Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Производство высокотитерного рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла из аллантойной жидкости

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Здесь мы предоставляем подробную процедуру производства, очистки и количественной оценки высокотитерного рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла. Этот протокол последовательно дает > 6 × 109 бляшекобразующих единиц / мл, обеспечивая количество вируса, подходящее для исследований in vivo на животных. Описаны дополнительные анализы контроля качества для обеспечения безопасности in vivo .

Abstract

Вирус болезни Ньюкасла (NDV), также известный как птичий ортоавулавирус серотип-1, является отрицательным чувством, одноцепочечным РНК-вирусом, который был разработан как онколитический вирус, так и вирусная векторная вакцина. NDV является привлекательным лечебно-профилактическим средством благодаря своей хорошо зарекомендовавшей себя системе обратной генетики, мощным иммуностимулирующим свойствам и отличному профилю безопасности. При введении в виде онколитического вируса или вирусно-векторной вакцины NDV вызывает надежный противоопухолевый или антиген-специфический иммунный ответ, активируя как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы.

Учитывая эти желательные характеристики, NDV был оценен в многочисленных клинических испытаниях и является одним из наиболее хорошо изученных онколитических вирусов. В настоящее время зарегистрировано два клинических испытания с участием NDV: одно оценивает рекомбинантную NDV-векторную вакцину для SARS-CoV-2 (NCT04871737), а второе оценивает рекомбинантный NDV, кодирующий интерлейкин-12 в сочетании с Durvalumab, антителом против PD-L1 (NCT04613492). Для содействия дальнейшему продвижению этого весьма перспективного вирусного вектора необходимы упрощенные методы генерации высокотитерных, in vivo-grade, рекомбинантных NDV (rNDV).

В этой статье описывается подробная процедура амплификации rNDV в определенных эмбриональных куриных яйцах без патогенов (SPF) и очистки rNDV от аллантойной жидкости с улучшениями для уменьшения потерь во время очистки. Также включены описания рекомендуемых анализов контроля качества, которые должны быть выполнены для подтверждения отсутствия загрязняющих веществ и целостности вируса. В целом, эта детальная процедура позволяет синтезировать, очищать и хранить высокотитерный, in vivo-grade, рекомбинантный, лентогенный и мезогенный NDV для использования в доклинических исследованиях.

Introduction

Вирус болезни Ньюкасла, также известный как Птичий ортоавулавирус-1, представляет собой окутанный птичий парамиксовирус с потенциалом использования как в качестве онколитического вируса, так и в качестве вирусной векторной вакцины 1,2,3,4,5,6,7. Совсем недавно NDV, разработанный для экспрессии спайкового белка SARS-CoV-2, был охарактеризован как эффективная интраназальная вакцина в моделях 7,8,9 мышей и хомяков. При использовании в качестве иммунотерапии рака он приводит к набору врожденных иммунных клеток, в частности естественных клеток-киллеров, производству интерферона I типа и генерации противоопухолевых Т-клеток 10,11,12,13. В дополнение к этим мощным иммуностимулирующим свойствам, NDV имеет сильный профиль безопасности и хорошо зарекомендовавшую себя систему обратной генетики14,15. Эти желательные характеристики побудили к оценке NDV в многочисленных доклинических и клинических испытаниях на людях (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Для дальнейшего продвижения этого многообещающего, иммуностимулирующего вирусного вектора необходимы подробные методы производства и очистки высокотитерного, ультрачистого NDV, который можно безопасно вводить in vivo.

Поскольку NDV является птичьим парамиксовирусом, он чаще всего усиливается в эмбриональных куриных яйцах. Хотя существуют клеточные системы, доступные для распространения NDV, большинство из них не смогли получить титры, аналогичные тем, которые были достигнуты в эмбриональных куриных яйцах18. Тем не менее, есть некоторые недостатки в производстве NDV в яйцах, в том числе тот факт, что производство на основе яиц является длительным и нелегко масштабируемым, получение большого количества куриных яиц SPF может быть проблематичным, и существует потенциал для загрязнения яичными аллергенами 13,18,19,20 . Недавно одна группа показала, что клетки Vero, выращенные в суспензии в среде, свободной от сыворотки, могут поддерживать репликацию NDV к титрам, сопоставимым с теми, которые достигаются в яйцеклетках, до очистки21. Однако для этого требовалось последовательное прохождение вируса для адаптации вируса к клеткам Vero, а оптимизация метода очистки NDV от суспензионных клеток Vero по-прежнему требуется21.

Как подчеркивалось ранее, методы, используемые для очистки вируса с высоким титром in vivo, варьируются в зависимости от вируса, рассматриваемого ввопросе 22. Существует хорошо зарекомендовавшая себя система обратной генетики, доступная для генерации рекомбинантного NDV. Этот процесс, включающий использование клона кДНК, вспомогательных плазмид и вируса-помощника, экспрессирующего Т7-РНК-полимеразу, был ранее подробно описан15,23. Этот протокол может быть применен как к лентогенному, так и к мезогенному NDV. Вирус, описанный в этом протоколе, представляет собой рекомбинантный мезогенный NDV, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea victoria, вставленный между вирусными генами P и M в качестве индивидуальной единицы транскрипции, поскольку это ранее было описано как оптимальное место для введения чужеродных трансгенов24.

Закрытые методы очерчивают очистку NDV исходя из его размера, варьирующегося от 100 до 500 нм, и его плотности15. Это позволило генерировать in vivo-grade, высокотитерные запасы NDV примерно за 3 недели, начиная с момента получения яиц до окончательного титра. Описаны методы, часто используемые в крупномасштабном производстве вирусов на основе яиц, такие как тангенциальная фильтрация потока, глубинная фильтрация и ультрацентрифугирование градиента плотности, что позволяет перевести эти методы в более крупномасштабное производство. Ранее описанные методы очистки NDV были улучшены путем включения стабилизирующего вирус буфера, использования йодиксанола во время ультрацентрифугирования градиента плотности и описания различных мер контроля качества для обеспечения качества in vivo-grade 15. Это позволило очистить NDV in vivo-класса, достигая титров до 3 × 1010 PFU/mL от 0,8 до 1,0 л аллантойной жидкости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все работы, связанные с использованием животных, были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Гвельфа в соответствии с Канадским советом по уходу за животными. Вся работа выполняется в лаборатории BioSafety Level 2 (BSL2) в Канаде, где мезогенный NDV является патогеном группы риска 2. Все этапы, связанные с усилением и очисткой NDV, должны выполняться в шкафу биологической безопасности типа IIA в целях безопасности и стерильности.

1. Амплификация NDV с использованием определенных эмбриональных куриных яиц без патогенов

  1. Инокуляция куриных яиц, зародышей SPF
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, восемь десятков куриных яиц, эмбрионированных SPF, используются для получения одной партии NDV in vivo. Закажите один или два десятка дополнительных яиц, чтобы учесть ущерб во время доставки, а также изменчивость в жизнеспособности. Эмбриональные куриные яйца являются биологическим материалом и должны обрабатываться в соответствии с институциональными руководящими принципами. Однако, поскольку эмбрионы не вылупляются, институциональное одобрение Комитета по уходу за животными не требуется.
    1. После получения SPF эмбриональные куриные яйца инкубируют в яичном инкубаторе при 37 °C, влажности 60% в течение 9 дней. Убедитесь, что инкубатор настроен на автоматическое вращение яиц каждый час.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца можно хранить при комнатной температуре до 24 ч или 4 °C до 72 ч; однако это может снизить жизнеспособность эмбриона.
    2. После 8-11 дней инкубации (в идеале на 9 день) подсвечивайте яйца, чтобы определить жизнеспособность эмбриона. Ищите паутиновидные сосуды (рисунок 1A) и движение эмбрионов в качестве индикаторов жизнеспособных эмбрионов. Утилизируйте яйца, лишенные этих особенностей (рисунок 1B).
    3. На жизнеспособных яйцах отметьте интерфейс между воздушным мешком и эмбрионом карандашом буквой «X» (рисунок 1A). Убедитесь, что это место инъекции не вызовет перфорацию сосудистой системы. Верните отмеченные яйца в инкубатор во время приготовления инокулята.
    4. Рассчитайте количество вируса, необходимое для инъекции всех эмбриональных куриных яиц SPF. Убедитесь, что каждая яйцеклетка получает 100 ПФЕ вируса в объеме 100 мкл; разбавляют вирус в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) до концентрации 1 × 103 PFU/мл. Подготовьте дополнительные 20% инокулята, чтобы учесть неточности в введении вируса.
    5. С помощью антистатической салфетки очистите верхушки помеченных яиц 10% раствором йода, разведенным в 70% этаноле. Подождите примерно 1-2 мин, пока раствор высохнет.
    6. Осторожно проткните раковину с помощью пары стерильных острых пинцетов. Продезинфицируйте пинцет в 70% этаноле между яйцами.
    7. Используя шприц объемом 1 мл и иглу 25 г, вводят 100 мкл инокуляции, приготовленной на стадии 1.1.4, в хориоаллантоидальную полость (рисунок 1С). Подойдите иглой под углом почти 90° к яйцу. Вставьте иглу только в верхнюю часть хориоаллантоической мембраны.
    8. После прививки используйте лак для ногтей, чтобы покрыть место прокола и вернуть яйца в инкубатор. Убедитесь, что настройка раскачивания включена до 24 часов после прививки.
    9. Проверьте жизнеспособность яйцеклетки через 24 ч после прививки. Отбросьте мертвые яйцеклетки, у которых отсутствует сосудистая система в хориоаллантойской оболочке и движении эмбрионов (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти яйцеклетки погибли из-за процесса прививки, а не от NDV.
    10. Верните яйца в инкубатор, при этом качелька выключится, чтобы предотвратить загрязнение аллантойной жидкости яичными белками.
    11. Проверяйте яйца каждые 12-24 ч, как описано в шаге 1.1.9, чтобы идентифицировать мертвые яйца. Переместите яйцеклетки, которые умирают через 24 часа после посева, до 4 °C, чтобы свести к минимуму аутолиз. Заготавливают аллантоидную жидкость в течение 2-12 ч после охлаждения.
    12. Инкубировать яйца не менее 72 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При распространении мезогенного штамма NDV оптимальное время инкубации составляет 60-72 ч, так как длительное время инкубации может ухудшить процесс очистки из-за снижения прозрачности аллантойной жидкости. Этот вопрос не так важен при размножении лентогенных штаммов NDV, поскольку им требуется гораздо больше времени, чтобы убить эмбрион.
    13. После соответствующего инкубационного периода переместите оставшиеся яйца до 4 °C в течение 2-12 ч перед сбором аллантовой жидкости.
  2. Сбор аллантойной жидкости, содержащей NDV
    1. Переместите охлажденные яйца в шкаф биобезопасности. Ботву яиц очистить 70% этанолом.
    2. Используйте стерильный пинцет и хирургические ножницы, чтобы вскрыть апикальную сторону яйца, где расположен воздушный мешок.
    3. Снимите оболочку, чтобы выявить хориоаллантоическую мембрану (рисунок 1D).
    4. Осторожно проколите мембрану и отклейте ее обратно, чтобы обнажить аллантовую полость (рисунок 1Е). Следите за тем, чтобы желточный мешок случайно не прокололся, так как это испортит яйцо.
    5. Используйте тупые щипцы, чтобы схватить эмбрион и открыть эмбриональный мешок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость внутри эмбрионального мешка также содержит NDV.
    6. Поджмите эмбрион щипцами и соберите аллантовую жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
    7. Хранить аллантовую жидкость на льду в конических трубках по 15 мл до осветления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если аллантовая жидкость желтая, желточный мешок был скомпрометирован, и аллантовая жидкость должна быть выброшена.
    8. Центрифугирование конических трубок, содержащих аллантовую жидкость, при 1,500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
    9. Точка паузы: аликвотировать осветленную аллантоидную жидкость в конические трубки объемом 50 мл и хранить их при -80 °C для длительного хранения (например, от недель до месяцев), дополняя жидкость сахарозой до конечной концентрации 5% для защиты вируса от суровых последствий замораживания-оттаивания. Альтернативно, для краткосрочного хранения (например, 1-3 дня) дополнить аллантоидную жидкость сахарозой (конечные 5%) или 3x буфером маннитол-лизин (ML) (15% маннитола, 3% лизина; см. Дополнительную таблицу S1 для буферных рецептов) для получения конечной концентрации 1x (5% маннитола, 1% лизина) до хранения при 4 °C.

