welche Cyanobakterien toxinproduzierende Fähigkeiten hatten.

Figure 1
Abbildung 1: Die chemische Struktur von BMAA und seinen Isomeren 2,4-DAB und AEG. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Zusammengefasstes Referenzdiagramm des Extraktionsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: LC-MS/MS-Chromatogramm eines Kalibrierstandards mit D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA und AEG zur Isomerenidentifizierung basierend auf Retention, angezeigt durch die hervorgehobenen Peaks. Schlüssel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bei 6,4 min (rot), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bei 6,4 min (grün), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bei 7,4 min (orange) und BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bei 7,8 min (blau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: LC-MS/MS-Chromatogramm zum Nachweis von D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA und AEG in Merismopedia-Arten , die aus dem Lake Liddell (NSW, Australien) gesammelt wurden, angezeigt durch die hervorgehobenen Peaks. Schlüssel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bei 6,4 min (rot), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bei 6,4 min (grün), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bei 7,4 min (orange) und BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bei 7,8 min (blau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: LC-MS/MS-Chromatogramm einer Negativkontrolle für 2,4-DAB, BMAA und AEG in einer gebundenen Fraktion von Microcystis flos-aquae-Arten , die in Walka Water Works (NSW, Australien) gesammelt wurden. Schlüssel: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z bei 6,4 min (rot - Spitze hervorgehoben), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z bei 6,4 min (grün), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z bei 7,4 min (orange) und BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z bei 7,8 min (blau). Die gestrichelten Linien stellen die Aufbewahrungszeiten für fehlende 2,4-DAB, AEG und BMAA dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: BMAA-, AEG- und 2,4-DAB-Konzentrationen in cyanobakteriellen Isolaten. Die Konzentrationen ± Standardfehler des Mittelwerts (n = 3). ND bedeutet nicht erkannt. Die höchste Konzentration jedes nachgewiesenen Isomers ist grün hervorgehoben. Die Tabelle ist eine modifizierte Version von Violi et al.38. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Das hier beschriebene Extraktionsprotokoll für die Analyse von NPAAs gilt für die Analyse von Aminosäuren in biologischen Proben. Für Anleitungen zur Isolierung und Kultivierung von Cyanobakterienstämmen kann man sich auf die Methoden beziehen, die in der Studie von Violi et al.38 vorgestellt wurden. Der erste Schritt im Protokoll führt die Probe an einen Punkt, an dem eine Normalisierung zwischen den Proben gegen das Trockengewicht erreicht werden kann. Der zweite Schritt ist die Zelllyse zur Freisetzung der Analyten und kann unter Verwendung einer Reihe von Techniken durchgeführt werden, einschließlich mechanischer Unterbrechungen / Lysen wie Sondenbeschallung wie in diesem Protokoll beschrieben, Gefrier- / Tauzyklen, Mahlen und Perlmahlen und nicht-mechanischen Störungen wie enzymatische, Reinigungsmittel und / oder chemische Lyse. Es ist bekannt, dass die mechanische Störung gegenüber nicht-mechanischen vorteilhaft ist, da sie eine größere Kapazität der Probe zur Lyse ermöglicht, während die intrazellulären Bindungen und Proteine intakt bleiben41, obwohl die Probenmatrix die optimale Methode für die Zelllyse diktieren kann.

Die Proteinfällung ist der kritische dritte Schritt dieses Protokolls bei der Extraktion von Aminosäuren für die Analyse. TCA ist das am häufigsten verwendete Lösungsmittel; Perchlorsäure, Aceton, Methyl-tert-Butylether (MTBE), Methanol und/oder Acetonitril 8,42 wurden jedoch ebenfalls verwendet, wobei jedes Extraktionslösungsmittel dazu bestimmt ist, verschiedene Substrate zu extrahieren und auszufällen. Das hier beschriebene Modell extrahiert das NPAA BMAA und seine Isomere aus einer cyanobakteriellen Matrix, und obwohl eine Reihe verschiedener Lösungsmittel verwendet wurden, sind die beiden häufigsten 10% TCA in Wasser (wässrig) und 10% TCA in Aceton. Im Allgemeinen wird die Proteinfällung mit TCA häufig verwendet, um Aminosäuren zu extrahieren, um freie Aminosäuren aus den proteingebundenen Aminosäuren zu fraktionieren. Darüber hinaus ermöglicht die TCA-Extraktion die Bestimmung des Gesamtproteingehalts, die Reduzierung von Verunreinigungen für die freie Fraktion und die Verringerung der Aktivität von Proteasen mit minimalem Proteinabbau43. Die TCA-Extraktion der freien Fraktion funktioniert, indem zunächst organisch lösliche Substanzen ausgespült werden, wobei Proteine und unlösliche Verbindungen wie Zellwandreste im Niederschlag zurückbleiben, gefolgt von der thermischen Hydrolyseextraktion der proteingebundenen Aminosäuren (gebundene Fraktion) unter Verwendung einer starken Säure.

