Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Summary

В этом видео статье мы описываем новый метод, позволяющий строительство одоранта градиенты со стабильной и контролируемой геометрией. Мы кратко проиллюстрировать, как эти градиенты могут быть использованы для выявления дефектов обонятельные (полная и частичная потеря обоняния) и изучить более тонкие особенности поведения хемотаксис.

Abstract

Обонятельные ответы у личинок дрозофилы были традиционно изучается в чашки Петри, включающий одно периферийное источник запаха. В этой поведенческой парадигмы, экспериментатор обычно предполагается, что быстрое распространение пахучих молекул из источника приводит к созданию стабильного градиента в блюдо. Чтобы установить количественное соотношение между сенсорными входами и поведенческие реакции, это необходимо для достижения более тщательной характеристике условий одоранта стимул. В этом видео статье мы описываем новый метод, позволяющий строительство одоранта градиенты со стабильной и контролируемой геометрией. Мы кратко проиллюстрировать, как эти градиенты могут быть использованы для выявления дефектов обонятельные (полная и частичная потеря обоняния) и изучить более тонкие особенности поведения хемотаксис.

Protocol

1. Оборудование и реактивы

Запах разведения:

• Парафиновые масла (Sigma, CAS номер: 8012-95-1)
• Неприятный запах из самых высоких чистоты доступны, которые вызывает привлечения дрозофилы личинок ^1. В этом видео статьи, животные были протестированы с изоамилацетат (Sigma, CAS номер: 123-92-2).
• 1,5 мл стеклянных флаконах с тефлоновой крышкой (Agilent Technologies)
• Цифровая измерительная шкала для точного разбавления по весу

Анализ арене настройки:

• Агарозы (Promega)
• Крышки 96-луночных микропланшетов (BD Falcon, номер по каталогу: 353071). Наши поведенческие арене состоит из трех сложенных крышками.
• Одноканальный 1-20 мкл pipetter или многоканальный pipetter загрузить одоранта капли (ы) в верхней крышке стека. Для настройки нескольких анализе источников, мы используем 5-50 мкл Пипетируйте-Lite многоканальный pipetter от Rainin.

Подготовка дрозофилы личинок для поведенческих тестов:

• 15% (в / в) раствором сахарозы
• Регулярные чашках Петри (BD Falcon) мыть и хранить личинки
• Кисти малярные (4-5мм длиной щетины) для управления и передачи личинки

Запись личинок движения:

• Малый булавок с плоской головкой для передачи личинок в арену
• Пинцет или кисть для удаления личинок после записи
• Освещенные сцене с однородным без отопления источник света, "Slim Edge" Light Pad производства Logan Электрические
• Кабинет окружить поведенческих арене и контроля освещенности
• Видео система слежения для записи движения животных. Мы используем программное обеспечение Ethovision (Noldus, Нидерланды).
• ПЗС-камера и видеозахвата видеокарты (EureCard Пикколо Basic) приобрела программное обеспечение с Ethovision
• Термометр и влажности рекордер для мониторинга атмосферных условий в течение поведенческие тесты (опционально)
• Matlab (Mathworks) для индивидуальных анализа данных (по желанию)

2. Поведенческие арене

Поведенческих арене состоит из трех сложенных 96-луночного крышками блюда. Нижняя крышка используется для изоляции остальной системы от света площадку и уменьшить конвекцию в арене. Второй крышкой, покрытой 25 мл 3% агарозном геле, выступает в качестве сцены для личинок для ходьбы. Верхняя крышка имеет запаха капельки, которые остаются взвешенными поверхностным натяжением.

Запах капли пипеткой непосредственно в лунки 96-луночного блюдо крышкой. Одного или нескольких источников запах может быть использован для создания градиентов с четкими, поддающимися проверке анкет ^2. Для проверки аносмия и хемотаксис дефектов в личинки, мы предлагаем использовать следующие два анализов.

2.1. Одноместный анализа источник запаха: одна капля запах заложен в скважине № E7 (стандартный 96-луночного системы отсчета пластины).

• Стимул: 10 мкл запаха разводят в керосин
• Начальные условия: одна личинка вводится по запаху источника (или в близком соседстве).
• Основные замечания: Для привлекательные стимулы (например изоамилацетат), личинки дикого типа накапливают под источником. Anosmic животных или животных, подвергнутых обонятельных дефекты быстро блуждать вдали от капли.
• Продолжительность испытания: 3 мин. Движение данного животного регистрируется до суда времени прошло или как только животное контакты стены пластины.
• Возможные показатели для количественной поведенческих: процент времени, затраченного на животное в маленькой круглой зоны сосредоточены на запах источника; среднее расстояние до источника запаха, время хода расстояние до источника запаха и т.д.

