Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Summary

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Abstract

Olfactorische reacties in Drosophila larven zijn van oudsher bestudeerd in petrischalen, bestaande uit een enkele perifere geur bron. In deze gedrags-paradigma, de onderzoeker veronderstelt meestal dat de snelle verspreiding van geurende moleculen van de bron leidt tot de creatie van een stabiele gradiënt in de schotel. Om een ​​kwantitatieve correlatie tussen de zintuiglijke input en gedragsmatige reacties, is het noodzakelijk om een ​​grondiger karakterisering van de geurstof stimulus voorwaarden te bereiken. In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Protocol

1. Apparatuur en reagentia

Geur verdunningen:

• Paraffineolie (Sigma, CAS-nummer: 8012-95-1)
• Geuren van de hoogste zuiverheid beschikbaar die aantrekkingskracht opwekt in Drosophila larven ^1. In deze video artikel, werden de dieren getest met isoamylacetaat (Sigma, CAS-nummer: 123-92-2).
• 1,5 ml glazen flacons met Teflon kap (Agilent Technologies)
• Digitale meetschaal voor een nauwkeurige verdunning van het gewicht

Assay arena set-up:

• Agarose (Promega)
• Deksels van 96-well Microplate (BD Falcon, catalogusnummer: 353071). Ons gedrag arena bestaat uit drie gestapelde deksels.
• Single-channel 10-20 ul pipetter of multi-channel pipetter naar geurstof druppel (s) te laden in het bovenste deksel van de stapel. Voor het instellen van de verschillende bronnen test maken we gebruik van 50-50 ul Pipet-Lite multi-channel pipetter van Rainin.

De voorbereiding van Drosophila larven voor gedragsverandering tests:

• 15% (w / w) sucrose-oplossing
• Reguliere Petrischalen (BD Falcon) te wassen en op te slaan larven
• Penseel (4-5mm borstel lengte) te manipuleren en overdracht larven

Het opnemen van larvale beweging:

• Kleine pinnen met een platte kop voor het overbrengen van larven in de arena
• Tang of kwast om larven te verwijderen na de opname
• Verlichte podium met een niet-homogene verwarming lichtbron, "Slim Edge" Light Pad vervaardigd door Logan Electric
• Kabinet te omringen de gedrags-arena en de controle lichtomstandigheden
• Video tracking systeem voor het registreren van de verplaatsingen van dieren. Wij maken gebruik van de Ethovision software (Noldus, Nederland).
• CCD-camera en het frame grabber videokaart (EureCard Piccolo Basic) gekocht met Ethovision software
• Thermometer en vochtigheid recorder aan de atmosferische omstandigheden volgen tijdens de gedragstesten (optioneel)
• Matlab (The Mathworks) voor op maat gemaakte data-analyse (optioneel)

2. Behavioral arena

De gedrags-arena bestaat uit drie gestapelde 96-well gerecht deksels. De onderste deksel wordt gebruikt om de rest van het systeem te isoleren van het licht pad en convectie te verminderen in de arena. De tweede deksel, bedekt met 25 ml van een 3% agarose gel, fungeert als een podium voor de larven om op te lopen. De deksel houdt de geur druppels die blijven hangen door de oppervlaktespanning.

Geur druppels worden direct gepipetteerd in de putjes van de 96-wells schaal deksel. Een enkele of meerdere geur-bronnen kunnen worden gebruikt om met verschillende hellingen en controleerbare profielen ² te genereren. Om te testen voor anosmie en chemotaxis gebreken in larven, stellen wij de volgende twee assays gebruiken.