Die Fraktionierung der freien Fraktion mit 10% wässrigem TCA plus Ultraschall erzeugt die umfangreichste Proteinfällung im Vergleich zu anderen organischen Lösungsmitteln44 und die besten Aminosäuregewinnungsraten42. Einige Studien entscheiden sich für die Verwendung einer Säure in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel (dh 10% -20% TCA in Aceton 43), um mehr Moleküle, einschließlich kleinerer Peptide / Biomoleküle, auszufällen, den Proteinabbau zu minimieren und Verunreinigungen wie Salzezu reduzieren 43. Ein weiterer Vorteil von 10% TCA in Aceton ist seine schnellere Trocknungsgeschwindigkeit bei der Vorbereitung des Pellets für die Hydrolyse, wodurch Feuchtigkeitsrückstände minimiert werden, um eine Aminosäuremodifikation zu verhindern. 10% wässrige TCA plus Ultraschall hat jedoch eine bessere Extraktionseffizienz von freien Aminosäuren im Vergleich zu 10% TCA in Aceton44 allein. Darüber hinaus hat die 10%ige wässrige TCA-Fällung Einschränkungen wie eine lange Trocknungszeit, die nicht in der Lage ist, alle Proteine oder kleine Peptide / Biomoleküle auszufällen, und abhängig vom interessierenden Analyten (dh Proteine oder Aminosäuren), erfordert Zusatzstoffe und Reduktionsmittel, um Oxidation und Abbau zu verhindern45,46.

Dieses Protokoll verwendet eine Kombination aus 10% wässriger TCA und 10% TCA in Aceton, um die Proteinfällung zu erhöhen, sicherzustellen, dass kleinere Peptide / Biomoleküle gefällt werden, schnellere Pellettrocknungszeiten zu ermöglichen und die Extraktionseffizienz zu erhöhen, wobei beide Lösungsmittelextraktionseigenschaften genutzt werden. Die Kombination von 10% wässriger TCA und 10% TCA in Aceton kann jedoch kleine Peptide / Biomoleküle in der freien Fraktion ausfällen, nachdem die 10% TCA im Acetonüberstand mit der wässrigen freien Fraktion kombiniert wurde. In diesem Fall sollten die Niederschläge zur Hydrolyse in die gebundene Fraktion überführt werden.

Die zweite Hälfte dieses Protokolls beinhaltet die Freisetzung von Aminosäuren (dh BMAA) aus dem Proteinpellet durch Säuredampfhydrolyse bei erhöhten Temperaturen in einer sauerstofffreien Umgebung. Der überwiegende limitierende Faktor für den Hydrolyseschritt ist, dass er zeitaufwendig und mühsam vorzubereiten ist. Die Inkubation über Nacht verhindert eine schnelle und zeiteffiziente Probenvorbereitung und -analyse. Darüber hinaus ist der quantitative Transfer des Pellets von einem Zentrifugenröhrchen in ein Schalenfläschchen (Schritt 3.4) ein mühsamer Prozess, der Sorgfalt und Geduld erfordert, um einen genauen Normalisierungspunkt für das Trockengewicht zu gewährleisten. Mögliche Probleme, mit denen der Benutzer konfrontiert sein kann, sind der unvollständige Transfer des Pellets, nass gefällte Proteine, die an den Pipettenspitzen und dem ursprünglichen Röhrchen haften, und feste Partikel des Pellets, die die Pipettenspitze blockieren. Ein praktischer Vorschlag zur Erleichterung des Transfers des Pellets besteht darin, etwa 0,3-0,5 mm vom Ende der Pipettenspitze mit einer Schere zu entfernen, so dass größere Pelletpartikel gezogen und in die Schalendurchstechflasche abgegeben werden können. Diese Transfermethode ist gängige Praxis bei der Proteinextraktion für alle Aminosäureanalysen. Es sollten jedoch Modifikationen untersucht werden, um die Effizienz und Genauigkeit des quantitativen Transfers des Pellets in die Schalendurchstechflasche zu verbessern.

