Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/63830
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

Abstract

וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs), שהם פתוגנים מדבקים לבעלי חוליות, מופצים על ידי מיני יתושים רבים, ומהווים איום חמור על בריאות הציבור. לאחר בליעתם, הנגיפים חייבים להתגבר על מחסום היתושים באמצע המעי כדי להגיע להמולימפה, משם הם עלולים להתפשט לבלוטות הרוק. כאשר יתוש עוקץ, וירוסים אלה מופצים לפונדקאים חדשים בעלי חוליות. באופן דומה, היתוש עלול לקלוט וירוסים שונים. באופן כללי, רק חלק זעיר מהווירוסים עשוי להיכנס לבלוטות הרוק דרך המעיים. יעילות ההעברה של נגיפים אלה לבלוטות מושפעת משני מחסומים פיזיים הנמצאים בזני יתושים שונים: מחסומי אמצע המעי ומחסומי בלוטות הרוק. פרוטוקול זה מציג שיטה לזיהוי וירוסים בבלוטות הרוק של Aedes aegypti לאחר הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה. יתר על כן, קביעה אם המעיים ו / או בלוטות הרוק מעכבים את התפשטות הנגיפים יכולה לסייע בהערכות הסיכון של MBV המועברים על ידי Aedes aegypti.

Introduction

וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs), קבוצה הטרוגנית של נגיפי RNA, יכולים להישאר בווקטורים של יתושים ולאחר מכן להתפשט לפונדקאים בעלי חוליות1. MBVs החשובים מבחינה קלינית מופצים בעיקר בארבע משפחות וירוסים, כלומר Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae ו- Peribunyavividae 2,3. בעשורים האחרונים, וירוסים אלה דווחו בכל רחבי העולם, וגרמו לבעיות בריאות הציבור. כאחד ה- MBV הידועים ביותר, נגיף דנגי (DENV) הפך לנגיף הארבו המתעורר או המתעורר מחדש הנפוץ ביותר ביותר מ -100 מדינות במהלך 20 השנים האחרונות4. מאז גילוי נגיף הזיקה (ZIKV) בפנים הארץ, כמעט כל המדינות והטריטוריות הטרופיות והסובטרופיות ביבשת דיווחו על זיהומי ZIKV אנושיים5. על מנת להעריך את הסיכון להעברת הנגיף, מחקרים רבים בשנים האחרונות התמקדו בכשירות וקטור יתושים לנגיפים אלה 6,7. כתוצאה מכך, חיוני למנוע ולשלוט ביעילות במחלות המועברות על ידי וקטורים.

Aedes aegypti (Ae. aegypti), אחד היתושים הקלים ביותר לגידול במעבדה, הוא וקטור חשוב של DENV, ZIKV, וירוס Chikungunya (CHIKV) ווירוס קדחת צהובה (YFV)8. במשך זמן רב, Ae. aegypti נמצא אך ורק ביבשת אפריקה ובדרום מזרח אסיה, אך בשנים האחרונות הוא התיישב כמעט בכל היבשות9. יתר על כן, השפע העולמי של Ae. aegypti גדל בהתמדה, עם גידול מוערך של 20% עד סוף המאה10. משנת 2004 עד 2009 בסין, חלה עלייה ניכרת ביכולת הווקטור Ae. aegypti עבור DENV עקב טמפרטורות יומיומיות גבוהות יותר11. מעמדו של Ae. aegypti כווקטור הפתוגני עלה משמעותית בסין. כתוצאה מכך, כדי להתמודד עם אתגרים אלה, יש צורך לחקור את היכולת הווקטורית של Ae. aegypti להעביר וירוסים.

כפרוק רגליים המטופגי, נקבת היתוש מנקבת את עורו של פונדקאי בעל חוליות וניזונה מהדם. יתושים אכן רוכשים מדי פעם וירוסים מפונדקאים נגועים בנגיף ואז מעבירים את הנגיפים לפונדקאי חדש. לכן, כדי לקבוע כשירות וקטורית, יתושים מוזנים בקמח דם מלאכותי המכיל ארבו-וירוסים באמצעות מערכת הזנה בסביבת מעבדה12. יתושים בודדים מופרדים לראשים, לגוף ולהפרשות רוק מספר ימים לאחר ההדבקה. כדי למדוד את שיעורי ההדבקה, ההפצה וההעברה של הנגיף, טיטרים של וירוסים זוהו על ידי PCR כמותי של שעתוק לאחור (qRT-PCR) או בדיקת פלאק. עם זאת, לא כל היתושים מפתחים זיהומים באמצע המעי ואת היכולת להעביר וירוס לפונדקאי הבא לאחר הזנת הדם. היא קשורה למחסומים הפיזיולוגיים של היתושים, המונעים מפתוגנים לחדור לגוף וממלאים תפקיד חיוני בחסינות המולדת שלהם13. מחסומי אמצע המעי, במיוחד מחסום הזיהום של המעי התיכון (MIB) ומחסום המילוט של המעי התיכון (MEB), משפיעים על היכולת של הנגיף להדביק את הווקטור באופן מערכתי ועל היעילות שבה הוא מתפשט. זה חוסם את הניתוח של זיהום של רקמות אחרות, כגון בלוטות רוק אשר גם להציג זיהום בלוטת הרוק לברוח מחסומים13,14. כדי לאפיין טוב יותר את הזיהום של המעי התיכון ובלוטות הרוק בווקטור, פרוטוקול מפורט להאכלה אוראלית וחיסון תוך חזה של arbovirus ב Ae. aegypti מוצג כאן. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם על זיהומים נוספים arbovirus במגוון רחב של וקטורים יתושים, כגון זיהום DENV ו ZIKV ב Aedes spp., והוא יכול להוכיח להיות הליך מעשי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת וירוסים ויתושים

  1. הכנת וירוסים
    הערה: כל התהליכים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). רמת הבטיחות הביולוגית בה נעשה שימוש צריכה להיקבע על ידי הערכת הסיכון של הפתוגן והתקנות הספציפיות למדינות ולאזורים. התהליך חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.
    1. חסן 1 x 106 C6/36 תאים לתוך בקבוק תרבית T75. מלאו את הבקבוק ב-10 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium המכיל 10% נסיוב בקר עוברי מומת בחום (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
      הערה: מדיום L-15 של לייבוביץ' (L15) או תווך הנשר של דולבקו (DMEM) יכולים לשמש גם לשמירה על תאי C6/36.
    2. לשמור על התאים ב 5% CO2 ב 28 ° C במשך הלילה ולהסיר את supernatant התא למחרת כאשר התאים הם 80%-90% זורמים.
    3. הוסף 1 מ"ל של דילול וירוס (ריבוי זיהום (MOI) = 0.01) לתוך בקבוק לדגור את התאים במשך 1 שעה ב 5% CO2 ב 28 ° C. וירוס אגם אבינור (EBIV)15, וירוס אורתובוניה הנישא על ידי יתושים, שימש כוירוס מודל לפרוטוקול זה.
    4. הסר את supernatant ולשטוף את התאים 3x עם 5 מ"ל של PBS. מלא את הבקבוק עם 15 מ"ל של מדיום סל"ד חדש עם 2% FBS. שמור על הבקבוק ב 5% CO2 ב 28 ° C.
    5. יש לאסוף את הנגיף המכיל את הסופרנאטנט כאשר מגיעים לטיטר הנגיפי הנדרש (לאחר כמעט 5 ימים, תלוי בנגיף בו משתמשים). עבור EBIV, ערך titer זה היה 107 יחידות יוצרות פלאק (PFU) / מ"ל. ארוז אותם בצינורות אחסון נפרדים של מכסה בורג 2 מ"ל ואחסן את הצינורות המכילים 0.5-1 מ"ל של וירוס ב -80 ° C.
  2. קביעת טיטר ויראלי
    הערה: קבע טיטר ויראלי באמצעות מבחני הפלאק16. BHK-21 שימש לקביעת טיטר נגיפי של EBIV, בשל ההשפעה הציטופתית הברורה (CPE) שנצפתה בתאים נגועים.
    1. חסן 1 x 105 BHK-21 תאים לתוך כל באר של 24 צלחות באר. מלא כל באר עם 1 מ"ל של מדיום DMEM המכיל 10% FBS ו 1% P / S. לשמור על התאים 5% CO2 ב 37 ° C במשך הלילה.
    2. בצע שש (10-6) דילולים רצופים פי 10 של סופרנאטנט המכיל וירוסים עם מדיום DMEM טרי המכיל 10% FBS ו- 1% P/S.
    3. הוסף 100 μL של וירוס מדלל לתוך כל באר של לוחות 24 באר המכילים monolayer BHK-21. יש להשליך את הנגיף המדולל לאחר הדגירה למשך שעה אחת ב-5% CO2 ב-37°C. הוסף 500 μL של DMEM המכיל 1.5% methylcellulose לכל באר.
    4. תאי תרבית ב 5% CO2 ב 37 ° C במשך 48 שעות (CPE לכאורה נמצא לאחר 48 שעות עבור EBIV). תקן את התאים בן לילה עם 750 μL של 3.7% פורמלדהיד.
    5. הכתימו אותם ב-200 μL של 2% קריסטל סגול למשך 15 דקות. ספור את מספר הפלאק כדי לחשב את הטיטר הנגיפי.
  3. גידול יתושים במעבדה
    הערה: יתושים אחוריים במעבדה להכלת פרוקי רגליים ברמה 1 (ACL-1).
    1. להכנת המים נטולי הכלור, ממלאים דלי של 20 ליטר במי ברז ומאפשרים להם לעמוד במשך 7-8 ימים ללא אור. אין לכסות את המכסה.
    2. שמור ביצים וזחלים של Ae. aegypti בחדר יתושים עם התנאים הבאים: 28 ± 1 °C (75 °F) עם מחזור בהיר / כהה של 12 שעות ולחות יחסית של 75% ± 5%.
    3. החזיקו קרוב ל-1,000 זחלים בצלחת רדודה (22 ס"מ x 15 ס"מ x 6 ס"מ) המכילה מים נטולי כלור לאחר בקיעת הביצים. האכילו אותם בכמעט 1/8 כפית אבקת מזון לבעלי חיים לעכברים. רעננו את המזון מדי יום והחליפו את המים כל יומיים.
    4. לאחר שהזחלים גורים לאחר 5-7 ימים, השתמשו בטפטפת חד פעמית כדי להעביר את הגלמים לכוס פלסטיק מלאה במים נטולי כלור.
    5. הכניסו חמש כוסות המכילות גלמים (כ-200 לכוס) לכלוב רשת אחד (30 ס"מ x 30 ס"מ x 30 ס"מ) והחזיקו את הכלובים באינקובטור החרקים באותם תנאים כמו בשלב 1.3.2.
    6. הניחו ספוג זעיר המכיל תמיסת גלוקוז של 8% (m/w) על כל כלוב רשת כדי להאכיל יתושים בוגרים. לאחר הופעת הבוגר, הוציאו את הכוסות ללא גלמים. החזיקו את כלובי הרשת עם כ-1,000 יתושים בוגרים בכל כלוב באותה אינקובטור חרקים.

2. הכנה לזיהום אוראלי

  1. הכינו נקבות יתושים לזיהום אוראלי. השתמשו במכונה לספיגת יתושים כדי לאסוף יתושים בני 5-8 ימים. מרדימים אותם ב -20 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ובודקים אם היתושים מסוחררים. אם לא, להרדים אותם במשך דקה נוספת ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. מזגו אותם במהירות לכוסות הפלסטיק (24 אונקיות) בכ-200 יתושים (נקבות וזכרים) לכוס. מכסים כל במהירות בכילה חתוכה היטב, ואחריה מכסה עם חור (בקוטר של כ-6 ס"מ) באמצע.
  3. להרעיב את היתושים במשך 24 שעות לפני זיהום אוראלי ולהכין ארוחת דם זיהומיות כדלקמן.
  4. בארון בטיחות ביולוגית בתנאי BSL-2, הוציאו את מלאי הנגיף מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והפשירו אותו על קרח. לדלל את מלאי הנגיף לריכוז של 2 x 106 PFU/mL עם מדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS ו 1% P/S. מערבבים את דילול הנגיף עם נפח שווה של דם סוס מנותק.
    הערה: התהליכים בוצעו בארון בטיחות ביולוגית במעבדת ACL-2.

3. בצע זיהום אוראלי

הערה: כל השלבים בוצעו במעבדת ACL-2. התהליך חייב להתבצע בתא הכפפות כדי למנוע בריחת יתושים.

  1. בצע הזנה מלאכותית באמצעות מערכת האכלת יתושים מלאכותית למשך שעה אחת.
    1. חותכים את קרומי הקולגן לגודל המתאים (כ-5 ס"מ קוטר), מאבטחים אותם למאגרים בעזרת אורינגים, ואז מוסיפים את תערובת הנגיף-דם (כ-3 מ"ל) למאגרים. השתמש בתקעי פלסטיק כדי לאטום מאגרים ולמנוע דליפות.
      הערה: צעדים אלה בוצעו בארון בטיחות ביולוגית.
    2. הכניסו את כוסות הפלסטיק (24 אונקיות) המכילות יתושים לקופסת הכפפות. הברג את המאגרים האטומים למזין FU1 והנח מיכל אחד על אחת, ולאחר מכן הפעל את יחידת הכוח. להאכיל את היתושים במשך 1 שעה
  2. מרדימים יתושים על ידיCO2 למשך מספר שניות עד שהם מתעלפים. בקיצור, הניחו את אקדח תרסיס הפחמן הדו-חמצני במרכז הרשת דרך החור בכוס המכיל יתושים, פתחו את הערך ואפשרו לכמויות עצומות של פחמן דו חמצני להיפלט החוצה כדי להרדים יתושים.
  3. יוצקים אותם לצלחת פטרי המונחת על קרח ומכסים את המכסה במהירות. בחרו את נקבות היתושים החרוטות בעזרת מלקחיים. כדי לזהות, לזכרים יש אנטנות נוצות ולנקבות יש אנטנות פשוטות. העבירו אותם לכוסות פלסטיק חדשות ב-50 נקבות יתושים לכוס.
    הערה: נקבות היתושים המאורגנות נקטפו כדי לשמור על עקביות מכיוון שכמות ההזנה משפיעה על התוכן הנגיפי.
  4. עוטפים את הכוס ברשת כילה חתוכה ואז מכסים אותה במכסה עם חור באמצע. חותכים את הספוג לחתיכה קטנה ומניחים אותו על הכוס.
  5. הוסיפו תמיסת גלוקוז 8% לספוג באמצעות טפטפת פלסטיק חד פעמית. שמור את הכוסות המכילות יתושים נקבות באינקובטור ב 27 ° C ב 80% לחות במשך 10 ימים. החליפו ספוג חדש רווי גלוקוז כל 72 שעות.

4. הכנה לחיסון תוך חזה

  1. הכינו את מחטי המיקרו-הזרקה כדלקמן. השתמשו ב-PUL-1000 כדי ליצור מחטי מיקרו-הזרקה (איור 1A) עם הפרמטרים הבאים בתוכנית משיכת המחטים: מדד חום = 450, כוח (g) = 110, מרחק (mm) = 1.00, והשהיה (s) = 0.
  2. חתכו את קצה המחט המשוכה בפינצטה מתחת למיקרוסקופ המנתח בהגדלה של פי 16 (איור 1B). אל תהפכו את הקצה לגדול מדי, אחרת זה יכול להזיק ליתושים.
  3. הכינו נקבות יתושים כמו בשלב 2.1.
    הערה: התהליכים הבאים בוצעו במעבדת ACL-2.
  4. הכינו את דילול הנגיף המדבק באופן הבא:
    1. הוציאו את מלאי הנגיף מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והפשירו אותו על קרח. לדלל את הנגיף לדילול וירוס 100 nL המכיל 100-500 PFU virus עם RPMI 1640 בינוני המכיל 10% FBS ו-1% P/S. יש לשמור על דילול הנגיף על קרח.
  5. ממלאים את המחט בשמן מינרלי באמצעות מזרק סטרילי חד פעמי. חבר את המחט למזרק בהתאם להוראה במכונה.
  6. הכנס את המחט לצינור המכיל את דילול הנגיף המדבק. אין לשבור את קצה המחט. לחץ על כפתור FILL כדי למלא את המחט בתמיסת וירוסים. הנפח הסופי של תמיסת הנגיף במחט הוא כ 4.0 μL. ברגע שהמחט מלאה בנגיף, היזהרו שלא לגעת בו ולפגוע בו.
    הערה: השלבים בוצעו בארון בטיחות ביולוגית.

5. ביצוע הזרקה ויראלית תחת מיקרוסקופ מנתח

הערה: כל השלבים בוצעו במעבדת ACL-2.

  1. מרדימים יתושים בטמפרטורה של -20°C למשך דקה אחת. יוצקים אותם לצלחת פטרי המונחת על קרח ומכסים את המכסה במהירות.
  2. בחרו כמעט 50 נקבות יתושים עם פינצטה והניחו אותן על צלחת הקרח. הניחו את צלחת הקרח מתחת למזרק והכניסו את המחט לחלל בית החזה של היתוש מתחת למיקרוסקופ המנתח (איור 1C).
  3. הגדר את נפח ההזרקה ל- 100 nL וקצב ל- 50 nL/s. לחץ על כפתור INJECT כדי לאפשר לתמיסת הנגיף לזרום לתוך היתוש. אם מתרחשת הזרקה מוצלחת, הבטן תבלוט מעט.
  4. הכניסו את היתוש הנגוע לכוס פלסטיק חדשה (24 אונקיות) שהונחה על קרח. כאשר מספר היתושים הנגועים מספיק, עוטפים את הכוס ברשת כילה חתוכה ואז מכסים אותה במכסה.
  5. שמור את הכוס המכילה יתושים זיהומיים באינקובטור ב 27 ° C ב 80% לחות במשך 10 ימים. האכילו את היתושים כמו בשלב 3.5.

6. עיבוד נקבות היתושים הנגועות

הערה: מכל נקבת יתוש נותחו שלוש רקמות/איברים שונים: המעי לחישוב קצב ההדבקה בנגיף (VIR), הראש לחישוב קצב הפצת הנגיף (VDR) והרוק לחישוב קצב העברת הנגיף (VTR). VIR הוגדר כמספר היתושים עם מעיים חיוביים לנגיף. VDR הוגדר כמספר היתושים עם ראש חיובי לווירוס חלקי מספר היתושים עם מעיים חיוביים לנגיף ב-100. VTR הוגדר כמספר היתושים עם רוק חיובי לווירוס חלקי מספר היתושים עם מעיים חיוביים לנגיף ב-100.

  1. איסוף רוק מנקבות היתושים הנגועות
    הערה: יש לבצע את התהליכים במעבדת ACL-2.
    1. הרדימו את נקבות היתושים הנגועות על ידי הרדמת פחמן דו חמצני כמו בשלב 3.2. יוצקים אותם לצלחת פטרי המונחת על קרח וסוגרים את המכסה במהירות.
    2. מניחים 10 קצוות פיפטה ממולאים בשמן טבילה זה לצד זה על בוץ הגומי.
    3. בחרו נקבות יתושים בפינצטה והניחו אותן על צלחת קרח. הסירו את רגליהם וכנפיהם בפינצטה. הניחו את פיו של יתוש אחד על כל קצה פיפטה.
    4. אספו את הרוק כפי שהופרש לשמן על ידי היתושים במשך 45-60 הדקות הבאות בטמפרטורת החדר.
    5. מניחים את קצות פיפטה בצינורות 1.5 מ"ל המכילים 200 μL של מדלל וירוס (RPMI 1640 בינוני המכיל 10% FBS ו 1% P / S). צנטריפוגו אותם ב 5,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לגרש רוק לתוך צינורות. אחסן צינורות אלה ב -80 °C לקביעה עוקבת של קצבי שידור.
  2. לנתח את נקבות היתושים הנגועות
    הערה: יש לבצע את התהליכים במעבדת ACL-2.
    1. השתמשו בפינצטה כדי לחתוך את ראשי נקבות היתושים לאחר איסוף הרוק. הכניסו כל ראש לצינור בודד המכיל 200 μL של סל"ד 1640 בינוני.
    2. תפוס את בית החזה עם טוויטר, ואז את החלק הלפני אחרון של הבטן עם פינצטה נוספת ומשוך אותו החוצה. המעיים יישלפו. נקו את המעי הנשלף מכל רקמה ואיברים תועים.
    3. שטפו את המעי עם PBS והכניסו כל מעי לצינור נפרד המכיל 200 μL של RPMI 1640 בינוני. אחסנו צינורות אלה בטמפרטורה של -80°C לצורך קביעה עוקבת של קצב ההדבקה בנגיף וקצב הפצתו.

7. ניתוח נתונים

  1. מיצוי RNA
    1. טוחנים את הרקמות לחתיכות עם מכונת טחינת הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה המוגדרת לפרמטרים הבאים: תדירות הפעלה = 60 הרץ, זמן פעולה = 15 שניות, זמן הפסקה = 10 שניות, מחזורים = 2 והגדרת טמפרטורה = 4.0 מעלות צלזיוס.
    2. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. חלץ את סך כל הרנ"א של כל דגימה על ידי מערכת אוטומטית למיצוי חומצות גרעין בהתאם להוראות המכשיר.
  2. ביצוע qRT-PCR
    1. השתמש בערכת RT-PCR בשלב אחד כדי לכמת את עותקי הרנ"א הנגיפיים באמצעות מכשיר PCR כמותי17. השתמש בפריימרים הבאים לזיהוי מקטע F של EBIV S: ATGGCATCACCTGGGAAAG ו- R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. הגדר את תהליך התגובה כ: שלב 1: 42 ° C למשך 5 דקות, 95 ° C למשך 10 שניות; שלב 2: 40 מחזורים של 95 ° C עבור 5 s ו 60 ° C עבור 20 שניות.
    2. לקבוע את מינון הנגיף הנמוך ביותר עבור זיהום בתאים באמצעות דילולים סדרתיים פי 10 מחוסן על תאים. השתמש בתאי BHK-21 כדי לקבוע את מינון הנגיף הנמוך ביותר של EBIV, באמצעות דילולים עד 10-7 כמתואר בשלב 1.2.
    3. חשב את ערך ה- Ct של מינון הנגיף הנמוך ביותר על ידי qRT-PCR. השתמש בערך החיתוך עבור EBIV-חיובי על ידי qRT-PCR כ- 35 <. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את עותקי EBIV בכל דגימה:
      y = -4.0312x + 3.384 [x = log (העותקים של EBIV), y = ערך Ct, R2 = 0.9905]
    4. חשב את קצב ההדבקה, קצב ההפצה וקצב ההדבקה כדלקמן:
      שיעור ההדבקה (%) = 100 x (מספר מעי היתושים החיוביים לווירוס / מספר היתושים הכולל)
      שיעור הפצה (%) = 100 x (מספר ראשי יתושים חיוביים לווירוס / מספר מעי יתושים חיוביים לנגיף)
      שיעור ההדבקה (%) = 100 x (מספר רוק היתושים החיובי לווירוס / מספר מעי היתושים החיוביים לנגיף)
    5. לנתח את ההבדלים במשתנים רציפים והבדלים בשיעורי ההדבקה של יתושים, שיעורי הפצה ושיעורי הדבקה באמצעות ניתוח קרוסקל-וואליס לא פרמטרי להשוואות מרובות והמבחן המדויק של פישר במידת הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבחון את התפלגות EBIV ביתושים הנגועים באמצעות הזנת דם מלאכותית (הטיטר הסופי הנגיפי היה 6.4 x 106 PFU/mL) והזרקה תוך חזה (המינון הנגיפי היה 340 PFU), נקבעו RNA נגיפי ברוק, בראש ובמעיים של היתושים לאחר 10 ימים לאחר ההדבקה (dpi).

עבור Ae. aegypti, טיטר הנגיף של EBIV במעיים, בראש וברוק של נקבות יתושים שחוסנו תוך בית החזה היה הרבה יותר גבוה מזה של נקבות יתושים נגועות דרך הפה (איור 2A-C). שיעור ההדבקה ושיעור ההפצה של נקבות יתושים שחוסנו תוך חזיה היה 100%, אך עבור נקבות היתושים הנגועות בפה היה 70% ו-38.1%, בהתאמה (איור 2D, E). שיעור ההדבקה של נקבות היתושים המחוסנות תוך חזיה הגיע עד 90%, אך עבור נקבות היתושים הנגועות דרך הפה היה רק 4.8%. הוא הצביע על כך שלמעיים של Ae. aegypti הייתה השפעה מעכבת חזקה על העברת הנגיף.

Figure 1
איור 1: סכמה של קצה מיקרופיפטה והזרקה תוך חזה . (A) משכו את קצה המיקרופיפטה לפני שבירת הקצה. (B) קצה מיקרופיפטה מוכן כראוי המתאים לחיסון תוך חזי. (C) סכמטי של הזרקה תוך חזה עבור היתושים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: יכולת וקטורית של יתושים בוגרים באמצעות הזנה דרך הפה וחיסון תוך חזי . נקבות היתושים הנגועות הודגרו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים. ערך p ≤ 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. ניתוח קרוסקל-וואליס הלא-פרמטרי שימש להשוואות מרובות ולמבחן המדויק של פישר במידת הצורך. נתון זה שונה ממחקר של Xia et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת שיטה זו הייתה לספק הערכת סיכונים מקיפה של נגיף אחד המועבר על ידי יתושים על ידי הערכת יכולת וקטורית באמצעות הזנה אוראלית וחיסון תוך חזי.

בניסוי האכלה דרך הפה, יש לקטוף יתושים חרוטים ולהעבירם למיכל חדש, דבר המהווה סיכון חמור למפעילים. הסיבה לכך היא שכל יתוש, כולל יתושים לא נגועים, עלול להיות מקור להדבקה19 . כתוצאה מכך, יש להרדים תחילה יתושים, כמפורט בפרוטוקול, ולאחר מכן לבצע את שלבי המעקב. חשוב לציין כי הוצאת יתושים חרוטים והעברתם צריכה להתבצע בתא כפפות אטום. שמרו את תא הכפפות סגור במהלך התהליך, אלא אם כן אין יתושים הנעים בחופשיות בקופסה.

בניסוי הזיהום, עדיף לשני אנשים לעבוד יחד, ולאחר ששני האנשים מאשרים שאין יתושים בורחים בו זמנית, הם יכולים לפתוח את תא הכפפות כדי למנוע מיתושים נגועים לברוח. אם מתרחשת בריחה, יש להרוג את היתושים האלה או ללכוד אותם מחדש. לא מומלץ להרוג יתושים נגועים בידיים חשופות. ניתן להפחית את סיכון הזיהום של המפעילים על ידי שימוש בשואפי ואקום או בכלים מתאימים אחרים (למשל, מלקחיים, מברשות צבע, ידיים בכפפות). לאחר הניסוי, יש לחטא את החלק הפנימי של תא הכפפות ואת פני השטח של שולחן העבודה בחומר חיטוי קונבנציונלי.

רוב המחקר על יכולת וקטור יתושים לנגיפים המועברים על ידי יתושים התמקד אך ורק בזיהום אוראלי20,21. עבור זיהום פומי, וירוסים חייבים להתגבר על מספר מחסומי רקמות הקשורים למעי התיכון ולבלוטות הרוק כדי להשתחרר לרוק14. ההשפעה של בלוטת המעי התיכון ובלוטת הרוק על היכולת הווקטוריאלית של יתושים לא הודגמה בניסוי זה. כאשר האכלה אוראלית והזרקה תוך חזה משולבים, ניתן להעריך ביסודיות את מחסומי הרקמה השונים. על פי התוצאות של הליך זה, המעי של Ae. aegypti ממלא תפקיד דומיננטי בכשירות הווקטורית של הנגיף, ומחסום בלוטת הרוק עשוי שלא להיות נוכח (איור 2). לשם כך, הפרוטוקול שלנו מועיל כדי לאשר את נוכחותם של מחסומים באמצע המעי או בלוטת הרוק לזיהום arboviruses.

על פי המתודולוגיה, רק RNA נגיפי זוהה בדגימות. חקירות אחרות, כגון ראיית הנגיף במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אישור הזיהום באמצעות בדיקות פלאק, או איתור חלבון נגיפי עם בדיקת אימונופלואורסצנטיות, נדרשות כדי לאשר את הנגיפים הזיהומיים בדגימות השונות. מתודולוגיה זו עשויה להשתנות ולשמש לחיסון וירוסים נוספים בעלי עניין למגוון רחב של וקטורי יתושים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aedes aegypti  Rockefeller strain
Automated nucleic acid extraction system  NanoMagBio S-48
BHK-21 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Buckets
C6/36 cells  National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Carbon dioxide spray gun  wuhan Yihong YHDFPCO2
Centrifugal machine Himac  CF16RN
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad CFX96 Touch
Ebinur Lake virus Cu20-XJ isolation
Formaldehyde  Wuhan Baiqiandu B0003
Glove box 
Glucose Hushi 10010518
Immersion oil  Cargille 16908-1
Insect incubator Memmert HPP750T7
Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine  Servicebio KZ-III-F
Magnetic Virus Genome Extraction Kit NanoMagBio NMG0966-16
mesh cages (30 x 30 x 30 cm) Huayu HY-35
methylcellulose Calbiochem 17851
mice feedstuff powder  BESSN BS018
Microelectrode Puller WPI PUL-1000 PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.
Mosquito net meshes 
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond 3-000-207
One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit  Takara RR096A
PBS, pH 7.4 Gibco C10010500BT
Penicillin/streptomycin Gibco 151140-122
Petri dishes 
Plastic cupes (7 oz)  Hubei Duoanduo
Plastic cups (24 oz)  Anhui shangji PET32-Tub-1
Plastic disposable droppers Biosharp BS-XG-O3L-NS
Refrigerator (-80 °C) sanyo MDF-U54V
Replacement Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
RPMI medium 1640  Gibco C11875500BT
Screw cap storage tubes (2 mL ) biofil  FCT010005
Shallow dishes 
Sponge
Sterile defibrillated horse blood Wuhan Purity Biotechnology CDHXB413
T75 culture flask Corning 430829
The artificial mosquito feeding system  Hemotek Hemotek PS6
The dissecting microscope  ZEISS  stemi508
The ice plates
The mosquito absorbing machine  Ningbo Bangning
The pipette tips  Axygen TF
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Tweezers Dumont 0203-5-PO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
  2. Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
  3. Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
  4. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
  5. Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
  6. Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
  7. Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
  8. Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
  9. Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
  10. Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
  11. Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
  12. Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
  13. Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
  14. Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
  15. Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
  16. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
  17. Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
  18. Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
  19. Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
  20. Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
  21. Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).

Tags

פסילה גיליון 185 וירוסים המועברים על ידי יתושים יתושים האכלה אוראלית מיקרו-הזרקה
זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Yang, C., Wang, S., Wu,… More

Wang, F., Yang, C., Wang, S., Wu, Q., Ochieng, C., Yuan, Z., Xia, H. Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection. J. Vis. Exp. (185), e63830, doi:10.3791/63830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter