Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Produksjon av high-titer rekombinant Newcastle Disease Virus fra Allantoic Fluid

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Her gir vi en detaljert prosedyre for produksjon, rensing og kvantifisering av høy-titer rekombinant Newcastle disease virus. Denne protokollen gir konsekvent > 6 × 109 plakkdannende enheter/ml, og gir virusmengder som er egnet for in vivo dyrestudier. Ytterligere kvalitetskontrollanalyser for å sikre sikkerhet in vivo er beskrevet.

Abstract

Newcastle disease virus (NDV), også kjent som aviær orthoavulavirus serotype-1, er en negativ følelse, enkeltstrenget RNA-virus som er utviklet både som et onkolytisk virus og en viral-vektorisert vaksine. NDV er et attraktivt terapeutisk og profylaktisk middel på grunn av det veletablerte omvendte genetikksystemet, potente immunostimulerende egenskaper og utmerket sikkerhetsprofil. Når det administreres som et onkolytisk virus eller en virusvektorvaksine, fremkaller NDV en robust antitumor- eller antigenspesifikk immunrespons, som aktiverer både immunsystemets medfødte og adaptive armer.

Gitt disse ønskelige egenskapene, har NDV blitt evaluert i en rekke kliniske studier og er et av de mest godt studerte onkolytiske virusene. For tiden er det to registrerte kliniske studier som involverer NDV: en som evaluerer en rekombinant NDV-vektorisert vaksine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), og en annen evaluerer en rekombinant NDV-koding Interleukin-12 i kombinasjon med Durvalumab, et antiPD-L1 antistoff (NCT04613492). For å lette videreutvikling av denne svært lovende virale vektoren, er det nødvendig med forenklede metoder for å generere høyt titer, in vivo-grade, rekombinant NDV (rNDV).

Dette papiret beskriver en detaljert prosedyre for å forsterke rNDV i spesifisert patogenfri (SPF) embryonert kyllingegg og rensing av rNDV fra allantoisk væske, med forbedringer for å redusere tap under rensing. Også inkludert er beskrivelser av de anbefalte kvalitetskontrollanalysene, som bør utføres for å bekrefte mangel på forurensninger og virusintegritet. Samlet sett muliggjør denne detaljerte prosedyren syntese, rensing og lagring av høy titer, in vivo-grade, rekombinant, lentogen og mesogen NDV for bruk i prekliniske studier.

Introduction

Newcastle Disease Virus, også kjent som Aviær Orthoavulavirus-1, er et innhyllet aviært paramyxovirus med potensial til å bli brukt både som et onkolytisk virus eller en viral-vektorisert vaksine 1,2,3,4,5,6,7. Senest har NDV konstruert for å uttrykke piggproteinet til SARS-CoV-2 blitt karakterisert som en effektiv intranasal vaksine i mus- og hamsterutfordringsmodeller 7,8,9. Når det brukes som kreftimmunterapi, resulterer det i rekruttering av medfødte immunceller, spesielt naturlige drepeceller, produksjon av type I interferon og generering av antitumorspesifikke T-celler 10,11,12,13. I tillegg til disse potente immunstimulerende egenskapene har NDV en sterk sikkerhetsprofil og et veletablert omvendt genetikksystem14,15. Disse ønskelige egenskapene har ført til evaluering av NDV i en rekke kliniske prekliniske og humane studier (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. For ytterligere å fremme denne svært lovende, immunstimulerende virale vektoren, er det nødvendig med detaljerte metoder for å produsere og rense høytiter, ultrarent NDV som trygt kan administreres in vivo.

Siden NDV er et aviært paramyxovirus, forsterkes det oftest i embryonerte kyllingegg. Mens det er cellebaserte systemer tilgjengelig for forplantning av NDV, har de fleste ikke vært i stand til å produsere titere som ligner det som oppnås i embryonale kyllingegg18. Likevel er det noen ulemper ved å produsere NDV i egg, inkludert det faktum at eggbasert produksjon er lang og ikke lett skalerbar, innkjøp av store mengder SPF-kyllingegg kan være problematisk, og det eksisterer potensial for forurensning med eggallergener 13,18,19,20 . Nylig har en gruppe vist at Vero-celler dyrket i suspensjon i serumfritt medium kan støtte replikasjonen av NDV til titere som er sammenlignbare med de som oppnås i egg, før rensing21. Dette krevde imidlertid seriell passasje av viruset for å tilpasse viruset til Vero-celler, og optimalisering av en metode for å rense NDV fra suspensjon Vero-celler er fortsatt nødvendig21.

Som fremhevet tidligere, varierer metoder som brukes for rensing av høytiter, in vivo-grade virus avhengig av viruset i spørsmålet22. Det er et veletablert omvendt genetikksystem tilgjengelig for generering av rekombinant NDV. Denne prosessen, som involverer bruk av en cDNA-klon, hjelperplasmider og et hjelpervirus som uttrykker T7 RNA-polymerase, er tidligere beskrevet i detalj15,23. Denne protokollen kan brukes på enten lentogen eller mesogen NDV. Viruset beskrevet i denne protokollen er en rekombinant mesogen NDV som koder for det grønne fluorescerende proteinet (GFP) fra maneten Aequorea victoria satt inn mellom virale P- og M-gener som en individuell transkripsjonsenhet, da dette tidligere har blitt beskrevet som det optimale stedet for utenlandsk transgeninnsetting24.

Vedlagte metoder skisserer rensing av NDV basert på størrelsen, fra 100 til 500 nm, og dens tetthet15. Dette har gjort det mulig å generere in vivo-grade, høy titer NDV-bestander i ca. 3 uker, fra eggene mottas til å ha en endelig titer. Teknikker som ofte brukes i storskala produksjon av eggbaserte virus som tangentiell strømningsfiltrering, dybdefiltrering og tetthetsgradient ultrasentrifugering er beskrevet, noe som muliggjør oversettelse av disse metodene til større produksjon. Tidligere beskrevne teknikker for rensing av NDV har blitt forbedret ved inkorporering av en virusstabiliserende buffer, bruk av jodidianol under tetthetsgradient ultracentrifugering, og beskrivelsen av ulike kvalitetskontrolltiltak for å sikre in vivo-grade kvalitet15. Dette har gjort det mulig å rense in vivo-grade NDV som når titere så høye som 3 × 1010 PFU / ml fra 0,8 til 1,0 liter allantoisk væske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt arbeid som involverer bruk av dyr ble godkjent av University of Guelph Animal Care Committee i samsvar med Canadian Council on Animal Care. Alt arbeid utføres i et BioSafety Level 2 (BSL2) laboratorium i Canada hvor mesogen NDV er et risikogruppe 2 patogen. Alle trinn som er involvert i forsterkning og rensing av NDV, skal utføres i et type IIA biologisk sikkerhetsskap for sikkerhets- og sterilitetsformål.