Zwei Formen von Hydrolysetechniken können verwendet werden, um Aminosäuren aus ihrem proteingebundenen Zustand freizusetzen: Flüssigphasenhydrolyse und Säuredampfhydrolyse. Die Flüssigphasenhydrolyse, bei der der Probe 6 M HCl zugegeben werden, die dann über Nacht in einen 110 °C-Ofen gegeben wird, ist eine Alternative zu der in diesem Protokoll beschriebenen Säuredampfhydrolyse. Extraktionstechniken, die Flüssigphasenhydrolyse verwenden, können eine weitere Verarbeitung erfordern, wie z. B. Entsalzung, insbesondere wenn die AQC-Derivatisierung gewählt wird, da sie grundlegende Bedingungen für die Markierung40 erfordert. Die Säuredampfhydrolyse vermeidet die Entsalzung und gibt dem Anwender die Freiheit, die Derivatisierungstechnik nach der Rekonstitution des endgültigen Pellets vor der Filtration zu wählen. Darüber hinaus können die Proben unabhängig von der gewählten Hydrolysemethode eine weitere Verarbeitung erfordern, wie z. B. SPE für die Matrixreinigung und die Konzentration 29,47,48, abhängig von der Wahl der Derivatisierungstechnik und/oder analytischen Analyse (z. B. UMKEHRPHASEN-LC-MS/MS vs. hydrophile Wechselwirkung Flüssigkeitschromatographie [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Die Rekonstitution des endgültigen Pellets in 20 mM HCl in diesem Protokoll ist für die Derivatisierung unter Verwendung von PCF-Reagenzien48über ein kommerziell erhältliches Aminosäurehydrolysekit39 geeignet (siehe Materialtabelle). Sowohl AQC als auch PCF werden alle Aminosäuren, Proteine und Nicht-Proteine derivatisieren, die in der Probe vorhanden sind, und die Selektivität der Analyten wird durch die Verwendung von LC-MS / MS und seiner Kombination aus Retentionszeitanpassung und sorgfältiger Auswahl des Quantifizierers und Qualifizierers MRMs38 erhalten. 

Aktuelle Hydrolyseprotokolle sind nicht für die Freisetzung von BMAA, 2,4-DAB und AEG optimiert, sondern für die 22 Proteinaminosäuren, die auf bestehenden Methoden zur Proteinhydrolyse 32 basieren, bei denen eine Inkubation über mehr als 18 h zum Abbau und zur Modifikation bestimmter Aminosäuren führt, was die LC-MS/MS-Analyse und damit die erhaltenen Konzentrationenbeeinflusst 32. Beach et al.49 untersuchten die Hydrolyse über die Zeit (0,5-120 h), um die Hydrolyse für die Analyse von BMAA und den proteinogenen Aminosäuren zu optimieren. Sie fanden heraus, dass, obwohl es während der ersten 0,5 Stunden der Hydrolyse eine frühe schnelle Freisetzung von BMAA gab, die BMAA-Werte mit zunehmender Hydrolysezeit ohne Abbau auch nach 5 Tagen weiter anstiegen49. Es gibt auch immer noch unterschiedliche Ansichten und Fragen über die wahre Natur von gebundenem BMAA und seinen Isomeren, wobei einige Studien darauf hindeuten, dass die BMAA-Protein-Assoziation eher oberflächlich ist 52 als BMAA-Bindung50,51 oder Fehlinkorporation in Proteine14. Der derzeitige Konsens in der Analyse von "gebundenem" BMAA erfordert jedoch den validierten und weithin akzeptierten Hydrolyseschritt, der Peptide / Proteine zerlegt, um Aminosäuren und damit BMAA und seine Isomere freizusetzen.

