Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Summary

Dans cet article, vidéo, nous décrivons une nouvelle méthode permettant la construction de gradients odorant avec des géométries stable et contrôlable. Nous illustrer brièvement comment ces gradients peuvent être utilisées pour dépister les défauts olfactifs (anosmie complète et partielle) et d'étudier les caractéristiques plus subtiles du comportement chimiotaxie.

Abstract

Réponses olfactives chez les larves de drosophile ont été traditionnellement étudiée en boîtes de Petri comprenant une source de l'odeur seule périphériques. Dans ce paradigme comportemental, l'expérimentateur suppose généralement que la diffusion rapide des molécules odorantes de la source conduit à la création d'un gradient stable dans le plat. Pour établir une corrélation quantitative entre les entrées sensorielles et réponses comportementales, il est nécessaire de réaliser une caractérisation plus approfondie des conditions de stimulation odorante. Dans cet article, vidéo, nous décrivons une nouvelle méthode permettant la construction de gradients odorant avec des géométries stable et contrôlable. Nous illustrer brièvement comment ces gradients peuvent être utilisées pour dépister les défauts olfactifs (anosmie complète et partielle) et d'étudier les caractéristiques plus subtiles du comportement chimiotaxie.

Protocol

1. Équipements et de réactifs

Dilutions odeur:

• L'huile de paraffine (Sigma, numéro CAS: 8012-95-1)
• Les odeurs de la disposition la plus grande pureté, qui provoque l'attraction des larves de drosophile ^1. Dans cet article, la vidéo, les animaux ont été testés avec de l'acétate d'isoamyle (Sigma, numéro CAS: 123-92-2).
• Flacons en verre 1.5ml avec bouchon en Teflon (Agilent Technologies)
• Numérique échelle de mesure pour la dilution précise en poids

Arena Assay mis en place:

• Agarose (Promega)
• Couvercles de 96 puits à microplaques (BD Falcon, numéro de catalogue: 353071). Notre aréna comportementale se compose de trois couvercles empilés.
• Monocanal 1-20 pipetteur ul ou multi-canaux pipetteur pour charger gouttelettes odorant (s) dans le couvercle du dessus de la pile. Pour configurer le dosage de sources multiples, nous utilisons 50 à 50 ul Pipet-Lite multi-canal à partir pipetteur Rainin.

Préparation de la drosophile larves pour des tests de comportement:

• 15% (p / p) solution de saccharose
• Régulière des boîtes de Petri (BD Falcon) pour laver et stocker les larves
• Pinceau (longueur de poil 4-5mm) pour manipuler et transférer les larves

Enregistrement de mouvement des larves:

• Petites broches à tête plate pour le transfert des larves dans l'arène
• Pince ou un pinceau pour enlever les larves après l'enregistrement
• Scène illuminée avec une homogénéité de non-chauffage source de lumière, «Slim Edge" Light Pad fabriqués par Logan électrique
• Cabinet d'entourer l'arène du comportement et de contrôle des conditions de lumière
• Système de suivi vidéo pour l'enregistrement des mouvements des animaux. Nous utilisons le logiciel Ethovision (Noldus, Pays-Bas).
• La caméra CCD et une carte vidéo frame grabber (Piccolo EureCard base) achetés avec le logiciel Ethovision
• Thermomètre et enregistreur d'humidité pour surveiller les conditions atmosphériques durant les tests comportementaux (facultatif)
• Matlab (The Mathworks) pour l'analyse des données personnalisées (facultatif)

2. Arena comportementale

L'arène de comportement consiste à empiler trois couvercles plat de 96 puits. Le couvercle inférieur est utilisé pour isoler du reste du système à partir du clavier de lumière et de réduire la convection dans l'arène. Le second couvercle, couvert de 25ml d'un gel d'agarose 3%, sert de scène pour les larves à la marche. Le couvercle supérieur détient les gouttelettes d'odeurs qui restent en suspension par la tension de surface.