2. Очистка NDV от аллантоевой жидкости

  1. Глубинная фильтрация аллантоевой жидкости
    1. Храните огуленную аллантовую жидкость при -80 °C и размораживайте ее при 4 °C в ночь перед очисткой.
    2. В шкафу биологической безопасности установите трубку и перистальтический насос, как показано на рисунке 2.
    3. Если это еще не выполнено, объедините аллантоидную жидкость с буфером 3x ML до конечной концентрации 1x.
    4. Перед подключением глубинного фильтра стерилизуйте трубку, пропуская 50 мл 0,5 М NaOH через систему в сосуд для отходов.
    5. Промыть трубку, пропуская 100 мл стерильной молекулярной воды через систему и в сосуд для отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку NaOH инактивирует NDV, важно, чтобы линии были адекватно промыты перед введением вируссодержащей аллантойной жидкости.
    6. Загрунтуйте систему, запустив через нее 50 мл PBS, остановив насос, когда в трубе осталось примерно 5 мл PBS.
    7. Прикрепите к трубе фильтр глубины с коэффициентом удержания 1-3 мкМ и снимите второй колпачок на апикальной стороне фильтра глубины, чтобы выпустить фильтр. Начните запускать дополнительные 50 мл PBS через систему.
    8. Как только PBS начнет проходить через вентиляционное отверстие в верхней части фильтра, закройте порт и продолжайте протекать PBS через линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные пузырьки воздуха являются приемлемыми, однако наличие большого количества воздуха потребует повторного выпуска фильтра, как это описано на этапах 2.1.7 и 2.1.8.
    9. Остановите насос, когда в трубке останется примерно 5 мл PBS.
    10. Замените сосуд для отходов новым стерильным резервуаром для сбора и начните пропускать аллантовую жидкость через глубинный фильтр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Давление не должно превышать 10 фунтов на квадратный дюйм, так как это приводит к сдвигу вируса. Давлением можно манипулировать, уменьшая или увеличивая расход насоса. Если давление начинает превышать 10 фунтов на квадратный дюйм и расход не может быть уменьшен дальше, следует использовать новый фильтр глубины. В этом случае этапы 2.1.6-2.1.8 должны быть выполнены до возобновления потока аллантоевой жидкости.
    11. После того, как вся аллантоидная жидкость пройдет через фильтр, запустите 50 мл 1x ML буфера через линии, чтобы максимизировать восстановление вируса.
    12. Соберите жидкость до тех пор, пока линии не высохнут. Хранить вирус в течение ночи или до 36 ч при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как вирус был подвергнут глубинной фильтрации, продолжайте процесс очистки в течение 36 часов после завершения глубинной фильтрации.
    13. Отсоедините фильтр глубины и продезинфицируйте трубку, запустив 100 мл 0,5 М NaOH, отбеливатель 400 PPM предварительно расплавленный до 42 °C через систему перед хранением в 0,5 М NaOH.
  2. Тангенциальная фильтрация потока для концентрации NDV
    1. Соберите компоненты кассеты, как показано на фиг.3А (и как показано ранее25), в шкаф биологической безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллектор и концевая пластина должны быть вымыты в моющем средстве и высушены перед использованием. Силиконовые прокладки являются многоразовыми и должны храниться в 0,5 М NaOH вместе с кассетой.
    2. Настройте систему тангенциальной фильтрации потока (TFF) (также известную как фильтрация поперечного потока) в «открытой» конформации (рисунок 3B).
      1. Если кассета используется впервые, соберите кассету TFF в конформацию Elution и промывайте 100 мл стерильной молекулярной воды (рисунок 3C).
      2. Как только в резервуаре резервуара останется всего 5 мл воды, приостановите насос и измените настройку системы TFF на закрытую конформацию (рисунок 3D).
      3. Добавьте в резервуар 100 мл 0,5 М NaOH, отбеливатель 400 PPM предварительно расплавленный до 42 °C и прокрутите через систему в течение 30-60 мин.
      4. Приостановите поток и верните систему TFF в установку элюирования, возобновив поток, чтобы элюировать чистящий раствор.
      5. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл, приостановите насос и добавьте 100 мл стерильной воды молекулярного класса для промывки системы.
      6. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл, приостановите насос и поместите систему TFF в открытую конформацию (рисунок 3B). Перейдите к шагу 2.2.3.
    3. Стерилизуйте кассету и трубку, пропуская 100 мл 0,5 М NaOH через систему с помощью перистальтического насоса. Убедитесь, что давление не превышает 30 фунтов на квадратный дюйм для поддержания целостности кассеты.
    4. Приостановите насос, когда в резервуаре останется примерно 5 мл 0,5 М NaOH.
    5. Добавьте 100 мл стерильной молекулярной воды в резервуар и возобновите прохождение жидкости через кассету. Закрутите резервуар, чтобы промыть весь NaOH со сторон резервуара, чтобы предотвратить инактивацию вируса. Повторите этап промывки резервуара.
    6. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл стерильной молекулярной воды, приостановите насос.
    7. Добавьте 100 мл PBS в резервуар, закручиваясь, чтобы обеспечить стерильную молекулярную воду с боков. Возобновите поток жидкости через кассету.
    8. Когда в резервуаре останется около 5 мл, приостановите насос, добавьте в резервуар аллантоидную жидкость с фильтрацией на глубину и возобновите поток насоса.
    9. Контролируйте манометр 1 (рисунок 3B), чтобы убедиться, что он не превышает 10 фунтов на квадратный дюйм, чтобы предотвратить сдвиг вируса. Используйте комбинацию скорости перистальтического насоса и использование С-зажимов для увеличения элюирования отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание скорости перистальтического насоса и С-зажимов приведет к повышению давления.
    10. Когда в резервуаре остается 50-100 мл аллантоической жидкости, приостановите насос для выполнения буферного обмена, добавив 150-200 мл 1x буфера ML.
    11. Возобновите расход насоса, снова контролируя манометр 1 (рисунок 3B), чтобы убедиться, что он не превышает 10 фунтов на квадратный дюйм.
    12. Когда в резервуаре останется 5-10 мл, приостановите насос.
    13. Используя два C-зажима, закройте две линии отходов, как показано на рисунке 3C.
    14. Отсоедините ретентатную линию, подающую резервуар, и вставьте ее в коническую трубку объемом 50 мл (рисунок 3C).
    15. Возобновляют поток насоса, останавливаясь, когда в резервуаре резервуара остается несколько капель жидкости.
    16. Снимите C-зажимы с линий отходов и снова прикрепите линию подачи ретентата к резервуару резервуара (рисунок 3B).
    17. Добавьте 20-25 мл буфера 1x ML и возобновите поток насоса до тех пор, пока в резервуаре резервуара не останется примерно 5 мл.
    18. Повторите шаги 2.2.13-2.2.16.
      ПРИМЕЧАНИЕ:3-е элюирование может быть выполнено путем повторения шагов 2.2.17 и 2.2.13-2.2.16 для увеличения выхода вируса. Однако большая часть вируса присутствует в первых двух элюциях.
    19. После окончания элюирования поместите вирус на лед или при температуре 4 °C.
    20. Чтобы очистить линии, настройте систему таким образом, чтобы она представляла собой формат замкнутого цикла (рисунок 3D) с линиями отходов, подаваемыми обратно в резервуар, как показано на рисунке 3D.
    21. Приступайте к очистке системы, добавляя 250 мл 0,5 М NaOH, отбеливатель 400 PPM предварительно расплавленный до 42 °C.
    22. Пропустите чистящий раствор через систему в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При рециркуляции чистящего раствора, если насос работает со скоростью 50 мл/мин, следует соблюдать давление около 5 фунтов на квадратный дюйм. Если давление превышает это, кассета загрязняется, и чистящий раствор следует заменить, а процесс повторить.
    23. Элюируйте чистящий раствор, направляя как линии отходов, так и линию ретентата в контейнер для отходов.
    24. Добавьте 400-500 мл стерильной воды в резервуар и пропустите ее через систему и в емкости для отходов.
    25. Когда в резервуаре останется примерно 5 мл, приостановите насос и добавьте 100-200 мл 0,5 М NaOH в резервуар резервуара, закручивая раствор для промывки резервуарного контейнера.
    26. Как только резервуар почти опустеет, повторите шаг 2.2.23 еще два раза.