2.1. Single geurbron test: een geur druppel gelegd in de put # E7 (standaard 96-well plaat referentie systeem).

• Stimulus: 10μl van geur verdund in paraffine-olie
• Beginvoorwaarden: een enkele larve is geïntroduceerd onder de geur bron (of in de directe omgeving).
• Basis opmerkingen: Voor aantrekkelijke stimuli (bijv. isoamylacetaat), wildtype larven zich ophopen onder de bron. Anosmic dieren of dieren onderworpen aan olfactorische gebreken snel te dwalen weg van de druppel.
• Duur van een studie: 3 minuten. De beweging van een bepaald dier is opgenomen totdat de rechtszaak is verstreken of zodra het dier contact op met de wand van de plaat.
• Mogelijke maatstaven voor gedragsverandering kwantificering: percentage van de tijd besteed door een dier in een kleine cirkelvormige zone het midden van de geurbron met een gemiddelde afstand tot de geurbron, tijdsverloop van de afstand tot de geurbron, etc.

Deze assay test efficiënt voor basis-anosmie in mutant larven. Het kan ook gebruikt worden om betrouwbaar te bepalen van de detectiegrens voor bepaalde geuren ^2.

2.2. Meerdere geurbron assay

Verschillende geur druppels zijn vastgelegd in de put van de bovenste deksel. In de huidige video-artikel, zetten we hellingen langs de centrale rij E. Een totaal zes druppels werden geïntroduceerd in putten # E2, E4 #, # E6, E8 #, # E10 en E12 # (standaard 96-well plaat referentiesysteem ). In tegenstelling tot de petrischaal en single geurbron assays, de meervoudige geurbron-test maakt kwalitatieve controle van het verloop geometrie gevestigd langs de lengte en de breedte van de arena. Deze test werd gebruikt om de sensorische mechanismen waardoor Drosophila larven chemotax ² karakteriseren.

• Stimulus: 10μl geur druppeltjes zijn vastgelegd in wisselende putten langs een rij. Deze regeling leidt tot het ontstaan ​​van een gradiënt gecentreerd geselecteerde rij. Om een ​​homogene gradiënt over de breedte van de arena, kunnen verschillende rijen worden geladen met meerdere bronnen.
• Beginvoorwaarden: een enkele larve is geïntroduceerd onder de geurbron tussen putten # E3 en #E4.
• Basis fenotypes: anosmic larven dwalen willekeurig uit het startpunt. Voor aantrekkelijke stimuli (bijv. isoamylacetaat), dieren die in staat zijn om te navigeren ruiken in de richting van toenemende geurconcentratie. De nauwkeurigheid waarmee een dier stijgt de geur parcours is gecorreleerd met zijn vermogen om betekenis en verwerken van de geurstof stimulus. Kronkelige paden worden vaak veroorzaakt door zintuiglijke gebreken. Zodra een dier heeft het punt bereikt van de hoogste concentratie in het onderzoek, blijft in de buurt van deze positie.
• Duur van een studie: 3 min maximum (langer tracking duur de neiging om ruis te introduceren als de larven hun belangstelling verliezen en uiteindelijk afzien van de gradiënt). Voor de gradiënten geïllustreerd in deze video artikel, was de beweging van een individuele larve opgenomen totdat het dier bereikte de buurt van de hoogste concentratie bron (ook # E12). De opname werd stopgezet zodra het dier bereikt het doelgebied of contact met een wand van de arena.
• Mogelijke maatstaven voor gedragsverandering kwantificering: percentage van de tijd besteed door een dier onder de geurstof lijn (blauwe rechthoek) met een gemiddelde rubriek met betrekking tot de lokale richting van de geur gradiënt, een gecombineerde score chemotaxis het meten van de wereldwijde tendens van een dier aan de geurstof te volgen lijn ^2.

3. Gradient profiel verificatie

Voor het testen larven in een bepaalde helling, is het belangrijk om vast te stellen de stabiliteit in de tijd. Op basis hiervan kan de onderzoeker bepalen een adequate duur voor elk onderzoek en het aantal larven die achtereenvolgens kunnen worden gevolgd in dezelfde arena. Voor het testen van de stabiliteit van het verloop, hebben we een methode ontwikkeld op basis van IR-spectroscopie ^2. Deze methode valt buiten het bestek van dit protocol en zal niet verder worden uitgewerkt.

