Beregningsmodellering af retinale neuroner til visuel proteseforskning - grundlæggende tilgange

Summary

Vi opsummerer en arbejdsgang til beregningsmæssigt at modellere en retinal neurons adfærd som reaktion på elektrisk stimulering. Beregningsmodellen er alsidig og omfatter automatiseringstrin, der er nyttige til at simulere en række fysiologiske scenarier og foregribe resultaterne af fremtidige in vivo / in vitro-undersøgelser .

Abstract

Computational modellering er blevet en stadig vigtigere metode inden for neural engineering på grund af dens evne til at forudsige adfærd i in vivo og in vitro systemer. Dette har den vigtigste fordel at minimere antallet af dyr, der kræves i en given undersøgelse ved at give en ofte meget præcis forudsigelse af fysiologiske resultater. Inden for visuel protese har beregningsmodellering en række praktiske anvendelser, herunder information om design af et implanterbart elektrodeararray og forudsigelse af visuelle opfattelser, der kan fremkaldes gennem levering af elektriske impulser fra det nævnte array. Nogle modeller beskrevet i litteraturen kombinerer en tredimensionel (3D) morfologi til beregning af det elektriske felt og en kabelmodel af neuronen eller neurale netværk af interesse. For at øge tilgængeligheden af denne totrinsmetode for forskere, der kan have begrænset tidligere erfaring med beregningsmodellering, leverer vi en video af de grundlæggende tilgange, der skal tages for at konstruere en beregningsmodel og bruge den til at forudsige de fysiologiske og psykofysiske resultater af stimuleringsprotokoller, der anvendes via en visuel protese. Vejledningen omfatter trinene til at opbygge en 3D-model i en FEM-software (finite element modeling), konstruktionen af en retinal ganglioncellemodel i en multi-compartmental neuron beregningssoftware, efterfulgt af sammenlægning af de to. En finite element modellering software til numerisk løsning af fysiske ligninger ville blive brugt til at løse elektrisk feltfordeling i vævets elektriske stimuleringer. Derefter blev specialiseret software til simulering af de elektriske aktiviteter i en neural celle eller et netværk brugt. For at følge denne vejledning kræves kendskab til arbejdsprincippet for en neuroprostese samt neurofysiologiske begreber (f.eks. Handlingspotentialemekanisme og en forståelse af Hodgkin-Huxley-modellen).

Introduction

Visuelle neuroprosteser er en gruppe enheder, der leverer stimuleringer (elektrisk, lys osv.) til de neurale celler i den visuelle vej for at skabe fosfener eller fornemmelse af at se lyset. Det er en behandlingsstrategi, der har været i klinisk brug i næsten et årti for mennesker med permanent blindhed forårsaget af degenerative retinale sygdomme. Typisk vil et komplet system omfatte et eksternt kamera, der fanger den visuelle information omkring brugeren, en strømforsyning og computerenhed til at behandle og oversætte billedet til en række elektriske impulser og et implanteret elektrodearray, der grænseflader det neurale væv og leverer de elektriske impulser til neurale celler. Arbejdsprincippet gør det muligt at placere en visuel neuroprotese på forskellige steder langs den visuelle vej fra nethinden til den visuelle cortex, så længe den er nedstrøms fra det beskadigede væv. Et flertal af den nuværende forskning i visuelle neuroproteser fokuserer på at øge effektiviteten af stimuleringen og forbedre den rumlige skarphed for at give en mere naturlig vision.

I bestræbelserne på at forbedre effektiviteten af stimuleringen har beregningsmodellering været en omkostnings- og tidseffektiv metode til at validere et protesedesign og simulere dets visuelle resultat. Beregningsmodellering på dette område blev populær siden 1999, da Greenberg¹ modellerede reaktionen fra en retinal ganglioncelle på ekstracellulære elektriske stimuli. Siden da er beregningsmodellering blevet brugt til at optimere parametrene for den elektriske puls ^2,3 eller det geometriske design af elektroden ^4,5. På trods af variationen i kompleksitet og forskningsspørgsmål fungerer disse modeller ved at bestemme den elektriske spændingsfordeling i mediet (f.eks. Neuralt væv) og estimere det elektriske respons, som neuronerne i nærheden vil producere på grund af den elektriske spænding.

Den elektriske spændingsfordeling i en leder kan findes ved at løse Poisson-ligningerne⁶ på alle steder:

hvor E er det elektriske felt, V det elektriske potentiale, J strømtætheden, og σ er den elektriske ledningsevne. I ligningen angives en gradientoperator. I tilfælde af stationær strøm pålægges modellen følgende grænsebetingelser:

hvor n er det normale for overfladen, repræsenterer Ω grænsen, og I₀ repræsenterer den specifikke strøm. Sammen skaber de elektrisk isolering ved de ydre grænser og skaber en strømkilde til en valgt grænse. Hvis vi antager en monopolær punktkilde i et homogent medium med en isotrop ledningsevne, kan det ekstracellulære elektriske potentiale på et vilkårligt sted beregnes med⁷:

hvor I_e er strømmen og er afstanden mellem elektroden og målepunktet. Når mediet er inhomogent eller anisotropisk, eller elektrodearrayet har flere elektroder, kan en beregningspakke til numerisk løsning af ligningerne være praktisk. En finite-element modelleringssoftware⁶ opdeler volumenlederen i små sektioner kendt som 'elementer'. Elementerne er forbundet med hinanden, således at virkningerne af ændring i et element påvirker ændring i andre, og det løser de fysiske ligninger, der tjener til at beskrive disse elementer. Med den stigende beregningshastighed for moderne computere kan denne proces afsluttes inden for få sekunder. Når det elektriske potentiale er beregnet, kan man derefter estimere neuronens elektriske respons.

En neuron sender og modtager information i form af elektriske signaler. Sådanne signaler kommer i to former - graduerede potentialer og handlingspotentialer. Graduerede potentialer er midlertidige ændringer i membranpotentialet, hvor spændingen over membranen bliver mere positiv (depolarisering) eller negativ (hyperpolarisering). Graduerede potentialer har typisk lokaliserede effekter. I celler, der producerer dem, er handlingspotentialer alt-eller-intet-reaktioner, der kan rejse lange afstande langs længden af en axon. Både graduerede og handlingspotentialer er følsomme over for det elektriske såvel som det kemiske miljø. En aktionspotentiel spike kan produceres af forskellige neuronale celletyper, herunder retinale ganglionceller, når et tærskeltransmembranpotentiale krydses. Handlingspotentialet spiking og formering udløser derefter synaptisk transmission af signaler til nedstrøms neuroner. En neuron kan modelleres som et kabel, der er opdelt i cylindriske segmenter, hvor hvert segment har kapacitans og modstand på grund af lipiddobbeltlagsmembranen⁸. Et neuronberegningsprogram⁹ kan estimere den elektriske aktivitet af en elektrisk spændende celle ved at diskretisere cellen i flere rum og løse den matematiske model¹⁰:

I denne ligning er C_mmembrankapacitansen, V _e,n er det ekstracellulære potentiale ved knude n, V_i,n det intracellulære potentiale ved knude n, R n den intracellulære (langsgående) modstand ved knude n, og _I-ion er den ioniske strøm, der går gennem ionkanalerne ved knude _n. Værdierne af V fra FEM-modellen implementeres som V_e,n for alle knuder i neuronen, når stimuleringen er aktiv.

Transmembranstrømmene fra ionkanaler kan modelleres ved hjælp af Hodgkin-Huxley-formuleringer¹¹:

hvor g i er kanalens specifikke konduktans, V _m transmembranpotentialet (V _i,n - V_e,n) og E_ion ionkanalens reverseringspotentiale. For spændingsstyrede kanaler, såsom Na-kanal, introduceres dimensionsløse parametre, m og h, der beskriver sandsynligheden for åbning eller lukning af kanalerne:

hvor er den maksimale membrankonduktans for den pågældende ionkanal, og værdierne for parametrene m og h er defineret ved differentialligninger:

hvor α x og β_x er spændingsafhængige funktioner, der definerer ionkanalens hastighedskonstanter. De har normalt form af:

Værdierne af parametrene i disse ligninger, herunder maksimal konduktans, samt konstanterne A, B, C og D, blev typisk fundet fra empiriske målinger.

Med disse byggesten kan modeller af forskellige kompleksiteter bygges ved at følge de beskrevne trin. En FEM-software er nyttig, når Poisson-ligningen ikke kan løses analytisk, såsom i tilfælde af inhomogen eller anisotrop konduktans i volumenlederen, eller når elektrodearrayets geometri er kompleks. Efter at de ekstracellulære potentielle værdier er blevet løst, kan neuronkabelmodellen derefter løses numerisk i neuronberegningssoftwaren. Kombination af de to software muliggør beregning af en kompleks neuroncelle eller netværk til et ikke-ensartet elektrisk felt.

En simpel to-trins model af en retinal ganglioncelle under en suprachoroidal stimulering vil blive bygget ved hjælp af de førnævnte programmer. I denne undersøgelse vil nethindeganglioncellen blive udsat for en række størrelser af elektriske strømimpulser. Placeringen af cellen i forhold til stimulus er også varieret for at vise afstands-tærskelforholdet. Desuden inkluderer undersøgelsen en validering af beregningsresultatet mod en in vivo-undersøgelse af den kortikale aktiveringstærskel ved hjælp af forskellige størrelser af stimuleringselektrode 12 samt en in vitro-undersøgelse, der viser forholdet mellem elektrode-neuronafstanden og aktiveringstærsklen¹³.

