Summary
Denne metoden, som inkluderte oral ernæring og intratorakal injeksjonsinfeksjon, kunne effektivt vurdere påvirkningen av midttarms- og/eller spyttkjertelbarrierer på arbovirusinfeksjon.
Abstract
Myggbårne virus (MBV), som er smittsomme patogener til vertebrater, spres av mange myggarter, og utgjør en alvorlig trussel mot folkehelsen. Når de er inntatt, må virusene overvinne myggens midttarmbarriere for å nå hemolymfen, hvorfra de potensielt kan spre seg til spyttkjertlene. Når en mygg biter, spres disse virusene til nye vertebratverter. På samme måte kan myggen plukke opp forskjellige virus. Generelt kan bare en liten del av virus komme inn i spyttkjertlene via tarmen. Overføringseffektiviteten til disse virusene til kjertlene påvirkes av de to fysiske barrierene som finnes i forskjellige myggarter: midttarmbarrierer og spyttkjertlerbarrierer. Denne protokollen presenterer en metode for viruspåvisning i spyttkjertler av Aedes aegyptis etter oral ernæring og intratorakal injeksjonsinfeksjon. Videre kan fastsettelse av om tarmen og / eller spyttkjertlene hindrer virusspredning hjelpe til med risikovurderingene av MBV overført av Aedes aegypti.
Introduction
Myggbårne virus (MBV), en heterogen gruppe RNA-virus, kan vedvare i myggvektorer og deretter spre seg til virveldyrverter1. De klinisk viktige MBVene er hovedsakelig fordelt i fire virusfamilier, nemlig Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae og Peribunyavividae 2,3. I de siste tiårene har disse virusene blitt rapportert over hele verden, noe som forårsaker folkehelseproblemer. Som en av de mest kjente MBVene har Dengue-viruset (DENV) blitt det mest utbredte fremvoksende eller gjenoppståtte arboviruset i over 100 land i løpet av de siste 20 årene4. Siden oppdagelsen av Zika-virus (ZIKV) i innlandet har nesten alle tropiske og subtropiske land og territorier på kontinentet rapportert menneskelige ZIKV-infeksjoner5. For å vurdere risikoen for virusoverføring har mange studier de siste årene fokusert på myggvektorkompetanse for disse virusene 6,7. Som et resultat er det avgjørende å effektivt forebygge og kontrollere vektorbårne sykdommer.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), en av de lettest oppdrettede myggene i laboratoriet, er en viktig vektor av DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) og gulfebervirus (YFV)8. Lenge fantes Ae. aegypti utelukkende på det afrikanske kontinentet og i Sørøst-Asia, men de siste årene har den kolonisert nesten alle kontinenter9. Videre har den globale overfloden av Ae. aegypti kontinuerlig vokst, med en estimert økning på 20% innen slutten av århundret10. Fra 2004 til 2009 i Kina var det en tydelig økning i Ae. aegypti vektorkompetanse for DENV på grunn av høyere dag-til-dag temperaturer11. Statusen til Ae. aegypti som den patogene vektoren har økt betydelig i Kina. For å møte disse utfordringene er det derfor nødvendig å undersøke vektorkompetansen til Ae. aegypti for å overføre virus.
Som en hematofagøs leddyr gjennomborer den kvinnelige myggen huden til en vertebratvert og spiser på blodet. Mygg får av og til virus fra virusinfiserte verter og overfører deretter virusene til en ny vert. Som sådan, for å bestemme vektorkompetanse, blir mygg matet et kunstig blodmel som inneholder arbovirus gjennom et fôringssystem i laboratorieinnstillingen12. Individuelle mygg er separert i hoder, kropper og spytt sekreter flere dager etter infeksjon. For å måle virusinfeksjon, spredning og overføringshastigheter har virustitere blitt detektert ved kvantitativ reverstranskripsjons-PCR (qRT-PCR) eller plakkanalyse. Imidlertid utvikler ikke alle mygg midgut infeksjoner og kapasitet til å overføre et virus til neste vert etter blodfôring. Det er knyttet til myggens fysiologiske barrierer, som hindrer patogener i å trenge inn i kroppen og spiller en viktig rolle i deres medfødte immunitet13. Midttarmbarrierene, spesielt midttarminfeksjonsbarrieren (MIB) og midgut escape barrier (MEB), påvirker om viruset kan infisere vektoren systemisk og effektiviteten som den sprer seg med. Det hindrer analysen av andre vevs infeksjon, for eksempel spyttkjertler som også viser spyttkjertelinfeksjon og rømningsbarrierer13,14. For bedre å karakterisere infeksjonen av midguts og spyttkjertler i vektoren, presenteres en detaljert protokoll for oral fôring og intratorakal inokulering av arbovirus i Ae. aegypti her. Denne protokollen kan brukes på ytterligere arbovirusinfeksjoner i en rekke myggvektorer, for eksempel DENV- og ZIKV-infeksjon i Aedes spp., Og kan vise seg å være en praktisk prosedyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av virus og mygg
- Forberedelse av virus
MERK: Alle prosesser ble utført i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium. Nivået av biosikkerhetsbegrensning som brukes, bør bestemmes av patogenets risikovurdering og forskrifter som er spesifikke for nasjoner og regioner. Prosessen må utføres i et biosikkerhetsskap.- Inokuler 1 x 106 C6/36 celler i en T75 kulturkolbe. Fyll kolben med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium som inneholder 10% varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S).
MERK: Leibovitzs L-15 medium (L15) eller Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) kan også brukes til å opprettholde C6/36 celler. - Hold cellene i 5% CO2 ved 28 ° C over natten og fjern cellesupernatanten neste dag når cellene er 80% -90% sammenflytende.
- Tilsett 1 ml virusfortynning (Multiplicity of Infection (MOI) = 0,01) i kolben og inkuber cellene i 1 time i 5% CO2 ved 28 ° C. Ebinur Lake virus (EBIV)15, et myggbårent orthobunyavirus, ble brukt som modellvirus for denne protokollen.
- Fjern supernatanten og vask cellene 3x med 5 ml PBS. Fyll kolben med 15 ml nytt RPMI-medium med 2% FBS. Hold kolben i 5 % CO2 ved 28 °C.
- Samle supernatantholdig virus når den nødvendige virale titer er nådd (etter nesten 5 dager, avhengig av viruset som brukes). For EBIV var denne titerverdien 107 plakkdannende enheter (PFU)/ml. Pakk dem inn i individuelle 2 ml skrukorklagringsrør og oppbevar tubene som inneholder 0,5-1 ml virus ved -80 °C.
- Inokuler 1 x 106 C6/36 celler i en T75 kulturkolbe. Fyll kolben med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium som inneholder 10% varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S).
- Bestemmelse av viral titer
MERK: Bestem viral titer gjennom plakkanalysene16. BHK-21 ble brukt til å bestemme viral titer av EBIV, på grunn av den åpenbare cytopatiske effekten (CPE) observert i infiserte celler.- Inokuler 1 x 105 BHK-21 celler i hver brønn med 24-brønnplater. Fyll hver brønn med 1 ml DMEM-medium inneholdende 10 % FBS og 1 % P/S. Vedlikehold cellene i 5 % CO2 ved 37 °C over natten.
- Lag seks (10-6) påfølgende 10 ganger fortynninger av virusholdig supernatant med ferskt DMEM-medium inneholdende 10% FBS og 1% P/S.
- Tilsett 100 μL virusfortynningsmiddel i hver brønn med 24-brønnsplater som inneholder monolaget BHK-21. Virusets fortynningsvæske skal kastes etter inkubasjon i 1 time ved 5 % CO2 ved 37 °C. Tilsett 500 μL DMEM inneholdende 1,5% metylcellulose til hver brønn.
- Dyrkningsceller i 5 % CO2 ved 37 °C i 48 timer (tilsynelatende CPE ble funnet etter 48 timer for EBIV). Fest cellene over natten med 750 μL 3,7% formaldehyd.
- Beis dem med 200 μL 2% krystallfiolett i 15 minutter. Tell antall plakk for å beregne virustiteren.
- Myggavl i laboratoriet
MERK: Bakre mygg i et leddyrinneslutningsnivå 1 (ACL-1) laboratorium.- For fremstilling av deklorert vann, fyll en 20 L bøtte med vann fra springen og la den stå i 7-8 dager uten lys. Ikke dekk til lokket.
- Hold egg og larver av Ae. aegypti i et myggrom med følgende forhold: 28 ± 1 °C med en lys/mørk syklus på 12 timer og en relativ luftfuktighet på 75 % ± 5 %.
- Hold nesten 1000 larver i en grunn tallerken (22 cm x 15 cm x 6 cm) som inneholder deklorert vann etter at eggene klekkes. Gi dem med nesten 1/8 ts musfôrpulver. Oppdater maten daglig og bytt vann hver 2.
- Når larvene forpupper seg etter 5-7 dager, bruk en engangsdråpe for å overføre pupper til en plastkopp (7 oz) fylt med deklorert vann.
- Sett fem kopper med pupper (ca. 200 per kopp) i ett nettingbur (30 cm x 30 cm x 30 cm) og hold burene i insektinkubatoren med samme betingelser som i trinn 1.3.2.
- Sett en liten svamp som inneholder en 8% (m / w) glukoseoppløsning på hvert nettingbur for å mate voksne mygg. Etter voksen fremvekst, ta ut koppene uten pupper. Hold nettingburene med ca 1000 voksne mygg per bur i samme insektinkubator.
2. Forberedelse til oral infeksjon
- Forbered kvinnelige mygg for oral infeksjon. Bruk myggabsorberende maskinen til å samle 5-8 dager gamle mygg. Bedøv dem ved -20 °C i 1 min og sjekk om myggen er svimmel. Hvis ikke, bedøv dem i et minutt til ved -20 °C.
- Hell dem raskt i plastkoppene (24 oz) på ca 200 mygg (kvinner og menn) per kopp. Dekk hver kopp raskt med et godt kuttet myggnett, etterfulgt av et lokk med et hull (ca. 6 cm i diameter) i midten.
- Sult myggene i 24 timer før oralinfeksjonen og lag smittsomt blodmåltid som følger.
- I et biosikkerhetsskap under BSL-2-forhold, ta ut viruslageret fra fryseren på -80 °C og tine dem på is. Fortynn viruslageret til en konsentrasjon på 2 x 106 PFU/ml med RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS og 1% P/S. Bland virusfortynningen med et likt volum defibrert hesteblod.
MERK: Prosessene ble utført i et biosikkerhetsskap i et ACL-2-laboratorium.
3. Utfør oral infeksjon
MERK: Alle trinnene ble utført i et ACL-2 laboratorium. Prosessen må utføres i hanskerommet for å forhindre mygg i å rømme.
- Utfør kunstig fôring ved å bruke det kunstige myggfôringssystemet i 1 time.
- Klipp kollagenmembranene til riktig størrelse (ca. 5 cm i diameter), fest dem til reservoarene med o-ringer, og tilsett deretter virus-blodblandingen (ca. 3 ml) til reservoarene. Bruk plastplugger til å tette reservoarer og forhindre lekkasjer.
MERK: Disse trinnene ble utført i et biosikkerhetsskap. - Sett plastkoppene (24 oz) som inneholder mygg i hanskerommet. Skru de forseglede reservoarene på FU1 Feeder og sett ett reservoar på en kopp, og slå deretter på kraftenheten. Fôr myggene i 1 time
- Klipp kollagenmembranene til riktig størrelse (ca. 5 cm i diameter), fest dem til reservoarene med o-ringer, og tilsett deretter virus-blodblandingen (ca. 3 ml) til reservoarene. Bruk plastplugger til å tette reservoarer og forhindre lekkasjer.
- Bedøv mygg av CO2 i flere sekunder til de besvimer. Kort sagt, plasser karbondioksidsprøytepistolen midt i nettnettet gjennom hullet på koppen som inneholder mygg, åpne verdien og la store mengder karbondioksid spys ut for å bedøve mygg.
- Hell dem i en petriskål plassert på is og dekk lokket raskt. Plukk ut de engorged kvinnelige myggene med tang. For å identifisere har hannene fjærantenner og hunnene har vanlige antenner. Overfør dem til nye plastkopper med 50 hunnmygg per kopp.
MERK: De engorged kvinnelige myggene ble plukket for å opprettholde konsistens da fôringsmengden påvirker virusinnholdet. - Pakk koppen med et kuttet myggnettnett og dekk det deretter med et lokk med et hull i midten. Klipp svampen i et lite stykke og legg det på koppen.
- Tilsett 8% glukoseoppløsning på svampen ved hjelp av en engangsdråpe av plast. Oppbevar koppene med hunnmygg i kuvøsen ved 27 °C ved 80 % luftfuktighet i 10 dager. Bytt ut en ny glukosemettet svamp hver 72.
4. Forberedelse for intratorakal inokulasjon
- Klargjør mikroinjeksjonsnålene som følger. Bruk en-1000 til å lage mikroinjeksjonsnåler (figur 1A) med følgende parametere i nåletrekkerprogrammet: Varmeindeks = 450, kraft (g) = 110, avstand (mm) = 1,00 og forsinkelse (er) = 0.
- Skjær spissen av en trukket nål med pinsett under dissekeringsmikroskopet ved 16x forstørrelse (figur 1B). Ikke gjør spissen for stor, ellers kan det skade myggene.
- Forbered hunnmygg som i trinn 2.1.
MERK: Følgende prosesser ble utført i et ACL-2 laboratorium. - Forbered fortynningen av smittsomme virus som følger:
- Ta ut viruslageret fra fryseren på -80 °C og tine dem på is. Fortynn virus til en 100 nL virusfortynning inneholdende 100-500 PFU virus med RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS og 1% P/S. Hold virusfortynningen på is.
- Fyll på nålen med mineralolje gjennom en steril engangssprøyte. Fest kanylen inn i injektoren i henhold til instruksjonene på maskinen.
- Stikk nålen inn i et rør som inneholder fortynningen av infeksjonsviruset. Ikke brekk kanylespissen. Trykk på FILL-knappen for å fylle kanylen med virusoppløsning. Det endelige volumet av virusoppløsningen i nålen er ca. 4,0 μL. Når nålen er fylt med viruset, vær forsiktig så du ikke berører og skader det.
MERK: Trinnene ble utført i et biosikkerhetsskap.
5. Utfør viral injeksjon under et dissekerende mikroskop
MERK: Alle trinnene ble utført i et ACL-2 laboratorium.
- Bedøv mygg ved -20 °C i 1 min. Hell dem i en petriskål plassert på is og dekk lokket raskt.
- Plukk ut nesten 50 hunnmygg med pinsett og legg dem på isplaten. Plasser isplaten under injektoren og stikk nålen inn i myggens thoraxhule under dissekeringsmikroskopet (figur 1C).
- Sett injeksjonsvolumet til 100 nL og hastigheten til 50 nL/s. Trykk på INJECT-knappen for å la virusoppløsningen strømme inn i myggen. Hvis vellykket injeksjon oppstår, vil magen litt bøye seg.
- Sett den infiserte myggen i en ny plastkopp (24 oz) plassert på is. Når antallet av de smittede myggene er nok, pakk koppen med et kuttet myggnettnett og dekk det deretter med lokket.
- Hold koppen med smittsomme mygg i inkubatoren ved 27 °C ved 80 % fuktighet i 10 dager. Fôr myggene som i trinn 3.5.
6. Behandling av infiserte kvinnelige mygg
MERK: Tre forskjellige vev / organer ble dissekert fra hver hunnmygg: tarmen for beregning av virusinfeksjonsraten (VIR), hodet for beregning av virusspredningshastigheten (VDR) og spytt for beregning av virusoverføringshastigheten (VTR). VIR ble definert som antall mygg med viruspositiv tarm. VDR ble definert som antall mygg med viruspositive hoder delt på antall mygg med viruspositiv tarm med 100. VTR ble definert som antall mygg med viruspositivt spytt delt på antall mygg med viruspositiv tarm med 100.
- Samling av spytt fra de smittede kvinnelige myggene
MERK: Prosessene må utføres i et ACL-2-laboratorium.- Bedøv de infiserte hunnmyggene ved karbondioksidbedøvelse som i trinn 3.2. Hell dem i en petriskål plassert på is og lukk lokket raskt.
- Plasser 10 μL pipettespisser fylt med nedsenkningsolje side om side på gummislammet.
- Plukk ut kvinnelige mygg med pinsett og legg dem på en isplate. Fjern bena og vingene med pinsett. Plasser munndelen av en mygg på hver pipettespiss.
- Samle spyttet som skilles ut i oljen av myggene de neste 45-60 minuttene ved romtemperatur.
- Plasser pipettespissene i rør på 1,5 ml inneholdende 200 mikroliter virusfortynningsmiddel (RPMI 1640 medium inneholdende 10 % FBS og 1 % P/S). Sentrifuger dem ved 5000 x g i 5 minutter ved 4 °C for å drive spytt ut i rør. Oppbevar disse rørene ved -80 °C for senere bestemmelse av overføringshastigheter.
- Dissekere de infiserte kvinnelige myggene
MERK: Prosessene må utføres i et ACL-2-laboratorium.- Bruk pinsett til å kutte hodene til de kvinnelige myggene etter spyttsamling. Plasser hvert hode i et individuelt rør som inneholder 200 μL RPMI 1640 medium.
- Ta tak i brystkassen med en pinsett, deretter det nest siste segmentet av magen med en annen pinsett og trekk den ut. Tarmen vil bli trukket ut. Rengjør den uttrukne tarmen av bortkommen vev og organer.
- Vask tarmen med PBS og plasser hver tarm i et individuelt rør som inneholder 200 μl RPMI 1640 medium. Oppbevar disse tubene ved -80 °C for senere bestemmelse av virusinfeksjonshastighet og spredningshastighet.
7. Dataanalyse
- RNA-ekstraksjon
- Mal vevet i stykker med en slipemaskin for vevshomogenisator ved lav temperatur satt til følgende parametere: driftsfrekvens = 60 Hz, driftstid = 15 s, pausetid = 10 s, sykluser = 2 og innstillingstemperatur = 4,0 °C.
- Sentrifuger prøvene ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Ekstraher totalt RNA av hver prøve ved hjelp av automatisert nukleinsyreekstraksjonssystem i henhold til instrumentinstruksjonene.
- Utføre qRT-PCR
- Bruk ett-trinns RT-PCR-settet til å kvantifisere de virale RNA-kopiene ved hjelp av et kvantitativt PCR-instrument17. Bruk følgende primere for påvisning av EBIV S segment F: ATGGCATCACCTGGGAAAG og R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Sett opp reaksjonsprosessen som: trinn 1: 42 °C i 5 minutter, 95 °C i 10 s; stadium 2: 40 sykluser på 95 °C i 5 s og 60 °C i 20 s.
- Bestem den laveste virusdosen for infeksjonen i cellene gjennom de serielle 10 ganger fortynningene inokulert på celler. Bruk BHK-21-cellene til å bestemme den laveste virusdosen av EBIV, ved bruk av fortynninger til 10-7 som beskrevet i trinn 1.2.
- Beregn Ct-verdien for den laveste virusdosen ved qRT-PCR. Bruk grenseverdien for EBIV-positiv ved qRT-PCR som < 35. Bruk følgende ligning til å beregne kopiene av EBIV i hver prøve:
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (kopiene av EBIV), y = Ct-verdi, R2 = 0,9905] - Beregn smittetall, spredningsrate og smittespredning slik:
Smitterate (%) = 100 x (antall viruspositive myggtarmer / antall mygg totalt)
Spredningsrate (%) = 100 x (antall viruspositive mygghoder / antall viruspositive myggtarmer)
Smittespredning (%) = 100 x (antall viruspositive myggspytt/antall viruspositive myggtarmer) - Analyser forskjellene i kontinuerlige variabler og forskjeller i mygginfeksjonsrater, spredningshastigheter og overføringshastigheter ved å bruke den ikke-parametriske Kruskal-Wallis-analysen for flere sammenligninger og Fishers eksakte test der det er hensiktsmessig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke EBIV-distribusjon i de infiserte myggene via kunstig blodfôring (viral slutttiter var 6,4 x 106 PFU/ml) og intratorakal injeksjon (virusdose var 340 PFU), ble virale RNA i spytt, hoder og innvoller hos myggen 10 dager etter infeksjon (dpi) bestemt.
For Ae. aegypti var virustiter av EBIV i tarm, hoder og spytt hos de intratorakalt inokulerte hunnmyggene mye høyere enn hos de oralinfiserte hunnmyggene (figur 2A-C). Infeksjonsrate og spredningsrate for de intratorakalt inokulerte hunnmyggene var 100 %, men for de oralinfiserte hunnmyggene henholdsvis 70 % og 38,1 % (figur 2D, E). Overføringshastigheten for de intratorakalt inokulerte kvinnelige myggene nådde opptil 90%, men for de oralinfiserte kvinnelige myggene var bare 4,8%. Det indikerte at tarmen til Ae. aegypti hadde en sterk hemmende effekt for virusoverføring.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av mikropipettespiss og intratorakal injeksjon . (A) Trakk mikropipettespissen før spissen knekkes. (B) Riktig tilberedt mikropipettespiss egnet for intratorakal inokulering. (C) Skjematisk av intratorakal injeksjon for mygg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vektorkompetanse hos voksne mygg ved peroral ernæring og intratorakal inokulasjon. De smittede hunnmyggene ble ruget ved 28 °C i 10 dager. P-verdi ≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Den ikke-parametriske Kruskal-Wallis-analysen ble brukt til flere sammenligninger og Fishers eksakte test der det var hensiktsmessig. Denne figuren er modifisert fra studie av Xia et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne metoden var å gi en helhetlig risikovurdering av ett myggbårent virus ved å evaluere vektorkompetanse gjennom oral ernæring og intratorakal inokulasjon.
I det orale fôringsforsøket må engorged-mygg plukkes ut og overføres til en ny beholder, noe som utgjør en alvorlig risiko for operatørene. Årsaken til dette er fordi enhver mygg, inkludert uinfiserte mygg, kan være en kilde til infeksjon19. Følgelig må mygg bedøves først, som spesifisert i protokollen, og deretter bør oppfølgingstrinnene utføres. Det er viktig å merke seg at å velge ut engorged mygg og overføre dem skal utføres i en forseglet hanskerom. Hold hanskerommet lukket under prosessen, med mindre det ikke er mygg i fritt bevegelige i esken.
I infeksjonsforsøket er det bedre for to personer å jobbe sammen, og etter at de to personene har bekreftet at det ikke er rømningsmygg samtidig, kan de åpne hanskerommet for å forhindre at infiserte mygg rømmer. Hvis en rømning finner sted, må disse myggene drepes eller gjenfanges. Det anbefales ikke å drepe smittede mygg med bare hender. Operatørenes infeksjonsrisiko kan reduseres ved å bruke vakuumsugere eller andre egnede verktøy (f.eks. tang, pensler, hansker). Etter forsøket, desinfiser innsiden av hanskerommet og overflaten av arbeidsbenken med et konvensjonelt desinfeksjonsmiddel.
Mesteparten av forskningen om myggvektorkompetanse for myggbårne virus har utelukkende fokusert på oral infeksjon20,21. For oral infeksjon, må virus overvinne flere vevsbarrierer forbundet med midgut og spyttkjertler som skal slippes ut i spytt14. Effekten av midttarmkjertel og spyttkjertel på myggvektoriell kapasitet ble ikke demonstrert i dette forsøket. Når oral ernæring og intratorakal injeksjon kombineres, kan de forskjellige vevsbarrierene evalueres grundig. Ifølge resultatene av denne prosedyren spiller tarmen til Ae. aegypti en dominerende rolle i vektorkompetansen for viruset, og spyttkjertelbarrieren er kanskje ikke til stede (figur 2). For dette er vår protokoll gunstig for å bekrefte tilstedeværelsen av midgut eller spyttkjertel barrierer for arboviruses infeksjon.
Ifølge metodikken ble bare viralt RNA identifisert i prøvene. Andre undersøkelser, som å se virionen med et transmisjonselektronmikroskop, bekrefte infeksjonen ved hjelp av plakkanalyser eller oppdage virusprotein med en immunfluorescensanalyse, kreves for å bekrefte de smittsomme virusene i de forskjellige prøvene. Denne metoden kan modifiseres og brukes til å inokulere ytterligere virus av interesse i et bredt spekter av myggvektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
