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Chemistry

Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

O presente protocolo descreve a extração de aminoácidos não proteicos de matrizes biológicas via precipitação de proteínas de ácido tricloroacético (TCA) e hidrólise ácida antes da análise por cromatografia líquida e espectrometria de massa tandem.

Abstract

Os aminoácidos não proteicos (NPAAs) são uma grande classe de aminoácidos (AAs) que não são geneticamente codificados para tradução em proteínas. A análise de NPAAs pode fornecer informações cruciais sobre a captação e/ou função celular, vias metabólicas e toxicidade potencial. β-metilamino-L-alanina (BMAA) é um NPAA neurotóxico produzido por várias espécies de algas e está associado a um risco aumentado de doenças neurodegenerativas, o que levou a um interesse significativo de pesquisa. Existem inúmeras maneiras de extrair AAs para análise, sendo a espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida a mais comum, exigindo precipitação de proteínas seguida de hidrólise ácida do pellet de proteína. Estudos sobre a presença de BMAA em espécies de algas fornecem resultados contraditórios, sendo o uso de preparação/extração e análise de amostras não validadas uma causa primária. Como a maioria dos NPAAs, a precipitação de proteínas em TCA aquoso a 10% e a hidrólise com HCl fumegante são a forma mais apropriada de extração para BMAA e seus isômeros aminoetilglicina (AEG) e ácido 2,4-diaminobutírico (2,4-DAB). O presente protocolo descreve as etapas de um método validado de extração de NPAA comumente utilizado em laboratórios de pesquisa e ensino.

Introduction

Os aminoácidos são compostos químicos que contêm pelo menos uma amina e um grupo funcional carboxílico. Alguns aminoácidos também contêm um grupo imino, um grupo ácido funcional diferente do carboxílico; outros aminoácidos têm grupos amina que não estão ligados ao grupo α-carbono1. Existem mais de 500 aminoácidos2, 22 dos quais são conhecidos como aminoácidos proteicos utilizados para codificação genética na síntese de proteínas ribossomais3. Estes 22 aminoácidos podem ainda ser subdivididos em essenciais e não essenciais. Os aminoácidos essenciais são necessários para que um organismo funcione corretamente e só podem ser adquiridos por fontes externas. Os aminoácidos não essenciais podem ser sintetizados dentro do organismo. A classificação dos 22 aminoácidos em essenciais/não essenciais é exclusiva de espécies individuais. Todos os outros aminoácidos são aminoácidos não proteicos (NPAAs) que não são codificados para a síntese de proteínas. Os aminoácidos, sejam eles proteicos ou não proteicos, também podem desempenhar um papel de sinalização dentro de um organismo e atuar como intermediários metabólicos4. Devido aos seus papéis importantes e variados, os níveis de aminoácidos podem fornecer uma visão sobre a condição do organismo, funcionalidade e vias metabólicas, etc. Existem dois mecanismos principais pelos quais os aminoácidos podem ser incorporados em uma cadeia polipeptídica: a síntese proteica ribossomal, que utiliza os 22 aminoácidos na codificação, e a síntese de peptídeos não ribossômicos, que, juntamente com os aminoácidos proteicos, permite o uso de alguns NPAAs na síntese. Certos NPAAs podem imitar aminoácidos proteicos, potencialmente levando à sua má incorporação em peptídeos e proteínas. A má incorporação provoca um desdobramento de proteínas, que, por sua vez, tem efeitos prejudiciais5, como a má incorporação da NPAA L-3,4 di-hidroxifenilalanina (L-DOPA) no lugar da tirosina, impactando negativamente a função celular e a saúde 6,7. Uma fonte adicional de NPAAs incorporados é através da modificação pós-translacional (PTM) de resíduos de aminoácidos. Os resíduos de aminoácidos são modificados por várias razões, incluindo alterações na conformação, estabilidade e funcionalidade do peptídeo ou da proteína. Após a hidrólise de proteínas ou peptídeos contendo PTM, esses resíduos de aminoácidos modificados são liberados em sua forma livre de NPAA 8,9.

A NPAA β-metilamino-L-alanina (BMAA) produzida por cianobactérias, diatomáceas e dinoflagelados 10 é uma neurotoxina suspeita que está implicada como fator contribuinte para várias doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência (ALS-PDC)11,12, esclerose lateral amiotrófica e doença de Alzheimer13 . Sugere-se que o BMAA é erroneamente incorporado na cadeia polipeptídica de proteínas no lugar da L-serina14 e / ou outros aminoácidos proteicos. A má incorporação do BMAA pode levar ao desdobramento das proteínas, resultando na deposição de agregados proteicos nos neurônios14. Na última década, o interesse no BMAA aumentou significativamente. Descobriu-se que uma ampla gama de espécies de cianobactérias de ambientes de água doce, marinha e salobra produz BMAA15, levando à sua ampla distribuição em vários ecossistemas16,17. Além disso, o BMAA demonstrou biomagnificar através da cadeia alimentar até a cadeia alimentar humana18,19. Devido aos potenciais efeitos na saúde, falta de compreensão e incongruências da toxicidade do BMAA, é imperativo continuar a pesquisa até que a toxicidade do BMAA seja finalmente compreendida ou o BMAA seja considerado seguro20,21.