Protocol

1. Opsætning af finite element-modellen til elektriske potentialeberegninger

1. Bestem simuleringstrinnene og kompleksiteten af modellen
   BEMÆRK: Formålet med det første trin er at afklare formålet med modelleringen, som bestemmer de nødvendige elementer i modellen og simuleringsproceduren. Et vigtigt punkt at overveje er adfærden af neurale celler, der skal vises af modellen, og hvilken testprotokol der ville være nødvendig for at demonstrere denne adfærd. Denne undersøgelse viser et afstandstærskelforhold for en neuron, der er ekstracellulært stimuleret, såvel som elektrodestørrelsestærskelkurven. For at gøre dette er der behov for en neural cellemodel opdelt i forskellige sektioner (for at inkorporere variationen af morfologiske og biofysiske parametre i neuronen), der er følsom over for ekstracellulær spænding og simulering af en række elektrodestørrelser og positioner.
   1. Definer forskningsspørgsmålet og de eksperimentelle variabler.
      1. Definer et forskningsspørgsmål og testprotokol for at guide konstruktionen af modellen. Det er bedst at starte med et klart spørgsmål og opbygge en model så enkel som muligt at besvare den.
   2. Bestem de nødvendige elementer, der skal medtages i den komplette model
      BEMÆRK: I denne modelleringsmetode ses cellen som nedsænket i et elektrisk ledende medium, det vil sige det biologiske væv. Den elektriske stimulering sker på tværs af denne 'volumenleder', dvs. mediet, hvilket resulterer i en fordeling af elektrisk potentiale.
      1. Baseret på de forskningsspørgsmål og variabler, der skal løses, skal du beslutte, om begge elementer (FEM og neuronkabelmodel) er påkrævet. Hvis modelleringen for eksempel har brug for en enkelt elektrode, der kan forenkles som punktkilde, og at mediet er homogent, er en FEM muligvis ikke nødvendig, og en analytisk beregning af det ekstracellulære elektriske felt kan udføres for at erstatte det.
2. Download og installer softwaren
   BEMÆRK: Undersøgelsen brugte versionerne af softwareapplikationer (COMSOL, NEURON og Python Anaconda) og hardware specificeret i materialetabellen. Der kan være mindre forskelle i trin eller resultater, hvis der bruges forskellige versioner af softwaren/hardwaren.
   1. Download den software, der passer til computerens operativsystem, og køb en licens, hvis det er nødvendigt. Sørg for, at alle de nødvendige simuleringsmoduler downloades, og installer al software.
3. Indsaml data om anatomien af vævet og cellen, der skal modelleres
   BEMÆRK: For denne metode blev de anatomiske og biofysiske parametre taget fra empiriske fund. Det er almindeligt, at beregningsmodeller blander parametre målt i forskellige arter på grund af manglende tilgængelige data. For en simulering af suprachoroidal stimulering skal vævslagene mellem de stimulerende og referenceelektroderne inkluderes i modellen.
   1. Saml vævets anatomi fra histologiske undersøgelser.
      1. I denne model skal du inkludere choroid, retinalvæv og glasagtige domæner, hvor hvert domæne er modelleret som et rektangulært prisme for nem konstruktion af modellen. Indsaml den gennemsnitlige retinale vævstykkelse fra offentliggjorte histologiske data¹⁴ for senere at blive brugt som højden af hvert prisme.
   2. Indsaml enkeltcellemorfologidata fra cellefarvning eller offentlig neurondatabase.
      1. Download den detaljerede neuronmorfologi fra en database som NeuroMorpho.org, som giver en søgemetadatafunktion for at finde den relevante neuron baseret på art, hjerneregion, celletype osv. Til denne undersøgelse finder du Guos OFF RGC-model (D23WM13_27_1-OffRGC_msa)¹⁵ ved at indtaste Rabbit > New Zealand White i artsfeltet og Nethinden i feltet Brain Region . Klik på modellen og download .swc-filen.
4. Indsaml de biofysiske data for cellen modelleret
   BEMÆRK: De biofysiske parametre inkluderer de elektriske ledningsevneværdier for hvert vævslag og de elektriske parametre for neurale membran- og ionkanaler.
   1. På grund af tilgængeligheden af data skal du bruge de elektriske ledningsevneværdier, der blev taget fra kaninen¹⁶ til vævsmodellen, mens dynamikken i ionkanalerne var baseret på Sheasby- og Fohlmeister-modellen af tigersalamanderens nethinde¹⁷.
5. Byg geometrien af den endelige elementmodel af vævet og elektroden i FEM-softwaren
   BEMÆRK: Geometrien af vævet og elektrodearrayet påvirker begge den elektriske potentialefordeling, hvilket igen påvirker den neurale celleadfærd. Derfor er det vigtigt at opbygge en realistisk geometri af mediet, hvor cellerne befinder sig, såvel som elektroden. FEM-softwaren, der bruges i denne vejledning, har en GUI, der muliggør nem konstruktion af modelgeometri.
   1. Opsætning af FEM-modellen i softwarens GUI:
      1. Kør FEM-softwaren, og klik på Model Wizard > 3D. I listen Vælg fysik skal du udvide AC / DC > elektriske felter og strøm > elektriske strømme (ec) og derefter klikke på Tilføj. Klik på Studer og tilføj en stationær undersøgelse under indstillingen Generelle studier , og klik derefter på Udført (supplerende figur 1).
   2. Opsætning af elektrodens enhed og geometriske parametre.
      1. I Modelbygger-træet skal du klikke på Parametre 1. I tabellen skal du skrive 'elec_rad' i feltet Navn og '50' i feltet Udtryk for at oprette en elektrode, der er 50 enheder i radius. Klik derefter på Geometri, og skift længdeenheden til μm, da somaen i en typisk retinal ganglioncelle er omkring 10 μm i diameter (supplerende figur 2).
   3. Opret vævslagene ved hjælp af blokdomæner
      BEMÆRK: For at opbygge modelgeometrien blev der brugt tre blokke til at repræsentere forskellige strukturer i øjet. Blok 1 repræsenterede choroiden, blok 2 retinalvævet og blok 3 glaslegemet.
      1. Højreklik på Geometry 1 > Block for at oprette et blokdomæne. Gentag dette trin to gange mere for at oprette tre blokke i alt. For alle blokke skal du indstille både dybde og bredde til 5.000 μm og ændre indstillingen Base (under Position) til Center. Tildel følgende værdier for højde (under Størrelse og form) og z (under Position) for hver blok:
         Blok 1: Højde = 112 μm, z = 0 μm
         Blok 2: Højde = 151 μm, z = 131,5 μm
         Blok 3: Højde = 5.000 μm, z = 2.707 μm
   4. Oprettelse af et arbejdsplan for at tilføje en elektrode til modellen
      1. Højreklik på geometri 1 i modeltræet, og vælg Arbejdsplan. Klik på Arbejdsplan 1 og skift plantype til Face Parallel, klik på knappen Aktivér valg under plantypen og vælg den nederste overflade af blok 1 (blk 1 > 1).
   5. Tegning af en diskelektrode på arbejdsplanet
      1. Klik på Plangeometri under Arbejdsplan 1 , og klik på Skitse i hovedværktøjslinjen. Vælg Cirkel, klik et vilkårligt sted inde i rektanglet under fanen Grafik , og træk for at oprette en diskelektrode. Skift radius til 'elec_rad' μm, xw og yw til 0 μm, og klik derefter på Byg alle.
   6. Tildeling af materialeegenskaber til hvert domæne
      BEMÆRK: Ved at følge trinene for at opbygge geometrien vil modellen blive opdelt i flere 'domæner', som er individuelle 3D-dele, der udgør den komplette geometri. Hvert domæne skal tildeles en elektrisk ledningsevneværdi for at beregne den elektriske feltfordeling gennem hele modellen.
      1. I modeltræet skal du højreklikke på Materiale > tomt materiale og derefter klikke på Materiale 1 og ændre markeringen til Manuel.
      2. Klik på domænerne i vinduet Grafik, så kun domæne 1 vælges. Vælg Materialeegenskaber > Grundlæggende egenskaber > Elektrisk ledningsevne, klik på knappen Føj til materiale , og skift værdien for elektrisk ledningsevne til værdien til 0,043 S / m¹⁵.
      3. Gentag trinnene for domæne 2 og 3 med de elektriske ledningsevneværdier på henholdsvis 0,7 16 og 1,55¹⁶ S/m (supplerende figur 3).
   7. Meshing en 3D-model: For at maskere modellen skal du gå til modeltræet og højreklikke på Mesh 1 > Free Tetrahedral. Klik på Free Tetrahedral 1 og vælg Build All.
      BEMÆRK: Maskeprocessen opdeler hele geometrien i mindre 'elementer' (et element er et virtuelt segment af modellens geometri, hvor de fysiske ligninger løses numerisk). Meshing med mindre elementer øger teoretisk nøjagtigheden af tilnærmelsen, men er beregningsmæssigt udtømmende. En almindelig praksis er ved at starte modellen med sparsomt net og registrere resultatet af simuleringen og derefter løbende gentage simuleringen med mindre meshelementer hver gang og sammenligne resultaterne. Forfiningsprocessen kan stoppe, når der ikke er nogen væsentlig forskel i beregningsresultaterne fra efterfølgende forfiningstrin.
      1. Vurdering af maskekvaliteten: Højreklik på Mesh 1 , og vælg Statistik for at vise histogrammet for elementkvaliteten. Følg nedenstående trin til raffinering af net for at forbedre elementernes kvalitet.
         BEMÆRK: Brug af standardnet kan producere mange elementer af lav kvalitet, hvilket igen giver unøjagtige beregninger. I de fleste tilfælde er der behov for en vis grad af mesh-raffinement.
      2. Raffinering af masken omkring elektrodens omkreds
         BEMÆRK: De områder, hvor der kan være pludselige ændringer i det elektriske felt, kræver typisk et mere raffineret net. Her blev en tættere maske omkring elektrodens omkreds tilføjet ved hjælp af kantfordelingsfunktionen.
         1. For det første skal du slette det eksisterende Free Tetrahedral 1 mesh. Højreklik derefter på Mesh 1 > Distribution, klik på Distribution 1, skift geometrisk enhedsniveau til kant og vælg kanter 19-22 (diskelektrodens omkreds).
         2. Indstil fordelingstypen til Fast antal elementer, og skift feltet Antal elementer til elec_rad*3/10 for at gøre elementerne rimeligt små.
      3. Raffinering af masken på tværs af choroid og retinalvævet
         1. I modeltræet skal du højreklikke på Mesh 1 > Swept. Klik på Swept 1. Vælg Domæne 1 og 2. Højreklik derefter på Mesh 1 > Free Tetrahedral, indstil det geometriske enhedsniveau til Resterende, og klik på Byg alle. (Valgfrit: Kontroller elementets kvalitetshistogram igen for at sikre, at elementerne af lav kvalitet er blevet reduceret i forhold).
6. Anvend fysikken på den endelige elementmodel
   BEMÆRK: 'Fysikken' i FEM-softwaren er sæt af matematiske ligninger og grænsebetingelser, der skal tildeles modellen. Det er beregningen af løsningen til det samtidige sæt ligninger, der udføres i løbet af modelens kørsel. Valget af fysik, der skal anvendes på geometri, afhænger af det fysiske fænomen, der simuleres. For eksempel observerer elektrisk strømfysik, som brugt i denne model, den elektriske feltfordeling og forsømmer det magnetiske (induktive) fænomen. Anden fysik kan anvendes på geometrien, hvis andre fysiske problemer (f.eks. temperaturfordeling, mekanisk belastning osv.) skal løses.
   1. Udvælgelse af fysik og anvendelse af grænsebetingelser
      BEMÆRK: Hvis der skal anvendes en konstant spændingsimpuls, skal den flydende potentielle grænsetilstand erstattes med en elektrisk potentiel grænsetilstand.
      1. Udvid elektriske strømme 1 i modeltræet, og kontroller, om strømbesparelse 1, elektrisk isolering 1 og startværdier 1 er angivet. Højreklik derefter på Electric Currents 1 > Ground (dette tildeler 0 V til et fjernt plan, der simulerer en fjern referenceelektrode) og anvend dette på overfladen længst væk fra elektroden (Overflade 10).
      2. Højreklik derefter på elektriske strømme 1 > flydende potentiale (dette simulerer en strømkilde med konstant strøm), der er tildelt diskelektroden (overflade 14), og skift I _0-værdien til 1 [μA] for at anvende en enhedsstrøm.
   2. Kører simuleringen med en parametrisk fejning.
      BEMÆRK: Dette trin kører simuleringen, og der blev tilføjet en parametrisk fejning, hvor flere simuleringer blev udført med værdien af en parameter ændret i hver simulering. Her blev elektroderadiusparameteren fejet, og den elektriske potentialefordeling for hver simulering blev gemt i modelfilen. Efter simuleringen blev kørt, blev resultatgrenen i modeltræet befolket med en elektrisk potentiale (ec) multislice-graf.
      1. I modeltræet skal du højreklikke på Study 1 > Parametric Sweep. Klik på Parametric Sweep, og klik på Tilføj i tabellen Study Setting, og vælg derefter elec_rad for parameternavnet.
      2. Skriv '50, 150, 350, 500' for parameterværdilisten og 'μm' for parameterenheden, og klik på Beregn for at køre undersøgelsen (supplerende figur 4).

Figur 1: Oprettelse af tisssue geometri. En blokgeometri blev indsat i FEM-modellen for at repræsentere vævet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Oprettelse af elektrodens geometri . (A) At lave et arbejdsplan til at tegne skiveelektroden. (B) Skitsering af en cirkel på et arbejdsplan for at skabe en skiveelektrode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: FEM-modellens histogram for elementkvalitet. Histogrammet viste kvaliteten af elementerne i hele modellen. Mesh-forbedringer er nødvendige, hvis en betydelig del af elementerne er i regionen af lav kvalitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Tildeling af en strømværdi til elektroden. En enhedsstrøm påført elektrodens geometri i FEM-softwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Import af geometrien af den neurale celle i neuron computational suite's GUI

1. Byg cellemodellens geometri
   1. Import af morfologien ved hjælp af funktionen Cell Builder.
      1. Kør 'nrngui' fra neuron computational suite's installationsmappe, klik på Værktøjer > diverse > Importer 3D, og marker derefter afkrydsningsfeltet Vælg en fil .
      2. Find den downloadede .swc-fil, og klik på Læs. Når geometrien er importeret, skal du klikke på Eksporter > cellebygger (supplerende figur 5).
   2. Oprettelse af en .hoc-fil af den importerede cellemorfologi
      1. Gå til fanen Delmængder , og observer de delmængder, der er foruddefineret i modellen (f.eks. soma, axon, basal osv.). Marker afkrydsningsfeltet Kontinuerlig oprettelse , gå til Administration > eksport, og eksporter morfologien som 'rgc.hoc'.
   3. Visning af cellens morfologi
      1. Klik på Tool > Model View > 1 Real Cells > Root Soma[0] på værktøjslinjen, højreklik på det viste vindue og klik på Axis Type > View Axis. Ved visuel inspektion er denne models dendritiske feltdiameter omkring 250 μm. Luk NEURON-vinduerne for nu.

Figur 5: Eksport af neuronmodeloplysningerne som en .hoc-fil. Neuronens geometri blev eksporteret til en .hoc-fil for at muliggøre yderligere ændringer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Måling af neuronens dimension. Neuronens morfologi (øverste visning) blev vist i GUI'en i neuronberegningspakken med x-y-akserne overlejret. Skalaen var i μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Programmering af NEURON-beregningssimuleringen

1. Justering af cellens morfologi ved at programmere på .hoc-sprog
   BEMÆRK: Cellens morfologi kan justeres via GUI'ens Cell Builder-funktion. Men hvordan dette kan gøres ved at redigere .hoc-filen for at fremskynde processen, demonstreres. .hoc-filen definerer topologien (fysiske forbindelser mellem hver del af neuronerne), morfologien (længden, diameteren og placeringen af hver neuronsektion) og de biofysiske egenskaber (ionkanalparametre) i den modellerede celle. Den komplette dokumentation for .hoc-programmering findes i: https://neuron.yale.edu/neuron/static/new_doc/index.html#,
   1. Åbn den resulterende .hoc-fil med en teksteditor (f.eks. Notesblok). Tilføj et axon indledende segment på 40 μm længde og et smalt aksonalt segment på 90 μm længde tæt på soma som beskrevet i Sheasby og Fohlmeister¹⁷, samt ændre længden af dendritterne, så dendritisk feltstørrelse bliver 180 μm for at matche G1-cellen i Rockhill, et ^al.18.
      1. Oprettelse af nye cellesektioner og definition af de topologiske forbindelser for hver sektion.
         1. Hvis du vil oprette nye cellesektioner for axonstartsegmentet (AIS) og det smalle axonale segment (NS), skal du føje disse linjer til begyndelsen af filen rgc.hoc:
            oprette AIS, NS // Erklæring af cellerum kaldet AIS og NS
            Udskift derefter linjen 'tilslut axon(0), soma[1](1)' med:
            connect ais(0), soma[1](1) // Tilslutning af det første segment af AIS til slutningen af soma[1]
            connect ns(0), ais(1) // Tilslutning af det første segment af NS til slutningen af AIS
            forbinde axon(0), ns(1) // Tilslutning af det første segment af axonen til enden af NS
      2. Definition af 3D-positioner, diametre og længde af cellesektionerne
         1. Definer 3D-positionerne og diametrene i AIS- og NS-rummene ved at skrive disse linjer inde i 'proc shape3d_31()' parenteserne:
            ais { pt3dadd(-2,25, -1,55, 0, 1) // De første tre tal er xyz-koordinaten, og diameteren er 1 μm
            pt3dadd(37,75, -1,55, 0, 1)} // Det første punkt er ved x = -2,25 μm og det sidste punkt er ved x = 37,75 μm
            ns { pt3dadd(37,75, -1,55, 0, 0,3) // 3D-koordinaterne og diameteren for NS-segmenterne
            Pt3dadd(127,75, -1,55, 0, 0,3)}
         2. I slutningen af filen skal du flytte axonens 3D-koordinat, så dens oprindelige punkt opfylder slutpunktet for NS ved at skrive:
            axon {for i=0,n3d()-1 {pt3dchange(i, x3d(i)+130, y3d(i),z3d(i)-5, diam3d(i))}} //Skift x-koordinaten
         3. I slutningen af filen skal du forkorte de dendritiske rum med 18% ved at skrive:
            forsec basal {L=L*0,82} // Skalering af længden for at gøre dendritisk feltstørrelse mindre
            define_shape() // Udfyldning af manglende 3D-oplysninger
2. Definition af antallet af segmenter for hver sektion
   BEMÆRK: Hver sektion af neuronen kan være rumligt diskretiseret, ligesom processen med at blande sig i FEM-modellen. Den rumlige diskretisering opdeler neuronen virtuelt i mindre segmenter, hvor beregninger skal udføres. For antallet af segmenter 'nseg' skal du sørge for, at ulige tal bruges til at sikre, at der er en intern knude i midtpunktet af en cellesektion, og prøv at tredoble nseg-tallet, indtil beregningen giver et konsistent resultat⁹. Et højere antal segmenter vil give en mere nøjagtig numerisk tilnærmelse, men øger også beregningsbelastningen.
   1. For at eksemplificere diskretiseringsprocessen skal du tilføje følgende linjer i filen rgc.hoc for at opdele neuronale sektioner i de somatiske og aksonale delmængder i flere segmenter:
      Forsec Somatic {NSEG=31}
      forsec axonal {nseg=301}
      Andre sektioner i modellen skal også diskretiseres ved at skrive disse linjer, men ændre delmængdenavnet (efter 'forsec') og antallet af segmenter (efter 'nseg') efter ønske.
3. Indsæt tilpassede ionkanalmekanismer
   1. Skrivning af tilpassede ionkanalmekanismer som .mod-filer: For at anvende ionkanalmekanismerne skal du oprette .mod-filer og indsætte filerne i den biofysiske sektionsdel af .hoc-filen ved at følge trin 3.3.1-3.3.3. .mod-filen indeholder variablerne og differentialligningerne, der skal løses for hver ionkanal.
      BEMÆRK: Korrekte definitioner og implementeringer af ionkanalmekanisme er kritiske i nøjagtige neuronsimuleringer. Når du skriver .mod-filer, skal du kontrollere, om enhederne er korrekte (det medfølgende 'modlunit'-værktøj, der kan køres for at kontrollere enhedens konsistens), og at ligningerne er skrevet korrekt. For at teste, at ionkanalmekanismerne er korrekte, kan strømmen for hver ionkanal under intracellulær eller ekstracellulær stimulering afbildes og sammenlignes med empiriske fund.
      1. Spændingsstyrede ionkanaler
         BEMÆRK: En .mod-fil til oprettelse af en spændingsstyret ionkanal indeholder typisk en AFLED-blok , der har differentialligningen at løse, en BREAKPOINT-blok , der har kommandoerne til at løse differentialligningerne ved hjælp af en valgt numerisk tilnærmelsesmetode, og PROCEDURE-blokke , der beder programmet om at beregne gatingparametrene (f.eks. mt, ht og d i dette eksempel). Denne kode beregner værdierne for den ioniske strøm, der passerer gennem kanalen for hvert tidstrin.
         1. For at eksemplificere processen skal du oprette en spændingsafhængig Ca-kanal, der har førsteordens differentialligninger til at løse for gatingvariablerne.
         2. Åbn en ny fil i teksteditoren, og skriv linjerne i den supplerende materialedefinerende en spændingsafhængig Cat-kanal. Gem denne fil som Cat.mod i samme mappe som .hoc-filen. Denne proces skal gentages for de andre ionkanaler, som modelneuronen indeholder.
      2. Spændings- og koncentrationsafhængige ionkanaler
         1. Kinetikken i nogle ionkanaler, såsom de calciumaktiverede kaliumkanaler i retinale ganglionceller, afhænger af den intracellulære calciumkoncentration udover transmembranspændingen¹⁹. For at modellere denne type mekanisme skal du oprette en fil kaldet KCa.mod og skrive linjerne som vist i Supplerende materialespændings- og koncentrationsafhængige ionkanaler. I denne .mod-fil blev variablen 'cai', som er defineret som den interne koncentration af Ca-ion, beregnet, og derefter bruges denne variabel i ligningen til at beregne iKCa-strømmen.
   2. Kompilering af .mod-filer
      1. Kompiler alle .mod-filer ved at køre neuron computational suite's mknrndll-værktøj fra installationsmappen. Find den mappe, hvor .mod-filerne er indeholdt, og klik på kompiler for at oprette O- og C-filer. Herefter kan mekanismerne indsættes i denne cellemodel.
   3. Anvendelse af .mod-filerne i NEURON-hovedmodelfilen.
      BEMÆRK: Udover at indsætte ionkanalerne blev den maksimale Na-konduktans kun defineret for den 'somatiske' delmængde. Vi kunne individuelt justere den maksimale membrankonduktans for forskellige neuronale segmenter, hvis det var nødvendigt.
      1. For kortheds skyld skal du kombinere alle ionkanalmekanismerne til en enkelt .mod-fil (supplerende materiale-komplet .mod-fil). Indsæt den kombinerede .mod-fil, der indeholder alle ionkanalerne og en passiv lækagekanal, i alle segmenterne i delmængden »somatisk« ved at skrive nedenstående linjer i »biophys«-proceduren i filen rgc.hoc:
         forsec somatisk {indsæt rgcSpike
         Indsæt PAS // Passiv lækagekanal
         gnabar_rgcSpike = 80e-3
         g_pas = 0,008E-3 // Lækagemembranens konduktans}
   4. Indstilling af den aksoplasmatiske resistivitet
      1. Cellerne har aksoplasmisk resistivitet, der kan ændres pr. Rum. For denne model har alle segmenter den samme resistivitet på 110 Ω·cm. Skift den axoplasmatiske resistivitet i filen rgc.hoc:
         forall {Ra = 110}
4. Indsæt ekstracellulære mekanismer og definer pulsbølgeform
   1. Indsættelse af en ekstracellulær mekanisme i cellemodellen
      1. For at cellemodellen kan reagere på ekstracellulær spænding, skal du indsætte en ekstracellulær mekanisme i alle segmenter ved at skrive linjen nederst i filen rgc.hoc:
         forall {indsæt ekstracellulær}
   2. Oprettelse af en bifasisk puls
      BEMÆRK: I denne demonstration fremstilles en konstant strømbifasisk puls, der er brugerjusterbar i pulsbredde, interfasegab og antallet af gentagelser ved at oprette en procedure i en .hoc-fil. For et mere struktureret program skal du bruge filen rgc.hoc som en fil til at oprette cellemodellen, mens stimuleringsprocessen anvendes i en separat .hoc-fil, som vil fylde den cellemodel, som stimuleringen anvendes på.
      1. Opret en ny tekstfil kaldet stimulation.hoc og start koden ved at indlæse cellemodelfilen; lav derefter en bifasisk puls ved at definere en procedure som vist i Supplerende materiale - Oprettelse af en bifasisk puls i neuronsimuleringen.
         BEMÆRK: Dette trin skaber en konstant strøm katodisk-første bifasisk puls, hvor stimulusparametrene skal erklæres af brugeren, når simuleringen køres. I øjeblikket er størrelsen af de anodiske og katodiske impulser ±1 μA, men denne størrelse skal ændres afhængigt af stimuleringsstrømmen leveret af diskelektroden.

4. Kørsel og automatisering af flere simuleringer

1. Kombination af modellerne
   1. Ekstraktion af koordinaterne for knuderne i neuroncellemodellen
      BEMÆRK: Formålet med at kombinere simuleringerne er at erhverve de ekstracellulære potentielle værdier, der svarer til hver knude i cellemodellen. Koordinaterne for de to modeller skal dog afstemmes. I dette eksempel blev midtersegmentet af soma (soma (0,5)) justeret til at ligge på det vandrette midtplan af retinalvævet (svarende til retinal ganglioncellelaget) med somaens centerknude placeret lige over midten af diskelektroden.
      1. Åbn FEM-modellen, og bemærk koordinaten for et referencepunkt (f.eks. Det vandrette midtplan af retinalvævet over midten af diskelektroden), i hvilket tilfælde det er [0, 0, 131,5] μm.
      2. I neuronberegningspakken skal du oprette en fil kaldet calculateCoord.hoc for at udtrække koordinaterne for hvert segments centroid og skifte hvert afsnit, så somaens centersegment har samme koordinat som referencepunktet i FEM-modellen (Supplerende materialeberegning af koordinaten for hver knude).
   2. Gemme koordinatpunkterne i en tekstfil
      1. Kør filen calculateCoord.hoc (enten ved at dobbeltklikke fra File Explorer eller ved at åbne GUI i neuron-beregningspakken; klik derefter på File > load hoc i værktøjslinjen). Gem koordinaterne for de ekstracellulære spændingsværdier, der skal evalueres til en tekstfil med navnet 'koordinater.dat'.
   3. Kørsel af simuleringerne og lagring af spændingsdata i en tekstfil
      BEMÆRK: I dette trin ekstraherede vi de beregnede ekstracellulære værdier fra FEM-modellen, men vi ville kun gemme dataene fra de relevante koordinater, der falder sammen med midten af hvert cellesegment. Følg trin 4.1.6.2, når der kræves et stort antal potentialer for at eksportere.
      1. Åbn vævsmodelfilen i FEM-softwaren; gå til overskriften Resultater i modeltræet, og klik på Eksporter > data > data 1. Sørg for, at datasættet er indstillet til Undersøg 1/Parametriske løsninger 1, og skriv derefter 'V' i kolonnen Udtryk og 'mV' i kolonnen Enhed .
      2. Under Output skal du ændre filnavnet til ekstracellulært .dat og vælge Punkter, der skal evalueres i: Fra fil. Indlæs koordinaterne.dat for feltet Koordinatfil , og klik derefter på Eksporter.
   4. Anvendelse af bifasisk puls på cellemodellen
      BEMÆRK: På dette stadium er de ekstracellulære spændingsværdier for hvert cellesegment på et tidspunkt (hvor strømmen er 1 μA) tilgængelig. Da undersøgelsen har til hensigt at udsætte cellen for en bifasisk puls, skal den ekstracellulære spændingsværdi, der opleves af cellen, ændre sig med tiden ved hjælp af 'vector.play'-metoden.
      1. Tilføj linjerne vist i den supplerende materiale-anvendelse af bifasisk puls i stimuleringen.hoc.
   5. Kørsel af den kombinerede simulering
      BEMÆRK: Der skal defineres et tidsinterval 'dt' for de numeriske tilnærmelser for at køre simuleringerne. I lighed med nseg kan en kortere dt øge beregningsnøjagtigheden, men øger også beregningsomkostningerne.
      1. Tilføj linjerne vist i den supplerende materiale-udførelse af neuronsimuleringen til slutningen af stimuleringen.hoc. Dobbeltklik derefter på filen stimulation.hoc for at indlæse scriptet og køre simuleringen automatisk. Transmembranpotentialet i det interessante segment kan vises i GUI'en i neuronberegningspakken (trin 4.2.1) eller gemmes i en tekstfil, der skal læses i andre programmer (trin 4.1.6.1.2). Følg trin 4.1.6.1 og 4.1.6.2, hvis gentagne beregninger og et stort antal membranpotentialer skal eksporteres.
   6. Ekstra: Automatisering af simuleringer
      BEMÆRK: For at finde en tærskelamplitude skal du sløjfe simuleringen flere gange med en anden strømamplitude hver gang. En anden automatisering kan være nødvendig for at finde tærsklen for neuroner placeret i forskellige positioner i forhold til den stimulerende elektrode. Et automatiseringstrin kan udføres i neuronberegningspakken ved hjælp af en procedure såvel som i FEM-softwaren ved hjælp af et script kaldet en 'metode'.
      1. Automatisering af neuronsimulering for at finde en tærskelamplitude
         BEMÆRK: En batch af neuronsimuleringer kan udføres automatisk. Følgende trin implementeres i neuronsimuleringsprogrammet for at finde tærskelamplituderne af neuroner under forskellige stimuleringsparametre.
         1. Opret en procedure til at gentage simulering i neuronsimuleringsprogrammet: I stimulation.hoc skal du oprette en vektor, der indeholder en række aktuelle amplitude til test. Opret derefter en procedure til at anvende den aktuelle amplitude og registrere enhver tilstedeværelse af en spids (en positiv ændring fra en negativ til en positiv transmembranspænding), og tærskelamplituden defineres som den laveste strømamplitude, der får en spids til at forekomme. For at gøre dette skal du definere en procedure kaldet findTh () (Supplementary Material-Looping over en række aktuelle amplituder) i slutningen af stimulation.hoc-filen
         2. Gemme svaret ved tærsklen til en tekstfil: Føj følgende linjer til findTh()-proceduren i stimulation.hoc for at gemme de beregnede transmembranspændingsværdier for alle neuronrum fra hvert tidstrin i en tekstfil:
            sprint(saveFileName, "Response_%d.dat", th) // Gem tærskelværdien
            saveFile.wopen(saveFileName)
            for i=0,(responseVector.size()-1){
            saveFile.printf("%g, ", responseVector.x[i])
            if(i==responseVector.size()-1) {saveFile.printf("%g\n", responseVector.x[i])
            saveFile.close(saveFileName)
            }}
      2. Automatisering i FEM-softwaren for at finde spændingsværdierne for neuroner forskellige steder
         BEMÆRK: En anden automatisering, der kan udføres, er den automatiske erhvervelse af ekstracellulære spændingsværdier for neuroner på forskellige steder. Application Builder-menuen i FEM-softwaren giver mulighed for at definere en 'metode' eller et script til at automatisere de trin, der er nødvendige for, at softwaren kan udføre beregninger. For at demonstrere forskydes cellens placering i x-retningen med 5 gange i et 100 μm trin (supplerende figur 6).
         1. Skrivning af en kode til automatisering af FEM-simuleringer.
            1. Gå til Application Builder, højreklik på Metoder i Application Builder-træet, vælg Ny metode, og klik på OK. Gå til Fil> Indstillinger > metoder, marker afkrydsningsfeltet Vis alle koder, og klik på OK.
            2. Skriv et .hoc-script, der indlæser koordinatfilen, flytter værdierne, så de passer til den ønskede placering, og gemmer en tekstfil, der indeholder spændingsværdierne for cellens nye placering, ved at skrive de koder, der vises i Supplementary Material-Defining a method to automate FEM-simuleringer.
         2. Kørsel af de automatiserede trin i FEM-softwaren: Skift til Model Builder, Developer > Run Method > Method 1. Dette vil producere .dat filer med de relevante spændingsværdier, navngivet extracellular_1.dat, extracellular_2.dat osv.
      3. Looping simuleringerne i et programmeringssprog til generelle formål
         BEMÆRK: For at sløjfe simuleringerne skal den relevante tekstfil indlæses i neuronberegningspakkens simulering hver gang, og et programmeringssprog²⁰ , der nemt kan indlæse og manipulere tekstfiler, er praktisk at udføre dette trin. Ethvert praktisk integreret udviklingsmiljø (IDE)²¹ kan bruges til dette trin.
         1. Åbn den valgte IDE, klik på Ny fil for at oprette et nyt script. Her bruges en .py-fil i dette eksempel. Skriv de linjer, der er vist i Supplerende materiale - Kørsel af simuleringerne i et programmeringssprog til generelle formål.
         2. Til sidst skal du klikke på Kør eller trykke på F5 for at køre scriptet, som også åbner GUI (supplerende figur 7).
2. Visning af simuleringsdata
   BEMÆRK: Ved at følge alle ovenstående trin skal simuleringsresultaterne gemmes i tekstfiler, der indeholder tærskelværdien og transmembranpotentialet ved tærsklen. Brugeren har dog mulighed for at vise simuleringsresultatet, mens simuleringen kører ved hjælp af NEURON's GUI.
   1. Graf neuronmodellens respons på den ekstracellulære stimulering i neuronberegningspakkens GUI. For at gøre dette skal du køre stimulation.hoc, klikke på Graf > spændingsakse fra værktøjslinjen og højreklikke et vilkårligt sted i grafvinduet og vælge Plot hvad.
   2. Indtast 'axon.v(1)' i feltet Variabel til graf , hvilket betyder, at det vil plotte transmembranpotentialet for det sidste segment af axonen pr. tidstrin.

Figur 7: Visning og eksport af FEM-beregningsresultaterne til en tekstfil. Vinduet Grafik, der viser et multislice-plot af det elektriske potentiale i V. Indstillingerne i indstillingen Dataeksport gjorde det muligt at eksportere den beregnede variabel til en tekstfil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Visning af grafen over transmembranpotentialet ved hjælp af en spændingsgraf. Neurontransmembranpotentialet blev vist i GUI'en i neuronberegningspakken. X-aksen er tid i ms, mens y-aksen er transmembranpotentialet for det valgte neuronsegment i mV. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Vi gennemførte to simuleringsprotokoller for at demonstrere brugen af modellen. Den første protokol involverede at variere elektrodestørrelsen, samtidig med at neuronens placering og de elektriske pulsparametre blev holdt den samme. Den anden protokol involverede at skifte neuronen i x-retningen i 100 μm trin, mens elektrodens størrelse forblev konstant. For begge protokoller var den anvendte puls en enkelt katodisk-første bifasisk puls på 0,25 ms bredde med et mellemrum på 0,05 ms. For den første protokol blev elektrodens radius varieret til at være 50, 150, 350 og 500 μm, mens elektrodens radius for den anden protokol blev holdt på en konstant 50 μm.

Den her beskrevne model viste, at forøgelse af den suprachoroidale elektrodestørrelse ved 0,25 ms pulsbredde øgede aktiveringstærsklen for modelneuronen (figur 9A). Dette resultat afspejlede in vivo-resultaterne fra Liang et ^al.12, der viste, at den kortikale aktiveringstærskel stiger med den stigende elektrodestørrelse ved denne pulsbredde.

Størrelsen af modellens aktiveringstærskler adskiller sig fra de empiriske fund på grund af flere faktorer. For det første involverer denne model kun en enkelt RGC af en bestemt type, som muligvis ikke er til stede i den gruppe celler, der aktiveres i in vivo-undersøgelsen . Dernæst omfattede denne model ikke et retinalt netværk, hvilket kan lette aktiveringen af RGC'er gennem excitatoriske input fra de bipolære celler. En anden mulig årsag til uoverensstemmelsen er elektrode-nethinden-afstanden. Det er muligt, at elektrode-nethindeafstanden i in vivo-undersøgelsen var lavere end i denne model på grund af anatomisk variabilitet eller operationen. Derfor overvurderede vi elektrode-nethindeafstanden og dermed aktiveringstærsklen. Det er også vigtigt at bemærke, at selvom dette ikke blev demonstreret i vores resultater, ville modellering af en enkeltcelletærskel ofte undervurdere in vivo kortikale tærskel. Dette skyldes de tekniske begrænsninger i kortikale målinger (primært relateret til signal-støj-forholdet), at den kortikale aktivitet typisk først detekteres, efter at flere nethindeganglionceller er blevet aktiveret. Som følge heraf kan der forventes en uoverensstemmelse i størrelsen af nethinde- og kortikale aktiveringstærskler. På trods af disse forskelle viste denne model med succes den stigende tendens til aktiveringstærsklen på grund af stigningen i elektrodestørrelsen. Dette skyldtes fraværet af et område med højt elektrisk felt sammenlignet med dets omgivelser, når elektrodestørrelsen øges, hvilket ikke favoriserede neural aktivering²².

Dernæst observerede vi handlingspotentialeegenskaberne for at validere den model, der er beskrevet her. Latensen eller tiden mellem stimulusstarten og toppen af handlingspotentialespidsen varierede fra 1-2,2 ms (figur 9B). Dette svarede til den korte latenstid, der steg på grund af ikke-netværksmedieret nethindeaktivering²³. Spidsbredden på denne model var 1 ms, og dette er i samme område som spidsbredderne for kanin-RGC'er målt in vitro²⁴.

I den anden stimuleringsprotokol blev kun neuronens placering i x-aksen (langs axonens længde) i forhold til elektroden varieret. På en afstand 0 var centroiden af soma-sektionen umiddelbart over midten af diskelektroden. Negativ afstand betyder, at diskelektroden var placeret tættere på den aksonale side, mens positiv afstand betyder, at diskelektroden var placeret tættere på den dendritiske side. Modellen viste, at den laveste tærskel blev opnået, når det smalle segment af axonen var umiddelbart over skiveelektroden, og den steg, da x-afstanden blev større (figur 9C). Flytning af elektroden længere mod den distale axon frembragte en lavere tærskel sammenlignet med at flytte elektroden mod dendritterne på grund af tilstedeværelsen af axonens indledende segment og det smalle segment, hvor natriumkanalerne er mere udbredte. Dette resultat stemte overens med in vitro-fundet fra Jensen et ^al.13, hvor kanin-RGC'er blev stimuleret med en ultrafin mikroelektrode, og aktiveringstærsklen var den højeste, når elektroden blev flyttet tættere på dendritterne.

Figur 9: Resultaterne af modelleringsmetoden . (A) Aktiveringstærsklerne for en retinal ganglioncelle placeret over diskelektroden. Elektroderadiusen blev varieret (50, 150, 350 og 500 μm), og tærsklen steg med stigende elektrodestørrelse. (B) Neuronmodellens handlingspotentialeform ved 0,25 ms pulsbredde. Handlingspotentialerne ved tærskel for forskellige elektrodestørrelser har den samme spidsbredde på 1 ms, men latenstiden steg med stigende elektrodestørrelse. Stimulusstarttiden var 1 ms, og den katodiske fase forårsagede en depolarisering ved membranen, men ikke nok til at forårsage et handlingspotentiale. (C) Neuronen blev forskudt langs x-aksen, og aktiveringstærsklerne viste, at den laveste tærskel blev opnået af neuronen, hvis soma var placeret lige over elektrodens centrum. Elektrodens radius var 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Initialisering af den endelige elementmodel. Typerne af undersøgelse og fysik bestemmer listen over ligninger løst i modellen. Disse blev indstillet under den første oprettelse af FEM-modelfilen, men kan også ændres/tilføjes, efter at modellen er oprettet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Ændring af længdeenheden. Længdeenheden og vinkelenheden bestemmer de enheder, der anvendes i geometridefinitionsprocessen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Indsættelse af en materiel egenskab. Materialeegenskaberne blev defineret for hvert domæne i en 3D-model. De tilgængelige materialeegenskaber blev angivet i vinduet Materialeegenskaber i vinduet Materialeindstilling. Til beregning af elektrisk potentiale blev kun egenskaben Elektrisk ledningsevne defineret. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Oprettelse af en parametrisk undersøgelse for at sløjfe over en liste over parameterværdier. En parametrisk undersøgelse gjorde det muligt for FEM-softwaren automatisk at gentage beregningerne og ændre elektroderadiusværdien for hver gentagelse. Beregningsresultaterne blev gemt for hver gentagelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Import af neuronmorfologien fra SWC-filen. Neuron computational suite var i stand til at læse SWC-fil erhvervet fra neuronal sporing. Den importerede fil indeholder oplysninger om morfologi og topologi for hvert neuronsegment. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Automatisering af FEM-operationer ved at definere en metode. En metode blev defineret ved at skrive et script til at automatisere processer i FEM-softwaren, der ikke kan gøres ved at definere en parametrisk undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: Integrering af modellerne og automatisering af simuleringerne ved hjælp af et programmeringssprog til generelle formål. Det generelle programmeringssprog blev brugt til at sløjfe neuronsimuleringerne, mens det ekstracellulære spændingsfil, der blev brugt som input, og den neurale responsspændingsfil blev ændret som output for hvert trin i løkken. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende materiale: Kommandolinjer til (1) Definition af en spændingsafhængig kattekanal. (2) Spændings- og koncentrationsafhængige ionkanaler. (3) Udfyld .mod-fil. (4) Oprettelse af en bifasisk puls i neuronsimuleringen. (5) Beregning af koordinaten for hver knude. (6) Anvendelse af bifasisk puls. (7) Udførelse af neuronsimuleringen. (8) Looping over en række aktuelle amplituder. (9) Fastlæggelse af en metode til automatisering af femme-simuleringer. (10) Simuleringerne køres på et programmeringssprog til generelle formål. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I dette papir har vi demonstreret en modelleringsarbejdsgang, der kombinerede endeligt element og biofysisk neuronmodellering. Modellen er meget fleksibel, da den kan ændres i sin kompleksitet, så den passer til forskellige formål, og den giver en måde at validere resultaterne mod empiriske fund. Vi demonstrerede også, hvordan vi parameteriserede modellen for at muliggøre automatisering.

To-trins modelleringsmetoden kombinerer fordelene ved at bruge FEM og neuron computational suite til at løse neuronens kabelligning i nærværelse af en ekstracellulær stimulering. En FEM er nyttig til nøjagtig beregning af det ekstracellulære felt på tværs af volumenlederen, hvilket ofte er upraktisk at løse analytisk i tilfælde af kompleks geometri eller inhomogenitet af ledningsevne. Beregningsomkostningerne ved denne model er også relativt lave, da en statisk tilstand antages.

Mens den beskrevne modelleringsmetode er fordelagtig i sin brugervenlighed og fleksibilitet, er der begrænsninger for denne modelleringsarbejdsgang. For det første tillod denne metode ikke tilstedeværelsen af en neural membran ved beregning af det elektriske felt. Joucla et ^al.25 sammenlignede totrinsmetoden med hele FEM-metoden, hvor den neurale geometri og membranegenskaber indgik i FEM-modellen. De viste, at inkludering af neuronen i den elektriske feltberegning ville ændre beregningen af transmembranpotentialet, når en større cellestruktur, såsom et cellelegeme, blev inkluderet i geometrien. Specifikt betyder forenklingen af neurongeometrien i totrinsmetoden, at transmembranpotentialet for ethvert punkt i et rum er repræsenteret af transmembranpotentialet ved knuden eller midtpunktet i rummet. I modsætning hertil omfattede hele FEM-modellen foreslået af Joucla en eksplicit repræsentation af neuronens 3D-geometri, hvilket muliggjorde den individuelle evaluering af transmembranpotentiale på ethvert punkt inde i rummet. Således kan hele FEM-modellen være mere egnet, hvis den nøjagtige form og placering af transmembranpotentialet er nødvendig. Denne metode er imidlertid beregningsmæssigt dyrere end totrinsmetoden.

Den anden begrænsning af modelleringsmetoden vedrører tilgængeligheden af morfologi og ionkinetikdata. Den model, der blev brugt her, var baseret på tigersalamanderdata, som er blevet brugt til at modellere RGC'er fra andre arter, men der kan have været forskelle i de tilstedeværende typer ionkanaler, der ikke er blevet belyst. Derfor kan det i nogle tilfælde være nødvendigt at udføre in vitro-værker for at justere ionkanalparametrene.

For det tredje kan omkostningerne ved FEM-softwaren være en begrænsning. I dette tilfælde kan et open source FEM-program²⁶ , der har en indbygget Poisson-ligningsløser, være et alternativ. Bortset fra den anvendte FEM-software er den software, der bruges i denne arbejdsgang, gratis. Mens den anvendte FEM-software tilbyder en intuitiv GUI og en klar til brug elektrisk strømmodellering, er det muligt at udføre de ekstracellulære værdiberegninger i en programmeringssoftware til generelle formål. Dette ville imidlertid kræve manuel definition af de fysiske ligninger og de numeriske metoder til løsning af ligningerne²⁷. Desuden kan denne metode være kedelig, når der skal anvendes en kompleks vævs- eller elektrodearraygeometri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer workstation	N/A	N/A	Windows 64-bit operating system, at least 4GB of RAM, at least 3 GB of disk space
Anaconda Python	Anaconda Inc.	Version 3.9	The open source Individual Edition containing Python 3.9 and preinstalled packages to perform data manipulation, as well as Spyder Integrated Development Environment. It could be used to control the simulation, as well as to display and analyse the simulation data.
COMSOL Multiphysics	COMSOL	Version 5.6	The simulation suite to perform finite element modelling. The licence for the AC/DC module should be purchased. The Application Builder capability should be included in the licence to follow the automation tutorial.
NEURON	NEURON	Version 8.0	A freely-distributed software to perform the computation of neuronal cells and/or neural networks.