Odeur gouttelettes sont pipetés directement dans le puits du couvercle plat de 96 puits. Une des sources d'odeurs simples ou multiples peuvent être utilisés pour générer des dégradés avec distinctes, les profils vérifiables ^2. Pour tester l'anosmie et les défauts de chimiotactisme chez les larves, nous proposons d'utiliser les deux suivants dosages.

2.1. Simple test source de l'odeur: une goutte d'odeur seule fixées dans le puits # E7 (standard 96 puits système de référence plaque).

• Relance: 10 ul d'odeur diluée dans l'huile de paraffine
• Les conditions initiales: une seule larve est introduit sous la source de l'odeur (ou dans son voisinage proche).
• Observations de base: Pour les stimuli attractifs (par exemple l'acétate de isoamyle), les larves de type sauvage s'accumulent au-dessous de la source. Animaux ou des animaux anosmiques soumis à des défauts olfactifs rapidement s'éloigner de la gouttelette.
• Durée d'un procès: 3 min. Le mouvement d'un animal donné est enregistrée jusqu'à ce que le temps d'essai est écoulée ou dès que les contacts des animaux de la paroi de la plaque.
• Métriques possibles pour la quantification de comportement: le pourcentage de temps passé par un animal dans une petite zone circulaire centrée sur la source des odeurs; distance moyenne de la source de l'odeur; bien sûr le temps de la distance à la source de l'odeur, etc

Ce test essais efficacement pour anosmie de base dans les larves mutantes. Il peut également être utilisé pour déterminer de façon fiable le seuil de détection des odeurs particulières ^2.

2.2. Plusieurs test source de l'odeur

Gouttelettes d'odeur Plusieurs sont définies dans le puits de la paupière supérieure. Dans l'article la vidéo actuelle, nous mettons en place des gradients le long de la rangée centrale E. Un total de six gouttes ont été introduits dans les puits # E2, E4 #, # E6, E8 #, # E10 et E12 # (standard 96 puits système de référence plaque ). En contraste avec la boîte de Pétri et unique source de l'odeur des essais, le dosage d'odeurs multiples sources permet un contrôle qualitatif de la géométrie gradient établis le long de la longueur et la largeur de l'arène. Ce dosage a été utilisé pour caractériser les mécanismes sensoriels permettant aux larves de drosophile chemotax ^2.

• De stimulation: les gouttelettes d'odeur 10 ul sont déposés en alternant des puits le long d'une rangée. Cette disposition conduit à la création d'un gradient centré ligne sélectionnée. Pour établir un gradient homogène sur toute la largeur de l'arène, plusieurs rangées peuvent être chargés avec des sources multiples.
• Les conditions initiales: une seule larve est introduit sous la source de l'odeur entre les puits # E3 et #E4.
• Phénotypes de base: les larves anosmiques promener au hasard dans le point de départ. Pour les stimuli attractifs (par exemple l'acétate de isoamyle), les animaux qui sont capables de naviguer le long de l'odeur de la direction de la concentration d'odeur augmente. La précision avec laquelle un animal monte sur le sentier de l'odeur est corrélée à sa capacité de détecter et de traiter le stimulus odorant. Chemins tortueux sont souvent causés par des défauts sensoriels. Une fois qu'un animal a atteint le point de plus forte concentration dans le procès, il reste dans le voisinage de cette position.
• Durée d'un procès: 3 min maximum (durée plus longue de suivi ont tendance à introduire de bruit que les larves de perdre tout intérêt et finissent par abandonner le gradient). Pour les gradients illustrés dans cet article la vidéo, le mouvement d'une larve individuels a été enregistré jusqu'à ce que l'animal atteint le voisinage de la source la plus forte concentration (puits # E12). L'enregistrement a été arrêté dès que l'animal atteint la zone cible ou contacté un mur de l'arène.
• Métriques possibles pour la quantification de comportement: le pourcentage de temps passé par un animal sous le seuil odorant (rectangle bleu); signifie cap par rapport à la direction locale du gradient d'odeur; un score combiné chimiotactisme la mesure de la tendance globale de l'animal à suivre l'odorant la ligne ^2.