A análise de aminoácidos em amostras biológicas pode ser dividida em quatro etapas principais: preparação da amostra, derivatização de aminoácidos, separação e detecção, e identificação e quantificação. Cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) é o método de análise preferido, pois fornece uma separação e análise direcionadas e reprodutíveis de aminoácidos.

As técnicas de preparação de amostras para análise de cianobactérias e outras amostras de algas envolvem predominantemente um método de extração de aminoácidos em suas formas livres e ligadas a proteínas. Ao longo dos anos, os métodos de extração permaneceram relativamente consistentes com elementos comuns, incluindo a desolvação da amostra para separar os aminoácidos livres de sua forma ligada, seguida de precipitação de proteínas e liberação dos aminoácidos ligados através da hidrólise com ácido clorídrico (HCl) a temperaturas elevadas22 . Esta forma de extração foi otimizada para aminoácidos proteicos e empregada para NPAAs. Entretanto, a detecção e quantificação do BMAA e seus isômeros (Figura 1), aminoetilglicina (AEG) e ácido 2,4-diaminobutírico (2,4-DAB), em uma mesma espécie de cianobactérias, têm mostrado resultados inconsistentes na literatura, com uma possível explicação residindo em diferenças nas condições de crescimento e/ou na cepa de algas produtoras de quantidades variáveis ou inexistentes de BMAA23 . Argumentou-se que uma explicação mais provável para as inconsistências na detecção e quantificação do BMAA e seus isômeros se deve a protocolos experimentais não validados, ao uso de uma ampla gama de técnicas analíticas e ao detalhamento experimental insuficiente nos métodos relatados16,24, levando a dados interlaboratoriais irreprodutíveis. No entanto, Glover et al.25 e Banack26 desenvolveram e validaram recentemente uma técnica analítica para a detecção e quantificação do BMAA e seus isômeros usando cromatografia líquida de ultraeficiência (UPLC)-MS/MS de acordo com as diretrizes da International Society of Analytical Chemists (AOAC), da Farmacopeia dos EUA e da FDA necessárias para a validação de laboratório único.

Esses experimentos de validação se concentraram na separação e detecção de BMAA e seus isômeros e não abordaram as inconsistências nos protocolos de preparação de amostras. Lage et al.27 compararam o desempenho de três métodos comuns de extração para quantificação do BMAA e seus isômeros em amostras de cianobactérias via LC-MS/MS: extração em fase sólida (SPE) de aminoácidos livres28,29; um método de precipitação de proteínas que envolva uma extracção de metanol e precipitação de acetona30; e o método de extração mais utilizado para o BMAA, a precipitação proteica com ácido tricloroacético (TCA)31. Eles concluíram que a precipitação da proteína TCA foi o protocolo ideal, produzindo maiores concentrações de BMAA nas amostras de teste em comparação com os outros métodos de extração. Seu estudo validou a extração de TCA com derivatização de BMAA usando 6-aminoquinolilo-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) em uma matriz de cianobactérias, fornecendo um guia estabelecido para obter dados confiáveis e reprodutíveis de BMAA. A extração de aminoácidos TCA é uma técnica de preparação de amostras aceita e comum que também pode ser aplicada a outras matrizes. No entanto, a estabilidade do aminoácido durante a hidrólise precisa ser considerada para evitar a degradação ou oxidação, que pode ser superada com o uso de modificadores químicos e agentes redutores32. A extração de TCA é rotineiramente utilizada e ensinada a novos alunos de pesquisa e, embora o protocolo seja amplamente divulgado, um auxílio visual na aplicação desse método é um recurso valioso, garantindo uma execução adequada e consistente.

A cromatografia de fase reversa é comumente usada para separar aminoácidos, exigindo uma etapa de derivatização antes das análises. A derivatização de aminoácidos como o BMAA permite a retenção cromatográfica e pode aumentar a resolução entre isômeros. Também aumenta a massa molecular e melhora a ionização no espectrômetro de massa. Vários reagentes derivatizantes têm sido utilizados para a análise de aminoácidos via LC-MS/MS, incluindo cloroformiato de propila (PCF)33, 6-aminoquinolilo-N-hidrossiciuccinimidil carbamato (AQC)27, 9-fluorenilmetil cloroformato (FMOC)34 e cloreto de dansila (DC)35. No entanto, as únicas técnicas validadas para análise do BMAA utilizaram o PCF 36 ou o AQC 24,26,37 como reagente derivatizante.