1. Forsterkning av NDV ved bruk av spesifisert patogenfri embryonert kyllingegg

  1. Inokulering av SPF embryonated kyllingegg
    MERK: Vanligvis brukes åtte dusin SPF embryonerte kyllingegg til å generere en in vivo-klasse batch av NDV. Bestill ett eller to dusin ekstra egg for å ta hensyn til skade under frakt, samt variasjon i levedyktighet. Embryonerte kyllingegg er biologisk materiale og skal håndteres i henhold til institusjonelle retningslinjer. Men siden embryoene ikke klekkes ut, er det ikke nødvendig med godkjenning fra institusjonsdyrpleiekomiteen.
    1. Etter å ha mottatt SPF embryonated kyllingegg, inkubere i en egginkubator ved 37 ° C, 60% fuktighet i 9 dager. Forsikre deg om at inkubatoren er satt til å automatisk rocke / rotere eggene hver time.
      MERK: Egg kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 24 timer eller 4 °C i opptil 72 timer; Dette kan imidlertid redusere embryoets levedyktighet.
    2. Etter 8-11 dager med inkubasjon (ideelt på dag 9), lys eggene for å bestemme embryoets levedyktighet. Se etter web-lignende vaskulatur (figur 1A) og embryo bevegelse som indikatorer på levedyktige embryoer. Kast egg som mangler disse egenskapene (figur 1B).
    3. På de levedyktige eggene markerer du grensesnittet mellom luftsekken og embryoet med blyant med en 'X' (figur 1A). Forsikre deg om at dette injeksjonsstedet ikke forårsaker perforering av vaskulaturen. Returner de merkede eggene til inkubatoren mens inokulumet er tilberedt.
    4. Beregn mengden virus som kreves for å injisere alle SPF embryonated kyllingegg. Sørg for at hvert egg mottar 100 PFU virus i et volum på 100 μL; fortynne viruset i fosfatbufret saltvann (PBS) til en konsentrasjon på 1 × 103 PFU/ml. Forbered ytterligere 20% av inokulumet for å ta hensyn til unøyaktigheter i virusadministrasjon.
    5. Rengjør toppen av de merkede eggene med en 10% jodoppløsning, fortynnet i 70% etanol ved hjelp av en antistatisk klut. Vent ca 1-2 min til løsningen tørker.
    6. Pierce skallet forsiktig ved hjelp av et par sterile skarpe pinsett. Desinfiser pinsetten i 70% etanol mellom eggene.
    7. Bruk en 1 ml sprøyte og en 25 G kanyle til å injisere 100 μl av inokulum tilberedt i trinn 1.1.4 i chorioallantoic cavity (figur 1C). Tilnærming med nålen i nesten 90 ° vinkel mot egget. Sett nålen like inn i toppen av chorioallantoic membranen.
    8. Etter inokulasjon, bruk neglelakk for å dekke punkteringsstedet og returner eggene til inkubatoren. Forsikre deg om at gyngeinnstillingen er PÅ til 24 timer etter inokulasjon.
    9. Sjekk eggets levedyktighet 24 timer etter inokulasjon. Kast døde egg som mangler vaskulatur i chorioallantoisk membran og embryobevegelse (figur 1B).
      MERK: Disse eggene har dødd på grunn av inokulasjonsprosessen og ikke fra NDV.
    10. Sett eggene tilbake til inkubatoren, med rockeren satt AV for å forhindre forurensning av allantovæsken med eggproteiner.
    11. Sjekk eggene hver 12.-24. time som beskrevet i trinn 1.1.9 for å identifisere døde egg. Flytt eggene som dør etter 24 timer etter inokulasjon til 4 ° C for å minimere autolyse. Høst allantoisk væske innen 2-12 timer etter avkjøling.
    12. Inkuber eggene i minst 72 timer.
      MERK: Hvis forplantning av en mesogen stamme av NDV, er den optimale inkubasjonstiden 60-72 timer, da langvarig inkubasjonstid kan svekke renseprosessen på grunn av redusert klarhet i allantoisk væske. Dette problemet er ikke like viktig når man forplanter lentogene NDV-stammer, da de tar mye lengre tid å drepe embryoet.
    13. Etter riktig inkubasjonsperiode, flytt de resterende eggene til 4 ° C i 2-12 timer før du høster allantovæsken.
  2. Høsting av allantoisk væske som inneholder NDV
    1. Flytt de kjølte eggene inn i biosikkerhetsskapet. Rengjør toppen av eggene med 70% etanol.
    2. Bruk steril pinsett og kirurgisk saks for å bryte opp den apikale siden av egget der luftsekken er plassert.
    3. Fjern skallet for å avsløre den chorioallantoiske membranen (figur 1D).
    4. Punkter membranen forsiktig og skrell den av for å eksponere det allantoiske hulrommet (figur 1E). Sørg for at plommesekken ikke punkteres ved et uhell, så vel som dette vil ødelegge egget.
    5. Bruk stump tang for å ta tak i embryoet og åpne embryonale sac.
      MERK: Væsken inne i embryonale sac inneholder også NDV.
    6. Trykk ned embryoet med tangen og samle allantovæsken ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
    7. Oppbevar allantovæsken på is i 15 ml koniske rør til avklaring.
      MERK: Hvis allantovæsken er gul, har plommesekken blitt kompromittert og allantoisk væske skal kastes.
    8. Sentrifuger de koniske rørene som inneholder allantovæsken ved 1 500 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    9. Pausepunkt: Aliquot den klargjorte allantoiske væsken i 50 ml koniske rør og lagre dem ved -80 ° C for langtidslagring (f.eks. Uker til måneder), og supplere væsken med sukrose til en endelig konsentrasjon på 5% for å beskytte viruset mot de harde effektene av fryse-tine. Alternativt, for kortvarig lagring (f.eks. 1-3 dager), kan du supplere allantovæsken med sukrose (siste 5%) eller med 3x Mannitol-Lysin (ML) buffer (15% Mannitol, 3% Lysin; se Tilleggstabell S1 for bufferoppskrifter) for å gi en endelig konsentrasjon på 1x (5% Mannitol, 1% Lysin) før lagring ved 4 ° C.

2. Rensing av NDV fra allantoisk væske

  1. Dybdefiltrering av allantoisk væske
    1. Oppbevar den klargjorte allantovæsken ved -80 °C og tine den ved 4 °C natten før rensing.
    2. Sett opp slangen og den peristaltiske pumpen i et biologisk sikkerhetsskap som vist i figur 2.
    3. Hvis det ikke allerede er utført, kombiner allantoisk væske med 3x ML buffer til en endelig konsentrasjon på 1x.
    4. Før du fester dybdefilteret, steriliser slangen ved å føre 50 ml 0,5 M NaOH gjennom systemet i en avfallsbeholder.
    5. Skyll slangen ved å føre 100 ml sterilt vann av molekylær kvalitet gjennom systemet og inn i avfallsbeholderen.
      MERK: Siden NaOH vil inaktivere NDV, er det viktig at linjene vaskes tilstrekkelig før den virusholdige allantovæsken introduseres.
    6. Klargjør systemet ved å kjøre 50 ml PBS gjennom det, og stopp pumpen når det er ca. 5 ml PBS igjen i røret.
    7. Fest dybdefilteret med 1-3 μM retensjonsgrad til slangen og fjern den andre hetten på den apikale siden av dybdefilteret for å lufte filteret. Begynn å kjøre ytterligere 50 ml PBS gjennom systemet.
    8. Når PBS begynner å strømme gjennom ventilen på toppen av filteret, lukk porten og fortsett å strømme PBS gjennom linjene.
      MERK: Mindre luftbobler er akseptable, men tilstedeværelsen av store mengder luft vil kreve at filteret ventileres på nytt som beskrevet i trinn 2.1.7 og 2.1.8.
    9. Stopp pumpen når det er ca. 5 ml PBS igjen i slangen.
    10. Bytt ut avfallsbeholderen med et nytt sterilt oppsamlingsbeholder og begynn å kjøre allantoisk væske gjennom dybdefilteret.
      MERK: Trykket bør ikke overstige 10 psi, da dette resulterer i skjæring av viruset. Trykket kan manipuleres ved å redusere eller øke pumpens strømningshastighet. Hvis trykket begynner å overstige 10 psi og strømningshastigheten ikke kan reduseres ytterligere, bør et nytt dybdefilter brukes. I dette tilfellet bør trinn 2.1.6-2.1.8 utføres før strømmen av allantoisk væske gjenopptas.
    11. Når all allantoisk væske har passert gjennom filteret, kjør 50 ml 1x ML buffer gjennom linjene for å maksimere virusgjenoppretting.
    12. Samle væsken til linjene går tørre. Oppbevar viruset over natten eller opptil 36 timer ved 4 °C.
      MERK: Når viruset er dybdefiltrert, fortsett renseprosessen innen 36 timer etter fullført dybdefiltrering.
    13. Koble fra dybdefilteret og desinfiser slangen ved å kjøre 100 ml med 0,5 M NaOH, 400 PPM blekemiddel forvarmet til 42 °C gjennom systemet før lagring i 0,5 M NaOH.
  2. Tangentiell strømningsfiltrering for konsentrasjonen av NDV
    1. Monter komponentene i kassetten som vist i figur 3A (og som vist tidligere25) i et biologisk sikkerhetsskap.
      MERK: Manifolden og endeplaten skal vaskes i vaskemiddel og tørkes før bruk. Silisiumpakningene er gjenbrukbare og skal lagres i 0,5 M NaOH med kassetten.
    2. Sett opp Tangential Flow Filtration (TFF) (også kjent som cross-flow filtration) system i en "åpen" konformasjon (figur 3B).
      1. Hvis du bruker en kassett for første gang, monter du TFF-kassetten i Elution-konformasjonen og skyll med 100 ml sterilt vann av molekylær kvalitet (figur 3C).
      2. Når det bare er 5 ml vann igjen i reservoartanken, setter du pumpen på pause og endrer TFF-systemoppsettet til en lukket konformasjon (figur 3D).
      3. Tilsett 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM blekemiddel forvarmet til 42 °C i reservoaret og sykle gjennom systemet i 30-60 minutter.
      4. Sett strømmen på pause og sett TFF-systemet tilbake til elueringsoppsettet, og fortsett strømmen for å eluere rengjøringsløsningen.
      5. Når det er ca. 5 ml igjen i reservoaret, pauser du pumpen og tilsetter 100 ml sterilt vann av molekylær kvalitet for å skylle systemet.
      6. Når det er ca. 5 ml igjen i reservoaret, setter du pumpen på pause og plasserer TFF-systemet i åpen konformasjon (figur 3B). Fortsett med trinn 2.2.3.
    3. Steriliser kassetten og slangen ved å føre 100 ml 0,5 M NaOH gjennom systemet ved hjelp av den peristaltiske pumpen. Forsikre deg om at trykket ikke overstiger 30 psi for å opprettholde kassettintegriteten.
    4. Sett pumpen på pause når det er ca. 5 ml 0,5 M NaOH igjen i reservoaret.
    5. Tilsett 100 ml sterilt vann av molekylær kvalitet til reservoaret og fortsett å føre væsken gjennom kassetten. Virvle reservoaret for å vaske all NaOH fra sidene av reservoaret for å forhindre inaktivering av virus. Gjenta reservoarvasketrinnet.
    6. Når det er ca. 5 ml sterilt vann av molekylær kvalitet igjen i reservoaret, setter du pumpen på pause.
    7. Tilsett 100 ml PBS i reservoaret, virvlende for å sikre at det sterile, molekylære vannet vaskes fra sidene. Fortsett væskestrømmen gjennom kassetten.
    8. Når det er ca. 5 ml igjen i reservoaret, pause pumpen, tilsett dybdefiltrert allantoisk væske til reservoaret og fortsett pumpestrømmen.
    9. Overvåk trykkmåler 1 (figur 3B) for å sikre at den ikke overstiger 10 psi for å forhindre skjæring av viruset. Bruk en kombinasjon av hastigheten på den peristaltiske pumpen og bruk av C-klemmer for å øke eluering til avfall.
      MERK: Kombinere hastigheten til den peristaltiske pumpen og C-klemmene vil føre til økt trykk.
    10. Når det er 50-100 ml allantoisk væske igjen i reservoaret, pause pumpen for å utføre en bufferutveksling ved å legge til 150-200 ml 1x ML buffer.
    11. Fortsett pumpestrømmen, og kontroller igjen trykkmåler 1 (figur 3B) for å sikre at den ikke overskrider 10 psi.
    12. Når det er 5-10 ml igjen i reservoaret, pause pumpen.
    13. Bruk to C-klemmer til å lukke de to avfallsledningene som vist i figur 3C.
    14. Koble fra retentatelinjen som mater reservoaret og sett det inn i et 50 ml konisk rør (figur 3C).
    15. Fortsett strømmen av pumpen, pause når det er noen dråper væske igjen i reservoartanken.
    16. Fjern C-klemmene fra avfallsledningene og fest retentate-tilførselsledningen til reservoartanken igjen (figur 3B).
    17. Tilsett 20-25 ml 1x ML buffer og fortsett pumpestrømmen til det er ca. 5 ml igjen i reservoartanken.
    18. Gjenta trinn 2.2.13 til 2.2.16.
      MERK: En 3. eluering kan gjøres ved å gjenta trinn 2.2.17 og 2.2.13 til 2.2.16 for å øke virusutbyttet. Imidlertid er det meste av viruset til stede i de to første elutionene.
    19. Etter å ha fullført elueringene, legg viruset på is eller ved 4 ° C.
    20. For å rense linjene, sett opp systemet slik at det er et lukket sløyfeformat (figur 3D) med avfallsledningene som mates tilbake i reservoaret som vist i figur 3D.
    21. Fortsett å rengjøre systemet ved å legge til 250 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM blekemiddel forvarmet til 42 ° C.
    22. Flyt rengjøringsløsningen gjennom systemet over natten.
      MERK: Ved resirkulering av rengjøringsløsningen skal det observeres et trykk på ca. 5 psi hvis pumpen kjøres med en hastighet på 50 ml/min. Hvis trykket overstiger dette, er kassetten skitten, og rengjøringsløsningen skal byttes ut, og prosessen gjentas.
    23. Eluer rengjøringsløsningen ved å lede både avfallsledninger og retentate-linjen inn i en avfallsbeholder.
    24. Tilsett 400-500 ml sterilt vann til reservoaret og strømning det gjennom systemet og inn i avfallsbeholderne.
    25. Når det er ca. 5 ml igjen i reservoaret, pauser du pumpen og tilsetter 100-200 ml 0,5 M NaOH i reservoartanken, og virvler løsningen for å vaske reservoarbeholderen.
    26. Når reservoaret er nesten tomt, gjenta trinn 2.2.23 ytterligere to ganger.
    27. Demonter TFF-oppsettet, oppbevar TFF-kassetten og pakningene i et lite volum på 0,5 M NaOH i en gjenlukkbar plastpose ved 4 °C.
      MERK: Slangen kan oppbevares ved romtemperatur nedsenket i 0,5 M NaOH.
  3. Iodixanol tetthet gradient ultracentrifugation
    1. Slå på ultracentrifugen og sett den til forkjøling til 4 °C. Forkjøl også ønsket rotor ved 4 °C (se materialtabellen).
      MERK: Rotorer skal oppbevares ved 4 °C.
    2. Bruk lager 60% jodidanol løsning (konsentrasjon på kjøpstidspunktet) for å generere 40%, 20% og 10% jodidianol løsninger ved å fortynne med PBS og 3x ML Buffer til en 1x endelig konsentrasjon av ML buffer.
    3. I en 13,2 ml, åpen, tynnvegget ultracentrifuge-slange, legger 0,5 ml, 2,5 ml og 2,5 ml av henholdsvis 40%, 20% og 10% jodidanolløsninger (figur 4A).
      MERK: Å vippe ultracentrifugerøret på siden og sakte utvise løsningen vil redusere risikoen for å blande de to gradientlagene betydelig. Separasjonen av hvert lag skal være tydelig, med en "halo" synlig mellom hvert lag av gradienten.
    4. Bruk en markørpenn til å markere grensesnittene til de forskjellige gradientlagene.
    5. Lag 6-6,5 ml av det eluerte viruset fra TFF-prosedyren over tetthetsgradienten. Tilsett viruset nøye som beskrevet i trinn 2.3.3 for å unngå å forstyrre tetthetsgradienten.
    6. Legg ultracentrifugerørene inn i innsatsene for den svingende bøtterotoren (se materialtabellen) ved hjelp av en åpen skala for å balansere innsatsene innen 0,01 g fra hverandre. Bruk PBS eller ekstra viruseluent for å ta hensyn til vektforskjellene.
    7. Når rørene er balansert, hette rørene og laste dem inn i rotoren.
    8. Sentrifuge i 1,5 time ved 125 000 × g ved 4 °C.
      MERK: Dette kan utføres over natten hvis en ultracentrifuge med forsinkelse-start-funksjon er tilgjengelig.
    9. Etter ultrasentrifugering, fjern rørene ved hjelp av et par sterile tang. Se etter målbåndet - et stort bånd - mellom 10% og 20% gradienter (figur 4B).
    10. Heng røret over toppen av et beger ved hjelp av et retortstativ.
    11. Fest en 18 G x 1,5 tommers kanyle til en 5 ml sprøyte og punkter siden av ultracentrifugerøret.
      MERK: Røret skal punkteres litt under målbåndet, med nålen i en oppadgående vinkel og skrå opp slik at den vil bevege seg inn i målbåndet.
    12. Strekk stempelet sakte ut for å fjerne målbåndet.
      MERK: Flytt nålen rundt i målbåndet for å maksimere viruset ekstrahert. Vær forsiktig så andre bånd eller rusk ikke blir blandet med målbåndet, og unngå å ta overflødig løsning, da dette vil føre til bruk av flere dialysekassetter.
    13. Når målbåndet er trukket ut, fjern nålen og la den gjenværende løsningen renne ned i avfallsbegeret. Dispenser målbåndet i et 50 ml konisk rør til alle bånd fra alle andre ultracentrifugerør er trukket ut.
    14. Gjenta trinn 2.3.10-2.3.13 til alle målbåndene er trukket ut fra alle ultracentrifugerørene.
    15. Alternativ tilnærming til å trekke ut målbåndene som beskrevet i trinn 2.3.10 til 2.3.13
      1. Fjern væsken som ligger over målbåndet sakte ved hjelp av en pipette. En gang på målbåndet, ekstrakt ved hjelp av en pipette og lagre viruset i et 50 ml konisk rør.
        MERK: Dette gjør at ultracentrifuge-rørene kan gjenbrukes.
  4. Fjerning av jodisanol fra virusløsning
    MERK: Det NDV-holdige båndet vises ved en jodikrontetthet mellom 15% og 16%. Konsentrasjonen av jodisanol i løsningen kan bestemmes ved å måle absorbansen ved 340 nm i referanse til en standardkurve (supplerende figur S1). Dette trinnet kan utelates da ingen bivirkninger eller akutt toksisitet ble observert når jodidoksanoloppløsninger med denne konsentrasjonen ble administrert til C57BL/6 mus.
    1. Prewet en 0,5-3 ml 10 kDa molekylvekt cut-off dialysekassett ved å senke den i PBS i 1 min.
      MERK: Dialysemembranen bør endres fra glatt til å ha et rufsete eller humpete utseende. Hvis volumet av ekstrahert virus overstiger 10 ml, bør to 0,5-3 ml dialysekassetter eller en 5-12 ml dialysekassett brukes.
    2. Bruk enten en 5 eller 10 ml sprøyte og en 18 G x 1,5 tommers stump fyllnål for å samle viruset fra det koniske røret på 50 ml.
    3. Bruk sprøyten til å gå inn i dialysekassetten, vær forsiktig så du ikke stikker hull i membranen, og injiser viruset.
      MERK: Dialysekassetten kan roteres for å manipulere plasseringen av luftlommen i kassetten. Luftlommen skal fjernes før kanylen fjernes fra kassetten.
    4. Fyll et 1 L beger med steril 1x PBS, legg en rørestang og dialysekassetten inni, og dekk til. Rug ved 4 °C under forsiktig omrøring.
      MERK: Bruk ekstrudert polystyrenskum og et elastisk bånd for å feste dialysekassetten slik at den vil flyte i PBS. Kassetten kan hovne litt opp på grunn av ML-bufferen.
    5. Etter 1-2 timer, erstatt med fersk 1x PBS og fortsett å ruge ved 4 ° C i ytterligere 8-10 timer med liten omrøring.
      MERK: Dette kan også gjøres over natten.
    6. Bytt ut med fersk 1x PBS en gang til, inkuberes ved romtemperatur i 1-2 timer.
  5. Konsentrasjon av virusløsning
    1. Fjern dialysekassetten fra dialysebufferen (figur 4C) og legg den i en liten plastpose som kan lukkes. Tilsett 15-25 ml 40 % 20 000 MW polyetylenglykol slik at dialysekassetten er helt nedsenket.
    2. Inkuberes ved romtemperatur med rocking. Kontroller virusvolumet i kassetten med jevne mellomrom ved hjelp av en 5 eller 10 ml sprøyte og en 18 G x 1,5 tommers stump fyllnål.
      MERK: Hvor lang tid det tar å konsentrere viruset vil variere basert på startvolum og ønsket sluttvolum. Vanligvis er det endelige ønskede volumet mellom 1 og 1,5 ml uavhengig av startvolumet av allantoisk væske. Når du kontrollerer volumet, må du være forsiktig så du ikke bruker den samme porten, da dette vil kompromittere portintegriteten og kan føre til blanding av polyetylenglykoloppløsningen og viruset.
    3. Før du fjerner det konsentrerte viruset fra dialysekassetten, skyll kort kassetten i 1x PBS og fyll en 18 G x 1,5 tommers stump fyllnål med luft.
    4. Sett den luftfylte sprøyten inn i dialysekassetten og trykk inn stempelet. Roter apparatet slik at det konsentrerte viruset kan fjernes uten å fjerne noe av den introduserte luften.
    5. Dispenser det konsentrerte viruset i et 50 ml konisk rør, og noter volumet dispensert.
    6. Bruk samme sprøyte og nål, injiser en passende mengde 60% sukrose i dialysekassetten, slik at den, når den kombineres med det tidligere fjernede viruset, har en endelig konsentrasjon på 5% sukrose.
    7. Bruk hanskede fingre til å massere membranen for å løsne gjenværende virus som kan ha festet seg til membranen, og vær forsiktig så du ikke skader den. Fjern noe av overflødig luft i dialysekassetten for å lette løsrivelsesprosessen.
    8. Kombiner denne vasken med viruset allerede i 50 ml konisk rør.
      MERK: Viruset er nå i 5% sukrose og klar til å bli dispensert til 20 μL, 50 μL, 100 μL eller 200 μL aliquots og lagret ved -80 ° C. Alternativt, for langtidslagring, kan NDV frysetørkes og oppbevares ved 4 °C som beskrevet i pkt. 2.6.
  6. Lyofilisering av NDV
    1. Lyofiliser viruset aliquoted i 1,5 ml sentrifugerør eller 15 ml koniske rør ved 44 × 10-3 MBAR og -52 ° C i 16 timer.
    2. Oppbevar de lyofiliserte prøvene ved 4 °C uten signifikant reduksjon i viral titer.

3. Analyse av kvalitetskontroll

  1. Viral RNA-isolasjon og revers transkripsjon PCR for genombekreftelse
    1. Tine et 20 μL virus aliquot. Følg den virale RNA-isolasjonsprotokollen som følger med settet.
    2. Bruk umiddelbart det isolerte RNA som mal for revers transkripsjons-PCR (RT-PCR) eller oppbevar det ved -80 °C.
    3. Forbered omvendt transkripsjonsreaksjoner som beskrevet i protokollen levert av produsenten.
    4. Bruk det resulterende cDNA som mal for ulike PCR-reaksjoner for kvalitetskontroll for å bekrefte NDV-patotypen (tabell 1, F-proteinprimersett) og tilstedeværelsen av nødvendige genkontrollelementer (tabell 1, Transgene primersett).
      MERK: Primere bør utformes basert på belastningen av NDV som forplantes.
      1. For å sekvensere F-proteinets spaltningssted, den viktigste determinanten for patotype, bruk F-proteinprimersettet (tabell 1). Se etter et PCR-produkt med 435 basepar i lengde.
        MERK: Her ble primere designet basert på LaSota-stammen av NDV (Genbank-tiltredelse AF077761.1). Det er godt etablert at optimal transgeneuttrykk oppstår når et fremmed transgen settes inn mellom P- og M-genene24.
      2. Bruk transgenprimersettet for å bekrefte integriteten til genstart- og genendeelementene i transgenet. Sekvenser PCR-produktet for å bekrefte genstart og gensluttsekvensintegritet.
    5. Send PCR-produktene for DNA-sekvensering og sammenlign dem med malen for homologi.
  2. SDS PAGE og Coomassie-farging for å oppdage forurensende proteiner
    1. Kast en tetthetsgradient SDS PAGE gel ved først å klargjøre 6 % og 15 % polyakrylamidløsninger (tilleggstabell S1). Bruk en 10 ml pipette til å trekke opp 5 ml av 15 %-oppløsningen, etterfulgt av 5 ml av 6 %-oppløsningen.
    2. Fjern pipetten fra oppløsningen og generer en luftboble ved å trekke opp luft kort.
      MERK: Når luftboblen beveger seg oppover, blander dette løsningen for å lage SDS PAGE-gradienten.
    3. Dispenser løsningen inn i støpeapparatet og la den stivne i 30 minutter.
    4. I et siste volum på 20 μL, kombiner en aliquot virus med 4x reduksjonsbuffer (tilleggstabell S1) slik at den endelige konsentrasjonen er 1x, og kok i 10 minutter ved 95 ° C i en termocykler. Last minst 1 × 107 PFU av viruset.
    5. Senk SDS-SIDEN i løpende buffer (tilleggstabell S1) og last inn prøvene.
    6. Kjør gelen ved 120 V i 1-1,5 time.
    7. Fjern gelen fra løpebufferen og overfør den til en mindre beholder.
    8. Tilsett Coomassie fargeløsning (tilleggstabell S1) for å dekke gelen. Inkuberes ved romtemperatur i 4-5 timer.
    9. Fjern fargeoppløsningen og tilsett avsettende oppløsning (tilleggstabell S1), inkuberes i 4-8 timer ved romtemperatur med omrøring. Endre løsningen tre til fire ganger.
      MERK: Gelen skal være klar og fargen skal være som den var før farging.
    10. Se for deg gelen på en kolorimetrisk innstilling. Se figur 5 for et representativt bilde av en Coomassie-farget SDS PAGE gel som inneholder prøver fra allantoisk væske og renset virus.
  3. Kvantifisering av infeksiøs viral titer ved median vevskultur infeksiøs dose (TCID50) og immunfluorescensanalyse
    MERK: Vero-celler kan brukes som et alternativ til DF1-celler; Den cytopatiske effekten (CPE) er imidlertid mindre uttalt i Vero-celler. NDV som inneholder L289A-mutasjonen, som forbedrer fusogeniteten, og uttrykker GFP mellom P - og M-genene , blir brukt i denne analysen.
    1. Frø en 96-brønns plate av DF1-celler på 20.000 celler / brønn i et volum på 80 μL dagen før du bruker DMEM supplert med 2% føtalt bovint serum (FBS) og 125 μg / ml trypsin. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2.
    2. Neste dag tiner du en 20 μL aliquot av virus på is.
    3. Bruk 1,5 ml rør for å forberede seriefortynning. Begynn med å fortynne 10 μL av viruset med 990 μL PBS for å forberede en 10-2 fortynning. Forbered alle andre fortynninger, opptil 10-10 i det minste, laget med 900 μL PBS og tilsetning av 100 μL av forrige fortynning.
      MERK: Bruk en ny pipettespiss når du beveger deg mellom fortynninger.
    4. Bruk 20 μL av hver fortynning for å infisere hver brønn i 96-brønnsplaten som vist i figur 6.
      MERK: Det endelige volumet i hver brønn vil være 100 μL.
    5. Inkuber platen i minst 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2, før du undersøker om det finnes CPE/GFP eller utfører en indirekte immunfluorescensanalyse (IFA).
      MERK: Under disse kulturforholdene er CPE tydelig etter 10 timer (figur 7A-D), og øker i løpet av de neste 24 timene (figur 7E-H). Platen kan inkuberes lenger for å forbedre intensiteten til CPE hvis du scorer av GFP eller CPE.
      1. Hvis du skårer etter CPE eller GFP og IKKE utfører IFA, går du til trinn 3.3.18.1.
    6. Hvis du utfører IFA, skyll cellene to ganger med 100 μL 1x PBS.
    7. Tilsett 100 μL 4% paraformaldehyd fortynnet i PBS til hver brønn og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
    8. Vask cellene 3x 5 min hver med 100 μL av 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Permeabiliserer cellene ved tilsetning av 100 μL på 0, 1% NP-40 i PBS og inkuberer dem ved romtemperatur i 10 minutter .
    10. Vask cellene 3x 5 min med 100 μL på 0,1% PBS-T.
    11. Tilsett 100 μL blokkeringsbuffer bestående av 5 % (V/V) normalt geiteserum fortynnet i 0,1 % PBS-T i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
    12. Tilsett 100 μL per brønn med primært anti-NDV ribonukleoproteinantistoff fortynnet i 0,1 % PBS-T til 1 μg/ml, inkuberes i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
    13. Vask cellene 3x i 5 minutter i 100 μL på 0,1% PBS-T.
    14. Tilsett 100 μL av et AlexaFluor 488 Goat anti-mus sekundært antistoff fortynnet i 0,1% PBS-T til 2 μg / ml. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
    15. Vask cellene 3x i 5 minutter i 100 μL på 0,1% PBS-T.
    16. Etter den endelige vasken, la cellene stå i 100 μL på 0, 1% PBS-T.
    17. Se for deg brønnene ved hjelp av et omvendt fluorescerende mikroskop.
    18. Når IFA utføres, se etter fluorescens som er større enn det som er sett i de negative kontrollbrønnene, noe som indikerer at brønnen er positiv for NDV som vist i figur 8.
      1. Se etter tilstedeværelsen av syncyti og store, avrundede celler som karakteriserer NDV CPE. Hvis du scorer brønner infisert med et virus som uttrykker GFP, se etter tilstedeværelsen av GFP.
    19. Skriv inn riktig informasjon i Spearman-Karber titer kalkulator26 for å bestemme PFU / ml av viruset (tabell 2). Se figur 6 for et eksempel TCID50 titerplate.
  4. Kvantifisering av viral titer ved kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR)
    MERK: Et ett-trinns qRT-PCR-sett anbefales for å spare tid og redusere manipuleringen av prøvene. En probebasert analyse brukes til å øke spesifisiteten til deteksjon for virussekvenser.
    1. Lag en standardkurve for en kjent mengde av virussekvensene (supplerende figur S2A, B).
      MERK: Dette kan gjøres ved å kjøpe et syntetisk 500 bp dobbeltstrenget DNA-fragment av NDV L-genet. Sekvensen for et 500 bp fragment av NDV L genet kan ses i supplerende figur S2C.
    2. Konverter mengden av virusets DNA-fragment (vanligvis gitt som nanogram eller femtomoler av produsenter) til antall molekyler eller kopier av DNA-fragment ved å bruke Avogadros antall og molene til molekyler formel (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Forbered standardkurveprøvene ved å utarbeide en ti ganger fortynningsserie av kjente virus-DNA-fragmentkopier, fra 1,00 × 1010 eksemplarer ned til 1,00 × 100 eksemplarer.
    4. For å bestemme mengden NDV RNA i ukjente prøver, ekstraher NDV RNA ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett. Følg protokollen som fulgte med settet. Når RNA er ekstrahert, fortsett med den anbefalte protokollen som er gitt i ett-trinns qRT-PCR-settet.
    5. Kjør reaksjonene i et sanntids PCR-instrument med følgende temperatur- og sykkelforhold: 1) en syklus med revers transkripsjon ved 55 °C i 10 minutter; 2) en syklus med innledende denaturering ved 95 °C i 1 min; og 3) 40 sykluser med denaturering (95 °C i 10 s), forlengelse (60 °C for 30 s) og fluorescerende signalanskaffelse.
    6. Når qRT-PCR-analysen er fullført, genererer du standardkurven basert på standardkurveprøvene ved hjelp av pcr-instrumentprogramvaren i sanntid (supplerende figur S2A,B).
      MERK: Programvaren vil også beregne mengden NDV RNA i ukjente prøver basert på standardkurven.
  5. Sikkerhetstesting for akutt toksisitet hos mus
    1. Injiser 1 × 108 PFU virus intravenøst via halevenen i tre 8 uker gamle BALB/C mus for å vurdere akutt toksisitet.
    2. Overvåk musene for bivirkninger som vekttap (>20%), bøyd holdning, rufsete pels, sløvhet og endringer i respirasjon. Vurder tre til fire ganger daglig i løpet av de første 48 timene. Som mus bør begynne å komme seg etter 48 timer, må du overvåke dem en til to ganger daglig til de er fullstendig gjenopprettet.
      1. Administrer saltvann subkutant og støttende behandling etter behov. For eksempel, supplere med utvinning diett gel, peanøttsmør, eller bruke varme pucks. Avliv mus som har nådd endepunktskriterier, som skissert i retningslinjene for dyrepleieinstitusjoner, ved overdosering av isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Høsting av allantoisk væske
Som allantoisk væske høstes fra embryonerte kyllingegg, bør den virke klar og gjennomsiktig. Hvis væsken virker ugjennomsiktig og gul, indikerer dette tilstedeværelsen av forurensninger. Inkludering av denne allantoiske væsken under rensing vil hindre renseprosessen, da trykket raskt vil stige og overgå 10 psi, noe som resulterer i skjæring av viruset og tap av smittsomt virus. Allantoisk væske som virker blodig antyder at eggene ble inokulert med for mange PFU av virus. Utbyttet fra denne batchen av egg vil være betydelig lavere enn forventet, og det er usannsynlig at dette viruset vil kunne brukes in vivo. Egg inokulert med lentogen NDV skal fortsatt ha vaskulatur tydelig etter 72 timer, og embryoene skal ikke ha dødd, som visualisert i figur 1. Hvis de har det, antyder dette at embryoet har blitt skadet eller forurenset på en eller annen måte.

Iodixanol tetthet gradient ultracentrifugation
Etter ultrasentrifugering bør et høyt titer, hvitt, NDV-holdig bånd være plassert mellom 10% og 20% gradienter (figur 4B).

Coomassie flekk av SDS-PAGE geler
Figur 5 viser forskjellen mellom en urenset (Lane 2) og renset viruslager (Lane 3). En sammenligning av de to viser en signifikant reduksjon i intensiteten av forurensende proteinbånd og fremveksten av dominerende NDV-bånd i den rensede virusbestanden.

Kvantifisering av viral titer ved TCID50
Hvis man bruker de anbefalte forholdene ved titering av en konsentrert bestand av NDV, bør CPE være tydelig etter 24 timer (figur 6). Sammenlignet med en lentogen stamme NDV av lignende titer, er CPE mer uttalt i den mesogene stammen på samme tidspunkt.

Akutt toksisitetsanalyse hos 8 uker gamle BALB/C mus
Når 1 × 108 PFU ble administrert intravenøst, bør mus overvåkes for bivirkninger som vekttap >20%, ruffled pels, bøyd stilling og unormal respirasjon. I løpet av de første 24-36 timene vil musene begynne å gå ned i vekt og sannsynligvis utvikle rufflede strøk og en bøyd holdning. Men hvis viruset er tilstrekkelig rent, begynner musene å komme seg, som observert ved vektøkning og forbedring i holdning og kappetilstand etter 36 timer. Mus som ikke viser disse tegnene på bedring innen 36 timer, bør fortsatt overvåkes nøye for endepunktskriterier. Vanligvis har dette skjedd på grunn av unøyaktig tittering, potensielt på grunn av aggregering av viruspartikler.

Figure 1
Figur 1: Infeksjon og høsting av NDV fra spesifiserte patogenfrie embryonerte kyllingegg. (A) Weblignende vaskulatur (piler) som skal være tydelig etter 9 dagers inkubasjon i tillegg til embryobevegelse. 'X' betegner grensesnittet mellom den chorioallantoiske membranen og lufthulen, og hvor hullet skal opprettes for inokulering av egget. (B) Bilde som viser et dødt embryo. Legg merke til fraværet av weblike vaskulatur. Mangel på embryobevegelse vil også bli observert. (C) Diagram over komponentene i et embryonert kyllingegg som viser plasseringen av lufthulen, eggeplommesekken, fostervesken, chorioallantoisk membran og allantoisk væske. (D) Fjerning av skallet for å eksponere den koriallantoiske membranen. (E) Illustrerer hvordan allantoisk væske og embryo skal se ut etter åpningen av chorioallantoic membranen. Forkortelse: NDV = Newcastle disease virus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk fremstilling av generalforsamlingen av apparatet som brukes til dybdefiltrering. Forsikre deg om at trykkmåleren er installert oppstrøms for dybdefilteret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Tangentielt strømningsfiltreringsoppsett i de forskjellige konfigurasjonene. Pilene viser retningen på væskestrømmen. (A) Illustrasjon av hvordan TFF-kassetten er satt sammen. (B) Skjematisk av TFF-systemet i sin "åpne" konfigurasjon som brukes under rensing og konsentrasjon av væske. (C) Skjematisk av TFF-oppsettet når væske blir eluert fra systemet, som brukes under eluering av virus og rengjøringsmiddel. (D) Skjematisk av TFF-systemet i sin "lukkede" konfigurasjon, som brukes under rengjøring av TFF-systemet. Forkortelse: TFF = Tangentiell strømningsfiltrering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Tetthetsgradient ultrasentrifugering og dialyse av konsentrert virus fra TFF. (A) Skjematisk viser sammensetningen av jodinjonsdensitetsgradienten. (B) Virusbåndmønster etter ultrasentrifugering av virus produsert ved bruk av ML-buffer under renseprosessen. Det viktigste virusholdige båndet er betegnet med en svart oval. (C) Typisk størrelse på en dialysekassett lastet med 10 ml virus fremstilt gjennom en jodidianolgradient ved slutten av dialyseprosedyren. Forkortelse: TFF = Tangentiell strømningsfiltrering; ML = Mannitol-Lysine. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Coomassie-farget SDS-PAGE gel. Gel sammenligner tilstedeværelsen av forurensende proteiner mellom urensede (bane 2) og rensede (lane 3) mesogene NDV-lagre når 1 × 105 PFU ble lastet. Baner 1 og 4 = molekylvektstige (MW). NDV HN, F0 og dets underenheter etter spaltning, F1 og F2, sammen med deres respektive molekylvekter27 er vist i hvit skrift. Forkortelser: SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese; NDV = Newcastle sykdom virus; PFU = plakkdannende enheter; HN = hemagglutinin; F0 = Fusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på et 96-brønns plateoppsett som brukes til å bestemme virus titer ved TCID50. Platen er delt inn i 12 kolonner, hvor hver kolonne representerer en annen seriell fortynning. Positive brønner (som bestemt av enten CPE, transgene uttrykk eller IFA) er indikert i grått. Gitt antall positive brønner i dette eksemplet, er forventet titer etter bruk av Spearman-Karber titerkalkulator (tabell 2) oppført i både TCID50/ml og PFU/ml. Forkortelser: TCID50 = median vevskultur infeksiøs dose; CPE = cytopatisk effekt; IFA = immunfluorescensanalyse; PFU = plakkdannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Sammenligning av CPE etter infeksjon av DF1-celler med lentogen eller mesogen NDV. En MOI på 0,5 ble brukt etter 10 timers inkubasjon (A-D) eller 24 timers inkubasjon (E-H) under forskjellige kulturforhold av DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% allantoisk væske eller DMEM + 2% FBS + 125 μg / ml trypsin. Skala barer = 200 μm. Forkortelser: CPE = cytopatisk effekt; NDV = Newcastle sykdom virus; MOI = mangfold av infeksjon; FBS = føtalt bovint serum; DMEM = Dulbecco's Modified Eagle's medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Et eksempel på en situasjon der IFA er nødvendig for å titere en lentogen NDV som mangler et GFP-transgen. Vero-celler ble dyrket i DMEM som inneholdt 2 % FBS og 125 mikrogram/ml trypsin. Bilder ble tatt fra 10-7 seriefortynning. (A) Brightfield bilde av infiserte celler. (B) Illustrerer det typiske utseendet til fargede celler når IFA brukes til å oppdage virus. (C) Et sammenslått bilde av (A) og (B). Skala barer = 100 μm. Forkortelser: IFA = immunfluorescensanalyse; NDV = Newcastle sykdom virus; GFP = grønt fluorescerende protein; FBS = føtalt bovint serum; DMEM = Dulbecco's Modified Eagle's medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: PCR- og RT-qPCR-primere for påvisning av Newcastle disease virus gensegmenter. Primersett som brukes til spesifikk forsterkning av to regioner i NDV-genomet. F-proteinprimersett resulterer i forsterkning av en region av F-proteinet som spenner over F-proteinets spaltningssted. Transgene primer sett forsterker den intergene regionen mellom fosfoprotein og matriksgener, det optimale transgene innsettingsstedet. Denne tabellen inneholder også primersekvensene som retter seg mot det virale L-genet21 og L-gensonden som brukes i qRT-PCR-analysen. Forkortelser: PCR = polymerasekjedereaksjon; RT-qPCR = revers transkripsjon kvantitativ PCR; NDV = Newcastle disease virus. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Spearmann-Karber titer kalkulator. Dette interaktive regnearket inneholder riktig arbeidsflyt og ligninger for å bestemme viruskonsentrasjon ved hjelp av TCID50-resultater basert på brønninokulum i ml, fortynningsskjema og antall replikasjoner per fortynning. Konsentrasjon er rapportert som volum i ml som er nødvendig for å infisere 50 % av vevskulturen (TCID50) og plakkdannende enheter per ml virussuspensjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende figur S1: Bestemmelse av jodidoksanolkonsentrasjoner. (A) Standardkurve generert fra absorbansen av løsninger med kjent jodidoksanolkonsentrasjon ved 340 nm. (B) Standardkurven og ligningen fra (A) ble brukt til å bestemme konsentrasjonen av iodixanol i oppløsning etter tetthetsgradient ultrasentrifugering, dialyse og polyetylenglykolkonsentrasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Forsterkning og standardkurve generert fra qRT-PCR-analyse av syntetisk 500 bp dobbeltstrenget DNA-fragment av NDV L-genet. Amplifikasjonen (A) og standardkurven (B) ble opprettet fra prøver som inneholdt ti ganger seriell fortynning (1,0 × 109 kopier til 1,0 × 100 kopier) av DNA-fragmentet. For forsterknings- og standardkurven var prøvene som inneholdt 1,0 ×10 1 eksemplarer og 1,0 × 100 eksemplarer under grenseverdien og ga ikke en krysningspunktverdi under 35 Cp. Den endelige standardkurven ble generert basert på prøver som inneholdt 1,0 × 109 kopier til 1,0 × 102 kopier av DNA-fragmentet. (C) DNA-sekvens av 500 nukleotid NDV L-genfragmentet som brukes til å generere standardkurven i qRT-PCR-protokollen. Forkortelser: PCR = polymerasekjedereaksjon; RT-qPCR = revers transkripsjon kvantitativ PCR; NDV = Newcastle sykdom virus; Cp = krysningspunkt. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Lasting og ekstraksjon av NDV fra dialysekassetten. (A) Den typiske størrelsen på en dialysekassett etter å ha blitt belastet med ca. 10 ml virusholdig oppløsning isolert fra en sukrosetetthetsgradient og avbildet på slutten av dialysetrinnet. (B) Et eksempel på resultatene oppnådd ved bruk av iodixanol tetthet gradient ultracentrifugation uten ML buffer tilskudd. Encircled er målet virus band for fjerning. Indikert av pilene er et ekstra bånd som kan inneholde skadede virioner. Merk at etter inkorporering av ML-buffer i renseprosessen, er dette båndet ikke lenger tydelig. Forkortelser: NDV = Newcastle disease virus; ML = mannitol-lysin. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Gir trinnene som kreves for å generere western blot-løsninger og ML-buffer som brukes under renseprosessen. Forkortelser: SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese; TEMED = tetrametyletylendiamin; ML = Mannitol-lysin. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virus brukt som terapeutiske midler i prekliniske studier må være svært renset for å unngå toksisitet når de administreres in vivo15. Hvis utilsiktede midler eller forurensninger ikke fjernes, kan dette føre til alvorlige bivirkninger som negerer den terapeutiske effekten av virusmidlet28. Siden NDV produseres i embryonale kyllingegg, er det flere forurensende eggproteiner, som ovalbumin, som må fjernes før bruk in vivo i prekliniske eller kliniske modeller29. Selv etter intensiv rensing er ovalbumin fortsatt funnet29. Fjerning av disse forurensende proteinene er en streng prosess som krever betydelig tid og ressurser 15,22. Hvis NDV kan produseres i et cellebasert system med tilstrekkelig høye titere som kreves for in vivo-applikasjoner, kan dette forenkle renseprosessen og forbedre oversettelsen av NDV til kliniske omgivelser. Imidlertid har eggbasert produksjon av onkolytisk NDV blitt brukt i en rekke kliniske studier på mennesker30.

Ved hvert trinn i renseprosessen kan prøver strekkes på blodagarplater som et ekstra kvalitetskontrolltiltak for å sikre fravær av bakteriell forurensning.

Trykket under dybdefiltrering skal ikke bygge seg opp raskt. Dette er et tegn på proteinforurensning og vil redusere renseprosessen betydelig og kreve bruk av ekstra dybdefiltre. Dybdefiltrering bør ikke fullføres raskt; dette trinnet tar vanligvis 1-1,5 time. Vanligvis resulterer rask fullføring av dybdefiltreringstrinnet i en lavere viral titer.

Når viruset er konsentrert, bør en "skyet strøm" komme inn i reservoaret fra retentatelinjen. Dette antyder at det er virus i allantovæsken som blir konsentrert når den passerer gjennom kassetten.

Under både dybdefiltrering og tangentielle strømningsfiltreringstrinn bør trykket aldri overstige 10 psi. Overskridelse av dette trykket vil skjære viruset. Tilsetningen av ML-buffer til allantoisk væske virker som et stabiliserende middel og er hypoteset for å forhindre viral aggregering, noe som resulterer i økt utvinning av smittsomt virus uten at det går ut over filtrerbarheten.

Ovennevnte metode skisserer en egnet prosedyre for å produsere både lentogene og mesogene stammer av NDV under BSL-2-forhold, siden mesogen NDV ikke er et utvalgt middel i Canada. Dette resulterer i generering av høye titerbestander som er egnet for bruk i dyremodeller. I likhet med andre protokoller i litteraturen som bruker størrelsesekskluderingsmetoder, for eksempel dybdefiltrering og TFF, begrenser disse metodene bruken av tøffere, ultrasentrifugeringsteknikker der virusgjenoppretting reduseres sammenlignet med størrelseseksklusjonsrensemetoder15.

Bruken av TFF gir et element av skalerbarhet da TFF kan brukes til å konsentrere store startvolumer, i motsetning til ultrasentrifugeringsteknikker. Eksisterende NDV-renseteknikker forbedres i ovennevnte protokoll gjennom substitusjon av sukrose for jodiskansanol i ultrasentrifugeringstrinnet, noe som i stor grad reduserer sjansen for å miste virus på grunn av kassettbrudd ved slutten av dialysetrinnet, og tilsetning av ML-buffer, noe som forbedrer filtreringen og øker utbyttet.