    27. Разберите установку TFF, храня кассету и прокладки TFF в небольшом объеме 0,5 М NaOH в многоразовом пластиковом пакете при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки могут храниться при комнатной температуре под водой в 0,5 М NaOH.
  3. Ультрацентрифугирование градиента плотности йодиксанола
    1. Включите ультрацентрифугу и установите ее на предварительное охлаждение до 4 °C. Предварительно охладите желаемый ротор при 4 °C (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Роторы должны храниться при температуре 4 °C.
    2. Используйте запасной 60% раствор йодиксанола (концентрация на момент покупки) для получения 40%, 20% и 10% растворов йодиксанола путем разбавления PBS и 3x ML Buffer до 1x конечной концентрации буфера ML.
    3. В тонкостенной ультрацентрифужной трубке объемом 13,2 мл с открытым верхом накладывают 0,5 мл, 2,5 мл и 2,5 мл из 40%, 20% и 10% растворов йодиксанола соответственно (рисунок 4А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон ультрацентрифужной трубки на бок и медленное вытеснение раствора значительно снизит риск смешивания двух градиентных слоев. Разделение каждого слоя должно быть очевидным, с «ореолом», видимым между каждым слоем градиента.
    4. Используйте маркерное перо, чтобы отметить интерфейсы различных градиентных слоев.
    5. Слой 6-6,5 мл элюированного вируса от процедуры TFF над градиентом плотности. Добавьте вирус осторожно, как описано в шаге 2.3.3, чтобы не нарушить градиент плотности.
    6. Загрузите трубки ультрацентрифуги во вставки для качающегося ротора ковша (см. Таблицу материалов) с помощью шкалы с открытым верхом, чтобы сбалансировать вставки в пределах 0,01 г друг от друга. Используйте PBS или дополнительный вирус eluent для учета разницы в весе.
    7. Как только трубы будут сбалансированы, закройте трубки крышкой и загрузите их в ротор.
    8. Центрифуга в течение 1,5 ч при 125 000 × г при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть выполнено в течение ночи, если доступна ультрацентрифуга с возможностью задержки запуска.
    9. После ультрацентрифугирования удалите трубки с помощью пары стерильных щипцов. Найдите целевую полосу — большую полосу — между 10% и 20% градиентами (рисунок 4B).
    10. Подвешивайте трубку над верхней частью стакана с помощью подставки для реторты.
    11. Прикрепите иглу размером 18 Г х 1,5 дюйма к шприцу объемом 5 мл и проколите боковую часть трубки ультрацентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка должна быть проколота немного ниже целевой полосы, с иглой под углом вверх и скосом вверх таким образом, чтобы она попала в целевую полосу.
    12. Медленно вытяните плунжер, чтобы удалить целевую полосу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещайте иглу в пределах целевой полосы, чтобы максимизировать извлеченный вирус. Будьте осторожны, чтобы другие полосы или мусор не смешивались с целевой полосой, и избегайте приема избыточного раствора, так как это приведет к использованию большего количества диализных кассет.
    13. После того, как целевая полоса была извлечена, удалите иглу и дайте оставшемуся раствору стекать в стакан для отходов. Распределите целевую полосу в коническую трубку объемом 50 мл до тех пор, пока не будут извлечены все полосы из всех других ультрацентрифужных трубок.
    14. Повторяйте шаги 2.3.10-2.3.13 до тех пор, пока все целевые полосы не будут извлечены из всех трубок ультрацентрифуги.
    15. Альтернативный подход к извлечению целевых полос, описанный на этапах 2.3.10-2.3.13
      1. Медленно удалите жидкость, накладывающуюся на целевую полосу, с помощью пипетки. Оказавшись на целевой полосе, извлеките с помощью пипетки и храните вирус в конической трубке объемом 50 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет повторно использовать ультрацентрифужные трубки.
  4. Удаление йодиксанола из раствора вируса
    ПРИМЕЧАНИЕ: NDV-содержащая полоса появляется с плотностью йодиксанола от 15% до 16%. Концентрацию йодиксанола в растворе можно определить путем измерения абсорбции при 340 нм по отношению к стандартной кривой (дополнительный рисунок S1). Этот этап может быть опущен, поскольку не наблюдалось никаких побочных эффектов или острой токсичности при введении растворов йодиксанола этой концентрации мышам C57BL/6.
    1. Предварительно внесите 0,5-3 мл 10 кДа молекулярно-весовой диализной кассеты, погружая ее в PBS на 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана диализа должна измениться от гладкой до взъерошенной или бугристой. Если объем экстрагированного вируса превышает 10 мл, следует использовать две диализные кассеты 0,5-3 мл или диализную кассету 5-12 мл.
    2. Если применимо, используйте шприц объемом 5 или 10 мл и иглу с тупым заполнением 18 Г х 1,5 дюйма для сбора вируса из конической трубки объемом 50 мл.
    3. Используйте шприц для входа в диализную кассету, соблюдая осторожность, чтобы не проткнуть мембрану, и ввести вирус.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализную кассету можно поворачивать, чтобы манипулировать позиционированием воздушного кармана в кассете. Воздушный карман следует снять перед извлечением иглы из кассеты.
    4. Наполните стакан объемом 1 л стерильным 1x PBS, поместите внутрь перемешиватель и диализную кассету и накройте крышкой. Инкубировать при 4 °C при мягком перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте экструдированный пенополистирол и эластичную ленту для прикрепления диализной кассеты, чтобы она плавала в PBS. Кассета может слегка набухать из-за буфера ML.
    5. Через 1-2 ч заменить на свежий 1x PBS и продолжать инкубировать при 4 °C еще 8-10 ч с легким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать за ночь.
    6. Замените на свежий 1x PBS еще раз, инкубируя при комнатной температуре в течение 1-2 ч.
  5. Концентрация раствора вируса
    1. Извлеките диализную кассету из диализного буфера (рисунок 4C) и поместите ее в небольшой запечатываемый пластиковый пакет. Добавьте 15-25 мл 40% полиэтиленгликоля 20 000 МВт, чтобы диализная кассета была полностью погружена.
    2. Инкубировать при комнатной температуре с раскачиванием. Периодически проверяйте объем вируса в кассете, используя шприц объемом 5 или 10 мл и иглу с тупым заполнением 18 Г х 1,5 дюйма.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени, необходимое для концентрации вируса, будет варьироваться в зависимости от начального объема и желаемого конечного объема. Как правило, конечный желаемый объем составляет от 1 до 1,5 мл независимо от начального объема аллантойной жидкости. При проверке объема будьте осторожны, чтобы не использовать один и тот же порт, так как это поставит под угрозу целостность порта и может привести к смешиванию раствора полиэтиленгликоля и вируса.
    3. Перед удалением концентрированного вируса из диализной кассеты кратковременно промойте кассету в 1x PBS и заполните воздухом иглу с тупым заполнением размером 18 G x 1,5 дюйма.
    4. Вставьте наполненный воздухом шприц в диализную кассету и нажмите на поршень. Поверните аппарат так, чтобы концентрированный вирус можно было удалить, не удаляя ни одного из введенных воздухов.
    5. Дозируйте концентрированный вирус в коническую трубку объемом 50 мл, отмечая объем дозирования.
    6. Используя тот же шприц и иглу, вводят соответствующее количество 60% сахарозы в диализную кассету, чтобы в сочетании с ранее удаленным вирусом она находилась в конечной концентрации 5% сахарозы.
    7. Используйте пальцы в перчатках для массажа мембраны, чтобы вытеснить остаточный вирус, который, возможно, прилип к мембране, стараясь не повредить ее. Удалите часть избыточного воздуха в диализной кассете, чтобы облегчить процесс смещения.
    8. Смешайте эту промывку с вирусом уже в конической пробирке объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус в настоящее время содержится в 5% сахарозы и готов к дозированию в 20 мкл, 50 мкл, 100 мкл или 200 мкл аликвот и хранится при -80 °C. Альтернативно, для длительного хранения NDV может быть лиофилизирован и сохранен при 4°C, как описано в разделе 2.6.
  6. Лиофилизация НДВ
    1. Лиофилизируют вирус, аликвотированный в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл или конических пробирках по 15 мл при 44 × 10-3 МБАР и -52 °C в течение 16 ч.
    2. Хранить лиофилизированные образцы при 4 °C без значительного снижения титра вируса.