4. Protocol voor de voorbereiding van een experiment

4.1. Voorbereiding van agarose platen en geur verdunningen:

1. 1. Giet 25 ml van 3% agarose op de platte top van een 96-wells schaal deksel, laat de agarose afkoelen en stollen (~ 30 min).
   
   Belangrijk: Zorg ervoor dat de 96-well deksels zijn op een vlakke ondergrond voor het storten van de agarose als de aanwezigheid van een helling op het gestolde agarose gel kan het gedrag van de larven kunnen beïnvloeden. Wanneer het gieten van de gel, verwijder eventuele luchtbellen die zich vormen op het oppervlak.
   
   
2. 2. Verdunnen geuren om de gewenste concentraties in paraffine olie met behulp van een digitale weegschaal om nauwkeurig meten van de hoeveelheid paraffine olie en geur in elke verdunning.

Opmerkingen: Bij lage geur concentraties worden gebruikt, is het beter voor te bereiden een reeks van bron concentraties op basis van seriële verdunningen. Start, bijvoorbeeld met een 1,0 M oplossing en het uitvoeren van een 1:02 verdunning tot het verkrijgen van een oplossing 0,5 M. Door te handelen herhaaldelijk, verkrijgt men een verdunningsreeks naar aanleiding van de geometrische progressie 1,0 M, 0,5 M, 0,25 M, 0.12M, 0.06M, 0.03M, 0.015M.

Belangrijk: Omdat veel organische geuren reageren met kunststof-, geur-verdunningen moet worden opgeslagen in glazen flacons met Teflon caps. Idealiter zou geuren vers worden bereid voor elke experiment om fluctuaties in de werkelijke geurconcentratie over experimenten te verminderen. Dit is vooral het geval bij het gebruik van zeer vluchtige chemicaliën.

4.2. Larven voorbereiding:

1. 1. Bereid 15% sucrose-oplossing in gedestilleerd water.
   
   Opmerkingen: Een 15% sucrose oplossing is dichter dan larven en zal ervoor zorgen dat ze ondersteund worden aan het oppervlak van de oplossing. Echter, onopgeloste vliegen eten brokken hebben een grotere dichtheid dan de oplossing en snel zinken naar de bodem. Dus, het gebruik van deze sucrose-oplossing biedt een efficiënte manier te scheiden larven uit het voedsel. Sucrose-oplossing is een uitstekend medium voor biologische verontreinigingen, indien de oplossing troebel wordt kan het filter worden gesteriliseerd om de verontreiniging te verwijderen.
   
   
2. Zorg voor een flacon met 6-dagen-oude larven of larven op de gewenste ontwikkelingsstadium.
   
   Opmerkingen: Al onze experimenten zijn uitgevoerd met zes-dagen oude larven (midden van de derde instar ontwikkelingsfase); larven in deze ontwikkelingsfase zijn groot genoeg voor het gemak van de detectie met onze software voor het bijhouden, maar ook zeer actief.
   
   
3. Giet sucrose in het voedsel flacon met de larven.
4. Met behulp van een spatel, breken en voorzichtig tot ontbinding van de vlieg voedsel voor de larven los te maken. Vrijgekomen larven zal drijven naar de oppervlakte.
5. Laat een paar minuten voor de vlieg voedsel brokken te zinken naar de bodem van de flacon, vandaar giet het sucrose en larven in een petrischaal. Als pre-selectie van de larven noodzakelijk is, kunnen dieren worden verzameld door het gieten van de sacharose door middel van een filter. Larven kunnen vervolgens worden overgedragen aan een schotel voor selectie met een penseel.
6. Laat de larven gedurende ongeveer 30 minuten in de sucrose oplossing voordat u verdergaat met gedragstesten om de dieren te wennen aan de sucrose-oplossing. Omdat de larven lijken niet te voeden met sucrose, zullen de dieren ervaren een toestand van de honger die de chemotaxis prestaties verbetert.
7. Het deksel van de petrischaal kan worden gevuld met water (of sacharose) en gebruikt als een vergaarbak voor afgedankte dieren na gedragstesten.