Этот анализ эффективности тестов для основных аносмия у мутантных личинок. Она также может быть использован для достоверного определения порога обнаружения для определенных запахов ^2.

2.2. Несколько анализа источника запаха

Несколько капель запах заложены в колодец крышкой. В настоящей статье видео, мы создали градиенты вдоль ряда центральных Е. общей сложности шесть капель были введены в скважинах # E2, E4 #, # E6, E8 #, # E10 и E12 # (стандартный 96-луночного системы отсчета пластины ). В отличие от чашки Петри и отдельные анализы источник запаха, несколько анализа источника запаха позволяет качественный контроль геометрии градиент создан по длине и ширине арене. Этот анализ был использован для характеристики сенсорных механизмов, позволяющих личинок дрозофилы chemotax ^2.

• Стимул: 10 мкл капли запах заложены в чередующихся скважин вдоль ряда. Этот механизм приводит к созданию градиента в центре выбранной строки. Для создания однородного градиента по ширине арены, несколько рядов могут быть загружены с различных источников.
• Начальные условия: одна личинка вводится по запаху источника между скважинами # E3 и #Е4.
• Основные фенотипы: anosmic личинки блуждать наугад из отправной точки. Для привлекательные стимулы (например изоамилацетат), животных, которые способны перемещаться по запаху сторону увеличения концентрации запаха. Точность, с которой животное поднимается запах следа коррелирует с его способность чувствовать и процесс одоранта стимул. Извилистый путь часто бывают вызваны сенсорными дефектами. После того, как животное достигло точки высокая концентрация в суде, он остается в непосредственной близости от этой позиции.
• Продолжительность испытания: 3 мин максимум (больше отслеживание продолжительности, как правило, ввести шума личинки теряют интерес и в конце концов отказаться от градиента). Для градиенты показано на этом видео статьи, движение отдельной личинки был записан, пока животное достигло окрестности высокая концентрация источника (скважины № Е12). Запись была остановлена, как только животное достигло целевой области или связался с любой стене арены.
• Возможные показатели для количественной поведенческих: процент времени, затраченного на животных под одоранта линии (синий прямоугольник), средний заголовок по отношению к местным направление градиента запаха; комбинированные оценка хемотаксиса измерения глобальной тенденцией животных следовать одоранта линии ^2.

3. Проверка Градиент профиля

Перед тестированием личинок в частности градиент, важно, чтобы определить его стабильность во времени. Исходя из этого, экспериментатор может определить адекватную длительность каждой проб и количество личинок, которые могут быть отслежены последовательно в той же арене. Для проверки стабильности градиент, мы разработали метод, основанный на ИК-спектроскопии ^2. Этот метод не входит в рамки этого протокола, и не будет дальнейшее развитие.

4. Протокол о подготовке эксперимента

4.1. Подготовка агарозном пластины и запах разведения:

1. 1. Налейте 25 мл 3%-ном агарозном на плоской вершине 96-луночного блюдо крышкой; позволяют агарозы, чтобы остыть и укрепить (~ 30 мин).
   
   Важно: Убедитесь, что 96-крышки на ровной поверхности перед заливкой агарозы как наличие склона на затвердевшего геля агарозы может повлиять на поведение личинок. При заливки геля, удалите все пузырьки, образующиеся на поверхности.
   
   
2. 2. Развести запахи желаемой концентрации в парафин нефти с использованием цифровой шкале для точного измерения количества нефти парафинов и запах в каждом разбавлении.

Примечание: При низкой концентрации запаха используются, желательно подготовить набор исходных концентрациях на базе серийных разведений. Начать, например, с 1,0 М раствор и выполнять 1:02 разбавления до получения раствора 0,5 М. Продолжая рекуррентно, то получим следующие серии разведений геометрическая прогрессия 1,0 М, 0,5 М, 0,25 М, 0.12M, 0.06M, 0,03 М, 0.015M.

Важно: Так как многие органические запахи реагирует с пластиком, запах разведения необходимо хранить в стеклянных флаконах с тефлоновым шапки. В идеале, запахов следует приготовить свежую перед каждым экспериментом уменьшить колебания фактическая концентрация запаха через эксперименты. Это особенно актуально при использовании высоко летучих химических веществ.

