Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Summary

In diesem Video-Beitrag beschreiben wir eine neue Methode erlaubt den Bau von Geruchsrezeptoren Gradienten mit stabilen und kontrollierbaren Geometrien. Wir haben kurz zeigen, wie diese Gradienten zu Bildschirm kann für olfaktorische Mängel (vollständiger oder teilweiser Anosmie) verwendet werden und auf subtilere Funktionen der Chemotaxis Verhalten zu studieren.

Abstract

Olfaktorische Reaktionen in Drosophila-Larven wurden traditionell in Petrischalen aus einer einzigen peripheren Geruchsquelle untersucht. In diesem Verhalten Paradigma der Experimentator in der Regel davon aus, dass die rasche Verbreitung der Duftmoleküle von der Quelle bis zur Schaffung eines stabilen Gradienten in der Schale führt. Um eine quantitative Korrelation zwischen sensorischen Input und Verhaltensreaktionen, ist es notwendig, eine genauere Charakterisierung der Geruchsstoff Reiz zu erzielen. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir eine neue Methode erlaubt den Bau von Geruchsrezeptoren Gradienten mit stabilen und kontrollierbaren Geometrien. Wir haben kurz zeigen, wie diese Gradienten zu Bildschirm kann für olfaktorische Mängel (vollständiger oder teilweiser Anosmie) verwendet werden und auf subtilere Funktionen der Chemotaxis Verhalten zu studieren.

Protocol

1. Geräte und Reagenzien

Odor Verdünnungen:

• Paraffinöl (Sigma, CAS-Nummer: 8012-95-1)
• Gerüche von höchster Reinheit zur Verfügung, die Anziehungskraft löst in Drosophila-Larven ^1. In diesem Video-Beitrag wurden die Tiere mit Isoamylacetat (: 123-92-2 Sigma, CAS-Nummer) getestet.
• 1,5 ml Glasfläschchen mit Teflon-Kappe (Agilent Technologies)
• Digitale Mess-Skala für präzise Verdünnung Gew.

Assay arena set-up:

• Agarose (Promega)
• Deckel des 96-well Mikrotiterplatten (BD Falcon, Katalog-Nummer: 353071). Unsere Verhaltens-Arena besteht aus drei übereinander Deckel.
• Single-Nummer 1-20 ul Pipette oder Mehrkanal-Pipette auf Geruchsstoff Tröpfchen (s) in den Deckel des Stapels zu laden. Zum Einrichten der mehrere Quell-Assay verwenden wir 5-50 ul Pipet-Lite Multi-Channel-Pipette aus Rainin.

Vorbereitung der Drosophila-Larven für Verhaltenstests:

• 15% (w / w) Saccharose-Lösung
• Regelmäßige Petrischalen (BD Falcon) zu waschen und zu speichern Larven
• Malerpinsel (4-5mm Borstenlänge) zu manipulieren und zu übertragen Larven

Aufnahme von Larven Bewegung:

• Kleine Stifte mit einem flachen Kopf für die Übertragung von Larven in Arena
• Pinzetten oder Pinsel zu Larven nach der Aufnahme zu entfernen
• Beleuchtete Bühne mit einer homogenen, nicht-Heizung Lichtquelle, "Slim Edge" Licht Pad von Logan Electric hergestellt
• Kabinett umgeben die Verhaltens-Arena und Kontrolle Lichtverhältnissen
• Video-Tracking-System für die Aufnahme von tierischen Bewegung. Wir sind mit dem Ethovision Software (Noldus, Niederlande).
• CCD-Kamera und Framegrabber-Grafikkarte (EureCard Piccolo Basic) mit Ethovision Software gekauft
• Thermometer und Feuchtigkeit Recorder auf die atmosphärischen Bedingungen während des Verhaltenstests (optional) überwachen
• Matlab (The MathWorks) für individuelle Datenanalyse (optional)

2. Behavioral-Arena

Die Verhaltens-Arena besteht aus drei übereinander 96-well Schale Deckel. Der untere Deckel wird verwendet, um den Rest des Systems aus dem Licht-Pad zu isolieren und zu reduzieren Konvektion in der Arena. Der zweite Deckel, mit 25 ml einer 3% igen Agarosegel bedeckt, dient als Bühne für die Larven zu begehen. Der Deckel hält den Geruch Tröpfchen, die durch die Oberflächenspannung ausgesetzt bleiben.