3. Vérification de profil de gradient

Avant de tester les larves dans un gradient particulier, il est important de déterminer sa stabilité au fil du temps. Sur cette base, l'expérimentateur peut déterminer une durée suffisante pour chaque essai et le nombre de larves qui peuvent être suivis de façon séquentielle dans la même arène. Pour tester la stabilité de la pente, nous avons développé une méthode basée sur la spectroscopie IR ^2. Cette méthode est au-delà de la portée de ce protocole et ne sera pas élaboré davantage.

4. Protocole pour la préparation d'une expérience

4.1. Préparation de la plaque d'agarose et des dilutions d'odeur:

1. 1. Verser 25ml de 3% d'agarose sur le sommet plat d'un couvercle plat de 96 puits; permettre à l'agarose refroidir et se solidifier (~ 30 min).
   
   Important: S'assurer que les couvercles de 96 puits sont sur ​​une surface plane avant de couler l'agarose comme la présence d'une pente sur le gel d'agarose solidifié peut affecter le comportement des larves. Lorsque vous versez le gel, enlever toutes les bulles qui se forment sur la surface.
   
   
2. 2. Diluer les odeurs à des concentrations souhaitées dans l'huile de paraffine en utilisant une échelle numérique pour mesurer avec précision les quantités d'huile de paraffine et l'odeur de chaque dilution.

Notes: Lorsque les concentrations sont utilisés à faible odeur, il est préférable de préparer une série de concentrations source basé sur des dilutions en série. Cliquez sur Démarrer, par exemple, avec une solution 1,0 M et de procéder à une dilution 1:02 pour obtenir une solution 0.5M. En procédant de façon récurrente, on obtient une série de dilution suite à la progression géométrique 1.0M, 0.5M, 0.25M, 0,12 M, 0,06 M, 0,03 M, 0,015.

Important: Depuis de nombreuses odeurs organiques réagissent avec le plastique, les dilutions odeurs doivent être stockés dans des flacons en verre avec bouchons en téflon. Idéalement, les odeurs doit être préparé avant chaque expérience afin de réduire les fluctuations de la concentration de l'odeur réelle à travers des expériences. Cela est particulièrement vrai lors de l'utilisation des produits chimiques hautement volatils.

4.2. La préparation des larves:

1. 1. Préparer une solution de saccharose à 15% dans de l'eau distillée.
   
   Notes: Une solution de saccharose à 15% est plus dense que les larves et les amènera à être gonflés à la surface de la solution. Cependant, non dissous morceaux volent la nourriture ont une densité supérieure de la solution rapidement et couler au fond. Ainsi, en utilisant cette solution de saccharose est un moyen efficace de séparer les larves de la nourriture. Solution de saccharose est un excellent moyen pour les contaminants biologiques, si la solution devient trouble il peut être stérilisée par filtration pour éliminer la contamination.
   
   
2. Procurez-vous un flacon de 6 jours d'âge des larves ou des larves au stade désiré de développement.
   
   Remarques: Toutes nos expériences sont réalisées avec des larves âgées de 6 jours (milieu du troisième stade larvaire stade de développement); larves à ce stade de développement sont assez grands pour la facilité de détection avec notre logiciel de suivi, mais aussi très actifs.
   
   
3. Verser le saccharose dans le flacon contenant la nourriture des larves.
4. Avec une spatule, briser et de dissoudre la nourriture volée en douceur pour libérer les larves. Sortie larves flottent à la surface.
5. Attendez quelques minutes pour les morceaux de nourriture volée à couler au fond du flacon, puis versez le saccharose et les larves dans une boîte de Pétri. Si la pré-sélection des larves est nécessaire, les animaux peuvent être collectés en versant le saccharose à travers un filtre. Les larves peuvent ensuite être transférés dans une boîte de sélection avec un pinceau.
6. Laisser les larves pendant 30 minutes environ dans le ssolution ucrose avant de procéder à des tests de comportement pour permettre aux animaux de s'habituer à la solution de saccharose. Comme les larves ne semblent pas se nourrir de saccharose, les animaux seront expérience d'un état de famine qui améliore les performances chimiotaxie.
7. Le couvercle de la boîte de Petri peut être rempli avec de l'eau (ou saccharose) et utilisée comme un réceptacle pour les animaux jetés après des tests comportementaux.

