Summary
Cette méthodologie, qui comprenait l’alimentation par voie orale et l’infection par injection intrathoracique, pourrait évaluer efficacement l’influence des barrières de l’intestin moyen et / ou des glandes salivaires sur l’infection à arbovirus.
Abstract
Les virus transmis par les moustiques (MBV), qui sont des agents pathogènes infectieux pour les vertébrés, sont propagés par de nombreuses espèces de moustiques, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique. Une fois ingérés, les virus doivent surmonter la barrière de l’intestin moyen des moustiques pour atteindre l’hémolymphe, d’où ils pourraient potentiellement se propager aux glandes salivaires. Lorsqu’un moustique pique, ces virus se propagent à de nouveaux hôtes vertébrés. De même, le moustique peut attraper différents virus. En général, seule une infime partie des virus peut pénétrer dans les glandes salivaires par l’intestin. L’efficacité de transmission de ces virus aux glandes est affectée par les deux barrières physiques trouvées chez différentes espèces de moustiques: les barrières de l’intestin moyen et les barrières des glandes salivaires. Ce protocole présente une méthode de détection du virus dans les glandes salivaires d’Aedes aegypti après une infection par voie orale et par injection intrathoracique. De plus, déterminer si les intestins et/ou les glandes salivaires entravent la propagation virale peut aider à évaluer les risques de MBV transmis par Aedes aegypti.
Introduction
Les virus transmis par les moustiques (MBV), un groupe hétérogène de virus à ARN, peuvent persister chez les moustiques vecteurs et se propager ensuite aux hôtes vertébrés1. Les MBV cliniquement importants sont principalement répartis dans quatre familles de virus, à savoir Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae et Peribunyavividae 2,3. Au cours des dernières décennies, ces virus ont été signalés partout dans le monde, causant des problèmes de santé publique. En tant que l’un des MBV les plus connus, le virus de la dengue (DENV) est devenu l’arbovirus émergent ou ré-émergent le plus répandu dans plus de 100 pays au cours des 20 dernières années4. Depuis la découverte du virus Zika (ZIKV) à l’intérieur des terres, presque tous les pays et territoires tropicaux et subtropicaux du continent ont signalé des infections humaines par le ZIKV5. Afin d’évaluer le risque de transmission du virus, de nombreuses études menées ces dernières années ont porté sur la compétence des moustiques vecteurs pour ces virus 6,7. Par conséquent, il est essentiel de prévenir et de contrôler efficacement les maladies à transmission vectorielle.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), l’un des moustiques les plus faciles à élever en laboratoire, est un vecteur important du DENV, du ZIKV, du virus Chikungunya (CHIKV) et du virus de la fièvre jaune (YFV)8. Pendant longtemps, Ae. aegypti n’a été trouvé que sur le continent africain et en Asie du Sud-Est, mais ces dernières années, il a colonisé presque tous les continents9. En outre, l’abondance mondiale d’Ae. aegypti n’a cessé de croître, avec une augmentation estimée à 20% d’ici la fin du siècle10. De 2004 à 2009 en Chine, il y a eu une augmentation évidente de la compétence du vecteur Ae. aegypti pour le DENV en raison des températures quotidiennes plus élevées11. Le statut d’Ae. aegypti en tant que vecteur pathogène a considérablement augmenté en Chine. Par conséquent, pour relever ces défis, il est nécessaire d’étudier la compétence vectorielle des Ae. aegypti pour transmettre des virus.