3. Анализы контроля качества

  1. Выделение вирусной РНК и ПЦР с обратной транскрипцией для подтверждения генома
    1. Разморозьте аликвоту вируса 20 мкл. Следуйте протоколу выделения вирусной РНК, поставляемому с комплектом.
    2. Немедленно используйте изолированную РНК в качестве шаблона для ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или храните ее при -80 °C.
    3. Подготовьте реакции обратной транскрипции, как описано в протоколе, предоставленном производителем.
    4. Используйте полученную кДНК в качестве шаблона для различных реакций ПЦР контроля качества для подтверждения патотипа NDV (таблица 1, набор праймеров белка F) и наличия необходимых элементов контроля генов (таблица 1, набор праймеров transgene).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки должны быть спроектированы на основе распространяемой деформации NDV.
      1. Для секвенирования участка расщепления белка F, основного детерминанта патотипа, используют набор праймеров белка F (таблица 1). Ищите продукт ПЦР длиной 435 пар оснований.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь грунтовки были разработаны на основе штамма LaSota NDV (genbank accession AF077761.1). Хорошо известно, что оптимальная экспрессия трансгена происходит, когда чужеродный трансген вставлен между генами P и M24.
      2. Используйте набор праймеров трансгена для подтверждения целостности начальных и конечных элементов гена трансгена. Секвенировать продукт ПЦР для подтверждения целостности последовательности начала и конца гена.
    5. Отправьте продукты ПЦР для секвенирования ДНК и сравните их с шаблоном для гомологии.
  2. Окрашивание SDS PAGE и Coomassie для обнаружения загрязняющих белков
    1. Отлить гель С градиентом плотности SDS PAGE путем предварительного приготовления 6% и 15% растворов полиакриламида (Дополнительная таблица S1). Используйте пипетку 10 мл для извлечения 5 мл 15% раствора, а затем 5 мл 6% раствора.
    2. Извлеките пипетку из раствора и создайте пузырь воздуха, ненадолго подтягивая воздух.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда воздушный пузырь движется вверх, это смешивает решение для создания градиента SDS PAGE.
    3. Дозируйте раствор в литейный аппарат и дайте ему затвердеть в течение 30 мин.
    4. В конечном объеме 20 мкл соедините аликвоту вируса с 4-кратным восстановительным буфером (дополнительная таблица S1) так, чтобы конечная концентрация составляла 1x, и кипятите в течение 10 мин при 95 °C в термоциклере. Загрузите не менее 1 × 107 ПФЕ вируса.
    5. Погрузите страницу SDS в работающий буфер (дополнительная таблица S1) и загрузите образцы.
    6. Запускают гель при 120 В в течение 1-1,5 ч.
    7. Извлеките гель из работающего буфера и переложите его в контейнер меньшего размера.
    8. Добавьте раствор для окрашивания Coomassie (дополнительная таблица S1) для покрытия геля. Инкубировать при комнатной температуре в течение 4-5 ч.
    9. Удалить окрашивающий раствор и добавить раствор для дестина (Дополнительная таблица S1), инкубируя в течение 4-8 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Измените решение destain три-четыре раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гель должен быть прозрачным, а его цвет должен быть таким, каким он был до окрашивания.
    10. Нанесите изображение геля на колориметрическую настройку. См. рисунок 5 для репрезентативного изображения окрашенного Coomassie геля SDS PAGE, содержащего образцы из аллантойной жидкости и очищенного вируса.
  3. Количественная оценка инфекционного вирусного титра по средней инфекционной дозе культуры ткани (TCID50) и иммунофлуоресцентному анализу
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки Vero могут использоваться в качестве альтернативы ячейкам DF1; однако цитопатический эффект (CPE) менее выражен в клетках Vero. NDV, содержащий мутацию L289A, которая усиливает фузогенность, и экспрессирующий GFP между генами P и M , используется в этом анализе.
    1. Засейте 96-луночную пластину клеток DF1 на 20 000 клеток / лунку в объеме 80 мкл за день до использования DMEM, дополненного 2% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 125 мкг / мл трипсина. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO2.
    2. На следующий день разморозьте 20 мкл аликвоты вируса на льду.
    3. Используйте пробирки по 1,5 мл для приготовления последовательных разведений. Начинают с разбавления 10 мкл вируса 990 мкл PBS для приготовления 10-2 разведения. Приготовьте все остальные разведения, минимум до 10-10 , приготовленные с 900 мкл PBS и добавлением 100 мкл предыдущего разведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый наконечник пипетки при перемещении между разведениями.
    4. Используйте 20 мкл каждого разведения для заражения каждой скважины 96-луночной пластины, как показано на рисунке 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем в каждой скважине составит 100 мкл.
    5. Инкубируют пластину в течение, по меньшей мере, 48 ч при 37 °C и 5% CO2, прежде чем исследовать на наличие CPE/GFP или выполнять непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих условиях культивирования CPE проявляется через 10 ч (рисунок 7A-D), увеличиваясь в течение следующих 24 ч (рисунок 7E-H). Пластина может быть инкубирована дольше, чтобы улучшить интенсивность CPE при оценке GFP или CPE.
      1. Если оценка по CPE или GFP и НЕ выполняетСЯ IFA, перейдите к шагу 3.3.18.1.
    6. При выполнении ИФА промывайте ячейки дважды 100 мкл 1x PBS.
    7. Добавьте в каждую лунку 100 мкл 4% параформальдегида, разведенного в PBS, и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре.
    8. Промывайте клетки 3x 5 мин каждая 100 мкл 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Пермеабилизируют клетки путем добавления 100 мкл 0,1% NP-40 в PBS и инкубации их при комнатной температуре в течение 10 мин.
    10. Промывайте клетки 3x 5 мин со 100 мкл 0,1% PBS-T.
    11. Добавьте 100 мкл блокирующего буфера, состоящего из 5% (V/V) нормальной козьей сыворотки, разведенной в 0,1% PBS-T в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
    12. Добавляют 100 мкл на лунку первичного мышиного анти-NDV рибонуклеопротеинового антитела, разведенного в 0,1% PBS-T до 1 мкг/мл, инкубируя в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
    13. Промывайте клетки 3x в течение 5 мин в 100 мкл 0,1% PBS-T.
    14. Добавьте 100 мкл вторичного антитела AlexaFluor 488 Goat против мыши, разведенного в 0,1% PBS-T до 2 мкг/мл. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
    15. Промывайте клетки 3x в течение 5 мин в 100 мкл 0,1% PBS-T.
    16. После окончательной промывки оставьте клетки в 100 мкл 0,1% PBS-T.
    17. Изобразите скважины с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.
    18. При выполнении IFA ищите флуоресценцию, большую, чем в отрицательных контрольных скважинах, что указывает на то, что скважина положительна для NDV, как показано на рисунке 8.
      1. Обратите внимание на наличие синцитии и больших, округлых клеток, которые характеризуют NDV CPE. Если скоринговые колодцы заражены вирусом, экспрессирующим GFP, ищите наличие GFP.
    19. Введите соответствующую информацию в калькулятор титров Spearman-Karber26 для определения ПФУ/мл вируса (таблица 2). См. рисунок 6 для примера титрной пластины TCID50 .
  4. Количественная оценка титра вируса с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать одношаговый комплект qRT-PCR для экономии времени и уменьшения манипуляций с образцами. Зондовый анализ используется для повышения специфичности обнаружения последовательностей вирусов.
    1. Создайте стандартную кривую известного количества последовательностей вирусов (дополнительный рисунок S2A,B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать, купив синтетический 500 bp двухцепочечный фрагмент ДНК гена NDV L. Последовательность для фрагмента 500 bp гена NDV L можно увидеть на дополнительном рисунке S2C.
    2. Преобразуйте количество фрагмента ДНК вируса (обычно предоставляемого производителями в виде нанограммов или фемтомол) в количество молекул или копий фрагмента ДНК, используя число Авогадро и формулу молей в молекулы (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Подготовьте стандартные образцы кривой, подготовив десятикратную серию разбавления известных копий фрагментов ДНК вируса, начиная от 1,00 ×10 10 копий до 1,00 × 100 копий.
    4. Чтобы определить количество РНК NDV в неизвестных образцах, извлеките РНК NDV с помощью набора для экстракции РНК. Следуйте протоколу, прилагаемому к комплекту. Как только РНК будет извлечена, перейдите к рекомендуемому протоколу, представленному в одношаговом наборе qRT-PCR.
    5. Запускайте реакции в приборе ПЦР в режиме реального времени со следующими температурными и циклическими условиями: 1) один цикл обратной транскрипции при 55 °C в течение 10 мин; 2) один цикл начальной денатурации при 95 °С в течение 1 мин; и 3) 40 циклов денатурации (95 °C в течение 10 с), удлинения (60 °C в течение 30 с) и получения флуоресцентного сигнала.
    6. После завершения анализа qRT-PCR сгенерируйте стандартную кривую на основе образцов стандартной кривой с помощью программного обеспечения прибора ПЦР в режиме реального времени (дополнительный рисунок S2A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение также рассчитает количество РНК NDV в неизвестных образцах на основе стандартной кривой.
  5. Тестирование безопасности на острую токсичность у мышей
    1. Вводят 1 × 108 ПФЕ вируса внутривенно через хвостовую вену трем 8-недельным мышам BALB/C для оценки острой токсичности.
    2. Следите за мышами на предмет неблагоприятных событий, таких как потеря веса (>20%), сгорбленная осанка, взъерошенная шерсть, летаргия и изменения дыхания. Оценивайте три-четыре раза в день в течение первых 48 ч. Поскольку мыши должны начать восстанавливаться через 48 ч, контролируйте их один-два раза в день до полного выздоровления.
      1. Вводите физиологический раствор подкожно и поддерживающий уход по мере необходимости. Например, дополнить восстанавливающим диетическим гелем, арахисовым маслом или использовать тепловые шайбы. Усыпляйте мышей, которые достигли критериев конечной точки, как указано в руководящих принципах учреждения по уходу за животными, путем передозировки изофлурана с последующим вывихом шейки матки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сбор алнантоевой жидкости
Поскольку аллантоидная жидкость собирается из эмбриональных куриных яиц, она должна казаться прозрачной и прозрачной. Если жидкость выглядит непрозрачной и желтой, это свидетельствует о наличии загрязнений. Включение этой аллантойной жидкости во время очистки будет препятствовать процессу очистки, так как давление будет быстро повышаться и превышать 10 фунтов на квадратный дюйм, что приведет к сдвигу вируса и потере инфекционного вируса. Аллантоевая жидкость, которая кажется кровавой, предполагает, что яйца были инокулированы слишком большим количеством ПФУ вируса. Выход из этой партии яиц будет значительно ниже ожидаемого и вряд ли этот вирус удастся использовать in vivo. Яйцеклетки, привитые лентогенным NDV, должны по-прежнему иметь сосудистую систему, проявляющуюся через 72 ч, и эмбрионы не должны были умереть, как показано на рисунке 1. Если они это сделали, это говорит о том, что эмбрион был поврежден или загрязнен каким-то образом.