5. Protocol bij gedrags-opnames uit te voeren

5.1. Arena set-up:

1. 1. Van toepassing zijn geur druppels aan de onderkant (welde zijde) van een verse 96-wells schaal deksel.
   
   Belangrijk: Om besmetting van verschillende geuren en geur concentraties worden vermeden, een frisse deksel moet worden gebruikt voor het laden van elke set-up. Geen van de deksels met geur-bronnen worden gerecycled na het experiment. Afhankelijk van de geur gebruikte concentratiebereik, zijn geurstof gradiënten zijn gevonden stabiel te zijn slechts voor 10 tot 20 minuten in een gesloten systeem. Het is daarom belangrijk om het minimaliseren van de tijd tussen de gradiënt set-up en de werkelijke begin van de gedrags-test.
   
   
2. Keer de deksel en stapel er boven een tweede deksel bekleed met de 3% agarose laag.
   
   Belangrijk: Invert het deksel voorzichtig naar geur druppels voorkoming van de verbreiding naar aangrenzende putten.
   
   
3. Bij inversie van de top deksel op de agarose oppervlak, zodat de geur aan gedurende 30 seconden diffuse vóór de invoering van de larve.

5.2. Het laden van larven:

1. Til het deksel met de geurstof druppels net genoeg om het laden van de larve.
2. De overdracht van een larve van de sucrose oplossing voor de agarose laag. De uitgangspositie van het dier is afhankelijk van de test wordt gebruikt:
   
   Voor de enkele geur bron assay, zijn larven vrijgegeven onder de geurstof druppel.
   
   Voor de vele geurbron assay, zijn larven vrij tussen de putten # E3 en E4 #.
   
   Belangrijk: Orient de nieuw binnengebrachte dieren in een consistente wijze. We oriënteren onze dieren in de richting van de gradiënt, ervoor te zorgen dat het dierlijk lichaam en het hoofd de hoogste concentratie gezicht. Dieren geïntroduceerd in een richting tegengesteld aan die van de gradiënt te starten een zoekgedrag. Naar onze mening is deze eerste zoekperiode vormt een bron van onnodig lawaai. Het beheersen van de kop oriëntatie vermindert het aantal dieren dat de arena wand contact tijdens hun verkennend gedrag. Deze praktijk is niet de eerste richting van de beweging van het dier of aanzienlijke toename van het aantal dieren anosmic chemotaxing langs de lijn geurstof bij toeval (dat wil zeggen vals-positief in geur testen).
   
   
3. Plaats de deksel en onmiddellijk beginnen met de opname.
   
   Opmerkingen: Gezonde start larven kruipen direct na hun introductie in de arena en kan een afstand van 1 cm binnen de eerste 10 seconden te dekken. Als de experimentator is traag op de inleiding van de opname, zal de initiële datapunten verloren. Om deze reden adviseren wij de experimentator wordt goed vertrouwd met de software commando's om de opname te starten voordat u probeert om een ​​experiment uit te voeren.
   
   
4. Laat de larve zich te gedragen voor de duur van de opname (meestal 3 minuten).
   
   Opmerkingen: Opnames worden afgesloten voor het einde van de 3 min als de larve raakt de arena muur of bereikt een doelgebied (zoals in het verloop assay).
   
5. Aan het einde van de opname, direct til het deksel en verwijder de larve met een tang of een penseel. Plaats de gevolgde dieren in de petrischaal deksel met water (of sacharose).
   
   Belangrijk: Opgenomen dieren niet opnieuw worden gebruikt. Het water schotel is slechts een handig bakje om opgenomen en de niet-geregistreerde dieren scheiden tijdens het uitvoeren van de experimenten.
   
6. Als het bijhouden van meerdere dieren onder een arena set-up, onmiddellijk laden de volgende larve en start de opname, zoals hierboven aangegeven.
   
   Belangrijk: Het aantal onderzoeken die zijn uitgevoerd in dezelfde arena set-up moet worden vastgesteld aan de hand van het verloop stabiliteit die moeten worden gecontroleerd voordat het uitvoeren van een gedrags-experiment ^2.
   