Odor Tröpfchen werden direkt in die Vertiefungen der 96-well Schale Deckel pipettiert. Eine einzelne oder mehrere Geruchs-Quellen können verwendet werden, um Steigungen mit deutlichen, überprüfbare Profile ² zu erzeugen. Zur Prüfung auf Anosmie und Chemotaxis Mängel in Larven, schlagen wir vor, die beiden folgenden Tests verwendet werden.

2.1. Einzel Geruchsquelle Test: Ein einziger Geruch Tropfen in die gut # E7 gelegt (Standard 96-Well-Platte Referenzsystem).

• Stimulus: 10 &mgr; l der Geruch in Paraffinöl verdünnt
• Ausgangsbedingungen: eine einzige Larve unter der Geruch Quelle (oder in dessen unmittelbarer Nachbarschaft) eingeführt.
• Grundsätzliche Bemerkungen: Für attraktive Stimuli (zB Isoamylacetat), reichern sich Wildtyp-Larven unter der Hand. Anosmic Tieren oder Tieren, die olfaktorischen Mängel schnell weg von den Tropfen wandern.
• Dauer eines Gerichtsverfahrens: 3 min. Die Bewegung eines bestimmten Tieres aufgenommen, bis die Testversion abgelaufen ist oder sobald das Tier in Kontakt mit der Wand der Platte.
• Mögliche Kennzahlen für Verhaltenstherapie Quantifizierung: Prozentsatz der Zeit, die ein Tier in einer kleinen kreisförmigen Zone auf den Geruch Quelle zentriert ausgegeben; mittlere Abstand, um den Geruch der Quelle; zeitlichen Verlauf der Strecke, um Gerüche zu Quelle, etc.

Dieser Assay effizient Tests für grundlegende Anosmie in mutierten Larven. Es kann auch verwendet werden, um zuverlässig die Nachweisgrenze für bestimmte Gerüche ² sein.

2.2. Mehrere Geruchsquelle Test

Mehrere Geruch Tröpfchen werden in den Brunnen des Deckels gelegt. Im vorliegenden Video-Artikel, haben wir Gradienten entlang der mittleren Reihe E. Insgesamt sechs Tropfen in Brunnen # E2, E4 #, # E6, # E8, E10 # und # E12 eingeführt wurden (Standard 96-Well-Platte Referenzsystem ). Im Gegensatz zu der Petrischale und einzigen Geruchsquelle Assays ermöglicht die mehrfache Geruchsquelle Assay qualitative Kontrolle des Verlaufs der Geometrie entlang der Länge und Breite der Arena errichtet. Dieser Assay wurde verwendet, um die sensorischen Mechanismen, die eine Drosophila-Larven zu chemotax ² charakterisieren.