Die Wiederfindungsraten von 20 Proteinaminosäuren wurden in einer Studie von Sedgwick et al.42 unter Verwendung der TCA-Extraktion bestimmt, was zu einer etwa 100%igen Erholung führte. Im Fall von BMAA und seinen Isomeren aus Algenmatrices haben Studien, die die Effizienz der BMAA-Extraktion mit verschiedenen Extraktionslösungsmitteln vergleichen, ergeben, dass 10% TCA das effizienteste für freies BMAA27 ist. Die Wiederfindungsraten für proteingebundenes BMAA, das mittels Flüssigphasenhydrolyse extrahiert wurde, wurden in Studien von Glover et al.25 und Faassen et al.53 ermittelt, wo die Genauigkeit durch Spiked-Recovery-Methoden mit einer durchschnittlichen BMAA-Wiederfindungsrate von 108,6% bzw. 70% bestimmt wurde. Faassen et al. beschrieben Verfahren für Spike-Recovery-Experimente und zeigten, wie sich die Gewinnung in Abhängigkeit von der Phase des Extraktionsprozesses unterscheidet, in dem der Spike gemacht wurde53. Faassen et al. bestimmten zusätzlich die Effizienz des hier vorgestellten Säuredampfprotokolls mit Wiederfindungsraten von 83,6% für die BMAA-Isomere, die vor der Extraktion und 68,6% für die vor der Hydrolyse aufgespießt wurden24. Diese Gewinnungsraten, Extraktionsmethoden und Analysen wurden von Banack 26 weiter validiert, mit Wiederfindungsraten von 94 % bis 106 % für BMAA in einer cyanobakteriellen Matrix und einer %relativen Standardabweichung (%RSD) zwischen 5,6 % und20 %, die die FDA-Kriterien für Genauigkeit54 erfüllten. Es wird empfohlen, dass jedes Labor zunächst seine Wiederfindungsraten und Genauigkeit ermittelt, bevor dieses Protokoll über Spike-Recovery-Experimente verwendet wird. Die in Faassen et al.53 und Glover et al.25 vorgestellten Wiederfindungsmethoden können als Anhaltspunkt herangezogen werden.

Alternative Formen der Hydrolysetechniken können anstelle der Nachtofenhydrolyse verwendet werden, um eine schnellere proteingebundene Extraktion des Analyten zu erreichen. Zum Beispiel könnte ein Mikrowellenextraktor die Hydrolysezeit von 24 h auf nur 10 min55 deutlich reduzieren. Die Mikrowellenhydrolyse für Aminosäuren verwendet die gleichen Prinzipien wie die herkömmliche thermische Methode, wobei ein Handschuhfach verwendet wird, um das Mikrowellengefäß in einer sauerstofffreien Umgebung vorzubereiten und zusammenzubauen und 6 M HCl hinzuzufügen. Sobald es luftdicht ist, wird das Gefäß, das die Probe enthält, Mikrowellenstrahlung unterzogen. Mikrowellenhydrolyse wurde verwendet, um Aminosäuren aus verschiedenen Probenmatrices56,57,58 zu extrahieren; Die Mikrowellenhydrolyse muss jedoch noch für die Analyse von BMAA entwickelt und validiert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die 10%ige wässrige TCA-Proteinfällung die optimale Methode ist, um freie Nicht-Protein-Aminosäuren aus cyanobakteriellen Matrices27 zu extrahieren, und die thermische Hydrolyse bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Extraktion der proteingebundenen Fraktion. Dieses Protokoll zur Extraktion des NPAA BMAA und seiner Isomere aus Cyanobakterien ist validiert und weithin akzeptiert. Zukünftige Richtungen zur weiteren Optimierung der BMAA-Extraktion werden sich auf den Hydrolyseschritt konzentrieren, der gemäß den Spezifikationen der 22 Proteinaminosäuren durchgeführt wird. Das hier vorgestellte Extraktionsprotokoll sollte jedoch dennoch als effizient und effektiv für die Analyse von BMAA und seinen Isomeren mittels LC-MS/MS angesehen werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

D.P.B., K.J.R. und S.M.M. werden von der Ian Potter Foundation unterstützt, und J.P.V. erhält ein Forschungsausbildungsprogramm der australischen Regierung, ein Stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

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