7. Zodra alle larven te worden beproefd in de arena set-up zijn opgespoord en verwijderd uit de arena, gooi de bovenste deksel en agarose laag. De tussenliggende deksel (dat wil zeggen de agarose deksel) kan worden gerecycled.
   
   Opmerking: Wij adviseren Ethovision gebruikers naar de 'achtergrond aftrek' detectiemethode te kiezen.

6. Monster experimenten aangetoond in de video-artikel

6.1. Single geurbron test met 1,0 M van isoamylacetaat.

Mutanten en tien wild type (W1118) larven aan elk waarvan een aantal was toegewezen - we blindelings tien Or83b-/ getest. De tracking experimentER heeft geen informatie ontvangen over het genotype van elk dier. Na elke opname, was een voorspellende fenotype is toegewezen aan elk getest dier: smellers, als accumulatie werd waargenomen onder de bron voor het hele onderzoek, niet-smellers, als het pad al snel de omgeving van de geurbron links. Na de opname van het gedrag van de 20 dieren, werden paden gegroepeerd volgens fenotype. Het resultaat van deze groepering werd vervolgens vergeleken met de werkelijke genotype van de larven: alle gemaakte opdrachten bleken juist te zijn.

6.2. Meerdere geurbron assay met exponentiële en lineaire gradiënten van isoamylacetaat.

In dit experiment, vergeleken we de prestaties van wild-type larven chemotaxing langs een lineaire en een exponentiële verloop. Chemotactische gedrag werden geregistreerd voor twee hellingen met hetzelfde hoogste concentratie van 0,5 M in te stellen. Zoals uiteengezet in het artikel, de geur bronnen van de exponentiële verloop varieerde tussen 0,015 en 0,5 M. De bronnen van de lineaire gradiënt varieerde tussen 0,25 en 0,5 M (rekenkundige progressie met gemeenschappelijke verschil 0,05 M).

De lineaire gradiënt vertegenwoordigden een meer uitdagende chemotaxis omgeving als de lokale verschil in concentratie was constant en relatief klein, en de concentratie range smalle (0,25). In tegenstelling, de concentratie bereik van de exponentiële gradiënt was groter met toenemende lokale verschillen in concentratie langs de route.

Vijftien larven werden opgenomen voor elk van de twee gradiënt geometrieën en de paden gelegd in een grafiek. Een visuele inspectie van de twee grafieken blijkt dat wild-type larven in staat waren om een ​​betrouwbare stijgen de gradiënt voor beide geometrieën maar dat de hoogte van de meanderende was groter voor de lineaire gradiënt conditie. Dit suggereert dat het signaal aanwezig is langs de gradiënt lengte is meer betrouwbaar gedetecteerd voor een exponentiële vorm dan voor een lineair.

6.3. Meerdere geurbron test met isoamylacetaat gradiënt in een "dak" geometrie.

Hier hebben we controleren of larven geïntroduceerd in een geur gradiënt zijn gevoelig voor lokale veranderingen in de geurconcentratie in plaats van alleen de aanwezigheid of afwezigheid van geur. Een isoamyl gradiënt is opgericht door de toepassing van de geur druppeltjes met de volgende concentraties: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0.12M. De daaruit voortvloeiende gradiënt geometrie leek op een asymmetrische "dak" een piek van 0,5 M.

Larven werden uitgebracht tussen de 0.06M 0.12M en de geur druppels. Onze hypothese was dat als de larven waren slechts het berekenen van de aanwezigheid van geur zouden ze de hele helling te volgen zonder een voorkeur voor de concentratie maximum. In tegenstelling, als larven zijn gevoelig voor lokale veranderingen in de concentratie zouden ze zich ophopen onder de 0,5 M druppel. Vijftien larven werden opgenomen, en het bleek dat na een korte oriënterende periode alle larven verzameld onder de hogere concentratie goed. Dit suggereert dat de lokale veranderingen in de geurconcentratie worden berekend en op de hoogte van de chemotactische gedrag van Drosophila larven.