5. Protocole d'effectuer des enregistrements de comportement

5.1. Mise en place Arena:

1. 1. Appliquer gouttelettes d'odeur à la partie inférieure (côté jailli) d'un couvercle plat de 96 puits fraîche.
   
   Important: Pour éviter la contamination par des odeurs différentes et des concentrations d'odeurs, d'un couvercle fraîche doit être utilisé pour le chargement de chaque set-up. Aucun des couvercles contenant les sources d'odeurs sont recyclés après l'expérience. Selon la plage de concentration d'odeur utilisés, les gradients odorantes ont été trouvés pour être stable que pendant 10 à 20 minutes dans un système fermé. Il est donc important de minimiser le temps entre le gradient de mettre en place et le démarrage effectif du test de comportement.
   
   
2. Inverser le couvercle et placez-dessus d'un second couvercle revêtu de la couche 3% d'agarose.
   
   Important: Inverser le couvercle avec précaution pour éviter les gouttelettes d'odeurs de se propager aux puits adjacents.
   
   
3. Sur l'inversion de la paupière supérieure à la surface d'agarose, permettent de diffuser l'odeur pendant 30 secondes avant d'introduire la larve.

5.2. Larves de chargement:

1. Soulevez le couvercle du dessus contenant les gouttelettes odorant juste assez pour permettre le chargement de la larve.
2. Transfert d'une larve de la solution de saccharose à la couche d'agarose. La position de départ de l'animal dépend du dosage utilisé:
   
   Pour le dosage de source de l'odeur unique, les larves sont publiés sous la gouttelette odorant.
   
   Pour le dosage de source de l'odeur multiples, les larves sont libérées entre les puits # E3 et E4 #.
   
   Important: Orienter les animaux nouvellement introduits de manière cohérente. Nous orientons nos animaux dans le sens de la pente, assurant que le corps de l'animal et la tête face à la plus forte concentration. Les animaux introduits dans une orientation opposée à celle du gradient de lancer un comportement de recherche. À notre avis, cette période de recherche initial représente une source inutile de bruit. Contrôle de l'orientation de la tête réduit le nombre d'animaux qui entrent en contact de la paroi arène pendant leur comportement exploratoire. Cette pratique ne s'amorce pas la direction du mouvement de l'animal ou augmenter significativement le nombre d'animaux anosmiques chemotaxing long de la ligne odorant par hasard (c.-à-faux-positifs dans les tests de l'odorat).
   
   
3. Remettez le couvercle en haut et en commencer l'enregistrement immédiatement.
   
   Notes: les larves saines commencent à ramper immédiatement après leur introduction dans l'arène et peut couvrir une distance de 1 cm dans les 10 premières secondes. Si l'expérimentateur est lent à amorcer l'enregistrement, de points de données initiales seront perdues. Pour cette raison, nous recommandons que l'expérimentateur devient ainsi familiariser avec les commandes du logiciel pour lancer l'enregistrement avant de tenter de lancer une expérimentation.
   
   
4. Autoriser la larve de se comporter pour la durée de l'enregistrement (en général 3 minutes).
   
   Notes: Les enregistrements sont résiliés avant la fin de la 3 min si la larve frappe le mur arène ou atteint une zone cible (comme dans le test de gradient).
   
5. A la fin de l'enregistrement, promptement soulever le couvercle et retirer la larve avec une pince ou d'un pinceau. Placer les animaux suivis dans l'eau de Petri couvercle plat contenant (ou saccharose).
   
   Important: animaux enregistrés ne sont pas réutilisés. Le plat de l'eau est simplement un réceptacle commode pour séparer les animaux enregistrés et non-enregistrés lors de l'exécution des expériences.
   
6. Si le suivi de plusieurs animaux dans une arène set-up, la charge rapide de la larve prochaine et commencer l'enregistrement, comme indiqué ci-dessus.
   
   Important: Le nombre d'essais effectués dans l'arène même set-up devrait être décidée sur la base de la stabilité du gradient qui doit être vérifié avant d'effectuer toute expérience comportementale ^2.
   
7. Une fois que toutes les larves d'être testés dans l'arène de configuration ont été suivis et retiré de l'arène, jeter le couvercle supérieur et de la couche d'agarose. Le couvercle intermédiaire (ie le couvercle d'agarose) peuvent être recyclés.
   
   Remarque: Nous conseillons aux utilisateurs de choisir Ethovision méthode de détection de la «soustraction de fond».

6. Exemple expériences ont démontré dans l'article la vidéo

6.1. Simple test source de l'odeur avec 1,0 M d'acétate d'isoamyle.

Nous aveuglément testé dix Or83b-/ - et dix mutants de type sauvage (W1118) larves à chacun desquels un certain nombre avaient été assignés. L'expérience de suiviER n'a reçu aucune information sur le génotype de chaque animal. Après chaque enregistrement, un phénotype prédictive a été attribué à chaque animal testé: smellers, si l'accumulation a été observée sous la source pour l'ensemble du procès, la non-smellers, si le chemin a rapidement quitté le quartier de la source de l'odeur. Après avoir enregistré le comportement de 20 animaux, des chemins ont été regroupés en fonction de phénotype. Le résultat de ce regroupement a ensuite été comparé avec le génotype réel de la larve: toutes les cessions effectuées ont été jugées correctes.

6.2. Multiple source de l'odeur de dosage avec des gradients exponentielle et linéaire de l'acétate d'isoamyle.

Dans cette expérience, nous avons comparé les performances des larves de type sauvage chemotaxing le long d'un gradient linéaire et une exponentielle. Comportements chimiotactiques ont été enregistrées pour deux gradients mis en place avec la plus forte concentration de 0,5 M mêmes. Comme expliqué dans l'article, les sources d'odeurs de la pente exponentielle variait entre 0,015 et 0,5. Les sources du dégradé linéaire variait entre 0,25 et 0,5 M (progression arithmétique avec une différence commune 0.05M).

Le dégradé linéaire représenté un environnement plus stimulant que le chimiotactisme la différence locale de la concentration a été constante et relativement faible, et la gamme de concentration étroite (0,25 M). En revanche, la gamme de concentration de la pente exponentielle a été plus importante avec l'augmentation des différences locales dans la concentration le long du sentier.

Quinze larves ont été enregistrées pour chacun des deux géométries de gradient et les chemins de superposer dans un même graphique. Une inspection visuelle des deux graphiques montre que les larves de type sauvage ont réussi à gravir la pente de manière fiable pour les deux géométries, mais que le montant des méandres a été plus grande pour l'état dégradé linéaire. Cela suggère que le signal présent sur toute la longueur du gradient est plus fiable pour détecter une forme exponentielle que pour un linéaire.

6.3. Plusieurs test source de l'odeur avec un gradient de l'acétate d'isoamyle dans un «toit» de la géométrie.

Ici nous vérifions que les larves introduites dans un gradient d'odeurs sont sensibles aux variations locales de la concentration d'odeur, plutôt que simplement la présence ou l'absence d'odeur. Un gradient d'isoamyle a été créé par l'application de gouttelettes d'odeur avec les concentrations suivantes: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0,12 M. La géométrie de gradient qui a suivi ressemblait à une asymétrie "toit" un pic à 0,5.

Les larves ont été libérés entre les gouttelettes d'odeur et de 0,06 M 0,12 M. Notre hypothèse était que si les larves étaient simplement le calcul de la présence de l'odeur qu'ils suivraient le gradient complet sans une préférence particulière pour le maximum de concentration. En revanche, si les larves sont sensibles aux variations locales de la concentration qu'ils s'accumulent sous les gouttelettes 0.5M. Quinze larves ont été enregistrées, et il a été constaté qu'après une courte période d'exploration toutes les larves s'accumuler sous la concentration plus élevée ainsi. Cela suggère que les variations locales de la concentration d'odeur sont calculés et informer le comportement chimiotactique de larves de drosophile.