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Engineering

Dispositif microfluidique pour la séparation de cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et non tumorales (MCF-10A) par diélectrophorèse AC

Published: August 11, 2022 doi: 10.3791/63850
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5
1Department of Biomedical Engineering, Foundation University Islamabad, 2College of Medical Technology, The Islamic University Najaf, 3Faculty of Mechanical Engineering, University of Tabriz, 4Department of Engineering Mathematics, University of Bristol, 5School of Life Sciences, University of Warwick

Summary

Les cellules cancéreuses du sein présentent des propriétés diélectriques différentes de celles des cellules épithéliales mammaires non tumorales. On a émis l’hypothèse que, sur la base de cette différence de propriétés diélectriques, les deux populations peuvent être séparées à des fins d’immunothérapie. Pour ce faire, nous modélisons un dispositif microfluidique pour trier les cellules MCF-7 et MCF-10A.

Abstract

Les dispositifs diélectrophorétiques sont capables de détecter et de manipuler des cellules cancéreuses d’une manière non étiquetée, rentable, robuste et précise en utilisant le principe de la polarisation des cellules cancéreuses dans le volume de l’échantillon en appliquant un champ électrique externe. Cet article démontre comment une plateforme microfluidique peut être utilisée pour le tri continu à haut débit des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) à l’aide de la diélectrophorèse hydrodynamique (HDEP) du mélange cellulaire. En générant un champ électrique entre deux électrodes placées côte à côte avec un espace de la taille d’un micron entre elles dans une puce microfluidique HDEP, les cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) peuvent être repoussées, présentant une DEP négative à l’intérieur du canal principal, tandis que les cellules cancéreuses du sein non métastatiques suivent leur cours sans être affectées lorsqu’elles sont suspendues dans le milieu cellulaire en raison de leur conductivité supérieure à la conductivité membranaire. Pour démontrer ce concept, des simulations ont été effectuées pour différentes valeurs de conductivité du milieu, et le tri des cellules a été étudié. Une étude paramétrique a été réalisée et une conductivité appropriée du mélange cellulaire s’est avérée être de 0,4 S/m. En maintenant la conductivité du milieu fixe, une fréquence AC adéquate de 0,8 MHz a été établie, donnant une efficacité de tri maximale, en faisant varier la fréquence du champ électrique. En utilisant la méthode démontrée, après avoir choisi la conductivité appropriée du milieu de suspension du mélange cellulaire et la fréquence du courant alternatif appliqué, une efficacité de tri maximale peut être atteinte.

Introduction

Une tumeur maligne qui se développe dans et autour du tissu mammaire est une cause fréquente de cancer du sein chez les femmes du monde entier, causant un problème de santé critique1. Les tumeurs du sein avant les métastases peuvent être traitées par chirurgie si elles sont détectées à un stade précoce, mais si elles sont ignorées, elles peuvent avoir de graves implications sur la vie du patient en se propageant à leurs poumons, à leur cerveau et à leurs os. Les traitements proposés à des stades ultérieurs, tels que la radiothérapie et les thérapies chimiques, ont des effets secondaires graves2. Des études récentes ont rapporté qu’un diagnostic précoce de cancer du sein réduit le taux de mortalité de 60 %3. Par conséquent, il est impératif de travailler à des méthodes de détection précoce personnalisées. À cette fin, des chercheurs travaillant dans différents domaines de la science et de la technologie ont utilisé la microfluidique pour développer des dispositifs de diagnostic précoce du cancer du sein4. Ces méthodes comprennent la microchromatographie d’affinité cellulaire, les trieurs de microcellules activés magnétiquement, la capture et la séparation des cellules cancéreuses basées sur la taille et la diélectrophorèse sur puce (DEP)5,6. Ces techniques microfluidiques rapportées dans la littérature permettent une manipulation cellulaire précise, un suivi en temps réel et le tri d’échantillons bien définis, qui servent d’étape intermédiaire dans de nombreuses applications diagnostiques et thérapeutiques5. L’intégration de ces mécanismes de tri avec la microfluidique offre une manipulation flexible et fiable des cellules cibles 7,8,9,10. L’un des principaux avantages d’une telle intégration est la possibilité de travailler avec des échantillons de fluide dans des volumes nano à microlitres et de pouvoir manipuler les propriétés électriques du fluide de l’échantillon. En ajustant la conductivité du fluide en suspension à l’intérieur des dispositifs microfluidiques, les cellules biologiques peuvent être triées en fonction de leurs tailles et des différences de leurs propriétés diélectriques11,12.