En tant qu’arthropode hématophage, le moustique femelle perce la peau d’un hôte vertébré et se nourrit du sang. Les moustiques acquièrent parfois des virus auprès d’hôtes infectés par des virus, puis transfèrent les virus à un nouvel hôte. Ainsi, pour déterminer la compétence des vecteurs, les moustiques sont nourris avec une farine de sang artificielle contenant des arbovirus grâce à un système d’alimentation en laboratoire12. Les moustiques individuels sont séparés en têtes, corps et sécrétions de salive plusieurs jours après l’infection. Pour mesurer les taux d’infection, de dissémination et de transmission du virus, les titres de virus ont été détectés par PCR quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) ou dosage de plaque. Cependant, tous les moustiques ne développent pas d’infections de l’intestin moyen et la capacité de transférer un virus à l’hôte suivant après l’alimentation par le sang. Il est lié aux barrières physiologiques des moustiques, qui empêchent les agents pathogènes de pénétrer dans le corps et jouent un rôle essentiel dans leur immunité innée13. Les barrières de l’intestin moyen, en particulier la barrière d’infection de l’intestin moyen (MIB) et la barrière de fuite de l’intestin moyen (MEB), influencent si le virus pourrait infecter le vecteur par voie systémique et l’efficacité avec laquelle il se propage. Il entrave l’analyse de l’infection d’autres tissus, tels que les glandes salivaires qui présentent également une infection des glandes salivaires et échappentaux barrières 13,14. Pour mieux caractériser l’infection de l’intestin moyen et des glandes salivaires chez le vecteur, un protocole détaillé pour l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique de l’arbovirus chez Ae. aegypti est présenté ici. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que l’infection par le DENV et le ZIKV chez Aedes spp., et pourrait s’avérer une procédure pratique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de virus et de moustiques
- Préparation des virus
REMARQUE : Tous les procédés ont été effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Le niveau de biosécurité utilisé doit être déterminé par l’évaluation des risques de l’agent pathogène et les réglementations spécifiques aux pays et aux régions. Le processus doit être effectué dans une enceinte de biosécurité.- Inoculer 1 x 106 cellules C6/36 dans une fiole de culture T75. Remplir la fiole avec 10 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
REMARQUE: Le milieu L-15 de Leibovitz (L15) ou le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) peuvent également être utilisés pour maintenir les cellules C6/36. - Maintenir les cellules dans 5% de CO2 à 28 °C pendant la nuit et retirer le surnageant cellulaire le lendemain lorsque les cellules sont confluentes à 80%-90%.
- Ajouter 1 mL de dilution virale (multiplicité de l’infection (MOI) = 0,01) dans la fiole et incuber les cellules pendant 1 h dans 5 % de CO2 à 28 °C. Le virus du lac Ebinur (EBIV)15, un orthobunyavirus transmis par les moustiques, a été utilisé comme virus modèle pour ce protocole.
- Retirer le surnageant et laver les cellules 3x avec 5 mL de PBS. Remplir la fiole avec 15 mL de nouveau milieu RPMI avec 2% FBS. Maintenir la fiole dans 5 % de CO2 à 28 °C.
- Prélever le surnageant contenant le virus lorsque le titre viral requis est atteint (après près de 5 jours, selon le virus utilisé). Pour EBIV, cette valeur de titre était de 107 unités formant des plaques (UFP)/mL. Sous-emballez-les dans des tubes de stockage individuels à bouchon à vis de 2 ml et entreposer les tubes contenant 0,5 à 1 mL de virus à -80 °C.
- Inoculer 1 x 106 cellules C6/36 dans une fiole de culture T75. Remplir la fiole avec 10 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
- Détermination du titre viral
REMARQUE : Déterminer le titre viral à l’aide des dosagesde plaque 16. BHK-21 a été utilisé pour déterminer le titre viral du VEB, en raison de l’effet cytopathique évident (ECP) observé dans les cellules infectées.- Inoculer 1 x 105 cellules BHK-21 dans chaque puits de plaques de 24 puits. Remplissez chaque puits avec 1 mL de milieu DMEM contenant 10% FBS et 1% P/S. Maintenir les cellules dans 5% CO2 à 37 °C pendant la nuit.
- Faire six (10-6) dilutions successives de 10 fois de surnageant contenant du virus avec un milieu DMEM frais contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S.
- Ajouter 100 μL de diluant de virus dans chaque puits de plaques de 24 puits contenant la monocouche BHK-21. Jeter le diluant du virus après incubation pendant 1 h dans 5 % de CO2 à 37 °C. Ajouter 500 μL de DMEM contenant 1,5 % de méthylcellulose à chaque puits.
- Cellules en culture dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 48 h (l’ECP apparente a été trouvée après 48 h pour le VEB). Fixez les cellules pendant la nuit avec 750 μL de formaldéhyde à 3,7%.
- Colorez-les avec 200 μL de violet cristallin à 2% pendant 15 min. Comptez le nombre de plaques pour calculer le titre viral.
- Élevage de moustiques en laboratoire
REMARQUE : Moustiques de retour dans un laboratoire de niveau de confinement d’arthropodes 1 (ACL-1).- Pour la préparation de l’eau déchlorée, remplissez un seau de 20 L avec de l’eau du robinet et laissez-le reposer pendant 7-8 jours sans lumière. Ne couvrez pas le couvercle.
- Gardez les œufs et les larves d’Ae. aegypti dans une chambre à moustiques dans les conditions suivantes: 28 ± 1 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et une humidité relative de 75% ± 5%.