• Stimulus: 10 &mgr; l Geruch Tropfen werden abwechselnd in Brunnen entlang einer Reihe gelegt. Diese Anordnung führt zur Bildung eines Gradienten zentriert ausgewählten Zeile. Um eine homogene Gradienten entlang der Breite der Arena können mehrere Zeilen mit mehreren Quellen geladen werden.
• Ausgangsbedingungen: eine einzige Larve unter der Geruch Quelle zwischen Brunnen # E3 und # eingeführtE4.
• Grundlegende Phänotypen: anosmic Larven nach dem Zufallsprinzip aus der Ausgangspunkt wandern. Für attraktive Stimuli (zB Isoamylacetat), Tiere, die in der Lage zu navigieren entlang der Richtung der zunehmenden Geruchskonzentration Geruch. Die Genauigkeit, mit der ein Tier steigt die Duftspur ist mit seiner Fähigkeit, Sinn und Verfahren der Geruchsstoff Reiz korreliert. Verschlungenen Wege sind oft durch sensorische Mängel verursacht. Sobald ein Tier hat den Punkt der höchsten Konzentration in der Studie erreicht, bleibt es in der Nähe dieser Position.
• Dauer eines Gerichtsverfahrens: 3 min maximal (mehr Tracking Laufzeiten neigen dazu, Lärm vorstellen als Larven das Interesse verlieren und schließlich verlassen die Steigung). Für die Gradienten in diesem Video Artikel dargestellt, war die Bewegung eines einzelnen Larven erfasst, bis das Tier die Gegend von der höchsten Konzentration Quelle (well # E12). Die Aufnahme wurde so schnell wie das Tier erreicht das Zielgebiet oder kontaktiert jeder Wand der Arena gestoppt.
• Mögliche Kennzahlen für Verhaltenstherapie Quantifizierung: Prozentsatz der Zeit, die ein Tier unter der Geruchsstoff line (blaues Rechteck) ausgegeben; bedeuten Überschrift in Bezug auf die lokale Richtung des Geruchs Gradienten; eine kombinierte Chemotaxis Score Messung der globalen Tendenz eines Tieres zu dem Geruchsstoff folgen Linie ^2.

3. Gradientenprofil Überprüfung

Vor der Prüfung Larven in einem bestimmten Gradienten, ist es wichtig, die Stabilität über die Zeit zu bestimmen. Auf dieser Basis kann der Experimentator bestimmt eine angemessene Dauer für jeden Versuch und die Zahl der Larven, die nacheinander in der gleichen Arena verfolgt werden. Zur Prüfung der Stabilität des Gradienten, haben wir eine Methode auf IR-Spektroskopie ^2-Basis entwickelt. Diese Methode würde den Rahmen dieses Protokolls und wird nicht weiter ausgeführt werden.

4. Protokoll für die Vorbereitung eines Experiments

4.1. Vorbereitung der Agarose Platten-und Geruchs-Verdünnungen:

1. 1. Gießen Sie 25ml von 3% Agarose auf den flachen Gipfel eines 96-well Schale Deckel; ermöglichen die Agarose abkühlen und sich verfestigen (~ 30 min).
   
   Wichtig: Stellen Sie sicher, dass der 96-Loch-Deckel auf eine ebene Fläche vor dem Gießen des Agarose als die Anwesenheit von einem Hang auf die verfestigte Agarosegel sind, können das Verhalten der Larven beeinflussen. Beim Eingießen des Gels, entfernen Sie alle Blasen auf der Oberfläche bilden.
   
   
2. 2. Verdünnen Gerüche gewünschten Konzentrationen in Paraffinöl mit einer digitalen Waage zur genauen Messung der Mengen an Paraffinöl und Geruch in jeder Verdünnung.

Hinweise: Wenn geruchsarm Konzentrationen eingesetzt werden, ist es vorzuziehen, eine Reihe von Quelle-Konzentrationen auf serielle Verdünnungen Basis vorzubereiten. Start, zum Beispiel mit einer 1,0 M Lösung und führen Sie eine 1:2-Verdünnung zu erhalten, eine Lösung 0,5 M. Durch dieses Vorgehen immer wieder, so erhält man eine Verdünnungsreihe nach geometrischer Progression 1,0 M, 0,5 M, 0,25 M, 0,12 M, 0,06 M, 0,03 M, 0,015.

Wichtig: Da viele organische Gerüche, die mit Kunststoff zu reagieren, Geruch Verdünnungen müssen in Glasfläschchen mit Teflon caps gespeichert werden. Idealerweise sollte Gerüche frisch zubereitet werden vor jedem Experiment Schwankungen der tatsächlichen Geruchskonzentration über Experimente zu reduzieren. Dies gilt insbesondere bei der Verwendung von leichtflüchtigen Chemikalien.