Parmi ces techniques, la DEP sur puce est souvent préférée car il s’agit d’une technique de tri cellulaire sans marquage qui exploite les propriétés électriques des échantillons biologiques. Il a été rapporté que la DEP manipulait des échantillons biologiques tels que l’ADN 13, l’ARN 14, les protéines15, les bactéries 16, les cellules sanguines 17, les cellules tumorales circulantes (CTC)18 et les cellules souches 19. Les dispositifs microfluidiques qui utilisent le DEP pour trier les échantillons biologiques ont été largement rapportés dans la littérature20. Des dispositifs microfluidiques DEP (rDEP) à base de réservoir pour le tri des cellules de levure viables et non viables ont été signalés qui protègent les cellules contre les effets néfastes des réactions électrochimiques21,22. Piacentini et coll. ont signalé un trieur de cellules microfluidiques crénelées qui séparait les globules rouges des plaquettes avec une efficacité de 97 %23. Des dispositifs DEP sur puce avec orifices asymétriques et électrodes intégrées ont également été signalés pour trier les cellules viables et non viables24. Valero et Demierre et al. ont modifié le trieur de cellules microfluidiques crénelées en introduisant deux réseaux de microélectrodes des deux côtés du canal25,26. Cela a aidé à concentrer les cellules au centre du canal. Zeynep et al. ont présenté un dispositif microfluidique à base de DEP pour séparer et concentrer les cellules cancéreuses du sein MCF7 des leucocytes27. Ils ont rapporté une efficacité d’extraction des cellules MCF7 des leucocytes entre 74% et 98% avec une fréquence de 1 MHz et une tension appliquée allant de 10 à 12 Vpp. Le tableau supplémentaire 1 présente une comparaison qualitative et quantitative entre les dispositifs de tri microfluidique basés sur DEP en fonction de leur conception, de la configuration des électrodes et des paramètres de fonctionnement (fréquence et tension appliquées).

Plus récemment, des chercheurs ont tenté de mesurer les différences dans le comportement diélectrique des cellules épithéliales du sein (MCF-10A) et des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) à l’intérieur d’une puce microfluidique28,29. Jithin et coll. ont également caractérisé les réponses diélectriques de différentes lignées cellulaires cancéreuses à l’aide d’une technique de sonde coaxiale ouverte avec des fréquences comprises entre 200 MHz et 13,6 GHz30. Ces différences dans les réponses diélectriques des lignées cellulaires MCF-7 et MCF-10A peuvent être exploitées pour les séparer en cours d’exécution et peuvent conduire au développement de dispositifs de diagnostic personnalisés à un stade précoce.

Dans cet article, nous simulons le tri contrôlé des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) à l’aide de la diélectrophorèse AC. La région de changement dans le champ électrique influence le tri à l’intérieur de la puce microfluidique. La technique proposée est facile à mettre en œuvre et permet l’intégration de la technique de tri dans diverses configurations de puces microfluidiques. Des simulations de dynamique des fluides numérique (CFD) ont été réalisées pour étudier la séparation des cellules cancéreuses du sein non métastatiques et des cellules épithéliales mammaires non tumorales en faisant varier la conductivité du milieu fluide dans lequel les cellules étaient suspendues. Dans ces simulations, il est démontré qu’en maintenant la conductivité constante et en modifiant la fréquence appliquée, la séparation des cellules cancéreuses et des cellules saines peut être contrôlée.

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Protocol

REMARQUE: Le protocole utilise COMSOL, un logiciel de simulation multiphysique, pour simuler le tri contrôlé des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales du sein non tumorales (MCF-10A) à l’aide de la diélectrophorèse AC.

