Summary
Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.
Abstract
Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), die infektiöse Krankheitserreger für Wirbeltiere sind, werden von vielen Mückenarten verbreitet und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Nach der Aufnahme müssen die Viren die Mitteldarmbarriere der Mücken überwinden, um die Hämolymphe zu erreichen, von wo aus sie sich möglicherweise auf die Speicheldrüsen ausbreiten können. Wenn eine Mücke sticht, werden diese Viren auf neue Wirbeltierwirte übertragen. In ähnlicher Weise kann die Mücke verschiedene Viren aufnehmen. In der Regel kann nur ein winziger Teil der Viren über den Darm in die Speicheldrüsen gelangen. Die Übertragungseffizienz dieser Viren auf die Drüsen wird durch die beiden physikalischen Barrieren beeinflusst, die bei verschiedenen Mückenarten zu finden sind: Mitteldarmbarrieren und Speicheldrüsenbarrieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Virusnachweis in Speicheldrüsen von Aedes aegypti nach oraler Nahrungsaufnahme und intrathorakaler Injektionsinfektion dar. Darüber hinaus kann die Feststellung, ob der Darm und/oder die Speicheldrüsen die Virusausbreitung behindern, bei der Risikobewertung von MBVs helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden.
Introduction
Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), eine heterogene Gruppe von RNA-Viren, können in Mückenvektoren persistieren und sich anschließend auf Wirbeltierwirte ausbreiten1. Die klinisch bedeutsamen MBVs sind hauptsächlich in vier Virusfamilien verteilt, nämlich Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae und Peribunyavividae 2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden diese Viren auf der ganzen Welt gemeldet und verursachten Probleme für die öffentliche Gesundheit. Als eines der bekanntesten MBVs hat sich das Dengue-Virus (DENV) in den letzten 20 Jahren in über 100 Ländern zum am weitesten verbreiteten neu auftretenden oder wieder auftretenden Arbovirus entwickelt4. Seit der Entdeckung des Zika-Virus (ZIKV) im Landesinneren haben fast alle tropischen und subtropischen Länder und Territorien des Kontinents ZIKV-Infektionen beim Menschen gemeldet5. Um das Risiko einer Virusübertragung abschätzen zu können, haben sich in den letzten Jahren zahlreiche Studien auf die Vektorkompetenz von Stechmücken für diese Viren konzentriert 6,7. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, durch Vektoren übertragene Krankheiten wirksam zu verhindern und zu kontrollieren.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), eine der am leichtesten zu züchtenden Stechmücken im Labor, ist ein wichtiger Vektor von DENV, ZIKV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und Gelbfiebervirus (YFV)8. Lange Zeit kam Ae. aegypti nur auf dem afrikanischen Kontinent und in Südostasien vor, hat aber in den letzten Jahren fast alle Kontinente besiedelt9. Darüber hinaus hat die weltweite Häufigkeit von Ae. aegypti kontinuierlich zugenommen, mit einem geschätzten Anstieg von 20 % bis zum Ende des Jahrhunderts10. Von 2004 bis 2009 gab es in China einen deutlichen Anstieg der Ae. aegypti-Vektorkompetenz für DENV aufgrund höherer Tagestemperaturen11. Der Status von Ae. aegypti als pathogener Vektor ist in China deutlich gestiegen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, ist es daher notwendig, die Vektorkompetenz von Ae. aegypti zur Übertragung von Viren zu untersuchen.
Als hämatophager Gliederfüßer durchbohrt die weibliche Stechmücke die Haut eines Wirbeltierwirts und ernährt sich vom Blut. Stechmücken erwerben gelegentlich Viren von virusinfizierten Wirten und übertragen die Viren dann auf einen neuen Wirt. Um die Vektorkompetenz zu bestimmen, werden Stechmücken daher über ein Fütterungssystem in der Laborumgebung mit einem künstlichen Blutmehl gefüttert, das Arboviren enthält12. Einzelne Stechmücken werden einige Tage nach der Infektion in Köpfe, Körper und Speichelsekrete getrennt. Zur Messung der Virusinfektion, -verbreitung und -übertragungsraten wurden Virustiter mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) oder Plaque-Assay nachgewiesen. Allerdings entwickeln nicht alle Mücken Mitteldarminfektionen und die Fähigkeit, ein Virus nach der Blutfütterung auf den nächsten Wirt zu übertragen. Es ist mit den physiologischen Barrieren der Mücken verbunden, die das Eindringen von Krankheitserregern in den Körper verhindern und eine wichtige Rolle für ihre angeborene Immunität spielen13. Die Mitteldarmbarrieren, insbesondere die Mitteldarm-Infektionsbarriere (MIB) und die Mitteldarm-Escape-Barriere (MEB), beeinflussen, ob das Virus den Vektor systemisch infizieren kann und mit welcher Effizienz es sich ausbreitet. Es behindert die Analyse der Infektion anderer Gewebe, wie z. B. Speicheldrüsen, die ebenfalls eine Speicheldrüseninfektion aufweisen, und Fluchtbarrieren13,14. Um die Infektion von Mitteldärmen und Speicheldrüsen im Vektor besser charakterisieren zu können, wird hier ein detailliertes Protokoll für die orale Ernährung und intrathorakale Inokulation von Arboviren bei Ae. aegypti vorgestellt. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren angewendet werden, wie z. B. die DENV- und ZIKV-Infektion bei Aedes spp., und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.
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Protocol
1. Vorbereitung von Viren und Mücken
- Präparation von Viren
HINWEIS: Alle Prozesse wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Der Grad der verwendeten biologischen Sicherheit sollte durch die Risikobewertung des Erregers und die länder- und regionsspezifischen Vorschriften bestimmt werden. Der Prozess muss in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.- 1 x 106 C6 /36-Zellen in einen T75-Kulturkolben impfen. Füllen Sie den Kolben mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält.
HINWEIS: Das L-15-Medium von Leibovitz (L15) oder das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco können ebenfalls zur Erhaltung von C6/36-Zellen verwendet werden. - Halten Sie die Zellen über Nacht in 5% CO2 bei 28 °C und entfernen Sie den Zellüberstand am nächsten Tag, wenn die Zellen zu 80%-90% konfluent sind.
- Geben Sie 1 ml Virusverdünnung (Multiplicity of Infection (MOI) = 0,01) in den Kolben und inkubieren Sie die Zellen 1 h lang in 5% CO2 bei 28 °C. Das Ebinur Lake Virus (EBIV)15, ein durch Stechmücken übertragenes Orturbunyavirus, wurde als Modellvirus für dieses Protokoll verwendet.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 3x mit 5 ml PBS. Füllen Sie den Kolben mit 15 ml neuem RPMI-Medium mit 2 % FBS. Halten Sie den Kolben in 5% CO2 bei 28 °C.
- Sammeln Sie den überstehenden Virus, wenn der erforderliche Virustiter erreicht ist (nach fast 5 Tagen, je nach verwendetem Virus). Für EBIV lag dieser Titerwert bei 107 plaquebildenden Einheiten (PFU)/ml. Verpacken Sie sie in einzelne 2-ml-Aufbewahrungsröhrchen mit Schraubverschluss und lagern Sie die Röhrchen mit 0,5-1 ml Virus bei -80 °C.
- 1 x 106 C6 /36-Zellen in einen T75-Kulturkolben impfen. Füllen Sie den Kolben mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält.
- Bestimmung des Virustiters
HINWEIS: Bestimmen Sie den Virustiter durch die Plaque-Assays16. BHK-21 wurde verwendet, um den viralen Titer von EBIV zu bestimmen, aufgrund der offensichtlichen zytopathischen Wirkung (CPE), die in infizierten Zellen beobachtet wurde.- Beimpfen Sie 1 x 105 BHK-21-Zellen in jede Vertiefung der 24-Well-Platten. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM-Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Halten Sie die Zellen über Nacht in 5 % CO2 bei 37 °C.
- Machen Sie sechs (10-6) aufeinanderfolgende 10-fache Verdünnungen des virushaltigen Überstands mit frischem DMEM-Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält.
- Geben Sie 100 μl Virusverdünnungsmittel in jede Vertiefung von 24-Well-Platten, die die Monoschicht BHK-21 enthalten. Das Virusverdünnungsmittel wird nach 1 h Inkubationszeit in 5 % CO2 bei 37 °C verworfen. Geben Sie 500 μl DMEM mit 1,5 % Methylcellulose in jede Vertiefung.
- Kulturzellen in 5% CO2 bei 37 °C für 48 h (das scheinbare CPE wurde nach 48 h für EBIV gefunden). Fixieren Sie die Zellen über Nacht mit 750 μl 3,7% Formaldehyd.
- Färben Sie sie mit 200 μl 2% Kristallviolett für 15 min. Zählen Sie die Anzahl der Plaques, um den Virustiter zu berechnen.
- Mückenzucht im Labor
HINWEIS: Rückwärtige Mücken in einem Labor der Eindämmungsstufe 1 (ACL-1) für Arthropoden.- Für die Zubereitung des entchlorten Wassers füllen Sie einen 20-Liter-Eimer mit Leitungswasser und lassen Sie ihn 7-8 Tage ohne Licht stehen. Decken Sie den Deckel nicht ab.
- Halten Sie Eier und Larven von Ae. aegypti in einem Moskitoraum unter folgenden Bedingungen: 28 ± 1 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75 % ± 5 %.
- Bewahren Sie fast 1.000 Larven nach dem Schlüpfen der Eier in einer flachen Schale (22 cm x 15 cm x 6 cm) mit dechloriertem Wasser auf. Füttern Sie sie mit fast 1/8 Teelöffel Mäusefutterpulver. Frischen Sie das Futter täglich auf und wechseln Sie das Wasser alle 2 Tage.
- Sobald sich die Larven nach 5-7 Tagen verpuppen, verwenden Sie eine einmalige Pipette, um die Puppen in einen Plastikbecher (7 oz) zu übertragen, der mit entchlortem Wasser gefüllt ist.
- Geben Sie fünf Becher mit Puppen (ca. 200 pro Tasse) in einen Gitterkäfig (30 cm x 30 cm x 30 cm) und halten Sie die Käfige unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 1.3.2 im Insektenbrutkasten.
- Legen Sie einen winzigen Schwamm mit einer 8%igen (m/w) Glukoselösung auf jeden Gitterkäfig, um erwachsene Mücken zu füttern. Nehmen Sie nach dem Schlüpfen der erwachsenen Tiere die Becher ohne Puppen heraus. Halten Sie die Netzkäfige mit etwa 1.000 erwachsenen Mücken pro Käfig im selben Insektenbrutkasten.
2. Vorbereitung auf orale Infektionen
- Bereiten Sie weibliche Mücken auf eine orale Infektion vor. Verwenden Sie die Mückenabsorptionsmaschine, um 5-8 Tage alte Mücken zu sammeln. Betäuben Sie sie bei -20 °C für 1 min und prüfen Sie, ob den Mücken schwindelig ist. Wenn nicht, betäuben Sie sie für eine weitere Minute bei -20 °C.
- Gießen Sie sie schnell in die Plastikbecher (24 oz) mit etwa 200 Mücken (weiblich und männlich) pro Tasse. Decken Sie jede Tasse schnell mit einem gut geschnittenen Moskitonetz ab, gefolgt von einem Deckel mit einem Loch (ca. 6 cm Durchmesser) in der Mitte.
- Lassen Sie die Mücken 24 Stunden vor der oralen Infektion aushungern und bereiten Sie infektiöse Blutmahlzeiten wie folgt zu.
- In einer Biosicherheitswerkbank unter BSL-2-Bedingungen den Virenbestand aus dem -80 °C Gefrierschrank entnehmen und auf Eis auftauen. Verdünnen Sie den Virusbestand auf eine Konzentration von 2 x 106 PFU/ml mit RPMI 1640 Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Mischen Sie die Virusverdünnung mit einer gleichen Menge defibriertem Pferdeblut.
HINWEIS: Die Prozesse wurden in einer Biosicherheitswerkbank in einem ACL-2-Labor durchgeführt.
3. Führen Sie eine orale Infektion durch
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem ACL-2-Labor durchgeführt. Der Vorgang muss im Handschuhfach durchgeführt werden, um zu verhindern, dass Mücken entkommen.
- Führen Sie eine künstliche Fütterung durch, indem Sie das künstliche Mückenfütterungssystem für 1 Stunde verwenden.
- Schneiden Sie die Kollagenmembranen auf die entsprechende Größe (ca. 5 cm Durchmesser) zu, befestigen Sie sie mit O-Ringen an den Reservoirs und geben Sie dann das Virus-Blut-Gemisch (ca. 3 ml) in die Reservoirs. Verwenden Sie Kunststoffstopfen, um die Behälter abzudichten und Leckagen zu vermeiden.
HINWEIS: Diese Schritte wurden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. - Legen Sie die Plastikbecher (24 oz) mit Mücken in das Handschuhfach. Schrauben Sie die versiegelten Behälter auf den FU1 Feeder und setzen Sie einen Behälter auf eine Tasse, dann schalten Sie das Netzteil ein. Füttern Sie die Mücken 1 h lang
- Schneiden Sie die Kollagenmembranen auf die entsprechende Größe (ca. 5 cm Durchmesser) zu, befestigen Sie sie mit O-Ringen an den Reservoirs und geben Sie dann das Virus-Blut-Gemisch (ca. 3 ml) in die Reservoirs. Verwenden Sie Kunststoffstopfen, um die Behälter abzudichten und Leckagen zu vermeiden.
- Betäuben Sie Mücken mit CO2 für einige Sekunden, bis sie ohnmächtig werden. Kurz gesagt, platzieren Sie die Kohlendioxid-Spritzpistole in der Mitte des Netzes durch das Loch auf dem Becher mit den Mücken, öffnen Sie den Wert und lassen Sie große Mengen Kohlendioxid ausspucken, um Mücken zu betäuben.
- Gießen Sie sie in eine auf Eis gestellte Petrischale und decken Sie den Deckel schnell ab. Wähle die angeschwollenen weiblichen Mücken mit einer Pinzette aus. Zur Identifizierung haben Männchen gefiederte Fühler und Weibchen einfache Fühler. Übertragen Sie sie in neue Plastikbecher mit 50 weiblichen Mücken pro Becher.
HINWEIS: Die angeschwollenen weiblichen Mücken wurden ausgewählt, um die Konsistenz zu erhalten, da die Futtermenge den Virusgehalt beeinflusst. - Wickeln Sie den Becher mit einem geschnittenen Moskitonetz ein und decken Sie ihn dann mit einem Deckel mit einem Loch in der Mitte ab. Schneiden Sie den Biskuit in ein kleines Stück und legen Sie ihn auf die Tasse.
- Geben Sie 8%ige Glukoselösung mit einer Einwegpipette aus Kunststoff auf den Schwamm. Bewahren Sie die Becher mit weiblichen Mücken 10 Tage lang im Inkubator bei 27 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit auf. Ersetzen Sie alle 72 Stunden einen neuen glukosegesättigten Schwamm.
4. Vorbereitung der intrathorakalen Inokulation
- Bereiten Sie die Mikroinjektionsnadeln wie folgt vor. Verwenden Sie eine PUL-1000, um Mikroinjektionsnadeln (Abbildung 1A) mit den folgenden Parametern im Nadelzieherprogramm herzustellen: Wärmeindex = 450, Kraft (g) = 110, Abstand (mm) = 1,00 und Verzögerung (s) = 0.
- Schneiden Sie die Spitze einer gezogenen Nadel mit einer Pinzette unter dem Präpariermikroskop bei 16-facher Vergrößerung ab (Abbildung 1B). Machen Sie die Spitze nicht zu groß, da sie sonst den Mücken schaden kann.
- Bereiten Sie weibliche Mücken wie in Schritt 2.1 vor.
HINWEIS: Die folgenden Prozesse wurden in einem ACL-2-Labor durchgeführt. - Bereiten Sie die Verdünnung des infektiösen Virus wie folgt vor:
- Nehmen Sie den Virenvorrat aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie ihn auf Eis auf. Verdünnen Sie das Virus auf eine 100-nL-Virusverdünnung, die 100-500 PFU-Viren enthält, mit RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Lassen Sie die Virusverdünnung auf Eis.
- Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl über eine sterile Einwegspritze auf. Setzen Sie die Nadel gemäß den Anweisungen auf der Maschine in den Injektor ein.
- Führen Sie die Nadel in ein Röhrchen ein, das die Verdünnung des infektiösen Virus enthält. Brechen Sie die Nadelspitze nicht ab. Drücken Sie die FILL-Taste , um die Nadel mit Virenlösung zu füllen. Das Endvolumen der Viruslösung in der Nadel beträgt ca. 4,0 μl. Sobald die Nadel mit dem Virus gefüllt ist, achten Sie darauf, sie nicht zu berühren und zu beschädigen.
HINWEIS: Die Schritte wurden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt.
5. Führen Sie die Virusinjektion unter einem Seziermikroskop durch
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem ACL-2-Labor durchgeführt.
- Betäuben Sie die Mücken bei -20 °C für 1 min. Gießen Sie sie in eine auf Eis gestellte Petrischale und decken Sie den Deckel schnell ab.
- Suchen Sie fast 50 weibliche Mücken mit einer Pinzette aus und legen Sie sie auf den Eisteller. Legen Sie die Eisplatte unter den Injektor und führen Sie die Nadel unter dem Präpariermikroskop in die Brusthöhle der Mücke ein (Abbildung 1C).
- Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 100 nL und die Rate auf 50 nL/s ein. Drücken Sie die INJECT-Taste , um die Virenlösung in die Mücke fließen zu lassen. Bei erfolgreicher Injektion wölbt sich der Bauch leicht.
- Geben Sie die infizierte Mücke in einen neuen Plastikbecher (24 oz), der auf Eis gestellt wird. Wenn die Anzahl der infizierten Mücken ausreicht, wickeln Sie den Becher mit einem geschnittenen Moskitonetznetz ein und decken Sie ihn dann mit dem Deckel ab.
- Bewahren Sie den Becher mit infektiösen Mücken 10 Tage lang im Inkubator bei 27 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit auf. Füttern Sie die Mücken wie in Schritt 3.5.
6. Verarbeitung der infizierten weiblichen Stechmücken
ANMERKUNG: Von jeder weiblichen Mücke wurden drei verschiedene Gewebe/Organe präpariert: der Darm zur Berechnung der Virusinfektionsrate (VIR), der Kopf zur Berechnung der Virusausbreitungsrate (VDR) und Speichel zur Berechnung der Virusübertragungsrate (VTR). VIR wurde definiert als die Anzahl der Stechmücken mit viruspositiven Eingeweiden. VDR wurde definiert als die Anzahl der Mücken mit viruspositiven Köpfen geteilt durch die Anzahl der Mücken mit viruspositiven Eingeweiden durch 100. Die VTR wurde definiert als die Anzahl der Mücken mit viruspositivem Speichel geteilt durch die Anzahl der Mücken mit viruspositiven Eingeweiden durch 100.
- Speichelentnahme der infizierten weiblichen Mücken
HINWEIS: Die Prozesse müssen in einem ACL-2-Labor durchgeführt werden.- Betäuben Sie die infizierten weiblichen Stechmücken durch Kohlendioxid-Betäubung wie in Schritt 3.2. Gießen Sie sie in eine auf Eis gestellte Petrischale und schließen Sie den Deckel schnell.
- Legen Sie 10 μL Pipettenspitzen, die mit Immersionsöl gefüllt sind, nebeneinander auf den Gummischlamm.
- Suchen Sie weibliche Mücken mit einer Pinzette heraus und legen Sie sie auf einen Eisteller. Entfernen Sie ihre Beine und Flügel mit einer Pinzette. Setzen Sie das Mundwerkzeug einer Mücke auf jede Pipettenspitze.
- Sammeln Sie den Speichel, der von den Mücken in das Öl abgesondert wird, für die nächsten 45-60 Minuten bei Raumtemperatur.
- Legen Sie die Pipettenspitzen in 1,5-ml-Röhrchen mit 200 μl Virusverdünnungsmedium (RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS und 1 % P/S). Zentrifugieren Sie sie bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C, um Speichel in Röhrchen auszustoßen. Lagern Sie diese Röhrchen bei -80 °C zur späteren Bestimmung der Übertragungsraten.
- Sezieren Sie die infizierten weiblichen Mücken
HINWEIS: Die Prozesse müssen in einem ACL-2-Labor durchgeführt werden.- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Köpfe der weiblichen Mücken nach der Speichelsammlung abzuschneiden. Legen Sie jeden Kopf in ein einzelnes Röhrchen mit 200 μl RPMI 1640 Medium.
- Fassen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette, dann das vorletzte Segment des Bauches mit einer anderen Pinzette und ziehen Sie es heraus. Der Darm wird herausgezogen. Reinigen Sie den herausgezogenen Darm von verirrtem Gewebe und Organen.
- Waschen Sie den Darm mit PBS und geben Sie jeden Darm in ein einzelnes Röhrchen mit 200 μl RPMI 1640 Medium. Lagern Sie diese Röhrchen bei -80 °C zur anschließenden Bestimmung der Virusinfektionsrate und der Verbreitungsrate.
7. Datenanalyse
- RNA-Extraktion
- Mahlen Sie das Gewebe mit einer Niedertemperatur-Tissue-Homogenisator-Schleifmaschine, die auf die folgenden Parameter eingestellt ist, in Stücke: Betriebsfrequenz = 60 Hz, Betriebszeit = 15 s, Pausenzeit = 10 s, Zyklen = 2 und Einstelltemperatur = 4,0 °C.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA jeder Probe mit einem automatisierten Nukleinsäure-Extraktionssystem gemäß den Anweisungen des Geräts.
- Durchführung der qRT-PCR
- Verwenden Sie das einstufige RT-PCR-Kit, um die viralen RNA-Kopien mit einem quantitativen PCR-Instrument17 zu quantifizieren. Verwenden Sie die folgenden Primer für den Nachweis des EBIV-S-Segments F: ATGGCATCACCTGGGAAAG und R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Richten Sie den Reaktionsprozess wie folgt ein: Stufe 1: 42 °C für 5 min, 95 °C für 10 s; Stufe 2: 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s und 60 °C für 20 s.
- Bestimmen Sie die niedrigste Virusdosis für die Infektion in den Zellen durch die seriellen 10-fachen Verdünnungen, die auf Zellen inokuliert werden. Verwenden Sie die BHK-21-Zellen, um die niedrigste Virusdosis von EBIV zu bestimmen, wobei Verdünnungen bis 10-7 verwendet werden, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
- Berechnen Sie den Ct-Wert der niedrigsten Virusdosis mittels qRT-PCR. Verwenden Sie den Cutoff-Wert für EBIV-positiv mittels qRT-PCR als < 35. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Kopien von EBIV in jeder Stichprobe zu berechnen:
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (die Kopien von EBIV), y = Ct-Wert, R2 = 0,9905] - Berechnen Sie die Infektionsrate, die Ausbreitungsrate und die Übertragungsrate wie folgt:
Infektionsrate (%) = 100 x (Anzahl der viruspositiven Mückendärme / Anzahl der Stechmücken)
Ausbreitungsrate (%) = 100 x (Anzahl der viruspositiven Mückenköpfe / Anzahl der viruspositiven Mückendärme)
Übertragungsrate (%) = 100 x (Anzahl der viruspositiven Mückenspeichel / Anzahl der viruspositiven Mückendärme) - Analysieren Sie die Unterschiede in kontinuierlichen Variablen und Unterschiede in den Infektionsraten, Ausbreitungsraten und Übertragungsraten von Mücken, indem Sie die nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Analyse für Mehrfachvergleiche und gegebenenfalls den exakten Test nach Fisher verwenden.
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Representative Results
Um die EBIV-Verteilung in den infizierten Stechmücken mittels künstlicher Blutfütterung (der virale Endtiter betrug 6,4 x 106 PFU/ml) und intrathorakaler Injektion (die Virusdosis betrug 340 PFU) zu untersuchen, wurden virale RNAs in Speichel, Kopf und Darm der Mücken 10 Tage nach der Infektion (dpi) bestimmt.
Bei Ae. aegypti war der Virustiter von EBIV in den Eingeweiden, Köpfen und im Speichel der intrathorakal inokulierten weiblichen Stechmücken viel höher als der der oral infizierten weiblichen Stechmücken (Abbildung 2A-C). Die Infektionsrate und die Ausbreitungsrate für die intrathorakal geimpften weiblichen Stechmücken betrugen 100 %, für die oral infizierten weiblichen Stechmücken jedoch 70 % bzw. 38,1 % (Abbildung 2D, E). Die Übertragungsrate der intrathorakal geimpften weiblichen Stechmücken erreichte bis zu 90 %, während die oralen infizierten weiblichen Stechmücken nur 4,8 % betrugen. Es zeigte sich, dass der Darm von Ae. aegypti eine stark hemmende Wirkung auf die Virusübertragung hat.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Mikropipettenspitze und der intrathorakalen Injektion . (A) Gezogene Mikropipettenspitze vor dem Brechen der Spitze. (B) Ordnungsgemäß vorbereitete Mikropipettenspitze, die für die intrathorakale Inokulation geeignet ist. (C) Schematische Darstellung der intrathorakalen Injektion für die Mücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vektorkompetenz adulter Stechmücken durch orale Fütterung und intrathorakale Inokulation. Die infizierten weiblichen Stechmücken wurden 10 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Analyse wurde für Mehrfachvergleiche und gegebenenfalls für den exakten Test nach Fisher verwendet. Diese Zahl wurde aus der Studie von Xia et al.18 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das Ziel dieser Methode war es, eine umfassende Risikobewertung für ein durch Stechmücken übertragenes Virus zu ermöglichen, indem die Vektorkompetenz durch orale Ernährung und intrathorakale Inokulation bewertet wurde.
Bei dem oralen Fütterungsexperiment müssen die angeschwollenen Mücken herausgesucht und in einen neuen Behälter umgepflanzt werden, was ein ernsthaftes Risiko für die Bediener darstellt. Der Grund dafür ist, dass jede Mücke, einschließlich nicht infizierter Mücken, eine Infektionsquelle sein kann19. Folglich müssen die Stechmücken zuerst betäubt werden, wie im Protokoll angegeben, und dann sollten die Folgeschritte durchgeführt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Auswahl und Übertragung von angeschwollenen Mücken in einem versiegelten Handschuhfach erfolgen sollte. Halten Sie das Handschuhfach während des Vorgangs geschlossen, es sei denn, es befinden sich keine frei beweglichen Mücken in der Box.
Beim Infektionsexperiment ist es besser, wenn zwei Personen zusammenarbeiten, und nachdem die beiden Personen bestätigt haben, dass es keine entkommenen Mücken gleichzeitig gibt, können sie das Handschuhfach öffnen, um zu verhindern, dass infizierte Mücken entkommen. Wenn eine Flucht stattfindet, müssen diese Mücken getötet oder wieder eingefangen werden. Es wird nicht empfohlen, infizierte Mücken mit bloßen Händen zu töten. Das Infektionsrisiko des Bedieners kann durch die Verwendung von Vakuumsaugern oder anderen geeigneten Werkzeugen (z. B. Pinzetten, Pinsel, behandschuhte Hände) verringert werden. Desinfizieren Sie nach dem Experiment die Innenseite des Handschuhfachs und die Oberfläche der Werkbank mit einem herkömmlichen Desinfektionsmittel.
Der Großteil der Forschung über die Kompetenz von Mückenvektoren für durch Stechmücken übertragene Viren hat sich ausschließlich auf orale Infektionen konzentriert20,21. Für eine orale Infektion müssen Viren mehrere Gewebebarrieren überwinden, die mit dem Mitteldarm und den Speicheldrüsen verbunden sind, um in den Speichel freigesetzt zu werden14. Die Wirkung von Mitteldarmdrüse und Speicheldrüse auf die Vektorkapazität der Mücken konnte in diesem Experiment nicht nachgewiesen werden. Wenn orale Ernährung und intrathorakale Injektion kombiniert werden, können die verschiedenen Gewebebarrieren gründlich untersucht werden. Nach den Ergebnissen dieses Verfahrens spielt der Darm von Ae. aegypti eine dominante Rolle bei der Vektorkompetenz für das Virus und die Speicheldrüsenbarriere ist möglicherweise nicht vorhanden (Abbildung 2). Zu diesem Zweck ist unser Protokoll von Vorteil, um das Vorhandensein von Barrieren im Mitteldarm oder in den Speicheldrüsen für eine Infektion mit Arboviren zu bestätigen.
Gemäß der Methodik wurde in den Proben nur virale RNA identifiziert. Weitere Untersuchungen, wie z. B. die Betrachtung des Virions mit einem Transmissionselektronenmikroskop, die Bestätigung der Infektion mit Plaque-Assays oder der Nachweis viraler Proteine mit einem Immunfluoreszenz-Assay, sind erforderlich, um die infektiösen Viren in den verschiedenen Proben zu bestätigen. Diese Methodik kann modifiziert und verwendet werden, um zusätzliche Viren von Interesse in eine breite Palette von Mückenvektoren zu impfen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