Ультрацентрифугирование градиента плотности йодиксанола
После ультрацентрифугирования между 10% и 20% градиентами должна быть расположена белая, содержащая NDV полоса с высоким титром (рисунок 4B).

Coomassie пятно гелей SDS-PAGE
На рисунке 5 показана разница между неочищенным (полоса 2) и очищенным вирусным запасом (полоса 3). Сравнение этих двух показателей показывает значительное снижение интенсивности загрязняющих белковых полос и появление доминирующих полос NDV в очищенном вирусном запасе.

Количественная оценка вирусного титра по TCID50
При использовании рекомендуемых условий при титровании концентрированного запаса NDV, CPE должен проявляться через 24 ч (рисунок 6). По сравнению с лентогенным штаммом NDV аналогичного титра, CPE более выражен в мезогенном штамме в тот же момент времени.

Анализ острой токсичности у 8-недельных мышей BALB/C
Когда 1 × 108 ФФУ вводились внутривенно, мышей следует контролировать на предмет побочных эффектов, таких как потеря веса >20%, взъерошенная шерсть, сгорбленная осанка и аномальное дыхание. В течение первых 24-36 часов мыши начнут терять вес и, вероятно, разовьют взъерошенную шерсть и сгорбленную позу. Однако, если вирус достаточно чистый, мыши начинают выздоравливать, что наблюдается при наборе веса и улучшении осанки и состояния шерсти через 36 ч. Мыши, которые не показывают этих признаков восстановления к 36 ч, должны продолжать тщательно контролироваться по критериям конечных точек. Как правило, это происходит из-за неточного титрования, потенциально из-за агрегации вирусных частиц.

Figure 1
Рисунок 1: Заражение и сбор NDV из определенных эмбриональных куриных яиц, не содержащих патогенов. (A) Паутиноподобная сосудистая система (стрелки), которая должна проявляться после 9 дней инкубации в дополнение к движению эмбриона. «X» обозначает границу раздела между хориоаллантоической мембраной и воздушной полостью, и где должно быть создано отверстие для инокуляции яйцеклетки. (B) Изображение мертвого эмбриона. Обратите внимание на отсутствие паутинообразной сосудистой системы. Также будет наблюдаться отсутствие движения эмбриона. (C) Диаграмма компонентов эмбрионального куриного яйца с указанием расположения воздушной полости, желточного мешка, амниотического мешка, хориоаллантоической мембраны и аллантойной жидкости. D) Удаление оболочки для обнажения хориаллантоидальной оболочки. (E) Иллюстрирует, как должна выглядеть аллантоическая жидкость и эмбрион после открытия хориоаллантоической мембраны. Аббревиатура: NDV = вирус болезни Ньюкасла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема, описывающая общую сборку аппарата, используемого для глубинной фильтрации. Убедитесь, что манометр установлен перед фильтром глубины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Настройка тангенциальной фильтрации потока в различных конфигурациях. Стрелки показывают направление потока жидкости. (A) Иллюстрация того, как собирается кассета TFF. (B) Схема системы TFF в ее "открытой" конфигурации, используемой при очистке и концентрации жидкости. (C) Схема установки TFF при элюировании жидкости из системы, используемой во время элюирования вируса и чистящего раствора. (D) Схема системы TFF в ее «закрытой» конфигурации, которая используется при очистке системы TFF. Аббревиатура: TFF = Тангенциальная фильтрация потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Ультрацентрифугирование градиента плотности и диализ концентрированного вируса из TFF. (A) Схема, показывающая состав градиента плотности йодиксанола. (B) Схема полосирования вируса после ультрацентрифугирования вируса, полученного с использованием буфера ML в процессе очистки. Основная вируссодержащая полоса обозначена черным овалом. (C) Типичный размер диализной кассеты, загруженной 10 мл вируса, полученного через градиент йодиксанола в конце процедуры диализа. Аббревиатура: TFF = Тангенциальная фильтрация потока; ML = Маннитол-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Окрашенный Coomassie гель SDS-PAGE. Гель сравнивает наличие загрязняющих белков между неочищенными (полоса 2) и очищенными (полоса 3) мезогенными запасами NDV при загрузке 1 × 105 PFU. Полосы 1 и 4 = молекулярно-весовая лестница (МВт). NDV HN, F0 и его субъединицы после расщепления F1 и F2 вместе с их соответствующими молекулярными массами27 показаны белым шрифтом. Сокращения: SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; NDV = вирус болезни Ньюкасла; ПФУ = бляшеобразующие единицы; HN = гемагглютинин; F0 = Слияние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Пример макета пластины с 96 скважинами, используемой для определения титра вируса по TCID50. Пластина разделена на 12 столбцов, каждая из которых представляет собой различное последовательное разбавление. Положительные скважины (определяемые либо CPE, трансгенной экспрессией, либо IFA) обозначены серым цветом. Учитывая количество положительных скважин в этом примере, ожидаемый титр после использования калькулятора титра Спирмена-Карбера (таблица 2) указан как в TCID50/мл, так и в PFU/мл. Сокращения: TCID50 = медиана инфекционной дозы культуры тканей; CPE = цитопатический эффект; IFA = иммунофлуоресцентный анализ; PFU = бляшеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Сравнение CPE после инфицирования клеток DF1 лентогенным или мезогенным NDV. MOI 0,5 использовали после 10 ч инкубации (A-D) или 24 ч инкубации (E-H) в различных условиях культивирования DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% аллантойной жидкости или DMEM + 2% FBS + 125 мкг/мл трипсина. Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: CPE = цитопатический эффект; NDV = вирус болезни Ньюкасла; МВД = множественность инфекции; FBS = фетальная бычья сыворотка; DMEM = среда модифицированного орла Дульбекко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Пример ситуации, когда IFA необходим для титрования лентогенного NDV, не имеющего трансгена GFP. Клетки Vero культивировали в DMEM, содержащем 2% FBS и 125 мкг/мл трипсина. Снимки были сделаны из 10-7 серийных разведений. (A) Яркое изображение инфицированных клеток. (B) Иллюстрирует типичный внешний вид окрашенных клеток, когда IFA используется для обнаружения вируса. (C) Объединенное изображение (A) и (B). Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: IFA = иммунофлуоресцентный анализ; NDV = вирус болезни Ньюкасла; GFP = зеленый флуоресцентный белок; FBS = фетальная бычья сыворотка; DMEM = среда модифицированного орла Дульбекко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Праймеры ПЦР и ОТ-qPCR для выявления сегментов генов вируса болезни Ньюкасла. Наборы праймеров используются для специфической амплификации двух областей генома NDV. Набор праймеров белка F приводит к амплификации области белка F, которая охватывает участок расщепления белка F. Набор трансгенных праймеров усиливает межгенную область между генами фосфопротеина и матрицы, оптимальный сайт вставки трансгена. Эта таблица также содержит последовательности праймеров, которые нацелены на вирусный ген L21 и зонд гена L, используемый в анализе qRT-PCR. Сокращения: ПЦР = полимеразная цепная реакция; ОТ-qPCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; NDV = вирус болезни Ньюкасла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Калькулятор титра Спирмана-Карбера. Эта интерактивная электронная таблица содержит соответствующий рабочий процесс и уравнения для определения концентрации вируса с использованием результатов TCID50 на основе скважинного инокулята в мл, схемы разбавления и количества реплик на разбавление. Концентрация сообщается как объем в мл, необходимый для инфицирования 50% культуры тканей (TCID50) и бляшек, образующих единицы на мл суспензии вируса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный рисунок S1: Определение концентраций йодиксанола. (A) Стандартная кривая, полученная из абсорбции растворов известной концентрации йодиксанола при 340 нм. (B) Стандартная кривая и уравнение из (A) использовались для определения концентрации йодиксанола в растворе после ультрацентрифугирования градиента плотности, диализа и концентрации полиэтиленгликоля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Амплификация и стандартная кривая, полученная из анализа qRT-PCR синтетического двухцепочечного фрагмента ДНК 500 bp гена NDV L. Амплификация (А) и стандартная кривая (В) были созданы из образцов, содержащих десятикратное последовательное разбавление (1,0 × 109 копий до 1,0 ×10 0 копий) фрагмента ДНК. Для усиления и стандартной кривой образцы, содержащие 1,0 × 101 копий и 1,0 × 100 копий, были ниже порогового значения и не давали значения точки пересечения ниже 35 Cp. Окончательная стандартная кривая была сгенерирована на основе образцов, содержащих 1,0 × 109 копий до 1,0 × 102 копий фрагмента ДНК. (C) Последовательность ДНК 500 нуклеотидного фрагмента гена NDV L, используемого для генерации стандартной кривой в протоколе qRT-PCR. Сокращения: ПЦР = полимеразная цепная реакция; ОТ-qPCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; NDV = вирус болезни Ньюкасла; Cp = точка пересечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Загрузка и извлечение NDV из диализной кассеты. (A) Типичный размер диализной кассеты после загрузки приблизительно 10 мл вируссодержащего раствора, выделенного из градиента плотности сахарозы и изображенного в конце стадии диализа. (B) Пример результатов, полученных при использовании ультрацентрифугирования градиента плотности йодиксанола без буферных добавок ML. Encircled является целевой вирусной полосой для удаления. Стрелками обозначена дополнительная полоса, которая может содержать поврежденные вирионы. Обратите внимание, что после включения буфера ML в процесс очистки эта полоса больше не проявляется. Сокращения: NDV = вирус болезни Ньюкасла; ML = маннитол-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Приведены этапы, необходимые для генерации растворов вестерн-блоттинга и буфера ML, используемых в процессе очистки. Сокращения: SDS-PAGE = электрофорез додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия; TEMED = тетраметилэтилендиамин; ML = Маннитол-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Вирусы, используемые в качестве терапевтических средств в доклинических исследованиях, должны быть высоко очищены, чтобы избежать токсичности при введении in vivo15. Если случайные агенты или загрязняющие вещества не удаляются, это может привести к тяжелым побочным реакциям, сводящим на нет терапевтический эффект вирусного агента28. Поскольку NDV продуцируется в эмбриональных куриных яйцах, существует несколько загрязняющих яичных белков, таких как овальбумин, которые должны быть удалены перед его использованием in vivo в доклинических или клинических моделях29. Даже после интенсивного очищения овальбумин все еще обнаруживается29. Удаление этих загрязняющих белков является строгим процессом, требующим значительного времени и ресурсов 15,22. Если NDV может быть получен в клеточной системе при достаточно высоких титрах, необходимых для применения in vivo, это может упростить процесс очистки и улучшить трансляцию NDV в клинических условиях. Тем не менее, производство онколитического NDV на основе яиц использовалось в многочисленных клинических испытаниях на людях30.

На каждом этапе процесса очистки образцы могут быть нанесены на пластины с агаром крови в качестве дополнительной меры контроля качества для обеспечения отсутствия бактериального загрязнения.

Давление во время глубинной фильтрации не должно быстро нарастать. Это является признаком белкового загрязнения и значительно замедлит процесс очистки и потребует использования дополнительных глубинных фильтров. Глубинная фильтрация не должна завершаться быстро; Этот шаг обычно занимает 1-1,5 ч. Обычно быстрое завершение стадии глубинной фильтрации приводит к более низкому титру вируса.

По мере концентрации вируса в резервуар из ретентатной линии должен выходить «облачный поток». Это говорит о том, что в аллантоической жидкости есть вирус, который концентрируется при прохождении через кассету.

Во время как глубинной фильтрации, так и тангенциальной фильтрации потока давление никогда не должно превышать 10 фунтов на квадратный дюйм. Превышение этого давления приведет к сдвигу вируса. Добавление буфера ML к аллантойной жидкости действует как стабилизирующий агент и, как предполагается, предотвращает вирусную агрегацию, что приводит к повышенному восстановлению инфекционного вируса без ущерба для фильтруемости.

В приведенном выше способе описана подходящая процедура получения как лентогенных, так и мезогенных штаммов NDV в условиях BSL-2, поскольку мезогенный NDV не является избранным агентом в Канаде. Это приводит к созданию высокотитерных запасов, пригодных для использования на животных моделях. Подобно другим протоколам в литературе, в которых используются методы очистки с исключением размера, такие как глубинная фильтрация и TFF, эти методы ограничивают использование более жестких методов ультрацентрифугирования, где восстановление вируса уменьшается по сравнению с методами очистки15 с исключением размера.

