Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Summary

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Abstract

Drosophila larvaları Olfaktör yanıtları geleneksel tek bir periferik koku kaynağı içeren Petri kutularına çalışılmıştır. Bu davranış paradigma, deneyci genellikle kaynaktan odorant moleküllerin hızlı difüzyon çanak istikrarlı bir degrade yaratılmasına neden olduğunu varsayar. Duyusal girdilerin ve davranışsal yanıtları arasında kantitatif bir ilişki kurmak için, daha kapsamlı bir karakterizasyonu odorant uyaran koşulları elde etmek için gerekli. Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Protocol

1. Ekipman ve Reaktifler

Koku dilüsyonları:

• Parafin yağı (Sigma, CAS numarası: 8012-95-1)
• Drosophila larvaları ¹ cazibe ortaya çıkarır yüksek saflıkta kullanılabilir kokuları. Bu video makalede, hayvanlar izoamil asetat (Sigma: 123-92-2, CAS numarası) ile test edildi.
• 1.5ml Teflon kapaklı cam şişe (Agilent Technologies)
• Ağırlık olarak hassas seyreltme için dijital ölçme skalası

Set-up Testi arenada:

• Agaroz (Promega)
• 96-well Mikroplaka (353.071 BD Falcon, katalog numarası) Kapaklar. Bizim davranış arenada üç yığılmış kapakları oluşur.
• Tek kanallı 1-20 ul pipetter veya çoklu-kanal pipetter odorant damlacık (ler), yığının en üst kapağının içine yüklemek için. Birden fazla kaynak deneyi kurmak için, biz Rainin 5-50 ul pipetleyin-Lite çok kanallı pipetter kullanın.

Drosophila davranış testleri için hazırlanması larva:

• % 15 (w / w) sakaroz çözeltisini
• Düzenli Petri kapları (BD Falcon) larvaları yıkayın ve saklamak için
• Larvaları işlemek ve aktarmak için boya-fırça (4-5mm kıl uzunluğu)

Larva hareket Kaydı:

• Arenaya larva transferi için düz bir kafa ile Küçük pimleri
• Forseps veya kaydettikten sonra larvalar çıkarmak için fırça
• Olmayan homojen bir ısıtma ışık kaynağı ile aydınlatılmış bir sahne, "İnce Edge" Işık Pad Logan Electric tarafından imal
• Kabine surround davranış arenada ve kontrol ışık koşullarında
• Video izleme sistemi, hayvan hareketlerini kayıt için. Biz Ethovision yazılımı (Noldus Hollanda) kullanıyor.
• CCD kamera ve frame grabber video kartı (Temel EureCard Piccolo) Ethovision yazılımı ile satın
• Termometre ve nem kaydedici (isteğe bağlı) davranış testleri sırasında atmosferik koşullar izlemek için
• Özelleştirilmiş veri analizi için Matlab (Mathworks) (isteğe bağlı)

2. Davranış arenada

Davranışsal arenada üç yığılmış 96-iyi çanak kapakları oluşur. Alt kapak, ışık ped sistemin geri kalanından izole ve konveksiyon arenada azaltmak için kullanılır. % 3 agaroz jel 25ml ile kaplı ikinci bir kapak, larvalar üzerine yürümek için bir sahne olarak hizmet vermektedir. Üst kapak yüzey gerilimi ile askıda kalır koku damlacıkları tutar.

Koku damlacıklar 96-iyi çanak kapağı kuyu içine doğrudan pipetlenir. Tek veya birden fazla koku kaynakları farklı, doğrulanabilir profilleri ² geçişinde oluşturmak için kullanılabilir. Anosmi ve larvaları kemotaksis kusurları için test için, aşağıdaki iki testleri kullanmayı öneriyoruz.

2.1. Tek koku kaynağı tahlil: iyi # E7 belirtilen tek bir koku damlacık (standart 96-plaka referans sistemi).

• Uyaran: parafin yağı seyreltilmiş koku 10μl
• İlk koşulları: Tek bir larva, koku kaynağı (veya yakın mahallede) altında tanıtıldı.
• Temel gözlemler: çekici uyaranlara (örneğin izoamil asetat), wild tip larva kaynağı altında birikir. Koku alma hatalarına maruz Anosmic hayvan veya hayvan hızla damlacık uzak dolaşın.
• Deneme Süresi: 3 dk. Deneme süresi en kısa sürede hayvan temas plaka duvar olarak geçen ya kadar verilen bir hayvanın hareket kaydedilir.
• Olası davranışsal ölçümü için ölçümlerini: küçük dairesel bir bölgede koku kaynağı merkezli bir hayvan tarafından harcanan zaman yüzdesi; koku kaynağına mesafe demek; koku kaynağı mesafe zaman ders vb.

Bu testte verimli mutant larvaları temel anosmi testleri. Aynı zamanda özellikle kokuları ² için güvenilir algılama eşiğini belirlemek için kullanılabilir.

2.2. Birden fazla koku kaynağı tahlil

Çeşitli koku damlacıkları üst kapak iyi serilir. Mevcut video makalede, merkezi satır E. boyunca toplam altı damlacıklarının (standart 96-plaka referans sistemi kuyuları # # E4 E2, E6, E8, E12 # E10 # getirilmiştir gradyanlar kurdu .) Petri kabı ve tek koku kaynağı testlerin aksine, birden fazla koku kaynağı tahlil arena uzunluk ve genişlik boyunca kurulan degrade geometri niteliksel kontrol sağlar. Bu testte chemotax ² Drosophila larvaları izin duyusal mekanizmaları karakterize etmek için kullanıldı.

• Uyaran: 10μl koku damlacıkları Bir satır boyunca kuyu alternatif serilir. Bu düzenleme, seçili satır merkezli bir degrade yaratılmasına yol açar. Arena genişliği boyunca homojen bir degrade oluşturmak için, birkaç satır birden fazla kaynaktan yüklenebilir.
• Başlangıç ​​koşulları: Tek bir larva, kuyular # E3 ve arasındaki koku kaynağı altında tanıtıldıE4.
• Temel fenotipleri: anosmic larvaları başlangıç ​​noktası rasgele dolaşmak. Çekici uyaranlara (örneğin izoamil asetat), artan koku konsantrasyonu yönünde gezinmek kokusunu mümkün olan hayvanlar. Olan bir hayvan koku izi yükselir doğruluğu odorant uyarıcı duygusu ve işleme yeteneği ile ilişkilidir. Kıvrımlı yollar genellikle duyu kusurları neden olur. Bir hayvan, deneme en yüksek konsantrasyon noktasına ulaştı, bu pozisyonda çevresinde kalır.
• Deneme Süresi: 3 dk maksimum (larva ilgi kaybedebilir ve sonunda degrade terk gürültü tanıtmak için daha uzun takip süreleri eğilimindedir). Bu video makalede gösterilen degradeler için hayvan yüksek konsantrasyon kaynak (iyi # E12) Mahallesi'nde ulaşıncaya kadar, bireysel bir larva hareketi kaydedildi. Hayvan hedef alan ulaşıldığında veya arena herhangi bir duvara temas olarak kaydetme gibi kısa bir süre durdu.
• Olası davranış ölçümü için ölçümlerini: odorant hattı (mavi dikdörtgen) altında bir hayvan tarafından harcanan zaman yüzdesi; koku degrade yerel yönüne göre başlık anlamına gelir; kombine kemotaksis puan odorant takip etmek bir hayvanın küresel eğilimin ölçülmesi hat ^2.

3. Degrade Profil doğrulama

Belirli bir degrade larvaları test etmeden önce, zaman içinde kendi dengesini belirlemek için önemlidir. Bu temel üzerinde, deneyci her deneme için yeterli bir süre ve aynı arenada sırayla takip edilebilir larvaların sayısı belirleyebilirsiniz. Degrade kararlılık testi için, IR spektroskopisi ² dayalı bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem, bu protokol kapsamı dışındadır ve daha ayrıntılı olmayacaktır.

4. Bir deney hazırlanması için protokol

4.1. Agaroz plaka ve koku dilüsyonları hazırlanması:

1. 1. 96-iyi çanak kapağı düz üstüne 3% agaroz 25ml dökün; izin agaroz soğumaya ve katılaşmaya (~ 30 dakika).
   
   Önemli: 96-kuyu kapakları larvaların davranış etkileyebilir katılaşmış agaroz jel üzerinde bir yamaç varlığı olarak agaroz dökülmeden önce düz bir yüzey üzerinde olduğunu emin olun. Jel dökme işlemi sırasında, yüzeyde formu varsa kabarcıkları giderin.
   
   
2. 2. Parafin yağı parafin yağı ve koku her seyreltme miktarda doğru ölçmek için bir dijital ölçeği kullanarak istenen konsantrasyonlarda kokuları sulandırınız.

Notlar: düşük koku konsantrasyonlarda kullanıldığında, seri dilüsyonları dayalı kaynak konsantrasyonlarda bir dizi hazırlamak için tercih edilir. 1.0M bir çözüm ile, örneğin, bir çözüm 0.5M elde etmek için 1:2 dilüsyon, Start ve gerçekleştirmek. Tekrarlı geçmeden, bir 0.5M geometrik ilerlemesi 1.0M, 0.25m, 0.12M, 0,06 m'lik, 0.03M, 0.015M izleyerek bir seyreltme serisi alır.

Önemli: Birçok organik kokuları plastik ile reaksiyona Teflon kapaklar cam şişeleri, koku dilüsyonları saklanmalıdır. İdeal olarak, her bir deney deneyler arasında gerçek koku konsantrasyon dalgalanmaları azaltmak için önce kokuları taze hazırlanmış olmalıdır. Yüksek uçucu kimyasallar kullanarak bu özellikle doğrudur.

4.2. Larva hazırlanması:

1. 1. Distile su ile% 15 sukroz solüsyonu hazırlayın.
   
   Notlar:% 15 sakaroz çözeltisini larvaları daha yoğundur ve onlara çözüm yüzey umutlu neden olacaktır. Ancak, çözünmemiş sinek yiyecek parçaları çözüm daha büyük bir yoğunluk var ve hızla dibine çöker. Böylece, bu sakaroz çözeltisini kullanarak etkin bir gıda larvaları ayırma anlamına gelir sağlar. Sakaroz çözeltisini, biyolojik kirleticiler için mükemmel bir ortam, çözüm bulutlu hale gelirse filtresi kontaminasyonu temizlemek için sterilize edilebilir.
   
   
2. 6 gün yaşlı larva veya istenilen gelişimsel aşamada larvaları ile bir şişe alın.
   
   Notlar: Tüm deneyler, 6 gün süren eski larva (üçüncü instar gelişimsel aşamada orta) ile yürütülmektedir, bu gelişimsel aşamada larva izleme yazılımı ile algılama kolaylığı için yeterince büyük, ama aynı zamanda son derece aktif .
   
   
3. Sakaroz, larvaları içeren gıda flakon içine dökün.
4. Bir spatula kullanarak, break up ve larvaların serbest bırakmak için hafifçe sinek gıda çözülür. Çıkış larvaları yüzeye kadar yüzer.
5. Flakonun dibine batırmak için anında yiyecek parçaları için birkaç dakika bekleyin, daha sonra, bir Petri kabı içine sakaroz ve larvaları dökün. Larvaların seçim öncesi gerekli ise, hayvanların bir filtre ile sakaroz dökerek toplanabilir. Larva sonra bir fırça ile seçimi için bir çanak transfer edilebilir.
6. S yaklaşık 30 dakika boyunca larva bırakındavranış testleri ile hayvanların sakaroz çözeltisini alışmakta izin geçmeden önce ucrose çözüm. Larvaları sakaroz beslemek için görünmez olarak, hayvanların açlık durumundan kemotaksis performansını artırır yaşayacaksınız.
7. Petri kabı kapağı (veya sakkaroz) su ile doldurulur ve davranışsal testler sonrasında atılan hayvanlar için bir priz olarak kullanılabilir.

5. Protokolü davranışsal kayıtları gerçekleştirmek için

5.1. Arena set-up:

1. 1. (Doldu tarafı) yeni bir 96-iyi çanak kapağı alt koku damlacıkları uygulayın.
   
   Önemli: farklı koku ve koku konsantrasyonları kirlenmeyi önlemek için, yeni bir kapak her yükleme set-up için kullanılması gerekir. Koku kaynakları içeren kapak Yok deney sonra geri dönüştürülür. Bağlı olarak kullanılan koku konsantrasyon aralığı, odorant gradyanlar kapalı bir sistem içerisinde sadece 10 ila 20 dakika boyunca sabit olduğu tespit edilmiştir. Degrade set-up ve davranış testi asıl başlangıcı arasındaki süreyi en aza indirmek için bu nedenle önemlidir.
   
   
2. Kapağını ters çevirin ve% 3 agaroz tabakası ile kaplı ikinci bir kapak üzerinde yığını.
   
   Önemli: koku damlacıkları komşu kuyuların yayılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde kapağı haricindekileri.
   
   
3. Agaroz yüzey üzerinde üst kapağın inversiyon üzerine, koku larva tanıtan önce 30 saniye boyunca diffüz izin verir.

5.2. Yükleniyor larva:

1. Yeterli larva yükleme izin odorant damlacıkları içeren üst kapağı kaldırın.
2. Sakaroz çözeltisini agaroz katmanı bir larva transferi. Kullanılan testin hayvan başlangıç ​​pozisyonuna bağlıdır:
   
   Tek bir koku kaynağı testi için, larva odorant damlacık altında yayınlandı.
   
   Birden fazla koku kaynağı testi için, larva kuyuları # E3 ve # E4 arasında serbest bırakılır.
   
   Önemli: Orient tutarlı bir şekilde pazara yeni sunulan hayvanların. Biz degrade yönde yönlendirmek hayvanlar, hayvan vücut ve baş yüksek konsantrasyon yüz emin. Degrade bir oryantasyon karşısında tanıtıldı Hayvanlar arama davranışı başlatın. Bizim görüşümüze göre, bu ilk arama süresi gereksiz bir gürültü kaynağı temsil eder. Baş yönünü kontrol, keşif davranışı sırasında arenada duvara temas hayvanların sayısını azaltır. Bu uygulama asal hayvan hareket yönü veya önemli ölçüde şans eseri odorant hattı boyunca chemotaxing anosmic hayvanların sayısını artırmak değil (yani koku testleri yanlış pozitif).
   
   
3. Üst kapak değiştirin ve kayıt derhal başlatmak.
   
   Notlar: Sağlıklı larvaları arenada sunulmasından hemen sonra sürünerek başlar ve ilk 10 saniye içinde 1cm mesafe kapsayabilir. Deneyci kayıt başlatarak yavaş ise, ilk datapoints kaybolur. Bu nedenle, deneyci bir denemeyi çalıştırmak için denemeden önce kayıt başlatmak için iyi yazılım komutları ile tanışmış olur öneririz.
   
   
4. Larva (genellikle 3 dakika) kayıt süresi için davranmasına izin verin.
   
   Notlar: larva arenada duvara çarptığında ya da hedef alan (degrade tahlil gibi) ulaşırsa Kayıtlar 3 dakika sona ermeden önce sona erdirilir .
   
5. Kaydın sonunda, derhal kapağı kaldırın ve forseps veya bir fırça ile larva kaldırmak. Petri kabı kapağı (veya sukroz) içeren su izlenen hayvanlar yerleştirin.
   
   Önemli: Kaydedilen hayvanların yeniden değildir. Su çanağı sadece deneyler çalışırken kaydedilir ve kaydedilen un hayvanları ayırmak için uygun bir priz.
   
6. Bir arena altında birden fazla hayvan izleme set-up olursa, hemen bir sonraki larva yük ve yukarıda gösterildiği gibi kayıt başlatmak.
   
   Önemli: set-up aynı alanda yapılan çalışmaların sayısı herhangi bir davranışsal deney ² gerçekleştirmeden önce kontrol edilmelidir degrade istikrarın temelinde karar verilmelidir.
   
7. Bir kez arenada set-up izlenir ve arenada kaldırılır var altında test edilmesi için tüm larvaları, üst kapak ve agaroz katmanı atın. Ara kapak (yani agaroz kapak) geri dönüştürülebilir.
   
   Not: Biz, 'arka plan çıkarma' algılama yöntemi seçmek için Ethovision kullanıcılara tavsiye ediyoruz .

6. Video makale gösterilen örnek deneyleri

6.1. Izoamil asetat 1.0M Tek koku kaynağı tahlil.

Bir numara atanmış olan, her biri mutantlar ve on vahşi tip (W1118) larvaları - Biz körü körüne on Or83b / test. Izleme denemeer her hayvanın genotipi hakkında herhangi bir bilgi almadı. Tüm deneme için kaynak altında birikimi gözlendi, smellers yolu çabuk koku kaynağı Mahallesi'nde sol olmayan smellers, her kaydettikten sonra, bir öngörü fenotip test edilen her hayvan atandı. 20 hayvan davranışı kaydedildi ettikten sonra, yolları fenotipe göre gruplandırıldı. Bu gruplaşma sonucu larvaların gerçek genotip ile karşılaştırıldı yapılan tüm atamaları doğru olduğu tespit edildi.

6.2. Izoamil asetat üstel ve lineer degradelerle Çoklu koku kaynağı tahlil.

Bu deneyde, lineer ve üstel bir degrade boyunca chemotaxing vahşi tip larvaların performansları karşılaştırıldı. Kemotaktik davranışları 0.5M, aynı yüksek konsantrasyon ile iki gradyanlar kaydedildi. Makalede açıklandığı gibi, üstel degrade koku kaynakları, 0,015 ve 0,5 M arasında değişiyordu. Doğrusal bir degrade kaynakları, 0,25 ve 0,5 M (0.05M ortak farkı aritmetik ilerlemesi) arasında değişiyordu.

Doğrusal bir degrade, konsantrasyon, yerel fark sürekli ve görece küçük olduğu gibi daha zorlu kemotaksis ortamı temsil ve dar bir konsantrasyon aralığında (0.25m). Buna karşılık, üstel degrade konsantrasyon aralığı patikada konsantrasyon yerel farklılıklar artan büyüktü.

Onbeş larvaları, her iki degrade geometrileri ve tek bir grafikte üst üste yolları kaydedildi. Iki grafik görsel denetim, vahşi tip larva hem de geometrileri için degrade güvenilir yükselmek mümkün olduğunu ancak kıvrımlı miktarını doğrusal bir degrade durum için daha fazla olduğunu gösterir. Bu sinyalin degrade uzunluğu boyunca doğrusal bir biri için çok daha güvenilir bir üstel şekli tespit olduğunu göstermektedir.

6.3. Izoamil asetat degrade bir "çatı" geometri ile birden fazla koku kaynağı tahlil.

Burada bir koku degrade getirilen larvaların yerine sadece koku varlığı ya da yokluğu çok koku konsantrasyonu yerel değişikliklere duyarlı olduğunu doğrulayın. 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M: Bir izoamil degrade Aşağıdaki konsantrasyonlarda koku damlacıklarının uygulama tarafından kurulmuştur. Bunu takip eden degrade geometri 0.5M kadar yükselerek asimetrik bir "çatı" benziyordu.

Larva ve 0,06 m'lik 0.12M koku damlacıkları arasında serbest bırakıldı. Bizim hipotezi larvaları sadece koku varlığı bilgisayar eğer belirli bir konsantrasyonu en fazla tercih yapmaksızın tüm degrade takip edecek. Buna karşılık, eğer larvalar 0.5M damlacık altında birikir konsantrasyon yerel değişikliklere duyarlıdır. Onbeş larvaları kaydedildi ve tüm larvalar kısa bir keşif döneminde de yüksek konsantrasyonda altında biriken bulundu. Bu yerel değişiklikler koku konsantrasyonu hesaplanır ve Drosophila larvaların kemotaktik davranış bilgilendirmek olduğunu göstermektedir.