- Maintenir près de 1 000 larves dans un plat peu profond (22 cm x 15 cm x 6 cm) contenant de l’eau déchlorée après l’éclosion des œufs. Nourrissez-les avec près de 1/8 cuillère à café de poudre d’aliment pour souris. Rafraîchissez les aliments tous les jours et changez l’eau tous les 2 jours.
- Une fois que les larves se nymphosent après 5-7 jours, utilisez un compte-gouttes unique pour transférer les pupes dans un gobelet en plastique (7 oz) rempli d’eau déchlorée.
- Mettez cinq tasses contenant des pupes (environ 200 par tasse) dans une cage à mailles (30 cm x 30 cm x 30 cm) et conservez les cages dans l’incubateur à insectes dans les mêmes conditions qu’à l’étape 1.3.2.
- Placez une minuscule éponge contenant une solution de glucose à 8% (m / p) sur chaque cage à mailles pour nourrir les moustiques adultes. Après la levée de l’adulte, sortez les tasses sans nymphes. Gardez les cages grillagées avec environ 1 000 moustiques adultes par cage dans le même incubateur d’insectes.
2. Préparation à l’infection buccale
- Préparez les moustiques femelles à l’infection buccale. Utilisez la machine absorbant les moustiques pour collecter les moustiques âgés de 5 à 8 jours. Anesthésiez-les à -20 °C pendant 1 min et vérifiez si les moustiques sont étourdis. Sinon, anesthésiez-les encore une minute à -20 °C.
- Versez-les rapidement dans les gobelets en plastique (24 oz) à environ 200 moustiques (femelles et mâles) par tasse. Couvrez rapidement chaque tasse avec une moustiquaire bien coupée, suivie d’un couvercle avec un trou (environ 6 cm de diamètre) au milieu.
- Affamez les moustiques pendant 24 heures avant l’infection buccale et préparez un repas de sang infectieux comme suit.
- Dans une enceinte de biosécurité dans des conditions BSL-2, sortir le stock de virus du congélateur à -80 °C et le décongeler sur de la glace. Diluer le stock de virus à une concentration de 2 x 106 UFP/mL avec un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S. Mélanger la dilution du virus avec un volume égal de sang de cheval défibé.
NOTE: Les processus ont été effectués dans une enceinte de biosécurité d’un laboratoire ACL-2.
3. Effectuer une infection buccale
NOTE: Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire ACL-2. Le processus doit être effectué dans la boîte à gants pour empêcher les moustiques de s’échapper.
- Effectuez une alimentation artificielle en utilisant le système d’alimentation des moustiques artificiels pendant 1 h.
- Coupez les membranes de collagène à la taille appropriée (environ 5 cm de diamètre), fixez-les aux réservoirs avec des joints toriques, puis ajoutez le mélange virus-sang (environ 3 mL) aux réservoirs. Utilisez des bouchons en plastique pour sceller les réservoirs et prévenir les fuites.
REMARQUE : Ces étapes ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité. - Mettez les gobelets en plastique (24 oz) contenant des moustiques dans la boîte à gants. Vissez les réservoirs scellés sur le chargeur FU1 et placez un réservoir sur une tasse, puis allumez l’unité d’alimentation. Nourrissez les moustiques pendant 1 h
- Coupez les membranes de collagène à la taille appropriée (environ 5 cm de diamètre), fixez-les aux réservoirs avec des joints toriques, puis ajoutez le mélange virus-sang (environ 3 mL) aux réservoirs. Utilisez des bouchons en plastique pour sceller les réservoirs et prévenir les fuites.
- Anesthésier les moustiques au CO2 pendant plusieurs secondes jusqu’à ce qu’ils s’évanouissent. En bref, placez le pistolet pulvérisateur de dioxyde de carbone au milieu du filet à travers le trou de la tasse contenant les moustiques, ouvrez la valeur et permettez à d’énormes quantités de dioxyde de carbone d’être craché pour anesthésier les moustiques.
- Versez-les dans une boîte de Petri placée sur de la glace et couvrez rapidement le couvercle. Choisissez les moustiques femelles engorgées avec des forceps. Pour s’identifier, les mâles ont des antennes plumeuses et les femelles ont des antennes unies. Transférez-les dans de nouveaux gobelets en plastique à 50 moustiques femelles par tasse.