Использование TFF обеспечивает элемент масштабируемости, поскольку TFF может быть использован для концентрации больших начальных объемов, в отличие от методов ультрацентрифугирования. Существующие методы очистки NDV улучшены в вышеуказанном протоколе путем замены сахарозы на йодиксанол на стадии ультрацентрифугирования, что значительно снижает вероятность потери вируса из-за разрыва кассеты в конце стадии диализа, и добавления буфера ML, который улучшает фильтрацию и увеличивает выход.

Использование градиентов йодиксанола предпочтительнее градиентов сахарозы, поскольку йодиксанол менее вязкий и нетоксичный для клеток и обеспечивает «более чистый» конечный продукт31,32. Йодиксанол достоверно снижал уровни провоспалительных цитокинов и хемокинов, присутствующих после ультрацентрифугирования очищенного вируса33 с градиентом плотности. Насколько нам известно, это первый раз, когда йодиксанол был использован в очистке NDV. Концентрацию йодиксанола в растворе можно определить путем количественной оценки абсорбции при 340 нм со ссылкой на стандартную кривую. Эта характеристика была использована для определения того, что NDV полосы примерно на 15% йодиксанола и для подтверждения того, что он может быть удален с помощью диализа (дополнительный рисунок S1B). Йодиксанол был первоначально разработан как контрастное средство визуализации, и мы не наблюдали никаких побочных эффектов, когда 15% раствор йодиксанола вводили внутривенно и интраназально мышам C57BL/6. Это говорит о том, что диализ для удаления йодиксанола может не потребоваться, сокращая процесс очистки примерно на 16 ч. Кроме того, сахароза является гигроскопичной, заставляя диализную кассету значительно набухать, ограничивая объем, который может быть введен, и увеличивая риск разрыва кассеты и потери вируса34,35. Когда равные объемы вируса, приготовленного йодиксанолом и сахарозой, вводились в диализные кассеты, в вирусе, приготовленном йодиксанолом, наблюдалось значительно меньше отеков (сравните рисунок 4C и дополнительный рисунок S3A). Однако сахароза является более подходящим стабилизатором для NDV, чем йодиксанол. Это привело к добавлению градиента йодиксанола буфером ML. До добавления буфера ML в процесс очистки наблюдалась более интенсивная полоса в 10% градиенте йодиксанола в дополнение к целевой полосе на 15% (дополнительный рисунок S3B). Эта полоса, вероятно, содержит поврежденные или неполные вирионы, образующиеся в процессе очистки. Добавление буфера ML позволяет лучше фильтровать NDV при минимизации гигроскопичности среды градиента плотности, снижая риск разрыва диализной кассеты. Отек диализной кассеты может быть дополнительно уменьшен путем диализа в 1x PBS, дополненном 5% сахарозой, так как в конечном итоге это то, в чем будет храниться вирус.

Поскольку NDV является отрицательным смыслом, одноцепочечный РНК-вирус, изолирующий РНК и генерирующий кДНК с использованием случайных праймеров и специфических наборов праймеров для ПЦР, позволяет секвенировать различные области генома из одной реакции кДНК (таблица 1). Это важно, так как позволяет подтвердить патотип и целостность трансгена и его транскрипционных регуляторных элементов. Участок расщепления лентогенного белка NDV F должен быть моноосновным, а не многоосновным, поскольку NDV, обладающие полиосновными участками расщепления, обычно являются мезогенными или велогенными патотипами и классифицируются как избранные агенты36,37. Этот протокол также описывает надежный метод RT-qPCR для высокопроизводительной количественной оценки геномов NDV. Перед его использованием на животных моделях и после завершения других анализов контроля качества острая токсичность должна быть оценена у 8-недельных мышей BALB / C. Этот штамм характеризуется как более чувствительный к токсичности, вызванной вирусом, чем другие штаммы мышей15. Кроме того, это даст некоторое представление о точности титра вируса. Например, будет наблюдаться потеря веса, но вес должен начать увеличиваться через 36-48 ч. Если это не так, то возможно, что титр вируса выше, чем первоначально сообщалось, что может быть связано с агрегацией вирусных частиц. Этот первоначальный результат после очистки рекомбинантного NDV привел к включению буфера ML на протяжении всего процесса очистки. Этот буфер был предложен для улучшения фильтруемости и восстановления вируса во время процессов очистки38.

При количественной оценке концентрации инфекционного вируса по TCID50 может потребоваться использование IFA для визуализации инфекции NDV, особенно при более высоких разведениях, когда CPE может быть неочевидным, или если вирус не экспрессирует флуоресцентный репортерный ген (рисунок 8). Первичное антитело, используемое для IFA, специфично для рибонуклеопротеина NDV, белкового комплекса, который связывается с геномом РНК во время репликации генома. Поскольку NDV является птичьим вирусом, клеточная линия фибробластов куриного эмбриона, DF1, является оптимальной клеточной линией для оценки титра вируса. Как правило, вирусотрицательная аллантоидная жидкость используется в качестве средства для обеспечения трипсиноподобных протеаз, необходимых лентогенным NDV для расщепления белка F39. Применения вирусотрицательной аллантойной жидкости можно избежать, добавляя 125 мкг/мл трипсина при снижении концентрации FBS до 2%. Это обеспечивает простую, экономически эффективную альтернативу вирусоотрицательной аллантоической жидкости, в то же время обеспечивая необходимые трипсиноподобные протеазы. При сравнении этих двух условий культивирования при MOI 0,5 в течение 24-часового промежутка времени, по-видимому, существует небольшая разница между ними, причем среда, дополненная трипсином, потенциально приводит к большему количеству CPE (рисунок 7). Другие клеточные линии, такие как клетки Vero, могут использоваться с теми же условиями культивирования; однако CPE менее выражен. Используя вышеуказанный протокол с ячейками DF1, NDV CPE должен быть очевиден в течение 24 часов. В частности, следует увидеть формирование синцитии к 24 ч (рисунок 7E-H). Используя описанную процедуру очистки, мы последовательно очищали NDV до титров в диапазоне от 1 × 109-3 ×10 10 PFU/мл от стартового объема 0,8-1,0 л аллантойной жидкости.

В целом, описанный протокол улучшает ранее опубликованные процедуры очистки NDV за счет использования йодиксанола в качестве среды градиента плотности вместо сахарозы и путем добавления буфера ML для улучшения фильтрации. Кроме того, описан дополнительный метод титрования NDV, включен подробный метод RT-qPCR для определения числа копий NDV, а также определены оптимальные условия применения трипсина вместо аллантойной жидкости при титровании вируса. Хотя этот процесс генерирует запасы NDV с высоким титром, которые могут быть введены системно в высоких дозах, эта процедура включает в себя несколько этапов, которые могут увеличить изменчивость среди пользователей и ввести потенциал для загрязнения. Дополнительным ограничением является требование о том, чтобы исходный материал был высокого качества. Крайне важно, чтобы аллантоидная жидкость не содержала загрязняющего желтка, так как это значительно снижает эффективность этапов фильтрации и исключения размера. В целом, этот процесс занимает много времени, но его можно сократить, исключив этап диализа. Эта процедура приводит к большему выходу вируса in vivo по сравнению с другими методами очистки15,18. Способность производить более качественный, более концентрированный NDV расширяет его возможности для использования в качестве онколитического агента или вектора вакцины в животных моделях заболеваний как в доклинических, так и в клинических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

J.G.E.Y был получателем стипендии Ветеринарного колледжа Онтарио PhD и стипендии для выпускников Онтарио. Эта работа финансировалась Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery Grants to SKW (грант No 304737) и LS (грант No 401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

Tags

Исследование рака выпуск 183
Производство высокотитерного рекомбинантного вируса болезни Ньюкасла из аллантойной жидкости
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. … More

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter