Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Summary

In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

Abstract

Risposte olfattivo nelle larve di Drosophila sono stati tradizionalmente studiati in piastre di Petri composto da una singola fonte odore periferici. In questo paradigma comportamentale, lo sperimentatore si assume di solito che la rapida diffusione di molecole aromatiche dalla sorgente porta alla creazione di un gradiente stabile nel piatto. Per stabilire una correlazione quantitativa tra gli input sensoriali e risposte comportamentali, è necessario ottenere una caratterizzazione più approfondita delle condizioni di stimolo della odorizzante. In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

Protocol

1. Attrezzature e reagenti

Odore diluizioni:

• Olio di paraffina (Sigma, numero CAS: 8012-95-1)
• Gli odori della massima purezza disponibile che suscita attrazione larve Drosophila ^1. In questo articolo video, gli animali sono stati testati con acetato di isoamile (Sigma, numero CAS: 123-92-2).
• Fiale di vetro 1,5 ml con tappo in teflon (Agilent Technologies)
• Digital scala di misurazione per la diluizione precisa in peso

Saggio arena set-up:

• Agarosio (Promega)
• Coperchi di micropiastre a 96 pozzetti (BD Falcon, numero di catalogo: 353071). La nostra arena comportamentale consiste di tre coperchi impilati.
• Monocanale 1-20 pipetter microlitri o multi-canale pipetter per caricare goccia odorizzante (s) nel coperchio superiore dello stack. Per impostare il test multiplo fonte, usiamo 5-50 microlitri Pipettare-Lite multicanale pipetter da Rainin.

Preparazione di larve di Drosophila per i test comportamentali:

• 15% (w / w) soluzione di saccarosio
• Regolare piastre di Petri (BD Falcon) per lavare e conservare le larve
• Pennello (4-5mm lunghezza setola) per manipolare e trasferire le larve

Registrazione del movimento larvale:

• Piccoli perni a testa piana per il trasferimento di larve in arena
• Forcipe o pennello per eliminare le larve dopo la registrazione
• Palco illuminato con un riscaldamento omogeneo non fonte di luce, "Slim Edge" Pad Luce prodotto da Logan elettrico
• Gabinetto per circondare l'arena comportamentali e controllare le condizioni di luce
• Video sistema di tracciamento per la registrazione dei movimenti degli animali. Stiamo usando il software Ethovision (Noldus, Paesi Bassi).
• Telecamera CCD e scheda video frame grabber (Piccolo EureCard Basic) acquistati con Ethovision software
• Termometro e umidità registratore di monitorare le condizioni atmosferiche durante le prove comportamentali (opzionale)
• Matlab (The Mathworks) per l'analisi dei dati personalizzati (opzionale)

2. Arena di comportamento

L'arena comportamentale consiste di tre impilati da 96 pozzetti coperchio piatto. Il coperchio inferiore è utilizzata per isolare il resto del sistema dal cuscinetto luce e ridurre convezione nell'arena. Il coperchio secondo, coperto con 25 ml di un 3% gel, funge da palcoscenico per le larve di camminare. Il coperchio superiore è l'odore goccioline che rimangono sospese dalla tensione superficiale.

Gocce odore sono pipettati direttamente nei pozzetti del coperchio piatto da 96 pozzetti. Un odore fonti singole o multiple possono essere usate per generare gradienti con distinte, profili verificabili ^2. Per verificare anosmia e difetti chemiotassi nelle larve, si propone di utilizzare i seguenti due saggi.

2.1. Un'unica fonte saggio odore: un odore goccia sola di cui nel pozzo # E7 (standard 96-well sistema di riferimento piastra).

• Stimolo: 10μl di odore diluito in olio di paraffina
• Condizioni iniziali: una larva unica venga introdotta con la sorgente di odore (o nei paesi limitrofi chiusura).
• Osservazioni fondamentali: per gli stimoli interessanti (ad esempio acetato di isoamile), larve di tipo selvatico si accumulano sotto la fonte. Anosmia animali o di animali sottoposti a difetti olfattivi rapidamente vagare lontano dalla goccia.
• Durata del processo: 3 min. Il moto di un determinato animale viene registrato fino a quando il cronometro è trascorso o non appena i contatti animale alla parete della piastra.
• Possibili metriche per la quantificazione del comportamento: percentuale di tempo impiegato da un animale in una piccola zona circolare centrata sulla sorgente odore; distanza media alla fonte di odore; durata di distanza dalla fonte di odore, ecc

Questo test test in modo efficiente per anosmia di base nelle larve mutanti. Può anche essere utilizzato per determinare la soglia di rilevazione affidabile per gli odori particolari ^2.

2.2. Multiple odore saggio fonte

Gocce odore diverse sono stabilite nel pozzo del coperchio superiore. Nel video presente articolo, abbiamo istituito gradienti lungo la fila centrale E. Un totale di sei gocce sono stati introdotti in pozzi # E2, E4 #, # E6, E8 #, # # E10 e E12 (standard 96-well sistema di riferimento piastra ). In contrasto con la piastra di Petri e singoli saggi fonte dell'odore, il più saggio fonte degli odori permette il controllo qualitativo della geometria gradiente stabilito per tutta la lunghezza e la larghezza del campo. Questo test è stato utilizzato per caratterizzare i meccanismi sensoriali permettendo larve di Drosophila per chemiotassi ^2.

• Stimolo: gocce odore 10μl sono stabilite in alternata pozzi lungo una fila. Questo accordo porta alla creazione di un gradiente centrato riga selezionata. Per stabilire una pendenza omogenea lungo la larghezza del campo, diverse file possono essere caricati con più fonti.
• Condizioni iniziali: una larva unica venga introdotta con la sorgente di odore tra pozzi e # # E3E4.
• Fenotipi di base: le larve di anosmia vagare a caso dal punto di partenza. Per stimoli interessanti (ad esempio acetato di isoamile), animali che sono in grado di odore navigare lungo la direzione della concentrazione di odore in aumento. L'accuratezza con cui un animale sale il sentiero odore è correlato con la sua capacità di percepire ed elaborare lo stimolo olfattivo. Percorsi tortuosi sono spesso causati da difetti sensoriali. Una volta che un animale ha raggiunto il punto di massima concentrazione nello studio, rimane in prossimità di questa posizione.
• Durata del processo: un massimo di 3 minuti (durata più a lungo inseguimento tende a introdurre rumore come larve di perdere interesse e, infine, abbandonare il gradiente). Per i gradienti illustrato in questo articolo video, il movimento di un individuo è stata registrata larva finché l'animale ha raggiunto il quartiere della sorgente più alta concentrazione (ben # E12). La registrazione è stata interrotta non appena l'animale ha raggiunto la zona di destinazione o contattato qualsiasi muro dell'arena.
• Possibili metriche per la quantificazione del comportamento: percentuale di tempo impiegato da un animale sotto la linea di odorizzante (rettangolo blu); significa voce rispetto alla direzione locale del gradiente odore; un punteggio combinato chemiotassi misura la tendenza globale di un animale di seguire la odorizzante linea ^2.

3. Gradiente profilo di verifica

Prima di verificare le larve in un gradiente particolare, è importante per determinare la sua stabilità nel tempo. Su questa base, lo sperimentatore può determinare una durata sufficiente per ogni prova e il numero di larve che possono essere tracciati in sequenza nella stessa arena. Per testare la stabilità del gradiente, abbiamo sviluppato un metodo basato sulla spettroscopia IR ^2. Questo metodo va oltre gli scopi di questo protocollo e non sarà ulteriormente elaborato.

4. Protocollo per la preparazione di un esperimento

4.1. Preparazione della piastra di agarosio e diluizioni odore:

1. 1. Versare 25 ml di agarosio 3% sulla cima piatta di un coperchio piatto a 96 pozzetti, permettono l'agarosio si raffreddi e solidifichi (~ 30 min).
   
   Importante: verificare che i coperchi a 96 pozzetti sono su una superficie piana prima di versare il agarosio come la presenza di un pendio sulla solidificato gel possono influenzare il comportamento delle larve. Quando si versa il gel, rimuovere tutte le bolle che si formano sulla superficie.
   
   
2. 2. Diluire gli odori a concentrazioni desiderate in olio di paraffina con una bilancia digitale per misurare con precisione le quantità di olio di paraffina e l'odore di ogni diluizione.

Note: Quando le concentrazioni di odore basse sono utilizzate, è preferibile preparare una serie di concentrazioni source basata su diluizioni seriali. Iniziare, per esempio, con una soluzione 1.0M e di eseguire una diluizione 1:2 per ottenere una soluzione 0,5 M. Procedendo ricorrentemente, si ottiene una serie di diluizioni in seguito alla progressione geometrica 1.0M, 0.5M, 0.25M, 0.12M, 0,06, 0.03M, 0.015M.

Importante: Dal momento che molti odori organici reagiscono con la plastica, l'odore diluizioni devono essere conservati in flaconi di vetro con tappi in teflon. Idealmente, gli odori deve essere preparato fresco prima di ogni esperimento per ridurre le fluttuazioni della concentrazione di odore reale attraverso esperimenti. Ciò è particolarmente vero quando si utilizzano sostanze chimiche altamente volatili.

4.2. Larve di preparazione:

1. 1. Preparare la soluzione di saccarosio al 15% in acqua distillata.
   
   Note: Una soluzione di saccarosio al 15% è più densa larve e causerà loro di essere sostenuto alla superficie della soluzione. Tuttavia, non disciolte volare pezzi di cibo hanno una densità maggiore rispetto alla soluzione e rapidamente si depositano sul fondo. Quindi, usando questa soluzione di saccarosio costituisce un modo efficace per separare le larve dal cibo. Soluzione di saccarosio è un mezzo eccellente per i contaminanti biologici, se la soluzione diventa torbida può essere sterilizzato filtro per rimuovere la contaminazione.
   
   
2. Ottenere una fiala con 6 giorni di età le larve o larve nella fase di sviluppo desiderato.
   
   Note: Tutti i nostri esperimenti siano condotti con 6 giorni di larve di età (metà del terzo stadio instar di sviluppo); larve in questa fase di sviluppo sono abbastanza grandi per facilitare la rilevazione con il nostro software di monitoraggio, ma anche molto attiva.
   
   
3. Versare saccarosio nel flaconcino alimenti contenenti le larve.
4. Con una spatola, rompere e sciogliere il cibo volare delicatamente per liberare le larve. Larve rilasciato galleggia in superficie.
5. Attendere alcuni minuti per i pezzi di cibo volare a depositarsi sul fondo della fiala, poi, versare il saccarosio e larve in una capsula di Petri. Se la pre-selezione delle larve è necessario, gli animali possono essere raccolte versando il saccarosio attraverso un filtro. Larve possono poi essere trasferiti in un piatto per la selezione con un pennello.
6. Lasciare le larve per circa 30 minuti nel sucrose soluzione prima di procedere con test comportamentali per consentire agli animali di abituarsi alla soluzione di saccarosio. Le larve non sembrano nutrirsi di saccarosio, gli animali sperimentare uno stato di fame, che migliora le prestazioni chemiotassi.
7. Il coperchio della scatola di Petri possono essere riempiti con acqua (o saccarosio) e utilizzato come un ricettacolo per gli animali scartati dopo test comportamentali.

5. Protocollo di effettuare registrazioni di comportamento

5.1. Set-up Arena:

1. 1. Applicare gocce odore alla parte inferiore (lato riempirono) di un nuovo coperchio piatto da 96 pozzetti.
   
   Importante: per evitare la contaminazione da odori diversi e le concentrazioni di odore, un coperchio fresco deve essere utilizzato per ogni carico di set-up. Nessuno dei coperchi contenenti fonti odori vengono riciclati dopo l'esperimento. A seconda del campo di concentrazione di odore utilizzati, gradienti odoranti sono stati trovati ad essere stabile solo per 10 a 20 minuti in un sistema chiuso. E 'quindi importante ridurre al minimo il tempo tra gradiente di set-up e l'inizio effettivo del test comportamentali.
   
   
2. Capovolgere il coperchio e lo stack sopra un coperchio rivestito con il secondo strato di agarosio 3%.
   
   Importante: Invertire il coperchio con cura per evitare la diffusione di goccioline di odore di pozzi adiacenti.
   
   
3. Su inversione del coperchio superiore sulla superficie agarosio, permettono l'odore di diffondere per 30 secondi prima di introdurre la larva.

5.2. Larve di carico:

1. Sollevare il coperchio superiore che contiene le goccioline odorizzante quel tanto che basta per consentire il caricamento della larva.
2. Trasferire una larva dalla soluzione di saccarosio per lo strato di agarosio. La posizione di partenza degli animali dipende dal dosaggio utilizzato:
   
   Per il singolo test fonte degli odori, le larve sono rilasciati sotto la goccia odorizzante.
   
   Per il saggio più fonte di cattivi odori, le larve vengono rilasciate tra pozzi # # E3 ed E4.
   
   Importante: Orientare gli animali di recente introduzione in modo coerente. Noi orientare i nostri animali nella direzione del gradiente, assicurando che il corpo animale e la testa faccia la più alta concentrazione. Gli animali introdotti in un orientamento opposto a quello del gradiente di avviare una ricerca condotta. A nostro avviso, questo periodo di ricerca iniziale rappresenta una fonte di rumore inutile. Controllare l'orientamento della testa riduce il numero di animali che contattare il muro arena durante il loro comportamento esplorativo. Questa pratica non adescare la direzione di movimento degli animali o di aumentare notevolmente il numero di animali anosmia chemotaxing lungo la linea di odorizzante per caso (cioè falsi positivi nei test odore).
   
   
3. Sostituire il coperchio superiore e avviare la registrazione prontamente.
   
   Note: larve sane iniziare la scansione immediatamente dopo la loro introduzione in campo e può coprire una distanza di 1 cm entro i primi 10 secondi. Se lo sperimentatore è lento ad avviare la registrazione, datapoint iniziale sarà perso. Per questo motivo si consiglia lo sperimentatore si conoscono bene i comandi del software per avviare la registrazione prima di tentare di eseguire un esperimento.
   
   
4. Lasciare che la larva di comportarsi per tutta la durata della registrazione (di solito 3 minuti).
   
   Note: Le registrazioni sono terminati prima della fine del min 3 se la larva colpisce il muro arena o raggiunge un area di destinazione (come nel test di gradiente).
   
5. Al termine della registrazione, prontamente sollevare il coperchio e rimuovere la larva con una pinza o un pennello. Posizionare gli animali monitorati in acqua coperchio Petri contenenti (o saccarosio).
   
   Importante: gli animali registrate non vengono riutilizzati. Il piatto l'acqua è solo un ricettacolo conveniente per separare gli animali registrati e non-registrato durante l'esecuzione degli esperimenti.
   
6. Se il rilevamento degli animali più in un'arena di set-up, prontamente caricare la larva successivo e avviare la registrazione come indicato sopra.
   
   Importante: Il numero di prove effettuate in campo lo stesso set-up dovrebbe essere decisa sulla base della stabilità gradiente che dovrebbe essere verificata prima di eseguire qualsiasi esperimento comportamentale ^2.
   
7. Una volta che tutte le larve da provare a l'arena di set-up sono stati rintracciati e rimosso dal campo, scarta il coperchio superiore e lo strato di agarosio. Il coperchio intermedio (cioè il coperchio agarosio) può essere riciclato.
   
   Nota: Si consiglia agli utenti di scegliere Ethovision metodo di rilevazione del 'background sottrazione'.

6. Esperimenti di esempio illustrato in questo articolo il video

6.1. Un'unica fonte test odore con 1.0M di acetato di isoamile.

Abbiamo testato dieci ciecamente Or83b-/ - mutanti e dieci wild-type (W1118) larve a ciascuno dei quali un numero era stato assegnato. L'esperimento di tracciamentoer non ha ricevuto alcuna informazione circa il genotipo di ciascun animale. Dopo ogni registrazione, un fenotipo predittivo è stato assegnato a ciascun animale testata: smellers, se l'accumulo è stato osservato con la sorgente di tutto il processo, non smellers, se il percorso rapidamente lasciato il quartiere della fonte dell'odore. Dopo aver registrato il comportamento di 20 animali, i percorsi sono stati raggruppati in base al fenotipo. Il risultato di questo raggruppamento è stato poi confrontato con il genotipo reale delle larve: tutte le assegnazioni fatte si sono rivelate corrette.

6.2. Molteplici sorgenti test odore con gradienti esponenziale e lineare di acetato di isoamile.

In questo esperimento, abbiamo confrontato le prestazioni delle larve di tipo selvatico chemotaxing lungo un lineare e un gradiente esponenziale. Chemiotattica comportamenti sono stati registrati per i due gradienti istituita con la più alta concentrazione di 0,5 M stesso. Come spiegato nell'articolo, le fonti odore del gradiente esponenziale oscillato tra 0,015 e 0,5 M. Le fonti della sfumatura lineare compresa tra 0,25 e 0,5 M (progressione aritmetica con la differenza comune 0,05 m).

Il gradiente lineare rappresentato un ambiente chemiotassi più impegnativo come la differenza nella concentrazione locale è stato costante e relativamente piccolo, e l'intervallo di concentrazione stretto (0.25M). Al contrario, l'intervallo di concentrazione del gradiente esponenziale era più grande con l'aumentare della concentrazione di differenze locali lungo il percorso.

Quindici le larve sono stati registrati per ciascuna delle due geometrie gradiente ei percorsi sovrapposti in un unico grafico. Una ispezione visiva dei due grafici mostra che le larve di tipo selvatico sono stati in grado di ascendere affidabile il gradiente per entrambe le geometrie, ma che la quantità di meandri è stata maggiore per la condizione sfumatura lineare. Ciò suggerisce che il segnale presente su tutta la lunghezza del gradiente è più affidabile rilevato per una forma esponenziale rispetto ad un lineare.

6.3. Molteplici sorgenti test odore con pendenza acetato di isoamile in una geometria "tetto".

Qui si verifica che le larve introdotto in un gradiente di odori sono sensibili ai cambiamenti locali concentrazione di odore piuttosto che solo la presenza o l'assenza di odore. Un gradiente isoamilico è stato istituito con l'applicazione di gocce odore con le seguenti concentrazioni: 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M. La geometria gradiente conseguente somigliava asimmetrico "tetto" picco di 0,5 M.

Le larve sono stati rilasciati tra le gocce di profumo e 0,06 0.12M. La nostra ipotesi era che se le larve fossero semplicemente calcolando la presenza di cattivi odori che avrebbero seguito l'intera sfumatura senza una particolare predilezione per la massima concentrazione. Al contrario, se le larve sono sensibili ai cambiamenti locali di concentrazione che avrebbero accumulano sotto la goccia 0.5M. Quindici le larve sono state registrate, e si è constatato che dopo un breve periodo esplorativo tutte le larve accumulato sotto la maggiore concentrazione bene. Ciò suggerisce che le variazioni locali di concentrazione degli odori vengono calcolati e informare il comportamento chemiotattica delle larve di Drosophila.