REMARQUE: Les moustiques femelles engorgées ont été choisies pour maintenir la consistance car la quantité d’alimentation affecte le contenu viral. - Enveloppez la tasse avec un filet anti-moustique coupé, puis couvrez-la avec un couvercle avec un trou au milieu. Coupez l’éponge en un petit morceau et mettez-la sur la tasse.
- Ajouter une solution de glucose à 8% sur l’éponge à l’aide d’un compte-gouttes jetable en plastique. Conservez les tasses contenant des moustiques femelles dans l’incubateur à 27 °C à 80% d’humidité pendant 10 jours. Remplacez une nouvelle éponge saturée en glucose toutes les 72 h.
4. Préparation à l’inoculation intrathoracique
- Préparez les aiguilles de micro-injection comme suit. Utilisez un PUL-1000 pour fabriquer des aiguilles de micro-injection (Figure 1A) avec les paramètres suivants dans le programme d’extraction d’aiguilles : indice de chaleur = 450, force (g) = 110, distance (mm) = 1,00 et retard (s) = 0.
- Coupez la pointe d’une aiguille tirée à l’aide d’une pince à épiler au microscope à dissection à un grossissement de 16x (figure 1B). Ne rendez pas la pointe trop grande, sinon elle pourrait nuire aux moustiques.
- Préparez les moustiques femelles comme à l’étape 2.1.
REMARQUE : Les procédés suivants ont été effectués dans un laboratoire ACL-2. - Préparer la dilution du virus infectieux comme suit :
- Sortez le stock de virus du congélateur à -80 °C et décongelez-le sur de la glace. Diluer le virus à une dilution virale de 100 nL contenant 100-500 virus PFU avec un milieu RPMI 1640 contenant 10% FBS et 1% P/S. Conserver la dilution du virus sur la glace.
- Remplissez l’aiguille avec de l’huile minérale à l’aide d’une seringue stérile jetable. Fixez l’aiguille dans l’injecteur en suivant les instructions sur la machine.
- Insérez l’aiguille dans un tube contenant la dilution du virus infectieux. Ne cassez pas le bout de l’aiguille. Appuyez sur le bouton FILL pour remplir l’aiguille avec une solution virale. Le volume final de la solution virale dans l’aiguille est d’environ 4,0 μL. Une fois que l’aiguille est remplie du virus, veillez à ne pas la toucher et l’endommager.
REMARQUE : Les étapes ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité.
5. Effectuer une injection virale au microscope à dissection
NOTE: Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire ACL-2.
- Anesthésier les moustiques à -20 °C pendant 1 min. Versez-les dans une boîte de Petri placée sur de la glace et couvrez rapidement le couvercle.
- Choisissez près de 50 moustiques femelles avec une pince à épiler et placez-les sur la plaque de glace. Placez la plaque de glace sous l’injecteur et insérez l’aiguille dans la cavité thoracique du moustique sous le microscope à dissection (Figure 1C).
- Réglez le volume d’injection sur 100 nL et le débit sur 50 nL/s. Appuyez sur le bouton INJECT pour laisser la solution virale s’écouler dans le moustique. Si l’injection réussie se produit, l’abdomen sera légèrement bombé.
- Mettez le moustique infecté dans un nouveau gobelet en plastique (24 oz) placé sur de la glace. Lorsque le nombre de moustiques infectés est suffisant, enveloppez la tasse avec un filet de moustiquaire coupé, puis couvrez-la avec le couvercle.
- Conservez la tasse contenant des moustiques infectieux dans l’incubateur à 27 °C à 80% d’humidité pendant 10 jours. Nourrissez les moustiques comme à l’étape 3.5.
6. Traitement des moustiques femelles infectées
NOTE: Trois tissus / organes différents ont été disséqués de chaque moustique femelle: l’intestin pour calculer le taux d’infection virale (VIR), la tête pour calculer le taux de propagation du virus (VDR) et la salive pour calculer le taux de transmission du virus (VTR). Le VIR a été défini comme le nombre de moustiques ayant des intestins positifs au virus. Le VDR a été défini comme le nombre de moustiques avec des têtes positives au virus divisé par le nombre de moustiques avec des intestins positifs au virus par 100. La VTR a été définie comme le nombre de moustiques avec une salive virale positive divisé par le nombre de moustiques avec des intestins positifs au virus par 100.
- Collecte de la salive des moustiques femelles infectées
NOTE: Les processus doivent être effectués dans un laboratoire ACL-2.- Anesthésier les moustiques femelles infectées par anesthésie au dioxyde de carbone comme à l’étape 3.2. Versez-les dans une boîte de Petri placée sur de la glace et fermez rapidement le couvercle.
- Placez côte à côte des embouts de pipette de 10 μL remplis d’huile d’immersion sur la boue de caoutchouc.
- Choisissez les moustiques femelles avec une pince à épiler et placez-les sur une plaque de glace. Enlevez leurs pattes et leurs ailes avec une pince à épiler. Placez la partie buccale d’un moustique sur chaque pointe de pipette.
- Recueillir la salive sécrétée dans l’huile par les moustiques pendant les 45-60 prochaines minutes à température ambiante.
- Placer les embouts des pipettes dans des tubes de 1,5 mL contenant 200 μL de milieu diluant viral (milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S). Les centrifuger à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour expulser la salive dans des tubes. Entreposer ces tubes à -80 °C pour déterminer ultérieurement les débits de transmission.
- Disséquer les moustiques femelles infectées
NOTE: Les processus doivent être effectués dans un laboratoire ACL-2.- Utilisez une pince à épiler pour couper la tête des moustiques femelles après la collecte de salive. Placer chaque tête dans un tube individuel contenant 200 μL de milieu RPMI 1640.
- Attrapez le thorax avec une pince à épiler, puis l’avant-dernier segment de l’abdomen avec une autre pince à épiler et retirez-le. L’intestin sera retiré. Nettoyez l’intestin arraché de tout tissu et organe errant.
- Laver l’intestin avec du PBS et placer chaque intestin dans un tube individuel contenant 200 μL de milieu RPMI 1640. Conserver ces tubes à -80 °C pour déterminer ensuite le taux d’infection virale et le taux de dissémination.
7. Analyse des données
- Extraction d’ARN
- Broyer les tissus en morceaux à l’aide d’une machine de broyage homogénéiseur de tissus à basse température réglée sur les paramètres suivants: fréquence de fonctionnement = 60 Hz, temps de fonctionnement = 15 s, temps de pause = 10 s, cycles = 2 et température de réglage = 4,0 °C.
- Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Extraire l’ARN total de chaque échantillon par un système automatisé d’extraction des acides nucléiques en suivant les instructions de l’instrument.
- Exécution de la qRT-PCR
- Utilisez le kit RT-PCR en une étape pour quantifier les copies d’ARN viral à l’aide d’un instrument de PCR quantitative17. Utilisez les amorces suivantes pour la détection du segment F du VEB S : ATGGCATCACCTGGGAAAG et R : TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Configurer le processus de réaction comme suit: étape 1: 42 °C pendant 5 min, 95 °C pendant 10 s; étape 2: 40 cycles de 95 °C pendant 5 s et de 60 °C pendant 20 s.
- Déterminer la dose virale la plus faible pour l’infection dans les cellules grâce aux dilutions en série de 10 fois inoculées sur les cellules. Utiliser les cellules BHK-21 pour déterminer la dose virale la plus faible de VEB, en utilisant des dilutions jusqu’à 10-7 comme décrit à l’étape 1.2.
- Calculer la valeur Ct de la dose virale la plus faible par qRT-PCR. Utilisez la valeur seuil pour EBIV-positif par qRT-PCR comme < 35. Utilisez l’équation suivante pour calculer les copies de l’EBIV dans chaque échantillon :
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (les copies de EBIV), y = valeur Ct, R2 = 0,9905] - Calculez le taux d’infection, le taux de dissémination et le taux de transmission comme suit :
Taux d’infection (%) = 100 x (nombre d’intestins de moustiques infectés par le virus / nombre total de moustiques)
Taux de dissémination (%) = 100 x (nombre de têtes de moustiques infectées par le virus / nombre d’intestins de moustiques infectés par le virus)
Taux de transmission (%) = 100 x (le nombre de salive de moustiques infectés par le virus / le nombre d’intestins de moustiques positifs au virus) - Analysez les différences dans les variables continues et les différences dans les taux d’infection par les moustiques, les taux de dissémination et les taux de transmission en utilisant l’analyse non paramétrique de Kruskal-Wallis pour des comparaisons multiples et le test exact de Fisher, le cas échéant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour examiner la distribution du VEB chez les moustiques infectés par injection sanguine artificielle (le titre final viral était de 6,4 x 106 UFP/mL) et par injection intrathoracique (la dose virale était de 340 UFP), les ARN viraux dans la salive, la tête et les intestins des moustiques 10 jours après l’infection (dpi) ont été déterminés.
Dans le cas d’Ae. aegypti, le titre du virus de l’EBIV dans les intestins, la tête et la salive des moustiques femelles inoculées par voie intrathoracique était beaucoup plus élevé que celui des moustiques femelles infectées par voie orale (figure 2A-C). Le taux d’infection et le taux de dissémination des moustiques femelles inoculées par voie intrathoracique étaient de 100 %, mais de 70 % et 38,1 %, respectivement pour les moustiques femelles infectées par voie orale (figure 2D, E). Le taux de transmission des moustiques femelles inoculées par voie intrathoracique a atteint jusqu’à 90%, mais celui des moustiques femelles infectées par voie orale n’était que de 4,8%. Il indiquait que l’intestin d’Ae. aegypti avait un fort effet inhibiteur pour la transmission du virus.
Figure 1 : Schéma de l’embout de la micropipette et de l’injection intrathoracique. (A) Pointe de micropipette tirée avant de casser l’embout. (B) Embout de micropipette correctement préparé et adapté à l’inoculation intrathoracique. (C) Schéma de l’injection intrathoracique pour les moustiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Compétence vectorielle des moustiques adultes par alimentation orale et inoculation intrathoracique. Les moustiques femelles infectées ont été incubées à 28 °C pendant 10 jours. La valeur p ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. L’analyse non paramétrique de Kruskal-Wallis a été utilisée pour des comparaisons multiples et le test exact de Fisher, le cas échéant. Ce chiffre a été modifié à partir de l’étude de Xia et al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’objectif de cette méthode était de fournir une évaluation complète des risques d’un virus transmis par les moustiques en évaluant la compétence des vecteurs par l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique.
Dans l’expérience d’alimentation orale, les moustiques engorgés doivent être choisis et transférés dans un nouveau conteneur, ce qui pose un risque grave pour les opérateurs. La raison en est que tout moustique, y compris les moustiques non infectés, pourrait être une source d’infection19. Par conséquent, les moustiques doivent d’abord être anesthésiés, comme spécifié dans le protocole, puis les étapes de suivi doivent être effectuées. Il est important de noter que la sélection des moustiques engorgés et leur transfert doivent être effectués dans une boîte à gants scellée. Gardez la boîte à gants fermée pendant le processus, sauf s’il n’y a pas de moustiques en mouvement libre dans la boîte.
Dans l’expérience d’infection, il est préférable que deux personnes travaillent ensemble, et après que les deux personnes ont confirmé qu’il n’y a pas de moustiques qui s’échappent en même temps, elles peuvent ouvrir la boîte à gants pour empêcher les moustiques infectés de s’échapper. Si une évasion a lieu, ces moustiques doivent être tués ou recapturés. Il n’est pas recommandé de tuer les moustiques infectés à mains nues. Le risque d’infection des opérateurs peut être réduit en utilisant des aspirateurs à vide ou d’autres outils appropriés (p. ex. forceps, pinceaux, mains gantées). Après l’expérience, désinfectez l’intérieur de la boîte à gants et la surface de l’établi avec un désinfectant conventionnel.
La majorité des recherches sur la compétence des moustiques vecteurs pour les virus transmis par les moustiques ont porté uniquement sur l’infection buccale20,21. Pour l’infection buccale, les virus doivent surmonter plusieurs barrières tissulaires associées à l’intestin moyen et aux glandes salivaires pour être libérés dans la salive14. L’effet de la glande intestinale moyenne et de la glande salivaire sur la capacité vectorielle des moustiques n’a pas été démontré dans cette expérience. Lorsque l’alimentation orale et l’injection intrathoracique sont combinées, les différentes barrières tissulaires peuvent être soigneusement évaluées. Selon les résultats de cette procédure, l’intestin d’Ae. aegypti joue un rôle dominant dans la compétence vectorielle pour le virus et la barrière des glandes salivaires peut ne pas être présente (Figure 2). Pour cela, notre protocole est bénéfique pour confirmer la présence de barrières de l’intestin moyen ou des glandes salivaires à l’infection par les arbovirus.
Selon la méthodologie, seul l’ARN viral a été identifié dans les échantillons. D’autres investigations, telles que la visualisation du virion avec un microscope électronique à transmission, la confirmation de l’infection à l’aide de tests de plaque ou la détection de protéines virales avec un test d’immunofluorescence, sont nécessaires pour confirmer les virus infectieux dans les différents échantillons. Cette méthodologie peut être modifiée et utilisée pour inoculer d’autres virus d’intérêt dans un large éventail de moustiques vecteurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