4.2. Личинки подготовки:

1. 1. Подготовка 15% раствором сахарозы в дистиллированной воде.
   
   Примечания: 15% раствором сахарозы плотнее, чем личинки и заставит их особого вдохновения на поверхность раствор. Тем не менее, нерастворенных куски летать на продовольствие большую плотность, чем решение и быстро опускаются на дно. Таким образом, используя эту сахарозы решение обеспечивает эффективный способ разделения личинок из пищи. Сахароза решение является отличной средой для биологических загрязнителей, если решение мутнеет можно стерилизовать фильтр для удаления загрязнений.
   
   
2. Получить флакон с 6-дневных личинок или личинок в нужном стадии развития.
   
   Примечания: Все наши эксперименты проводятся с 6-дневных личинок (середина третьей стадии развития, возраста), личинки на этой стадии развития являются достаточно большими для упрощения обнаружения с нашими отслеживания программного обеспечения, но также весьма активно.
   
   
3. Налейте сахарозы в пищу флакон, содержащий личинки.
4. Используя лопаточку, распадаются и растворяются летать еда осторожно выпустить личинок. Год выхода личинки будут всплывать на поверхность.
5. Разрешить несколько минут лету куски пищи оседают на дне флакона, затем залить сахарозы и личинки в чашку Петри. Если предварительный отбор личинок необходимо, животные могут быть собраны путем заливки сахарозы через фильтр. Личинки могут быть переданы в блюдо для выбора с кистью.
6. Оставьте личинок в течение приблизительно 30 минут сucrose решение, прежде чем приступить поведенческие тесты, чтобы приучить животных к раствором сахарозы. Как личинки, кажется, не питаться сахарозой, животные будут испытывать состояние голода, который улучшает производительность хемотаксис.
7. Крышку чашки Петри могут быть заполнены водой (или сахарозы) и используется в качестве сосуда для отбрасываются животных после поведенческие тесты.

5. Протокол для выполнения поведенческих записей

5.1. Арена настройки:

1. 1. Применить запах капель на нижней (навернулись сторона) свежей 96-луночного блюдо крышкой.
   
   Важно: Во избежание загрязнения от различных запахов и запаха концентрациях, свежие крышка должна быть использована для каждой загрузки установки. Ни один из крышки содержащие запаха источники переработанного после эксперимента. В зависимости от диапазона концентрации запаха использовании одоранта градиенты были признаны устойчивыми только от 10 до 20 минут в закрытой системе. Поэтому важно, чтобы свести к минимуму время между градиентом настройки и фактическое начало поведенческих тестов.
   
   
2. Обратить крышкой и укладывают его над вторым крышка покрыта слоем 3% агарозы.
   
   Важно: Обратить крышкой тщательно, чтобы предотвратить запах капель распространиться на соседние скважины.
   
   
3. После инверсии крышка на поверхности агарозы, позволяют запах диффузный в течение 30 секунд, прежде чем внедрять личинки.

5.2. Загрузка личинок:

1. Поднимите верхнюю крышку содержащие одоранта капель вполне достаточно, чтобы позволить загрузку личинки.
2. Передача личинки из раствора сахарозы в слое агарозы. Исходное положение животного зависит от анализа используются:
   
   Для анализа одного источника запаха, личинки выходят под одоранта капли.
   
   Для анализа нескольких источников запаха, личинки освобождаются от скважины # E3 и E4 #.
   
   Важно: Восток вновь вводимых животных в согласованном порядке. Мы ориентируем наших животных в направлении градиента, гарантируя, что тело животного и голова лицо высокая концентрация. Животные введен в ориентации противоположном градиенту инициировать поиск поведение. На наш взгляд, этот начальный период поиска представляет ненужный источник шума. Контроль ориентации головы уменьшает количество животных, которые контактируют арене стен во время их поисковое поведение. Такая практика не премьер направление движения животного или значительно увеличить число anosmic животных chemotaxing вдоль линии одоранта случайно (т.е. ложно-положительных в запах тестов).
   
   
3. Установите верхнюю крышку и начать запись немедленно.
   
   Примечания: Здоровый личинки начать сканирование немедленно после их введения в арене и может покрывать расстояния 1 см в течение первых 10 секунд. Если экспериментатор медленно начала записи, начальные точки данных будут потеряны. По этой причине мы рекомендуем, чтобы экспериментатор становится хорошо знаком с программным обеспечением команд для начала записи, прежде чем пытаться запустить эксперимент.
   