4.2. Die Larven der Zubereitung:

1. 1. Bereiten Sie 15% Saccharose-Lösung in destilliertem Wasser.
   
   Notes: A 15% Saccharose-Lösung ist dichter als Larven und will sie an die Oberfläche der Lösung getragen werden. Allerdings haben ungelösten essen fliegen Brocken eine größere Dichte als die Lösung und schnell auf den Boden sinken. So, mit dieser Saccharose-Lösung bietet eine effiziente Möglichkeit der Trennung von Larven aus der Nahrung. Saccharose-Lösung ist ein hervorragendes Medium für biologische Verunreinigungen, wenn die Lösung trübt es kann sterilfiltriert werden, um die Verunreinigungen zu entfernen.
   
   
2. Besorgen Sie sich eine Flasche mit 6-Tage alte Larven oder Larven an der gewünschten Entwicklungsstadium.
   
   Notes: Alle unsere Experimente werden mit 6-Tage alte Larven (Mitte des dritten Stadiums Entwicklungsstadium) durchgeführt; Larven in dieser Entwicklungsstufe sind groß genug für eine einfache Erkennung mit unserem Tracking-Software, sondern auch sehr aktiv.
   
   
3. Gießen Saccharose in der Lebensmittel-Fläschchen mit den Larven.
4. Mit einem Spatel, aufzubrechen und lösen the fly Lebensmittel schonend zu den Larven lösen. Released Larven schwimmen an die Oberfläche.
5. Warten Sie einige Minuten, bis die Fliege Essen Brocken auf den Boden des Fläschchens sinken, dann gießen Sie den Saccharose und Larven in einer Petrischale. Wenn Vorauswahl der Larven notwendig ist, können Tiere, indem die Saccharose durch einen Filter gesammelt werden. Die Larven können dann in eine Schüssel für die Auswahl mit einem Pinsel übertragen werden.
6. Lassen Sie sich die Larven etwa 30 Minuten in der sucrose Lösung, bevor Sie mit Verhaltenstests, damit die Tiere auf die Saccharose-Lösung gewöhnen. Da die Larven nicht angezeigt werden, auf Saccharose-Feeds, werden die Tiere in einen Zustand des Hungers, die Chemotaxis die Leistung verbessert.
7. Der Deckel der Petrischale mit Wasser (oder Saccharose) gefüllt werden und als Aufnahme für verworfen Tiere nach Verhaltenstests.

5. Protokoll zu führen Verhaltens-Aufnahmen

5.1. Arena Set-up:

1. 1. Bewerben Geruch Tröpfchen an der Unterseite (quoll auf dieser Seite) einer frischen 96-well Schale Deckel.
   
   Wichtig: Um Verunreinigungen aus verschiedenen Gerüche und Geruch Konzentrationen zu vermeiden, eine frische Deckel muss für jeden Be-Set-up verwendet werden. Keiner der Deckel mit Geruchsquellen sind nach dem Versuch recycelt. Je nach Geruch Konzentrationsbereich verwendet werden, haben Geruchsstoff Gradienten wurde festgestellt, dass nur für 10 bis 20 Minuten stabil in einem geschlossenen System. Es ist daher wichtig, die Zeit zwischen Gradient Set-up und dem tatsächlichen Beginn der Verhaltenstest zu minimieren.
   
   
2. Drehen Sie die Deckel und stapelt es über einen zweiten Deckel mit den 3% igen beschichtet.
   
   Wichtig: Drehen Sie den Deckel vorsichtig auf Geruch Tröpfchen ein Übergreifen auf benachbarte Vertiefungen zu verhindern.
   
   
3. Bei Umkehrung der Deckel auf dem Agarose Oberfläche, damit der Geruch nach 30 Sekunden vor dem Einbringen der Larve diffundieren.

5.2. Loading Larven:

1. Heben Sie den Deckel mit dem Duftstoff Tröpfchen gerade genug, damit Belastung der Larve.
2. Übertragen einer Larve aus der Saccharose-Lösung, um die Agarose-Schicht. Die Ausgangsposition des Tieres hängt von der Assay verwendet wird:
   
   Für die einzelnen Geruchsquelle Assay werden Larven unter der Geruchsstoff Tropfen freigegeben.
   
   Für die multiple Geruchsquelle Assay werden Larven zwischen den Wells # E3 und E4 # veröffentlicht.
   
   Wichtig: Richten Sie die neu eingeführten Tiere in einer konsistenten Art und Weise. Wir orientieren unsere Tiere in die Richtung des Gradienten, sicherzustellen, dass die tierischen Körper und Kopf die höchste Konzentration Gesicht. Tiere in einer Orientierung entgegengesetzt zu der des Gradienten eingeführt initiieren Suchverhalten. Aus unserer Sicht stellt dieses anfängliche Suche Zeitraum eine unnötige Lärmquelle. Controlling der Kopf Orientierung reduziert die Anzahl der Tiere, die die Arena Wand während ihres explorativen Verhalten zu kontaktieren. Diese Praxis nicht prime die Richtung der Bewegung des Tieres oder erhöhen die Anzahl der Tiere anosmic chemotaxing entlang der Geruchsstoff Linie durch Zufall (dh falsch-positive in Geruch Tests).
   
   
3. Ersetzen Sie den Deckel und starten Sie die Aufnahme sofort.
   
   Notes: Gesunde Larven zu krabbeln beginnt sofort nach ihrer Einführung in die Arena und kann eine Entfernung von 1cm innerhalb der ersten 10 Sekunden zu decken. Wenn der Experimentator ist langsam am Beginn der Aufnahme, wird erste Datenpunkte verloren. Aus diesem Grund empfehlen wir, dass der Experimentator auch mit der Software-Befehle kennen, um die Aufnahme, bevor Sie versuchen, ein Experiment zu laufen beginnen wird.
   
   
4. Lassen Sie sich die Larve für die Dauer der Aufnahme (in der Regel 3 Minuten) zu verhalten.
   
   Notes: Die Aufnahmen werden noch vor Ende der 3 min beendet, wenn die Larve hits der Arena Wand erreicht oder ein Zielgebiet (z. B. in den Gradienten-Test).
   
5. Am Ende der Aufnahme, zeitnah heben Sie den Deckel und entfernen Sie die Larve mit einer Pinzette oder einem Pinsel. Legen Sie die verfolgt Tiere in der Petrischale Deckel mit Wasser (oder Saccharose).
   
   Wichtig: Aufgenommen Tiere sind nicht wiederverwendet werden. Die Wasserschale ist lediglich eine bequeme Aufnahme erfasst und un-recorded Tiere während der Ausführung der Experimente zu trennen.
   
6. Wenn Tracking für mehrere Tiere unter einer Arena Set-up, umgehend Belastung der nächsten Larve und starten Sie die Aufnahme wie oben gezeigt.
   
   Wichtig: Die Anzahl der Versuche in der gleichen Arena Set-up durchgeführt werden soll auf der Grundlage des Gradienten Stabilität, die vor dem Durchführen von Verhaltens-Experiment ² überprüft werden sollte entschieden werden.
   
7. Sobald alle Larven unter der Arena Set-up wurden aufgespürt und entfernt von der Arena getestet werden, werfen Sie die obere Abdeckung und Agarose-Schicht. Das Zwischenprodukt Deckel (dh die Agarose Deckel) können recycelt werden.
   
   Hinweis: Wir empfehlen Ethovision Benutzer auf die "Hintergrund-Subtraktion" Nachweismethode zu wählen.

6. Beispiel Experimente in der Video-Artikel gezeigt

6.1. Einzel Geruchsquelle Assay mit 1,0 M von Isoamylacetat.

Wir blind getestet zehn Or83b-/ - Mutanten und zehn Wildtyp (W1118) Larven, denen jeweils eine Zahl zugewiesen worden war. Die Tracking-Experimenter habe keine Informationen über den Genotyp jedes einzelnen Tieres. Nach jeder Aufnahme wurde eine prädiktive Phänotyp zu jedem Tier getestet zugeordnet: smellers, wenn Akkumulation wurde unter der Hand für den gesamten Studie beobachtet; nicht smellers, wenn der Weg schnell nach links der Nachbarschaft der Geruch Quelle. Nachdem erfasst das Verhalten von 20 Tieren wurden Wege nach Phänotyp gruppiert. Das Ergebnis dieser Gruppierung wurde dann mit den tatsächlichen Genotyp der Larven im Vergleich: alle Zuordnungen erwiesen sich als richtig.

6.2. Mehrere Geruchsquelle Assay mit exponentiellen und linearen Gradienten von Isoamylacetat.

In diesem Experiment verglichen wir die Leistungen von Wildtyp-Larven chemotaxing entlang einer linearen und einer exponentiellen Verlauf. Chemotaktische Verhalten wurden für zwei Steigungen mit den gleichen höchsten Konzentration von 0,5 M eingestellt aufgezeichnet. Wie in dem Artikel erläutert, lag der Geruch Quellen des exponentiellen Gradienten zwischen 0,015 und 0,5. Die Quellen der linearen Gradienten lagen zwischen 0,25 und 0,5 M (arithmetische Folge mit gemeinsamen Differenz 0,05).

Die linearen Verlauf stellte eine größere Herausforderung Chemotaxis Umwelt als lokal unterschiedliche Konzentration wurde konstant und relativ klein, und die Konzentration Bereich schmal (0,25 M). Im Gegensatz dazu war die Konzentration Bereich des exponentiellen Gradienten größer mit zunehmender lokale Unterschiede in der Konzentration entlang der Strecke.

Fünfzehn Larven wurden für jede der beiden Gradienten-Geometrien und die Wege in einem Graphen übereinander aufgezeichnet. Eine visuelle Inspektion der beiden Diagramme zeigt, dass Wildtyp-Larven in der Lage, zuverlässig steigen die Gradienten für beide Geometrien wurden, aber die Höhe der mäandernden größer war als bei der linearen Gradienten Zustand. Dies deutet darauf hin, dass das Signal, das entlang des Gradienten Länge zuverlässiger ist für eine exponentielle Form als für eine lineare erkannt.

6.3. Mehrere Geruchsquelle Assay mit Isoamylacetat Gradienten in einem "Dach"-Geometrie.

Hier überprüfen wir, dass Larven in einen Geruch Gradienten eingeführt empfindlich auf lokale Änderungen in Geruchskonzentration nicht nur das Vorhandensein oder Fehlen von Geruch sind. 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0,12 M: Ein Isoamyl Gradient wurde durch die Anwendung der Geruch Tröpfchen mit folgenden Konzentrationen hergestellt. Die anschließende Steigung Geometrie glich einem asymmetrischen "Dach" Höchststand von 0,5 M.

Die Larven wurden zwischen 0,06 M und 0,12 M Geruch Tröpfchen freigesetzt. Unsere Hypothese war, dass, wenn die Larven lediglich Computing waren das Vorhandensein von Geruch, sie würden den gesamten Verlauf ohne eine besondere Vorliebe für die Konzentration maximal zu folgen. Im Gegensatz dazu sind bei Larven empfindlich auf lokale Änderungen in der Konzentration sie unter dem 0,5 M Tropfen ansammeln würde. Fünfzehn Larven wurden aufgezeichnet, und es wurde festgestellt, dass nach einer kurzen exploratorischen Zeit alle Larven unter der höheren Konzentration auch angesammelt. Dies deutet darauf hin, dass lokale Änderungen in Geruchskonzentration berechnet und informieren die chemotaktische Verhalten von Drosophila-Larven.