1. Conception de la puce et sélection des paramètres

  1. Ouvrez le logiciel multiphysique et sélectionnez Modèle vierge. Cliquez avec le bouton droit sur les définitions globales et sélectionnez Paramètres. Importez les paramètres indiqués dans le tableau 1 dans les définitions globales sous forme de fichier texte ou entrez les valeurs individuellement.
  2. Sélectionnez Ajouter un composant dans l’onglet Accueil et ajoutez un composant 2D. Cliquez avec le bouton droit sur la géométrie et importez le fichier de modèle en double-cliquant sur le fichier.
  3. Choisissez un matériau vierge et utilisez les propriétés du matériau du tableau 1.
  4. Sélectionnez Ajouter une physique dans l’onglet d’accueil et tapez AC/DC. Sous le nœud AC/DC, choisissez Courants électriques comme Physique sous le sous-nœud des champs et courants électriques.
  5. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le courant électrique et choisissez les sous-nœuds Conservation du courant, Isoler et Potentiel électrique pour isoler les parois du canal afin d’attribuer un potentiel aux électrodes.
  6. Sélectionnez Ajouter de la physique dans l’onglet d’accueil, puis sous le nœud Flux de fluide , choisissez Physique de l’écoulement rampant sous le sous-nœud Flux monophasé. Cliquez avec le bouton droit sur Flux monophasé et affichez les limites de la puce sous forme de murs à l’aide du sous-nœud Mur .
  7. Faites un clic droit sur Single-Phase Flow et ajoutez deux sous-nœuds d’entrée et un sous-nœud de sortie.
  8. Affectez les entrées à l’aide du sous-nœud d’entrée et utilisez normal dans Vitesse d’écoulement comme condition aux limites. Attribuez la prise à l’aide du sous-nœud de sortie.
  9. Sélectionnez Ajouter une physique dans l’onglet d’accueil, puis sous le nœud Flux de fluide , choisissez Particle Tracing Flow Physics sous le sous-nœud de Particle Tracing.
  10. Cliquez avec le bouton droit sur le nœud de traçage des particules et ajoutez le mur des sous-nœuds, les sous-nœuds de propriété de deux particules, deux sous-nœuds d’entrée, un sous-nœud de sortie, deux sous-nœuds de force de diélectrophorèse et un sous-nœud de force de glissement.
    1. Définissez les propriétés des particules pour les cellules MCF-7 et MCF-10A à l’aide du sous-nœud Propriétés des particules. Choisissez les propriétés des particules dans les paramètres de la section Définition globale.
    2. Ajoutez le sous-nœud Drag Force pour affecter la force diélectrophorétique aux deux types de cellules.
    3. Ajoutez les propriétés des particules dans ce cas à partir de la section des paramètres. Ajoutez le sous-nœud Shell pour modéliser les cellules de mammifères.
  11. Dans l’onglet d’accueil, choisissez Ajouter un maillage et sélectionnez Maillage fin. Choisissez Construire un maillage dans l’onglet Accueil pour créer un maillage.
  12. Dans l’onglet d’accueil, cliquez sur Ajouter une étude pour ajouter trois étapes d’étude. L’étape 1 de l’étude consiste à simuler une réponse en fréquence; utiliser un sous-nœud du domaine fréquentiel .
    1. Pour simuler un écoulement rampant, choisissez un nœud d’étude stationnaire . Ajouter deux étapes dépendantes du temps pour simuler des conditions avec une force diélectrophorétique et sans force diélectrophorétique.
    2. Pour la condition non diélectrophorétique, choisissez Physique et sélection des variables, cochez la case intitulée Modifier la configuration du modèle pour l’étape d’étude et désactivez l’étape diélectrophorétique. Pour les conditions diélectrophorétiques, ne pas désactiver. Enregistrez le fichier et appuyez sur Calculer pour que la simulation s’exécute.
      REMARQUE : La puce microfluidique conçue pour le tri des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) comporte deux entrées distinctes pour l’écoulement du mélange cellulaire et pour la focalisation du flux hydrodynamique, respectivement, avec des largeurs de 20 μm et 40 μm, respectivement, comme le montrent la figure supplémentaire 1 et la figure supplémentaire 2.
    3. Attribuer la fréquence (f0) sous le sous-nœud du domaine fréquentiel et la tension à l’aide du sous-nœud de potentiel électrique aux électrodes de rabotage (295 μm de largeur) placées le long de la paroi latérale supérieure de la chambre de tri. À la sortie, utilisez la condition de paroi « gel » pour visualiser les particules triées.

2. Modèle mathématique et analyse informatique

  1. Vérifiez les paramètres de fonctionnement pour séparer les cellules cancéreuses du sein non métastatiques et les cellules épithéliales mammaires non tumorales à l’intérieur du dispositif microfluidique en mettant en place une étude de dynamique des fluides numérique (CFD).
    REMARQUE : Un logiciel multiphysique (modules AC/DC, microfluidique et suivi des particules) a été utilisé à cette fin. Les équations directrices et le contexte théorique sont donnés en détail dans le dossier supplémentaire 1. Le modèle a été testé en utilisant les propriétés diélectriques des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) rapportées dans la littérature31,32, qui sont résumées dans le tableau 1.
  2. Effectuez les simulations CFD en introduisant des lignées cellulaires de cancer du sein non métastatique (MCF7) et d’épithélium mammaire non tumoral (MCF-10A) avec un rapport de 1:1 à l’entrée du mélange cellulaire.
    1. Dans un premier temps, réaliser une étude d’indépendance du maillage afin d’optimiser la taille du maillage pour les simulations33.
      REMARQUE: Une étude d’indépendance du maillage a été réalisée pour trouver la meilleure solution pour les paramètres de fonctionnement. Un ensemble de cinq tailles de mailles différentes a été choisi pour quantifier la meilleure taille d’élément possible pour la convergence de la solution. Il a été observé que, lorsque le nombre total d’éléments définissant un maillage était de 635 (maille plus grossière), comme le montre la figure supplémentaire 3A, l’efficacité de tri était la plus faible, certaines des cellules MCF7 se déplaçant vers la sortie inférieure, comme le montre la figure supplémentaire 3B. Lorsque la taille du maillage a été augmentée à fine, le nombre d’éléments définissant le maillage a également augmenté à 2 288. L’efficacité de tri était à son maximum dans ce cas, les cellules MCF7 et MCF-10A se déplaçant vers leurs sorties respectives. Le maillage plus fin a également été simulé, le nombre d’éléments définissant le maillage passant à 3 188. L’efficacité du tri n’a pas été affectée au-delà de ce point. Par conséquent, nous pouvons dire en toute sécurité que la taille des mailles fines fonctionne le mieux dans notre cas.
    2. Résolvez deux séries d’études CFD.
    3. Pour le premier ensemble, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étude 1 et ajoutez le sous-nœud Parametric Sweep . Appuyez sur le signe + pour ajouter la conductivité du milieu fluide « σm » comme variable de balayage. Effectuer une étude de balayage paramétrique pour la conductivité du milieu fluide σm allant de 0,01 S/m à 2,5 S/m, en maintenant la fréquence appliquée, f (Hz), constante à une valeur de 800 kHz.
    4. Pour la deuxième série, effectuer une étude de balayage paramétrique en faisant varier la fréquence AC appliquée de 100 kHz à 100 MHz tout en maintenant la conductivité du milieu fluide, σ m, fixée à 0,4 S/m pour chaque cas. Cette valeur de σm a été choisie sur la base des résultats de la première étude CFD, car une séparation maximale entre MCF-7 et MCF-10A a été observée à cette valeur.
    5. La force de la force de diélectrophorèse (DEP), FDEP (-), exercée sur une particule sphérique diélectrique en milieu conducteur est donnée par l’équation 1T34:
      FDEP Equation 1 [1]
      Utilisez l’équation 1 sous le sous-nœud de force diélectrophorétique. Dans l’équation 1, r montre le rayon de la particule sur laquelle FDEPest appliqué; K (-) est connu sous le nom de facteur de Clausius-Mossotti; εm(-) montre la permittivité diélectrique du milieu; et E(V/m) est la valeur quadratique moyenne du champ électrique.
    6. Utilisez l’équation 2 pour une particule sphérique sous le sous-nœud de force diélectrophorétique.
      Equation 2[2]
      Dans l’équation 2, Equation 3 (-) montre la permittivité complexe de la particule sur laquelle la force DEP est appliquée; Equation 4 (-) montre la permittivité complexe du fluide entourant la particule. La permittivité Equation 3 complexe et Equation 4 sont définis comme suit35:
    7. Utilisez l’équation 3 pour une particule sphérique sous le sous-nœud de force diélectrophorétique:
      Equation 6[3]
      Dans l’équation 3, εp (-) montre la partie réelle de la permittivité complexe de la particule; εm (-) montre la partie réelle de la permittivité complexe du fluide entourant la particule; σp (S/m) montre la conductivité des particules; σm (S/m) montre la conductivité du milieu entourant la particule; et ω (Hz) est la fréquence du champ électrique appliqué.
      NOTE: Le signe de Re(K) détermine la polarité duDEP F. Si le signe de Re(K) est négatif, alors la particule subit une force diélectrophorétique négative (nDEP); Au contraire, si le signe de Re(K) est positif, il implique une force diélectrophorétique positive (pDEP). Pour le facteur de Clausius-Mossotti (K), la variation se situe dans la plage de -1 à 1.
  3. Utilisez une forme modifiée de l’équation 3 pour modéliser des cellules biologiques telles que les cellules de mammifères, qui sont plus complexes et ont une structure multicouche.
    K (Equation 7) = Equation 8 [4]
    Dans l’équation 4, (-) incorpore à la fois la permittivité complexe du cytoplasme, (-), et la permittivité complexe de la membrane cellulaire, Equation 9 Equation 10 Equation 11 (-), et est donnée comme suit:36
  4. Utilisez l’équation 5 pour résoudre « Equation 12 »:
    Equation 13[5]
    Dans l’équation 5, R cyto (m) et Rmem (m) montrent respectivement le rayon du cytoplasme cellulaire et de la membrane cellulaire.
  5. Ensuite, utilisez l’équation 4 pour tracer Re(K) en fonction du champ électrique appliqué pour les cellules cancéreuses et saines. Calculez la partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti (CM), Re(K), pour quantifier la force diélectrophorétique (DEP) subie par la particule.
  6. Cliquez avec le bouton droit sur le nœud Résultats, ajoutez le sous-nœud Évaluation des particules et, dans la section expression, tapez fpt.deff1.K pour tracer le facteur CM pour la particule 1 et fpt.deff2.K pour la particule 2.
    REMARQUE: Toutes les étapes de protocole énumérées dans le texte principal peuvent être visualisées dans la vidéo de protocole (vidéo 1).

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Representative Results

Étudier les paramètres opérationnels optimaux pour un tri efficace basé sur la DEP des cellules du cancer du sein non métastatique (MCF-7) et de l’épithélium du sein non tumoral (MCF-10A)
Pour obtenir une séparation réussie des cellules du cancer du sein non métastatique (MCF-7) et de l’épithélium du sein non tumoral (MCF-10A) ayant des propriétés diélectriques divergentes lors de la diélectrophorèse, leurs facteurs K doivent être distincts en maintenant la fréquence appliquée fixe37,38. La quantification des réponses diélectriques des cellules cancéreuses du sein non métastatiques et des cellules épithéliales mammaires non tumorales sous un champ électrique appliqué et le calcul du facteur « K » en fonction de la fréquence appliquée pour les deux lignées cellulaires ont été obtenus en utilisant l’équation 4. Les résultats présentés à la figure 1 ont été générés en maintenant fixes tous les paramètres diélectriques des cellules cancéreuses du sein non métastatiques et des cellules épithéliales mammaires non tumorales tandis que la fréquence appliquée du champ électrique variait pour trois valeurs différentes de conductivité du milieu de suspension cellulaire, σm.

Comme le montre la figure 1, dans chaque cas, la valeur de K se situe dans la plage de -1 à 1, conformément aux études précédentes39,40. Néanmoins, le tracé de la fréquence réelle (K) par rapport à la fréquence change pour les cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et les cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) en fonction de la valeur de la conductivité moyenne (σm). Les résultats présentés à la figure 1 concordent avec une étude récente dans laquelle l’effet de σm sur Re(K) pour les cellules MCF-7 a été quantifié41.

Figure 1
Figure 1 : Facteur Clausius-Mossotti. La partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti, K, tracée en fonction de la fréquence, pour les cellules MCF-7 et MCF-10A en suspension dans un milieu caractérisé par une conductivité de (A) σ m = 0,01 S/m ; B) σ m = 0,4 S/m; (C) σ m = 1,2 S/m. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 1 a été tracée à l’aide de l’outil MyDEP pour trois valeurs différentes de σm, en conservant et en faisant varier la fréquence CA appliquée de 100 kHz à 100 MHz. Initialement, la fréquence σ m a été choisie pour être de 0,01 S/m, et la fréquence AC appliquée a varié entre 100 kHz et 100 MHz, comme le montre la figure 1A. À une fréquence AC appliquée de 100 kHz, la valeur de Re(K) pour les cellules MCF-10A s’est avérée être de 0,82, ce qui signifie qu’elles subissent une diélectrophorèse positive (pDEP) et devraient se déplacer vers une zone de champ électrique élevé. De même, les cellules MCF-7 à 100 kHz subissent également pDEP avec une valeur Re(K) de 0,76. La fréquence a été augmentée par pas de 100 kHz, et la valeur du facteur CM pour les deux types de cellules est restée positive tout au long du spectre de fréquences appliqué. En maintenant constants tous les autres paramètres de fonctionnement, la conductivité du milieu a été augmentée à 0,4 S/m pour tracer le Re(K), comme le montre la figure 1B. MCF-10A et MCF-7 ont démontré un comportement négatif de diélectrophorèse (nDEP) avec des valeurs Re(k) de -0,46 et -0,31, respectivement, à 100 kHz. Lorsque la fréquence a été augmentée à 0,8 MHz, la réponse DEP des cellules MCF-10 a changé, et elles ont connu pDEP avec une valeur Re(K) de 0,014. Ce comportement des cellules MCF-7 est causé par la polarisation Maxwell-Wagner à l’interface entre la membrane cellulaire et le milieu de suspension cellulaire environnant 39,41. La fréquence à laquelle ce changement de réponse DEP est observé est connue sous le nom de fréquence croisée, comme le montre la figure 1A42,22. Les cellules MCF-7, dans ce cas, ont connu nDEP. La fréquence a encore été augmentée jusqu’à 100 MHz, mais les deux types de cellules n’ont pas modifié leur comportement DEP et, par conséquent, sont restés inchangés par les variations de la fréquence du champ électrique appliqué. Lorsque la conductivité a été augmentée à 1,2 S/m, les cellules MCF-10A et MCF-7 ont connu une nDEP à 100 kHz. Les valeurs Re(k) pour les cellules MCF-10A et MCF-7, dans ce cas, étaient respectivement de -0,49 et -0,43, comme le montre la figure 1C. Comme la fréquence a été augmentée à 0,8 MHz, la réponse DEP des cellules n’a pas changé, car elles ont continué à subir nDEP. Le comportement DEP négatif des lignées cellulaires MCF-7 et MCF-10A à des valeurs élevées de conductivité du milieu de suspension cellulaire est en accord avec les études précédemment rapportées 39,43,44. Le comportement DEP des cellules à des fréquences supérieures à la première fréquence croisée est régi par l’interaction entre la conductivité cytoplasmique et la solution de suspension45,46. D’autre part, à des fréquences inférieures à la première fréquence de croisement, la réponse diélectrique des cellules est déterminée par l’interaction entre la conductivité de la membrane cellulaire et le milieu de suspension cellulaire.

Sur la base des résultats de la figure 1, des simulations COMSOL ont été mises en place. Initialement, l’intensité du champ électrique a été quantifiée à l’aide de ce logiciel de simulation, comme le montre la figure 2. On peut voir que les maxima de l’amplitude du champ électrique total généré par deux électrodes placées côte à côte sur la paroi supérieure du canal de tri sont situés près des bords des électrodes. Les flèches indiquent la direction du champ électrique.

Figure 2
Figure 2 : Intensité du champ électrique. Champ électrique généré par deux électrodes placées côte à côte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les simulations pour trier les cellules MCF-7 et MCF-10A ont été mises en place en maintenant la fréquence AC appliquée fixée à 0,8 MHz (fréquence de croisement) et en modifiant la valeur de σm. Trois valeurs pour σm ont été choisies conformément aux diagrammes Re(K) illustrés à la figure 1. Initialement, lorsque σ m était de 0,01 S/m, les deux types de cellules ont connu une DEP positive, se sont déplacés vers la région de champ électrique élevé et se sont éloignés de la sortie supérieure, comme le montre la figure 3A. Les conductivités cytoplasmiques σcytoplasme pour les deux lignées cellulaires étaient supérieures à la conductivité moyenne σm dans ce cas particulier, forçant ainsi les deux lignées cellulaires à se rapprocher des électrodes au sommet du canal microfluidique47. La réponse DEP des cellules MCF-10A a changé, et elles ont connu une DEP négative, lorsque la σ m a été augmentée à 0,4 S/m avec la fréquence appliquée fixée à 0,8 MHz. La figure 3B montre que les cellules MCF-10A se déplacent vers la sortie supérieure, tandis que les cellules MCF-7 se déplacent vers la sortie inférieure. La raison de cette séparation est que les cellules MCF-7 sont plus polarisées par rapport à MCF-10A car leur conductivité cytoplasmique σcytoplasme est supérieure à la conductivité moyenne σm, comme le montre la vidéo de tri cellulaire (vidéo 2).

Figure 3
Figure 3 : Fréquence fixe de tri des cellules. Simulation du MCF-7 et de la séparation des cellules saines dans le temps par DEP dans le dispositif microfluidique conçu. MCF-7 et séparation des cellules saines à trois valeurs différentes de conductivité du milieu en suspension : (A) 0,01 S/m ; B) 0,4 S/m; C) 1,2 S/m. Dans chaque cas, la fréquence appliquée était de 0,8 MHz, latension Vpp appliquée était de 1,5 V et la vitesse d’écoulement à l’entrée d’injection était de 184 μm/s et de 853 μm/s à l’entrée de focalisation du flux. Dans la simulation, les cellules MCF-7 et MCF-10A sont représentées par des cercles bleus et rouges, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comme la conductivité du milieu a été augmentée à 1,2 S / m, les cellules MCF-7 et MCF-10A sont devenues moins polarisables que le milieu qui les entoure en raison de la conductivité cytoplasmique σ des valeurs decytoplasme plus faibles. Par conséquent, ils ont connu le nDEP et se sont éloignés des régions à champ électrique élevé, comme le montre la figure 3C.

Ces résultats démontrent que la conductivité du milieu joue un rôle important dans la séparation des cellules cancéreuses du sein non métastatiques MCF-7 des cellules épithéliales mammaires non tumorales MCF-10A basées sur la DEP. De plus, comme le montre la figure 3B, pour obtenir une séparation efficace, la conductivité du milieu doit être ajustée de manière à ce que les cellules subissent pDEP ou nDEP, en fonction de leurs propriétés diélectriques respectives.

Enfin, l’effet de la force diélectrophorétique appliquée, F DEP, sur le comportement de tri des deux lignées cellulaires a été étudié en maintenant la conductivité du milieu constante à 0,4 S/m. FDEP est fonction de la fréquence du champ électrique appliqué48,49, et comme la fréquence du champ électrique appliqué est modifiée, les cellules modifient leur comportement DEP. Les simulations ont commencé par régler la fréquence à 100 kHz, et il a été observé que les lignées cellulaires MCF-10A et MCF-7 ont subi nDEP et se sont éloignées de la région de champ électrique élevé vers la sortie inférieure, comme le montre la figure 4A. Au fur et à mesure que la fréquence augmentait, le comportement DEP des deux lignées cellulaires restait inchangé jusqu’à 0,8 MHz, lorsque MCF-10A a changé son comportement DEP et est passé à la région pDEP. Il s’agit du point où la séparation maximale entre les cellules de réponse DEP étudiées et l’efficacité de tri maximale, comme le montre la figure 4B. Lorsque la fréquence a été augmentée à 100 MHz, on a observé que les deux lignées cellulaires ont subi une pDEP et se sont déplacées vers la sortie supérieure, comme le montre la figure 4C. À des fréquences plus élevées au-dessus de 0,8 MHz, les cellules ont commencé à s’immobiliser au niveau des parois du canal. L’immobilisation des cellules au niveau des parois du canal peut entraîner une perte de cellules pendant le processus de tri, ce qui, à son tour, a un effet sur l’efficacité globale du dispositif. L’effet de ces forces peut également entraîner une perte importante de viabilité cellulaire si elles sont exposées pendant une période plus longue. Yang et coll. ont quantifié l’effet des forces DEP sur une lignée cellulaire de Listeria monocytogenes en les exposant à un champ électrique alternatif de 5 MHz et à une tension de crête à crête de 20 VPP50. Leurs résultats ont indiqué une perte cellulaire viable de 56% à 89% lorsqu’ils sont maintenus sous l’effet de la force DEP pendant 4 heures. De même, les forces DEP ont également été signalées comme ayant un effet sur le mouvement des cellules lorsqu’elles sont suspendues dans un milieu polarisable et ont été utilisées pour immobiliser les cellules. Ettehad et coll. ont signalé un dispositif microfluidique avec des électrodes interdigitées (IDE) qui utilisait une fréquence CA de 1 MHz et 20 VPP pour immobiliser les cellules de levure51. Ils ont montré que l’immobilisation de leurs cellules de levure dépendait du rapport d’aspect de l’espacement entre leurs IDE et de la tension appliquée. L’augmentation du rapport hauteur / largeur de l’espacement IDE a entraîné une forte diminution de l’immobilisation des cellules, et afin d’immobiliser les cellules dans les dispositifs avec un plus grand espacement entre les IDE, un VPP plus élevé était nécessaire. L’immobilisation cellulaire est une application souhaitée lorsque les cellules doivent être piégées pour l’analyse ou la croissance. Les résultats précédents ont clairement montré que la fréquence et la tension CA appliquées ont un effet sur l’immobilisation des cellules. Dans les applications où le tri ou le criblage à haut débit est le résultat souhaité, l’immobilisation cellulaire entraîne une perte de cellule et réduit l’efficacité de sortie du dispositif.

Afin de quantifier l’effet de la fréquence et de la tension appliquées sur l’immobilisation des cellules, un ensemble de simulations a été effectué de la gamme de fréquences kilohertz à mégahertz à une tension appliquée fixe de 1,5 VPP. Les résultats sont présentés dans la figure supplémentaire S4. Les résultats ont révélé qu’à des fréquences de l’ordre du kHz, l’immobilisation des cellules au niveau des parois du canal était bien moindre que celle des fréquences de l’ordre du MHz. Comme la force DEP est directement proportionnelle à la fréquence AC appliquée, nous pouvons en déduire que, à force DEP élevée, l’immobilisation des cellules est plus prononcée. Pour ce dispositif microfluidique, il y aura une perte de cellule lors du tri des cellules MCF7 et MCF-10A car il est nécessaire de fonctionner à des fréquences supérieures à 0,8 MHz. L’effet de la distribution aléatoire des cellules à l’entrée a été étudié plus en détail en choisissant une condition limite de distribution aléatoire. Plus d’interactions entre la paroi cellulaire et le canal cellulaire ont été observées dans ce cas, comme le montre la figure supplémentaire 5.

Figure 4
Figure 4 : Tri cellulaire avec conductivité de milieu fixe. Effet de la fréquence du champ AC appliqué sur la séparation des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) dans le dispositif microfluidique simulé. (A) f= 100 KHz; (B) f = 0,8 MHz; (C) f = 100 MHz. La conductivité du milieu fluide a été fixée à σ m = 0,4 S/m. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Propriétés diélectriques pour la simulation εcytoplasme σcytoplasme
(S/h)		 εmembrane σmembrane
(S/h)
MCF-7 50 0.8 11 6× 10-6
MCF-10A 100 0.1 11 6
F0 800 [kHz] 1,2 x 103 Hz Fréquence du champ électrique
sigma_f 0,4 [S/m] 0,8 S/m Conductivité du milieu fluide
epsilon_f 80 80 Permittivité relative des fluides
rho_f 1000 [kg/m3] 1000 kg/m³ Densité du fluide
mu_f 1 x 10-3 [Pa·s] 0,001 Pa·s Viscosité dynamique des fluides
rho_p 1050 [kg/m3] 1050 kg/m³ Densité des particules
DP1 17 [μm] 1,7 x 10-5 m Diamètre des particules
DP2 16 [euh] 1,6 x 10-5 m Diamètre des particules
sigma_p1 0,8 [A/m] 0,6 S/m Conductivité des particules
sigma_p2 0,1 [S/m] 1,1 S/m Conductivité des particules
epsilon_p1 50 55 Permittivité relative saine
epsilon_p2 100 65 Permittivité relative du cancer
sigma_s1 6 x 10-6 [A/m] 6 x 10-6 S/m Conductivité électrique de la coque
sigma_s2 6 [S/m] 6 S/m Conductivité électrique de la coque
epsilon_s1 11 11 Permittivité relative de la coquille
epsilon_s2 11 11 Permittivité relative de la coquille
th_s1 7 [nm] 7 x 10-9 m Épaisseur de la coque
th_s2 7 [nm] 7 x 10-9 m Épaisseur de la coque

Tableau 1 : Paramètres de fonctionnement. Propriétés diélectriques de MCF-7 et MCF-10A

Vidéo 1 : Une vidéo montrant les étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Vidéo de tri cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Dossier supplémentaire 1 : Les équations gouvernantes et le contexte théorique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Conception et paramètres de l’appareil. Conception de dispositifs microfluidiques mettant en évidence différentes parties de l’appareil. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Écart entre les électrodes. L’écart entre deux électrodes de patch. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Étude sur l’indépendance du maillage. Une étude d’indépendance du maillage décrivant l’effet de différentes tailles de mailles sur le tri des cellules MCF-7 et MCF-10A. (A) Les différentes mailles du dispositif microfluidique, représentant le nombre d’éléments pour chaque maille. Le nombre d’éléments qui constitue le maillage augmente de maille plus grossière à plus fine. (B) Le tri des cellules MCF7 et MCF-10A sur différentes tailles de maillage en maintenant constants tous les autres paramètres de fonctionnement. Les mailles fines et plus fines produisent les meilleurs résultats pour le tri. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Test d’immobilisation cellulaire et de distribution aléatoire. Simulations effectuées pour des fréquences comprises entre 10 KHz et 6 MHz afin de valider l’effet de la force DEP sur l’immobilisation des cellules. (A) À f = 10 kHz, aucun tri et immobilisation cellulaire n’est observé. (B) À f = 200 kHz, aucun tri et immobilisation des cellules n’est observé. (C) À f = 0,8 MHz, on observe un tri et une immobilisation des cellules aux parois de sortie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Distribution aléatoire. Particules distribuées aléatoirement à l’entrée de la puce. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Comparaison de différents dispositifs de tri microfluidique à base de DEP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Des dispositifs microfluidiques ont déjà été signalés pour la culture cellulaire, le piégeage et le tri 47,52,53. La fabrication de ces dispositifs en salle blanche est un processus coûteux, et il est impératif de quantifier le rendement et l’efficacité d’un dispositif microfluidique proposé grâce à des simulations CFD. Cette étude présente la conception et les simulations d’un dispositif microfluidique AC-diélectrophorétique pour la séparation continue des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) en fonction de leurs propriétés diélectriques23.

Le dispositif est actionné en appliquant un champ électrique alternatif via un ensemble de deux microélectrodes intégrées dans un seul canal de tri microfluidique pour séparer les cellules MCF-7 et MCF-10A en fonction de leurs propriétés diélectriques. L’efficacité de séparation du dispositif a été simulée par calcul pour différentes valeurs de conductivité moyenne et pour une gamme de fréquences AC appliquées. Les valeurs optimales de fréquence CA et de conductivité du média appliquées étaient respectivement de 0,8 MHz et 0,4 S/m. Une basse tension de 1,5 Vp-c a été utilisée tout au long des simulations. La gamme de fréquences CA appliquée et la tension appliquée sont comparables à la littérature précédemment rapportée23,47. À des fréquences supérieures à 1 MHz, l’effet d’immobilisation de la cellule a été observé, ce qui devrait être pris en considération pour la conception et la fabrication futures des dispositifs. Nous listons cette immobilisation cellulaire comme une limitation de notre méthode dans le contexte des applications de tri cellulaire. Nous pensons que l’immobilisation cellulaire à des fréquences plus élevées peut être utilisée pour la différenciation cellulaire, comme indiqué précédemment dans la littérature54, donnant à cette conception proposée une nouvelle direction. Cette application serait d’un grand intérêt pour les chercheurs en biologie synthétique.

Les étapes critiques pour la mise en œuvre correcte de ce protocole comprennent le choix de nœuds et de sous-nœuds physiques appropriés (étapes 1.5-1.9). Ces étapes constituent la base de l’ensemble du protocole de simulation et aident à choisir les valeurs de paramètres pour chaque type de cellule, force appliquée et tension appliquée. Une autre étape critique consiste à choisir la conductivité du milieu fluide et la fréquence appliquée correctes. Cela peut être réalisé en exécutant une étape de dépannage du balayage paramétrique. Le balayage paramétrique de ces deux paramètres peut aider à décider des valeurs optimales pour toute simulation future. Enfin, une étude d’indépendance du maillage est également essentielle dans le contexte du choix de la bonne taille de maille pour toute simulation future. Il est fortement recommandé d’effectuer une étude d’indépendance du maillage comme étape de dépannage avant de finaliser toute simulation future.

Cette étude fournit le premier exemple basé sur la simulation de séparation en ligne des cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et des cellules épithéliales mammaires non tumorales (MCF-10A) en fonction de leurs propriétés diélectriques. Nous pensons que cette conception peut être davantage mise en œuvre pour un tri cellulaire viable et non viable.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par la Commission de l’enseignement supérieur du Pakistan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

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Dispositif microfluidique pour la séparation de cellules cancéreuses du sein non métastatiques (MCF-7) et non tumorales (MCF-10A) par diélectrophorèse AC
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ur Rehman, A., Zabibah, R. S., Kharratian, S., Mustafa, A. Microfluidic Device for the Separation of Non-Metastatic (MCF-7) and Non-Tumor (MCF-10A) Breast Cancer Cells Using AC Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (186), e63850, doi:10.3791/63850 (2022).

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