   
4. Разрешить личинки вести себя на время записи (обычно 3 минуты).
   
   Примечания: Записи прекращаются до конца 3 минуты, если личинка попадает на арену стене или достигает целевой области (например, в градиент анализ).
   
5. В конце записи, немедленно снять крышку и удалить личинки пинцетом или кистью. Место гусеничных животных в крышку чашки Петри, содержащие воду (или сахароза).
   
   Важно: Записано животные не используются повторно. Емкость с водой это просто удобный сосуд для разделения записан и снимите записал животных при выполнении экспериментов.
   
6. Если отслеживание нескольких животных в арену настройки, оперативно загружать следующий личинки и начать запись, как показано выше.
   
   Важно: количество испытаний выполнена в той же арене настройки должны решаться на основе градиент стабильности, которая должна быть проверена перед выполнением любой поведенческий эксперимент ^2.
   
7. После того как все личинки должны быть испытаны в арену настройки были отслеживаются и удаляются из арены, отказаться от верхней крышкой и агарозном слоя. Промежуточные крышки (т.е. крышка агарозы) могут быть переработаны.
   
   Примечание: Мы советуем Ethovision пользователям выбрать метод обнаружения "вычитание фона.

6. Пример эксперименты показали в видео статья

6.1. Одноместный анализа источника запаха с 1,0 М по изоамилацетат.

Мы слепо протестированы десять Or83b-/ - мутанты и десять дикого типа (W1118), личинки к каждой из которых число были назначены. Отслеживания экспериментаэ не получали никакой информации о генотипе каждого животного. После каждой записи, интеллектуальный фенотипа была возложена на каждого животного тестирование: smellers, если накопление наблюдалось в источнике в течение всего судебного разбирательства; без smellers, если путь быстро покинули окрестности запах источник. После того, как записал поведение 20 животных, пути были сгруппированы по фенотипу. Результатом этой группировки было тогда по сравнению с фактическими генотип личинки: все назначения, сделанные оказались правильными.

6.2. Несколько анализа источника запаха с экспоненциальной и линейной градиенты изоамилацетат.

В этом эксперименте мы сравнили выступления диких личинок типа chemotaxing по линейным и экспоненциальным градиентом. Хемотаксиса поведения были записаны для двух градиентов создан с той же высокой концентрацией 0,5 М. Как объясняется в статье, запах источников экспоненциальной градиент колебался между 0,015 и 0,5 М. Источники линейный градиент колебался от 0,25 до 0,5 М (арифметической прогрессии с разностью 0,05 М).

Линейный градиент представлены более сложные хемотаксис среды как местные различия в концентрации была постоянной и сравнительно небольшие, и диапазон концентраций узкий (0,25 М). В отличие от концентрации от экспоненциальной градиент был больше с увеличением местные различия в концентрации вдоль тропы.

Пятнадцать личинки были записаны для каждого из двух геометрий градиента и пути накладывается в одной графе. Визуальный осмотр двух графиков показывает, что дикие личинки типа были в состоянии надежно подняться градиент как для геометрии, но это количество было больше, извилистые для линейное условие градиента. Это говорит о том, что сигнал присутствует наряду градиент длиной более надежно обнаружен экспоненциальной форме, чем по линейному.

6.3. Несколько анализа источника запаха с изоамилового градиентом ацетата в «крышу» геометрии.

Здесь мы убедимся, что личинки введен в запах градиент чувствительны к локальным изменениям в концентрации запаха, а не только наличие или отсутствие запаха. Градиент изоамилового была создана путем применения запах капель со следующими концентрациями: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0.12M. Последовавшая за этим градиентом геометрии напоминает асимметричную "крышей" с пиком в 0,5 М.

Личинки были освобождены от 0.06M 0.12M и капель запах. Наша гипотеза, что если личинки были просто вычислительные наличие запаха они будут следовать весь градиент без особых предпочтений по максимальной концентрации. Напротив, если личинки чувствительны к локальным изменениям в концентрации они будут накапливаться под 0,5 М капли. Пятнадцать личинки были записаны, и было обнаружено, что после короткого периода поисковых всех личинок накопленных под более высокие концентрации хорошо. Это означает, что локальные изменения концентрации запаха вычисляются и информировать хемотаксиса поведение личинок дрозофилы.