O escopo deste protocolo está focado na extração de TCA de NPAAs de matrizes cianobacterianas. É um método intensivo em mão-de-obra que é rotineiramente usado e ensinado em laboratórios de pesquisa acadêmicos e industriais com base em manuscritos que podem ser curtos em detalhes; portanto, este protocolo fornece detalhes do procedimento e das técnicas envolvidas no preparo de amostras para a análise de BMAA livre e ligado como aminoácido modelo.

Protocol

A espécie de cianobactérias Merismopedia foi utilizada para o presente estudo38.

1. Preparação bruta da amostra

  1. Recolher a escória de algas da fonte aquática de interesse ou de um balão cultivado com cianobactérias e colocá-la num tubo de centrífuga de 50 ml38.
    NOTA: A amostra deve ser congelada a -20 °C para extrações posteriores e descongelada antes da etapa seguinte.
  2. Centrifugar os tubos que contêm a amostra a 3,500 x g durante 10 min a 25 °C. Decantar o sobrenadante em um recipiente de resíduos e descartá-lo em resíduos biológicos.
    NOTA: O sobrenadante pode ser reservado para análise futura do exossomo.
  3. Cubra o tubo que contém o pellet de amostra com segurança com uma película de vedação (ver Tabela de Materiais) e perfure alguns orifícios no filme usando um pinçador de nariz longo e afiado. Conservar o tubo na posição vertical a -80 °C durante 30 minutos.
  4. Ligue e equilibre o liofilizador a 0,1 mbar e a -80 °C (~30 min).
    NOTA: Os parâmetros (etapa 1.4) são otimizados para o liofilizador utilizado para o presente estudo (ver Tabela de Materiais). Siga os procedimentos operacionais padrão de acordo com o modelo de liofilizador disponível no laboratório ou defina a temperatura mais baixa possível se o modelo de liofilizador não for tão baixo quanto -80 °C.
    1. Coloque o(s) tubo(s) de centrífuga na posição vertical em um recipiente de vidro do liofilizador e coloque-o dentro do congelador a -80 °C por 5 minutos para resfriar o frasco.
    2. Retire o recipiente de vidro do congelador e prenda a tampa de borracha.
    3. Certifique-se de que a alça na saída da válvula de borracha do liofilizador esteja ventilada para a atmosfera (apontando para cima) e prenda o recipiente de vidro com firmeza.
    4. Gire a alça da saída da válvula de borracha muito lentamente para a posição apontando para baixo para expor o frasco ao vácuo e permita até 24 h de liofilização para garantir a sublimação de todo o líquido.
    5. Para liberar o vácuo no frasco, gire a alça para a posição apontando para cima, retire o recipiente de vidro e remova as amostras liofilizadas.
  5. Use uma balança analítica para pesar 15-50 mg de pellets de amostra seca em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: As amostras podem ser colocadas em armazenagem a -80 °C se não forem posteriormente processadas nesta fase.

2. Lisamento celular e fracionamento de NPAAs livres

  1. Adicionar 100 μL de 100 ng/ml de D5-2,4-DAB (ver Tabela de Materiais) de série utilizando uma micropipeta ao tubo de amostra (opcional).
  2. Adicionar 300-600 μL de tricloroacético aquoso a 10% p/v (TCA, ver Tabela de Materiais) ou 300-600 μL de TCA 11,7%-13,3%, respetivamente, se adicionar o padrão D5-2,4-DAB.
    NOTA: Escolha um volume de TCA aquoso que cubra totalmente o pellet.
  3. Coloque os tubos de amostra em um recipiente cheio de gelo triturado.
  4. Use um sonicator de sonda (consulte Tabela de Materiais) em potência média-alta (70%) e lise a amostra por 1 minuto seguindo as etapas abaixo.
    CUIDADO: Garanta um EPI adequado com o uso de protetores auriculares com cancelamento de ruído.
    1. Siga os protocolos de segurança apropriados em preparação para o uso do sonicador de sonda, colocando sinalização em uso na porta, realizando sonicação no exaustor de fumaça e usando protetores auriculares com cancelamento de ruído.
    2. Ligue o sonicator e insira os seguintes parâmetros: amplitude, 70%; tempo, 1 min.
    3. Pulverize 70% de etanol em um lenço de papel sem fiapos (consulte Tabela de materiais) e limpe a sonda.
    4. Mergulhe totalmente a extremidade da sonda na amostra e pressione start.
    5. Quando o sonicator da sonda parar, coloque o tubo de centrífuga contendo a amostra no gelo por 1 min.
    6. Para garantir que as células sejam lisadas, repita as etapas 2.4.3-2.4.5 mais uma vez.
  5. Colocar a amostra num frigorífico a 4 °C durante 12-24 h para permitir a precipitação proteica.
  6. Centrifugar a amostra aquosa de TCA a 10% a 3.500 x g durante 15 min a 8 °C.
  7. Use uma micropipeta para transferir o sobrenadante para um tubo de 2 mL rotulado como "Fração Livre".
  8. Micropipeta 400 μL de TCA aquoso a 10% para o tubo de centrífuga que contém o pellet de amostra restante e quebre o pellet por agitação de vórtice ou com a ponta da micropipeta.
  9. Repita os passos 2,6-2,7, transferindo o sobrenadante para o mesmo tubo de "Fração Livre" de 2 mL.
  10. Micropipeta 400 μL de TCA/acetona a 10% para o tubo de centrífuga com o pellet restante e quebre o pellet com vórtice ou a ponta da micropipeta.
  11. Centrifugar a amostra de TCA/acetona a 10% a 3.500 x g durante 15 min a 8 °C. Use uma micropipeta para transferir o sobrenadante para o tubo de 2 mL rotulado como "Fração Livre".
  12. Colocar o tubo de "fracção livre" com a tampa aberta num evaporador centrífugo (ver Tabela de Materiais) até que todos os líquidos voláteis sejam removidos (pelo menos 1 h).
  13. Uma vez que a amostra esteja livre de líquidos voláteis, cubra o tubo com segurança com filme de vedação e perfure o filme com alguns orifícios usando um pinçador de nariz longo e afiado. Colocar a amostra num congelador a -80 °C.
  14. Liofilizar a amostra de "Fração Livre" repetindo todas as etapas da etapa 1.4.
  15. Micropipeta de 200 μL de ácido clorídrico (HCl) a 20 mM para o tubo de "Fração Livre" para reconstituir a amostra liofilizada e colocá-la em armazenamento congelador a -80 °C.
    NOTA: A "Fração livre" da amostra está pronta para filtração na etapa 4. O pellet restante será processado nas etapas seguintes para fracionamento de proteínas.

3. Fracionamento dos NPAAs ligados às proteínas

  1. Use um gravador de vidro para rotular frascos de casca de vidro com os detalhes da amostra para identificação.
    NOTA: O ácido forte pode dissipar a etiquetagem da tinta; portanto, recomenda-se gravar os rótulos em vidro.
  2. Micropipeta 100 μL de 100 ng/mL padrão D5-2,4-DAB no pellet da amostra (opcional).
  3. Micropipeta 400 μL de acetona a 100% sobre o pellet da amostra e quebre o pellet usando a agitação do vórtice ou a ponta da micropipeta.
  4. Use uma micropipeta de 1 mL ajustada a 1.000 μL para transferir o pellet lavado e ressuspenso para o frasco para injetáveis de casca de vidro correspondente.
    NOTA: Outros 400 μL de acetona a 100% podem ser adicionados ao pellet agitado para ajudar na transferência completa do pellet para o frasco para injetáveis de casca de vidro. Isso pode ser repetido uma terceira vez, se necessário.
  5. Centrifugar a 8 000 x g durante 5 min a 25 °C e decantar o líquido em resíduos biológicos.
  6. Coloque o pellet restante em um evaporador centrífugo até que todo o líquido seja removido e o pellet esteja seco (~ 1 h).
  7. Prepare o frasco para injetáveis de hidrólise a vácuo adicionando 1 ml de HCl 6 M no fundo do frasco para injetáveis de hidrólise.
  8. Use pinças para inserir cuidadosamente os frascos para injetáveis com casca rotulados contendo as amostras secas no frasco para injetáveis de hidrólise, garantindo uma posição vertical e estável.
    NOTA: Podem ser utilizados frascos para injetáveis com casca vazia para ajudar a manter os frascos para injetáveis de amostra na posição vertical se o número de amostras for inferior à capacidade do frasco para injetáveis de hidrólise.
  9. Fixe a tampa ao frasco para injetáveis de hidrólise e empurre o botão vermelho na tampa para fechar a válvula.
  10. Ligue a bomba de vácuo, prenda o tubo de vácuo à cabeça da tampa do frasco para injetáveis de hidrólise e pressione o botão verde na tampa para abrir a válvula.
  11. Deixe a bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais) remover o ar do frasco para injetáveis durante 1 min.
  12. Feche o frasco para injetáveis pressionando o botão vermelho na tampa do frasco para injetáveis de hidrólise, desligue a bomba de vácuo e remova o tubo de vácuo.
  13. Fixe um tubo de borracha à torneira de gás nitrogênio na bancada do laboratório e abra a torneira ligeiramente. Coloque o polegar na extremidade do tubo, sele-o e conte até que o gás comece a escapar à medida que a pressão se acumula. Este será o prazo para a próxima etapa. Ajuste o fluxo de gás para um período de tempo adequado.
  14. Fixe a outra extremidade do tubo de borracha à cabeça da tampa do frasco para injetáveis de hidrólise e, em seguida, empurre imediatamente o botão verde da tampa. Conte até ao tempo determinado no passo 3.13 e empurre rapidamente o botão vermelho da tampa e remova o tubo de borracha.
  15. Repita os passos 3.10-3.14 duas vezes para garantir que o frasco para injetáveis de hidrólise de vidro está livre de ar e cheio de gás azoto.
  16. Colocar o frasco para injetáveis de hidrólise num forno pré-aquecido regulado a 110 °C durante 16-18 h.
  17. Use luvas de forno para remover o frasco de hidrólise de vidro do forno e deixe-o esfriar dentro do exaustor por 10 min. Dentro do exaustor, enquanto o encara para longe de você, empurre o botão verde para liberar pressão e gás.
  18. Use pinças para remover os frascos para injetáveis com casca do frasco para injetáveis de hidrólise.
  19. Reconstituir os pellets de amostra hidrolisados por micropipetagem de 200 μL de HCl de 20 mM no frasco para injetáveis com casca. Certifique-se de que o pellet seja ressuspenso por vórtice ou usando uma ponta de pipeta.
  20. Centrifugar os frascos para injetáveis contendo os pellets de amostra reconstituídos durante 2 minutos a 5,300 x g e 25 °C.

4. Filtragem de amostras

  1. Rotular tubos filtrantes de 2 ml (ver Tabela de Materiais) contendo filtros de membrana de poros de 0,2 μm como "Fração Livre" e "Fração de Proteína".
  2. Transferir as amostras reconstituídas das etapas 2.15 (fracção livre) e 3.20 (fracção proteica) para os tubos filtrantes correspondentes.
  3. Colocá-los na centrífuga durante 30 minutos a 5.000 x g e a 25 °C.
  4. Remova os filtros dos tubos de filtro e tampa-os. As amostras estão agora prontas para a derivatização de aminoácidos na etapa 5.
    NOTA: As amostras podem ser colocadas no congelador a -80 °C para armazenamento para posterior derivatização e análise.

5. Derivatização de aminoácidos

  1. Derivatizar as amostras utilizando cloroformiato de propilo (PCF)39 ou 6-aminoquinolilo-N-hidrossuccinimidil carbamato (AQC)40 de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).

Representative Results

Uma ilustração do protocolo de extração é fornecida na Figura 2 como um guia de referência resumido. Os resultados obtidos por Violi et al.38 foram escolhidos para representar um resultado positivo deste protocolo de extração para a análise de isômeros BMAA de cianobactérias. Dezenove espécies únicas de cianobactérias foram cultivadas em 11 locais de água doce do leste da Austrália. Usando o mesmo protocolo, os isômeros BMAA foram extraídos em frações livres e proteicas, derivatizados com PCF e analisados usando LC-MS/MS. Dezessete dos isolados de cianobactérias foram positivos para BMAA, e todos os 19 continham o isômero 2,4-DAB. Um resultado positivo é confirmado usando um método LC-MS/MS validado e observando pelo menos três transições de monitoramento de reações múltiplas (MRM), uma como íon quantificador e duas como íons qualificadores no tempo de retenção esperado. Um cromatograma MRM representativo de um padrão contendo BMAA e seus isômeros, indicado pelas linhas codificadas por cores, é mostrado na Figura 3. A presença e a concentração de BMAA e isômeros em todas as 19 amostras, seccionadas para mostrar a concentração de BMAA e isômero nas frações livre e ligada, estão resumidas na Tabela 1. Uma detecção positiva para os três isômeros foi observada na fração livre das espécies de Merismopedia coletadas no Lago Liddell (NSW, Austrália), onde a fração livre continha uma concentração de BMAA de 68,38 μg/g de peso seco (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB com concentração de 1.223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, e AEG com concentração de 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. Os MRMs cromatográficos são mostrados na Figura 4. Para ilustrar um resultado negativo para o BMAA e seus isômeros em uma amostra, a fração ligada das espécies Microcystis flos-aquae coletadas da Walka Water Works (NSW, Austrália) é apresentada cromatograficamente na Figura 5. Enquanto a fração ligada não continha BMAA, 2,4-DAB e/ou AEG, sua fração livre continha os três isômeros, com concentrações de 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW e 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW, respectivamente.

Assim, por meio do uso desse protocolo, Violi et al.38 confirmaram a presença de isômeros BMAA em cianobactérias de água doce do leste australiano e determinaram quais cianobactérias tinham capacidades produtoras de toxinas.

Figure 1
Figura 1: A estrutura química do BMAA e seus isômeros 2,4-DAB e AEG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de referência resumido do protocolo de extração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Cromatograma LC-MS/MS de um padrão de calibração contendo D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA e AEG para identificação de isômeros com base na retenção, indicada pelos picos destacados. Chave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (vermelho), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (laranja) e BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (azul). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Cromatograma LC-MS/MS para detecção de D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA e AEG em espécies de Merismopedia coletadas do Lago Liddell (NSW, Austrália), indicadas pelos picos destacados. Chave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (vermelho), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (laranja) e BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (azul). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Cromatograma LC-MS/MS de um controle negativo para 2,4-DAB, BMAA e AEG em uma fração ligada de espécies de Microcystis flos-aquae coletadas da Walka Water Works (NSW, Austrália). Chave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (vermelho - pico destacado), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (laranja) e BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (azul). As linhas tracejadas representam os tempos de retenção para 2,4-DAB, AEG e BMAA ausentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Concentrações de BMAA, AEG e 2,4-DAB em isolados de cianobactérias. As concentrações ± erro padrão da média (n = 3). ND denota não detectado. A maior concentração de cada isômero detectado é destacada em verde. A tabela é uma versão modificada de Violi et al.38. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussion

O protocolo de extração descrito aqui para a análise de NPAAs aplica-se à análise de quaisquer aminoácidos em amostras biológicas. Para guias sobre isolamento e cultivo de cepas cianobacterianas, pode-se consultar os métodos apresentados no estudo de Violi et al.38. A primeira etapa do protocolo leva a amostra a um ponto em que a normalização entre as amostras em relação ao peso seco pode ser alcançada. O segundo passo é a lise celular para liberar os analitos e pode ser realizada usando uma série de técnicas, incluindo rupturas mecânicas / lises, como sonicação da sonda, conforme descrito neste protocolo, ciclos de congelamento / descongelamento, moagem e moagem de contas e rupturas não mecânicas, como lise enzimática, detergente e / ou química. Sabe-se que a ruptura mecânica é vantajosa em relação à não mecânica, pois permite uma maior capacidade da amostra de lisar, permitindo que as ligações intracelulares e as proteínas permaneçam intactas41, embora a matriz da amostra possa ditar o método ideal para a lise celular.

A precipitação de proteínas é o terceiro passo crítico deste protocolo ao extrair aminoácidos para análise. O TCA é o solvente mais comumente usado; no entanto, ácido perclórico, acetona, éter metil-terc-butílico (MTBE), metanol e/ou acetonitrila 8,42 também foram utilizados, onde cada solvente de extração é destinado a extrair e precipitar diferentes substratos. O modelo aqui descrito extrai o NPAA BMAA e seus isômeros de uma matriz cianobacteriana e, embora uma gama de solventes diferentes tenha sido utilizada, os dois mais comuns são 10% de TCA em água (aquosa) e 10% de TCA em acetona. Em geral, a precipitação de proteínas com TCA é comumente usada para extrair aminoácidos para fracionar aminoácidos livres dos aminoácidos ligados à proteína. Além disso, a extração de TCA permite determinar o teor de proteína total, reduzindo os contaminantes para a fração livre e reduzindo a atividade das proteases com degradação proteica mínima43. A extração de TCA da fração livre funciona enxaguando inicialmente substâncias orgânico-solúveis, deixando para trás proteínas e compostos insolúveis, como restos de parede celular no precipitado, que é seguida pela extração de hidrólise térmica dos aminoácidos ligados à proteína (fração ligada) usando um ácido forte.

O fracionamento da fração livre com 10% de TCA aquoso mais sonicação produz a precipitação proteica mais extensa em comparação com outros solventes orgânicos44 e as melhores recuperações de aminoácidos42. Alguns estudos optam por usar um ácido combinado com um solvente orgânico (ou seja, 10%-20% de TCA na acetona 43) para precipitar mais moléculas, incluindo peptídeos / biomoléculas menores, minimizar a degradação de proteínas e reduzir contaminantes, como sais43. Outra vantagem do TCA de 10% na acetona é sua taxa de secagem mais rápida na preparação do pellet para hidrólise, minimizando o resíduo de umidade para evitar a modificação de aminoácidos. No entanto, 10% de TCA aquoso mais sonicação tem melhores eficiências de extração de aminoácidos livres quando comparado a 10% de TCA na acetona44 sozinha. Além disso, a precipitação aquosa de TCA a 10% apresenta limitações como um longo tempo de secagem, não sendo capaz de precipitar todas as proteínas ou pequenos peptídeos/biomoléculas, e dependendo do analito de interesse (ou seja, proteínas ou aminoácidos), necessitando de aditivos e agentes redutores para prevenir a oxidação e degradação45,46.

Este protocolo usa uma combinação de 10% de TCA aquoso e 10% de TCA em acetona para aumentar a precipitação de proteínas, garantir que peptídeos/biomoléculas menores sejam precipitados, permitir tempos de secagem de pellets mais rápidos e aumentar a eficiência da extração, aproveitando ambas as propriedades de extração com solvente. No entanto, a combinação de 10% de TCA aquoso e 10% de TCA em acetona pode precipitar pequenos peptídeos/biomoléculas na fração livre após o 10% de TCA no sobrenadante de acetona ser combinado com a fração livre aquosa. Neste caso, os precipitados devem ser transferidos para a fração ligada para hidrólise.

A segunda metade deste protocolo envolve a liberação de aminoácidos (ou seja, BMAA) do pellet de proteína via hidrólise ácido-vapor a temperaturas elevadas em um ambiente livre de oxigênio. O fator predominantemente limitante para a etapa de hidrólise é que é demorado e trabalhoso de preparar. A incubação durante a noite impede a preparação e análise de amostras rápidas e eficientes em termos de tempo. Além disso, a transferência quantitativa do pellet de um tubo de centrífuga para um frasco para injetáveis (passo 3.4) é um processo árduo que requer diligência e paciência para garantir um ponto preciso de normalização para o peso seco. Possíveis problemas que o usuário pode enfrentar são a transferência incompleta do pellet, proteínas precipitadas úmidas aderindo às pontas da pipeta e ao tubo original e partículas sólidas do pellet bloqueando a ponta da pipeta. Uma sugestão prática para ajudar a uma transferência mais fácil do pellet é remover cerca de 0,3-0,5 mm da extremidade da ponta da pipeta com um par de tesouras, permitindo que partículas maiores de pellets sejam retiradas e liberadas no frasco para injetáveis da casca. Este método de transferência é uma prática comum para a extração de proteínas para todas as análises de aminoácidos. No entanto, devem ser investigadas modificações para melhorar a eficiência e a precisão da transferência quantitativa do pellet para o frasco para injetáveis de concha.

Duas formas de técnicas de hidrólise podem ser empregadas para liberar aminoácidos de seu estado ligado às proteínas: hidrólise em fase líquida e hidrólise ácido-vapor. A hidrólise em fase líquida, que envolve a adição de HCl 6 M à amostra, que é então colocada em forno a 110 °C durante a noite, é uma alternativa à hidrólise ácido-vapor descrita neste protocolo. Técnicas de extração que empregam hidrólise em fase líquida podem exigir processamento adicional, como a dessalinização, especialmente se a derivatização de AQC for escolhida, pois requer condições básicas para a marcação40. A hidrólise ácido-vapor evita a dessalinização e permite ao usuário a liberdade de escolher a técnica de derivatização após a reconstituição do pellet final antes da filtração. Além disso, independentemente do método de hidrólise escolhido, as amostras podem necessitar de processamento adicional, como SPE para purificação e concentração da matriz 29,47,48, dependendo da escolha da técnica de derivatização e/ou análise analítica (por exemplo, fase reversa LC-MS/MS vs. cromatografia líquida de interação hidrofílica [HILIC] LC-MS/MS 37 ). A reconstituição do pellet final em HCl 20 mM neste protocolo é apropriada para derivatização usando reagentes PCF48através de um kit de hidrólise de aminoácidos39 comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Tanto o AQC quanto o PCF derivarão todos os aminoácidos, proteínas e não proteínas de origem presentes na amostra, e a seletividade dos analitos é obtida através do uso de LC-MS/MS e sua combinação de correspondência de tempo de retenção e seleção cuidadosa do quantificador e qualificador MRMs38. 

Os protocolos atuais de hidrólise não são otimizados para a liberação de BMAA, 2,4-DAB e AEG, mas para os 22 aminoácidos proteicos baseados nos métodos existentes para hidrólise proteica 32, onde a incubação por mais de 18 h resulta na degradação e modificação de certos aminoácidos, afetando a análise LC-MS/MS e, portanto, as concentrações obtidas32. Beach et al.49 investigaram a hidrólise ao longo do tempo (0,5-120 h) para otimizar a hidrólise para análise do BMAA e dos aminoácidos proteinogênicos. Eles descobriram que, embora tenha havido uma liberação rápida precoce de BMAA durante os primeiros 0,5 h da hidrólise, os níveis de BMAA continuaram a aumentar à medida que o tempo de hidrólise aumentava, sem degradação, mesmo após 5 dias49. Há também ainda diferentes visões e questões sobre a verdadeira natureza do BMAA ligado e seus isômeros, com alguns estudos sugerindo que, em vez de ligação BMAA 50,51 ou má incorporação em proteínas14, a associação BMAA-proteína é superficial52. No entanto, o consenso atual na análise do BMAA "ligado" requer a etapa de hidrólise validada e amplamente aceita que separa peptídeos / proteínas para liberar aminoácidos e, portanto, BMAA e seus isômeros.

As taxas de recuperação de 20 aminoácidos proteicos foram determinadas em um estudo de Sedgwick et al.42 utilizando a extração de TCA, resultando em aproximadamente 100% de recuperação. No caso do BMAA e seus isômeros de matrizes de algas, estudos comparando a eficiência da extração de BMAA utilizando vários solventes de extração encontraram 10% de TCA como o mais eficiente para BMAA livre27. As taxas de recuperação do BMAA ligado à proteína extraído por hidrólise em fase líquida foram estabelecidas em estudos de Glover et al.25 e de Faassen et al.53, onde a acurácia foi determinada por métodos de recuperação spiked, com uma taxa média de recuperação do BMAA de 108,6% e 70%, respectivamente. Faassen et al. descreveram procedimentos para experimentos de recuperação de spike e ilustraram como a recuperação difere dependendo do estágio do processo de extração que o spike foi feito53. Faassen e col. determinaram adicionalmente a eficiência do protocolo ácido-vapor aqui apresentado, com taxas de recuperação de 83,6% para os isômeros BMAA cravados antes da extração e 68,6% para aqueles cravados antes da hidrólise24. Essas recuperações, métodos de extração e análises foram validados por Banack 26, com taxas de recuperação de 94%-106% para BMAA em uma matriz cianobacteriana e um %Desvio Padrão Relativo (%RSD) entre 5,6% e20%, atendendo aos critérios de precisão da FDA54. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça inicialmente suas taxas de recuperação e precisão antes de utilizar este protocolo por meio de experimentos de recuperação de pico. Os métodos de recuperação apresentados em Faassen et al.53 e Glover et al.25 podem ser seguidos como guia.

Formas alternativas de técnicas de hidrólise podem ser utilizadas em vez de hidrólise em forno durante a noite para uma extração mais rápida ligada às proteínas do analito. Por exemplo, um extrator de micro-ondas poderia reduzir significativamente o tempo de hidrólise de 24 h para apenas 10 min55. A hidrólise de micro-ondas para aminoácidos usa os mesmos princípios que o método térmico convencional, usando um porta-luvas para preparar e montar o recipiente de micro-ondas em um ambiente livre de oxigênio e adicionando 6 M HCl. Uma vez hermético, o recipiente que contém a amostra sofre radiação de micro-ondas. A hidrólise de micro-ondas tem sido utilizada para extrair aminoácidos de várias matrizes de amostras56,57,58; no entanto, a hidrólise de micro-ondas ainda não foi desenvolvida e validada para a análise do BMAA.

Em conclusão, a precipitação aquosa de 10% da proteína TCA é o método ideal para extrair aminoácidos livres não proteicos de matrizes cianobacterianas27, e a hidrólise térmica fornece uma extração confiável e reprodutível da fração ligada à proteína. Este protocolo para extrair o NPAA BMAA e seus isômeros de cianobactérias é validado e amplamente aceito. Direções futuras para otimizar ainda mais a extração de BMAA se concentrarão na etapa de hidrólise, que é realizada de acordo com as especificações dos 22 aminoácidos proteicos. No entanto, o protocolo de extração aqui apresentado ainda deve ser considerado eficiente e eficaz para a análise do BMAA e seus isômeros via LC-MS/MS.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

D.P.B., K.J.R. e S.M.M. são apoiados pela Fundação Ian Potter, e J.P.V. é o destinatário de um Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano, Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

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References

  1. Larsen, P. O. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. Miflin, B. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 225-269 (1980).
  2. Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
  3. Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
  4. Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. , Academic Press. Cambridge, MA. 21-29 (2015).
  5. Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
  6. Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson's disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
  7. Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
  8. Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
  9. Hashiguchi, A., Komatsu, S. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. Shukla, A. K. , Academic Press. Cambridge, MA. 97-113 (2017).
  10. Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
  11. Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
  12. Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
  13. Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer's disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
  14. Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
  15. Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
  16. Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
  17. Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
  18. Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
  19. Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
  20. Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
  21. Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
  22. Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
  23. Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
  24. Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
  25. Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
  26. Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
  27. Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
  28. Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
  29. Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
  30. Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
  31. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
  32. Davidson, I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. Smith, B. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 111-122 (2003).
  33. Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
  34. Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
  35. Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
  36. Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
  37. Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
  38. Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
  39. Phenomenex. EZ:faast For Amino Acid Analysis of Protein Hydroysates by LC-MS. User's Manual. , Available from: http://phx.phenomenex.com/lib/3882_L6_LC_MS.pdf (2005).
  40. AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters. , Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014).
  41. D'Hondt, E., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 133-154 (2017).
  42. Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
  43. Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
  44. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  45. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  46. Novák, P., Havlíček, V. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). Ciborowski, P., Silberring, J. , Elsevier. 51-62 (2016).
  47. Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
  48. Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
  49. Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
  50. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
  51. Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
  52. van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
  53. Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
  54. Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
  55. Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
  56. Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
  57. Chen, S. -T., Chiou, S. -H., Chu, Y. -H., Wang, K. -T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
  58. Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).

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