Bruken av jodidianolgradienter foretrekkes fremfor sukrosegradienter, da jodinoksanol er mindre viskøs og giftfri for celler og gir et "renere" sluttprodukt31,32. Iodixanol reduserte signifikant nivåene av proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner tilstede etter tetthetsgradient ultracentrifugering av renset virus33. Så vidt vi vet, er dette første gang jodidianol har blitt brukt i rensing av NDV. Konsentrasjonen av jodiskansanol i en løsning kan bestemmes ved å kvantifisere absorbansen ved 340 nm med referanse til en standardkurve. Denne egenskapen ble brukt til å bestemme at NDV-bånd på ca. 15% jodidoksanol og for å bekrefte at den kan fjernes ved dialyse (supplerende figur S1B). Jodidoksanol ble initialt utviklet som kontrastavbildningsmiddel, og vi observerte ingen bivirkninger når en 15 % jodidoksanolløsning ble gitt intravenøst og intranasalt til C57BL/6 mus. Dette antyder at dialyse for å fjerne jodisanol kanskje ikke er nødvendig, og forkorter renseprosessen med ca. 16 timer. I tillegg er sukrose hygroskopisk, noe som får dialysekassetten til å svulme betydelig, begrense volumet som kan injiseres og øke risikoen for kassettbrudd og tap av virus34,35. Når like store mengder jodidianol- og sukrosetilberedt virus ble injisert i dialysekassetter, forekom signifikant mindre hevelse i det jodidoksanoltilberedte viruset (sammenlign figur 4C og tilleggsfigur S3A). Sukrose er imidlertid et mer egnet stabiliseringsmiddel for NDV enn jodidoksanol. Dette førte til tilskudd av jodidoksanolgradienten med ML-buffer. Før tilsetning av ML-buffer til renseprosessen var det et mer intenst bånd i 10% jodidianolgradienten observert i tillegg til målbåndet ved 15% (Supplerende figur S3B). Dette båndet inneholder sannsynligvis skadede eller ufullstendige virioner generert under renseprosessen. Tilsetning av ML-buffer muliggjør bedre filtrering av NDV samtidig som den hygroskopiske naturen til tetthetsgradientmediet minimeres, noe som reduserer risikoen for å sprekke dialysekassetten. Hevelsen i dialysekassetten kan reduseres ytterligere ved dialyzing i 1x PBS supplert med 5% sukrose, da det til slutt er dette viruset vil bli lagret i.

Siden NDV er en negativ følelse, tillater enkeltstrenget RNA-virus, isolerende RNA og generering av cDNA ved hjelp av tilfeldige primere og spesifikke primersett for PCR sekvensering av forskjellige regioner av genomet fra en cDNA-reaksjon (tabell 1). Dette er viktig da det gjør det mulig å bekrefte patotypen og integriteten til transgenet og dets transkripsjonelle reguleringselementer. Spaltningsstedet til det lentogene NDV F-proteinet bør være monobasisk i stedet for polybasisk, da NDV som har polybasiske spaltningssteder vanligvis er mesogene eller velogene patotyper, og klassifisert som utvalgte midler36,37. Denne protokollen beskriver også en pålitelig RT-qPCR-metode for kvantifisering av NDV-genomer med høy gjennomstrømning. Før bruk i dyremodeller og etter fullføring av de andre kvalitetskontrollanalysene, bør akutt toksisitet vurderes hos 8 uker gamle BALB/C-mus. Denne stammen er karakterisert som mer følsom for virusindusert toksisitet enn andre stammer av mus15. I tillegg vil dette gi en viss indikasjon på nøyaktigheten av virustiteren. For eksempel vil vekttap bli observert, men vekten skal begynne å øke etter 36-48 timer. Hvis dette ikke er tilfelle, er det mulig at virustiteren er høyere enn først rapportert, noe som kan skyldes aggregering av virale partikler. Dette første resultatet etter rensingen av en rekombinant NDV førte til inkorporering av ML-bufferen gjennom hele renseprosessen. Denne bufferen har blitt foreslått for å forbedre filtrerbarheten og utvinningen av viruset under renseprosessene38.

Ved kvantifisering av konsentrasjonen av infeksiøst virus ved TCID50 kan bruk av IFA være nødvendig for å visualisere NDV-infeksjon, spesielt ved høyere fortynninger når CPE kanskje ikke er åpenbar, eller hvis viruset ikke uttrykker et fluorescerende reportergen (figur 8). Det primære antistoffet som brukes til IFA er spesifikt for ribonukleoproteinet til NDV, et proteinkompleks som knytter seg til RNA-genomet under genomreplikasjon. Siden NDV er et fuglevirus, er kyllingembryofibroblastcellelinjen, DF1, en optimal cellelinje for å vurdere virustiter. Vanligvis brukes virusnegativ allantoisk væske som et middel for å gi de trypsinlignende proteasene som kreves av lentogene NTV-er for F-proteinspaltning39. Bruk av virusnegativ allantoisk væske kan unngås ved å supplere med 125 μg / ml trypsin samtidig som FBS-konsentrasjonen reduseres til 2%. Dette gir et enkelt, kostnadseffektivt alternativ til virusnegativ allantoisk væske, samtidig som det gir de trypsinlignende proteasene som kreves. Når man sammenligner disse to kulturforholdene ved en MOI på 0,5 over en 24 timers tidsperiode, ser det ut til å være liten forskjell mellom de to, med mediet supplert med trypsin som potensielt resulterer i mer CPE (figur 7). Andre cellelinjer som Vero-celler kan brukes med de samme kulturforholdene; CPE er imidlertid mindre uttalt. Ved å bruke ovennevnte protokoll med DF1-celler, bør NDV CPE være tydelig innen 24 timer. Spesielt bør man se dannelsen av syncyti med 24 timer (figur 7E-H). Ved hjelp av den beskrevne renseprosedyren renset vi konsekvent NDV til titere fra 1 × 109-3 × 1010 PFU / ml fra et startvolum på 0,8-1,0 liter allantoisk væske.

Samlet sett forbedrer den beskrevne protokollen tidligere publiserte NDV-rensingsprosedyrer ved å bruke jodikvaranol som et tetthetsgradientmedium i stedet for sukrose og ved tilsetning av ML-buffer for å forbedre filtreringen. I tillegg beskriver vi en komplementær metode for titering av NDV, inkluderer en detaljert RT-qPCR-metode for bestemmelse av NDV-kopinummer, og definerer optimale forhold for bruk av trypsin i stedet for allantoisk væske under virustitrering. Selv om denne prosessen genererer høytiter NDV-lagre som kan administreres systemisk ved høye doser, innebærer denne prosedyren flere trinn, noe som kan øke variasjonen blant brukerne og introdusere potensialet for forurensning. En ytterligere begrensning er kravet om at utgangsmaterialet skal være av høy kvalitet. Det er viktig at allantoisk væske er fri for forurensende eggeplomme, da dette i stor grad reduserer effektiviteten av filtrerings- og størrelsesekskluderingstrinnene. Samlet sett er denne prosessen tidkrevende, men kan forkortes ved å utelate dialysetrinnet. Denne prosedyren resulterer i et større utbytte av in vivo-grade virus sammenlignet med andre rensemetoder15,18. Evnen til å produsere høyere kvalitet, mer konsentrert NDV utvider sine evner til å bli brukt som et onkolytisk middel eller vaksinevektor i dyremodeller av sykdom i både prekliniske og kliniske omgivelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

JGEY var mottaker av et Ontario Veterinary College PhD-stipend og et Ontario Graduate Scholarship. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants til SKW (grant #304737) og LS (grant #401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

Tags

Kreftforskning utgave 183
Produksjon av high-titer rekombinant Newcastle Disease Virus fra Allantoic Fluid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. … More

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter