Summary
Le cellule del cancro al seno presentano proprietà dielettriche diverse rispetto alle cellule epiteliali mammarie non tumorali. È stato ipotizzato che, sulla base di questa differenza di proprietà dielettriche, le due popolazioni possano essere separate ai fini dell'immunoterapia. Per supportare questo, modelliamo un dispositivo microfluidico per ordinare le celle MCF-7 e MCF-10A.
Abstract
I dispositivi dielettroforetici sono in grado di rilevare e manipolare le cellule tumorali in modo privo di etichette, economico, robusto e accurato utilizzando il principio della polarizzazione delle cellule tumorali nel volume del campione applicando un campo elettrico esterno. Questo articolo dimostra come una piattaforma microfluidica può essere utilizzata per lo smistamento continuo ad alto rendimento di cellule di cancro al seno non metastatico (MCF-7) e cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) utilizzando la dielettroforesi idrodinamica (HDEP) dalla miscela cellulare. Generando un campo elettrico tra due elettrodi posti fianco a fianco con uno spazio di dimensioni micron tra loro in un chip microfluidico HDEP, le cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) possono essere allontanate, esibendo DEP negativo all'interno del canale principale, mentre le cellule di cancro al seno non metastatico seguono il loro decorso inalterate quando sospese nel mezzo cellulare a causa della conduttività superiore alla conduttività della membrana. Per dimostrare questo concetto, sono state eseguite simulazioni per diversi valori di media conduttività ed è stato studiato lo smistamento delle celle. È stato condotto uno studio parametrico ed è risultata una conduttività della miscela cellulare adatta a 0,4 S/m. Mantenendo fissa la conducibilità del mezzo, è stata stabilita un'adeguata frequenza CA di 0,8 MHz, dando la massima efficienza di ordinamento, variando la frequenza del campo elettrico. Utilizzando il metodo dimostrato, dopo aver scelto la conduttività e la frequenza della media di sospensione della miscela cellulare appropriata dell'AC applicata, è possibile ottenere la massima efficienza di selezione.
Introduction
Un tumore maligno che si sviluppa dentro e intorno al tessuto mammario è una causa frequente di cancro al seno nelle donne di tutto il mondo, causando un problema di salute critico1. I tumori al seno prima delle metastasi possono essere trattati chirurgicamente se rilevati in una fase precoce, ma se ignorati, possono avere gravi implicazioni sulla vita del paziente diffondendosi ai polmoni, al cervello e alle ossa. I trattamenti offerti nelle fasi successive, come le radiazioni e le terapie a base chimica, hanno gravi effetti collaterali2. Studi recenti hanno riportato che una diagnosi precoce di cancro al seno riduce il tasso di mortalità del 60%3. Quindi, è imperativo lavorare verso metodi di diagnosi precoce personalizzati. A tal fine, ricercatori che lavorano in diversi campi della scienza e della tecnologia hanno utilizzato la microfluidica per sviluppare dispositivi per la diagnosi precoce del cancro al seno4. Questi metodi includono microcromatografia ad affinità cellulare, selezionatori di microcellule attivati magneticamente, cattura e separazione delle cellule tumorali basate sulle dimensioni e dielettroforesi su chip (DEP)5,6. Queste tecniche microfluidiche riportate in letteratura consentono una manipolazione cellulare precisa, il monitoraggio in tempo reale e lo smistamento di campioni ben definiti, che fungono da passaggio intermedio in molte applicazioni diagnostiche e terapeutiche5. L'integrazione di questi meccanismi di selezione con la microfluidica offre una manipolazione flessibile e affidabile delle cellule bersaglio 7,8,9,10. Uno dei principali vantaggi di tale integrazione è la capacità di lavorare con campioni di fluido in volumi da nano a microlitri e anche di essere in grado di manipolare le proprietà elettriche del fluido campione. Regolando la conduttività del fluido sospeso all'interno di dispositivi microfluidici, le cellule biologiche possono essere ordinate in base alle loro dimensioni e alle differenze nelle loro proprietà dielettriche11,12.
Tra queste tecniche, il DEP su chip è spesso preferito in quanto è una tecnica di selezione cellulare label-free che sfrutta le proprietà elettriche dei campioni biologici. È stato segnalato che il DEP manipola campioni biologici come DNA 13, RNA 14, proteine 15, batteri 16, cellule del sangue17, cellule tumorali circolanti (CTC) 18 e cellule staminali 19. I dispositivi microfluidici che impiegano DEP per la selezione di campioni biologici sono stati ampiamente riportati nella letteratura20. Sono stati segnalati dispositivi microfluidici DEP (rDEP) basati su serbatoi per la selezione di cellule di lievito vitali e non vitali che proteggono le cellule dagli effetti avversi delle reazioni elettrochimiche21,22. Piacentini et al. hanno riportato un selezionatore di cellule microfluidiche castellate che separava i globuli rossi dalle piastrine con un'efficienza del 97% 23. Sono stati segnalati anche dispositivi DEP su chip con orifizi asimmetrici ed elettrodi incorporati per ordinare celle vitali e non vitali24. Valero e Demierre et al. hanno modificato la selezionatrice di cellule microfluidiche castellate introducendo due array di microelettrodi su entrambi i lati del canale25,26. Ciò ha aiutato a focalizzare le celle al centro del canale. Zeynep et al. hanno presentato un dispositivo microfluidico basato su DEP per separare e concentrare le cellule di cancro al seno MCF7 dai leucociti27. Hanno riportato un'efficienza nell'estrazione di cellule MCF7 dai leucociti tra il 74% e il 98% con una frequenza di 1 MHz e una tensione applicata compresa tra 10-12 Vpp. La tabella supplementare 1 rappresenta un confronto qualitativo e quantitativo tra i dispositivi di selezione microfluidica basati su DEP in base al loro design, alla configurazione degli elettrodi e ai parametri operativi (frequenza e tensione applicate).
Più recentemente, i ricercatori hanno cercato di misurare le differenze nel comportamento dielettrico delle cellule epiteliali del seno (MCF-10A) e delle cellule di cancro al seno non metastatico (MCF-7) all'interno di un chip microfluidico28,29. Jithin et al. hanno anche caratterizzato le risposte dielettriche di diverse linee cellulari tumorali utilizzando una tecnica di sonda coassiale aperta con frequenze comprese tra 200 MHz e 13,6 GHz30. Queste differenze nelle risposte dielettriche delle linee cellulari MCF-7 e MCF-10A possono essere sfruttate per separarle in fase di esecuzione e possono portare allo sviluppo di dispositivi personalizzati di diagnosi precoce.
In questo articolo, simuliamo l'ordinamento controllato delle cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) utilizzando la dielettroforesi AC. La regione di cambiamento nel campo elettrico influenza lo smistamento all'interno del chip microfluidico. La tecnica proposta è facile da implementare e consente l'integrazione della tecnica di selezione in vari layout di chip microfluidici. Sono state effettuate simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) per studiare la separazione delle cellule di carcinoma mammario non metastatico e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali variando la conduttività del mezzo fluido in cui le cellule sono state sospese. In queste simulazioni, è dimostrato che, mantenendo costante la conducibilità e modificando la frequenza applicata, la separazione delle cellule tumorali e delle cellule sane può essere controllata.
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Protocol
NOTA: Il protocollo qui utilizza COMSOL, un software di simulazione multifisica, per simulare l'ordinamento controllato delle cellule di cancro al seno non metastatiche (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) utilizzando la dielettroforesi AC.
1. Progettazione del chip e selezione dei parametri
- Aprire il software multifisico e selezionare Modello vuoto. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Definizioni globali e selezionare Parametri. Importare i parametri indicati nella Tabella 1 nelle definizioni globali come file di testo o immettere i valori singolarmente.
- Selezionare Aggiungi componente dalla scheda Home e aggiungere un componente 2D. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla geometria e importare il file del modello facendo doppio clic sul file.
- Scegliete un materiale vuoto e utilizzate le proprietà del materiale della Tabella 1.
- Selezionare Aggiungi fisica dalla scheda Home e digitare AC/DC. Sotto il nodo AC/DC, scegli correnti elettriche come Fisica sotto il sottonodo di campi e correnti elettriche.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse su Corrente elettrica e scegliere i sottonodi Conservazione corrente, Isolare e Potenziale elettrico per isolare le pareti del canale per assegnare potenziale agli elettrodi.
- Selezionare Aggiungi fisica dalla scheda Home e, sotto il nodo Flusso fluido , scegliere Fisica flusso strisciante sotto il sottonodo di Flusso monofase. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Flusso monofase ed eseguire il rendering dei limiti del chip come muri utilizzando il sottonodo Wall .
- Fare clic con il pulsante destro del mouse su Flusso monofase e aggiungere due sottonodi di ingresso e un sottonodo di uscita.
- Assegnate gli ingressi utilizzando il sottonodo di ingresso e utilizzate normal in Velocità flusso (Flow Velocity ) come condizione al contorno. Assegnare la presa utilizzando il sottonodo di uscita.
- Selezionare Aggiungi fisica dalla scheda Home e, sotto il nodo Flusso fluido , scegliere Fisica del flusso di tracciatura delle particelle sotto il sottonodo di Ricalco delle particelle.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo Tracciatura particelle e aggiungere la parete dei sottonodi, i sottonodi delle proprietà delle due particelle, due sottonodi di ingresso, un sottonodo di uscita, due sottonodi della forza di dielettroforesi e un sottonodo della forza di trascinamento.
- Impostare le proprietà delle particelle per le celle MCF-7 e MCF-10A utilizzando il sottonodo Proprietà particelle . Scegliere le proprietà delle particelle dai parametri nella sezione Definizione globale .
- Aggiungete il sottonodo Forza trascinamento (Drag Force ) per assegnare la forza dielettroforetica a entrambi i tipi di celle.
- Aggiungete Proprietà particella in questo caso dalla sezione dei parametri. Aggiungere il sottonodo Shell per modellare le cellule dei mammiferi.
- Dalla scheda Home, scegliete Aggiungi trama e selezionate Mesh fine. Scegliete Crea mesh dalla scheda Home per creare una mesh.
- Dalla scheda Home, fai clic su Aggiungi studio per aggiungere tre passaggi di studio. La fase 1 dello studio consiste nella simulazione di una risposta in frequenza; utilizzare un sottonodo Dominio di frequenza .
- Per simulare il flusso strisciante, scegliere un nodo Studio stazionario . Aggiungere due passaggi dipendenti dal tempo per simulare condizioni con forza dielettroforetica e senza forza dielettroforetica.
- Per la condizione senza dielettroforetico, scegliere Selezione fisica e variabili, selezionare la casella Modifica configurazione modello per la fase di studio e disattivare la fase dielettroforetica. Per condizioni dielettroforetiche, non disabilitare. Salvare il file e premere Compute per eseguire la simulazione.
NOTA: Il chip microfluidico progettato per lo smistamento delle cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) ha due ingressi separati per il flusso della miscela cellulare e per la focalizzazione del flusso idrodinamico, rispettivamente, con larghezze di 20 μm e 40 μm, rispettivamente, come mostrato nella Figura supplementare 1 e nella Figura supplementare 2. - Assegnare la frequenza (f0) sotto il sottonodo Dominio della frequenza e la tensione utilizzando il sottonodo Potenziale elettrico agli elettrodi piallatori (295 μm di larghezza) posti lungo la parete laterale superiore della camera di selezione. All'uscita, utilizzare la condizione della parete "freeze" per visualizzare le particelle ordinate.
2. Modello matematico e analisi computazionale
- Verificare i parametri operativi per separare le cellule di carcinoma mammario non metastatico e le cellule epiteliali mammarie non tumorali all'interno del dispositivo microfluidico impostando uno studio fluidodinamico computazionale (CFD).
NOTA: a tale scopo è stato utilizzato un software multifisico (moduli AC/DC, Microfluidics e Particle Tracking). Le equazioni che governano e il background teorico sono riportati in dettaglio nel file supplementare 1. Il modello è stato testato utilizzando le proprietà dielettriche delle cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) riportate in letteratura31,32, che sono riassunte nella Tabella 1. - Eseguire le simulazioni CFD introducendo linee cellulari di carcinoma mammario non metastatico (MCF7) e epiteliale mammario non tumorale (MCF-10A) con un rapporto di 1:1 all'ingresso della miscela cellulare.
- Inizialmente, eseguire uno studio sull'indipendenza della mesh per ottimizzare la dimensione della mesh per le simulazioni33.
NOTA: è stato eseguito uno studio sull'indipendenza della rete per trovare la soluzione migliore per i parametri operativi. È stato scelto un set di cinque diverse dimensioni di maglia per quantificare la migliore dimensione possibile dell'elemento per la convergenza della soluzione. È stato osservato che, quando il numero totale di elementi che definiscono una maglia era 635 (maglia più grossolana), come mostrato nella figura supplementare 3A, l'efficienza di selezione era al minimo, con alcune delle celle MCF7 che si spostavano verso l'uscita inferiore, come illustrato nella figura supplementare 3B. Quando la dimensione della maglia è stata aumentata a fine, anche il numero di elementi che definiscono la maglia è aumentato a 2.288. L'efficienza di selezione era al massimo in questo caso, con entrambe le celle MCF7 e MCF-10A che si muovevano verso le rispettive uscite. È stata simulata anche la mesh più fine, con il numero di elementi che definiscono la mesh che è aumentato a 3.188. L'efficienza di smistamento è rimasta inalterata oltre questo punto. Quindi, possiamo tranquillamente dire che la dimensione della maglia fine funziona meglio nel nostro caso. - Risolvi due serie di studi CFD.
- Per il primo set, fare clic con il pulsante destro del mouse su Studio 1 e aggiungere il sottonodo Sweep parametrica . Premete il segno + per aggiungere la conducibilità fluida "σm" come variabile sweep. Eseguire uno studio parametrico di sweep per la conducibilità del fluido σm compresa tra 0,01 S/m e 2,5 S/m, mantenendo costante la frequenza applicata, f (Hz), ad un valore di 800 kHz.
- Per il secondo set, condurre uno studio Parametric Sweep variando la frequenza CA applicata da 100 kHz a 100 MHz mantenendo la conduttività del fluido, σ m, fissata a 0,4 S /m per ciascun caso. Questo valore di σm è stato scelto in base ai risultati del primo studio CFD poiché è stata osservata una separazione massima tra MCF-7 e MCF-10A a questo valore.
- La forza della forza di dielettroforesi (DEP), FDEP (-), esercitata su una particella sferica dielettrica in un mezzo conduttivo è data dall'equazione 1T34:
FDEP
[1]
Utilizzare l'equazione 1 sotto il sottonodo della forza dielettroforetica. Nell'equazione 1, r mostra il raggio della particella su cui è applicato FDEP; K (-) è noto come fattore di Clausius-Mossotti; εm(-) mostra la permittività dielettrica del mezzo; e E(V/m) è il valore quadratico medio della radice del campo elettrico. - Usa l'equazione 2 per una particella sferica sotto il sottonodo della forza dielettroforetica.
[2]
Nell'equazione 2,
(-) mostra la permittività complessa della particella su cui è applicata la forza DEP; 
(-) mostra la permittività complessa del fluido che circonda la particella. La permittività complessa e sono definiti come segue35: - Usate l'equazione 3 per una particella sferica sotto il sottonodo della forza dielettroforetica:
[3]
Nell'equazione 3, εp (-) mostra la parte reale della permittività complessa della particella; εm (-) mostra la parte reale della permittività complessa del fluido che circonda la particella; σp (S/m) mostra la conducibilità delle particelle; σ m (S/m ) mostra la conducibilità del mezzo che circonda la particella; e ω (Hz) è la frequenza del campo elettrico applicato.
NOTA: Il segno di Re(K) determina la polarità delDEP F. Se il segno di Re(K) è negativo, allora la particella sperimenta una forza dielettroforetica negativa (nDEP); al contrario, se il segno di Re(K) è positivo, implica una forza dielettroforetica positiva (pDEP). Per il fattore di Clausius-Mossotti (K), la variazione rientra nell'intervallo da -1 a 1.
- Inizialmente, eseguire uno studio sull'indipendenza della mesh per ottimizzare la dimensione della mesh per le simulazioni33.
- Utilizzare una forma modificata dell'equazione 3 per modellare cellule biologiche come le cellule di mammifero, che sono più complesse e hanno una struttura multistrato.
K (
) = 
[4]
Nell'equazione 4, (-) incorpora sia la permittività complessa del citoplasma, (-), sia la permittività complessa della membrana cellulare,
(-), ed è data come segue:36 - Usa l'equazione 5 per risolvere ""
:
[5]
Nell'equazione 5, R cyto (m) e Rmem (m) mostrano rispettivamente il raggio del citoplasma cellulare e della membrana cellulare. - Quindi, utilizzare l'equazione 4 per tracciare Re(K) in funzione del campo elettrico applicato sia per il cancro che per le cellule sane. Calcolare la parte reale del fattore di Clausius-Mossotti (CM), Re(K), per quantificare la forza dielettroforetica (DEP) che la particella sperimenta.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo Risultati, aggiungere il sottonodo Valutazione particelle e nella sezione espressione digitare fpt.deff1.K per tracciare il fattore CM per la particella 1 e fpt.deff2.K per la particella 2.
NOTA: Tutti i passaggi del protocollo elencati nel testo principale possono essere visualizzati nel video del protocollo (Video 1).
[1]
[2]
(-) mostra la permittività complessa della particella su cui è applicata la forza DEP; 
(-) mostra la permittività complessa del fluido che circonda la particella. La permittività 
[3]
) = 
[4]
(-), ed è data come segue:36
:
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Representative Results
Studiare i parametri operativi ottimali per un efficace ordinamento basato su DEP delle cellule epiteliali mammarie non metastatiche (MCF-7) e non tumorali (MCF-10A)
Per ottenere una separazione di successo del carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) con proprietà dielettriche divergenti quando sottoposte a dielettroforesi, i loro fattori K dovrebbero essere distinti mantenendo la frequenza applicata fissa37,38. La quantificazione delle risposte dielettriche delle cellule di carcinoma mammario non metastatico e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali sotto un campo elettrico applicato e il calcolo del fattore "K" in funzione della frequenza applicata per entrambe le linee cellulari sono stati ottenuti utilizzando l'equazione 4. I risultati mostrati in Figura 1 sono stati generati mantenendo fissi tutti i parametri dielettrici delle cellule di carcinoma mammario non metastatico e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali, mentre la frequenza applicata del campo elettrico è stata variata per tre diversi valori di conduttività dei mezzi di sospensione cellulare, σm.
Come mostrato nella figura 1, in ciascun caso, il valore di K è compreso nell'intervallo da -1 a 1, in linea con gli studi precedenti39,40. Tuttavia, il grafico di reale (K) rispetto alla frequenza cambia sia per le cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) che per le cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) in base al valore della conduttività media (σm). I risultati mostrati nella Figura 1 sono in accordo con un recente studio in cui l'effetto di σm su Re(K) per le cellule MCF-7 è stato quantificato41.
Figura 1: Fattore Clausius-Mosscotti. La parte reale del fattore di Clausius-Mossotti, K, tracciata in funzione della frequenza, per celle MCF-7 e MCF-10A sospese in un mezzo caratterizzato da una conducibilità di (A) σ m = 0,01 S/m ; (B) σ m = 0,4 S/m ; (C) σ m = 1,2 S/m . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La Figura 1 è stata tracciata utilizzando lo strumento MyDEP per tre diversi valori di σm, mantenendo e variando la frequenza CA applicata da 100 kHz a 100 MHz. Inizialmente, il σ m è stato scelto per essere 0,01 S/m, e la frequenza CA applicata è stata variata tra 100 kHz e 100 MHz, come mostrato nella Figura 1A. A una frequenza CA applicata di 100 kHz, il valore di Re (K) per le cellule MCF-10A si è rivelato essere 0,82, il che significa che sperimentano una dielettroforesi positiva (pDEP) e dovrebbero spostarsi verso un'area di elevata intensità del campo elettrico. Allo stesso modo, le celle MCF-7 a 100 kHz sperimentano anche pDEP con un valore Re(K) di 0,76. La frequenza è stata aumentata in incrementi di 100 kHz e il valore del fattore CM per entrambi i tipi di celle è rimasto positivo in tutto lo spettro di frequenza applicato. Mantenendo costanti tutti gli altri parametri operativi, la conducibilità del mezzo è stata aumentata a 0,4 S/m per tracciare il Re(K), come mostrato nella Figura 1B. MCF-10A e MCF-7 hanno dimostrato un comportamento negativo alla dielettroforesi (nDEP) con valori Re(k) di -0,46 e -0,31, rispettivamente, a 100 kHz. Quando la frequenza è stata aumentata a 0,8 MHz, la risposta DEP delle cellule MCF-10 è cambiata e hanno sperimentato pDEP con un valore Re(K) di 0,014. Questo comportamento delle cellule MCF-7 è causato dalla polarizzazione di Maxwell-Wagner all'interfaccia tra la membrana cellulare e il mezzo di sospensione cellulare circostante39,41. La frequenza in cui si osserva questo cambiamento nella risposta DEP è nota come frequenza di cross-over, come mostrato nella Figura 1A42,22. Le cellule MCF-7, in questo caso, hanno sperimentato nDEP. La frequenza è stata ulteriormente aumentata fino a 100 MHz, ma entrambi i tipi di celle non hanno cambiato il loro comportamento DEP e, quindi, non sono stati influenzati dalle variazioni della frequenza del campo elettrico applicata. Quando la conduttività è stata aumentata a 1,2 S/m, le celle MCF-10A e MCF-7 hanno sperimentato nDEP a 100 kHz. I valori di Re(k) per le celle MCF-10A e MCF-7, in questo caso, erano rispettivamente -0,49 e -0,43, come mostrato nella Figura 1C. Quando la frequenza è stata aumentata a 0,8 MHz, la risposta DEP delle celle non è cambiata, poiché hanno continuato a sperimentare nDEP. Il comportamento negativo del DEP di entrambe le linee cellulari MCF-7 e MCF-10A ad alti valori di conduttività del mezzo di sospensione cellulare è in accordo con gli studi precedentemente riportati 39,43,44. Il comportamento DEP delle cellule a frequenze superiori alla prima frequenza di cross-over è governato dall'interazione tra conducibilità citoplasmatica e soluzione sospesa45,46. D'altra parte, a frequenze inferiori alla prima frequenza di cross-over, la risposta dielettrica delle cellule è determinata dall'interazione tra la conduttività della membrana cellulare e il mezzo di sospensione cellulare.
Sulla base dei risultati mostrati nella Figura 1, sono state impostate le simulazioni COMSOL. Inizialmente, l'intensità del campo elettrico è stata quantificata utilizzando questo software di simulazione, come mostrato nella Figura 2. Si può vedere che i massimi della grandezza del campo elettrico totale generato da due elettrodi posti fianco a fianco sulla parete superiore del canale di selezione si trovano vicino ai bordi degli elettrodi. Le frecce mostrano la direzione del campo elettrico.
Figura 2: Intensità del campo elettrico. Il campo elettrico generato da due elettrodi posti fianco a fianco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le simulazioni per ordinare le celle MCF-7 e MCF-10A sono state impostate mantenendo la frequenza CA applicata fissa a 0,8 MHz (frequenza di cross-over) e modificando il valore di σm. Sono stati scelti tre valori per σm in base ai grafici Re(K) mostrati nella figura 1. Inizialmente, quando σ m era 0,01 S/m, entrambi i tipi di cellule hanno sperimentato un DEP positivo, si sono spostati verso la regione di elevata intensità del campo elettrico e si sono spostati fuori dalla presa superiore, come mostrato in Figura 3A. Le conduttività citoplasmatiche σcitoplasma per entrambe le linee cellulari erano superiori alla conduttività media σm in questo caso particolare, costringendo così entrambe le linee cellulari ad avvicinarsi agli elettrodi nella parte superiore del canale microfluidico47. La risposta DEP delle celle MCF-10A è cambiata e hanno sperimentato un DEP negativo, quando il σ m è stato aumentato a 0,4 S /m con la frequenza applicata fissata a 0,8 MHz. La Figura 3B mostra che le celle MCF-10A si spostano verso l'uscita superiore, mentre le celle MCF-7 si spostano verso l'uscita inferiore. La ragione di questa separazione è che le cellule MCF-7 sono più polarizzate rispetto a MCF-10A poiché la loro conduttività citoplasmatica σcitoplasma è maggiore della conduttività media σm, come mostrato nel video di selezione cellulare (Video 2).
Figura 3: Frequenza fissa di ordinamento delle celle. Simulazione di MCF-7 e separazione cellulare sana nel tempo mediante DEP nel dispositivo microfluidico progettato. MCF-7 e separazione cellulare sana a tre diversi valori di conducibilità del mezzo sospeso: (A) 0,01 S/m; (B) 0,4 S/m; (C) 1,2 S/m. In ogni caso, la frequenza applicata era di 0,8 MHz, la tensione applicata Vpp era di 1,5 V e la velocità del flusso all'ingresso di iniezione era di 184 μm/s e 853 μm/s all'ingresso di focalizzazione del flusso. Nella simulazione, le celle MCF-7 e le celle MCF-10A sono rappresentate rispettivamente con cerchi blu e rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Poiché la conduttività media è stata ulteriormente aumentata a 1,2 S / m, entrambe le cellule MCF-7 e MCF-10A sono diventate meno polarizzabili rispetto al mezzo che le circonda a causa della conduttività citoplasmatica σ dei valoricitoplasmatici più bassi. Di conseguenza, hanno sperimentato nDEP e si sono allontanati dalle regioni ad alto campo elettrico, come mostrato nella Figura 3C.
Questi risultati dimostrano che la conduttività del mezzo svolge un ruolo importante nella separazione delle cellule di carcinoma mammario non metastatico MCF-7 dalle cellule epiteliali mammarie non tumorali MCF-10A basate su DEP. Inoltre, come mostrato nella Figura 3B, per ottenere una separazione efficace, la conduttività del mezzo deve essere regolata in modo che le celle sperimentino pDEP o nDEP, in base alle rispettive proprietà dielettriche.
Infine, l'effetto della forza dielettroforetica applicata, F DEP, sul comportamento di ordinamento di entrambe le linee cellulari è stato studiato mantenendo costante la conducibilità del mezzo a 0,4 S/m. FDEP è una funzione della frequenza del campo elettrico applicato48,49, e al variare della frequenza del campo elettrico applicato, le cellule cambiano il loro comportamento DEP. Le simulazioni sono state avviate impostando la frequenza a 100 kHz ed è stato osservato che entrambe le linee cellulari MCF-10A e MCF-7 hanno sperimentato nDEP e si sono allontanate dalla regione di alto campo elettrico verso l'uscita inferiore, come mostrato in Figura 4A. Con l'aumento della frequenza, il comportamento DEP di entrambe le linee cellulari è rimasto invariato fino a 0,8 MHz, quando MCF-10A ha cambiato il loro comportamento DEP e si è trasferito nella regione pDEP. Questo è il punto con la massima separazione tra le celle di risposta DEP in esame e la massima efficienza di selezione, come mostrato nella Figura 4B. Quando la frequenza è stata aumentata a 100 MHz, è stato osservato che entrambe le linee cellulari hanno sperimentato pDEP e si sono spostate verso l'uscita superiore, come mostrato nella Figura 4C. A frequenze più alte superiori a 0,8 MHz, le cellule hanno iniziato a immobilizzarsi sulle pareti del canale. L'immobilizzazione delle cellule sulle pareti del canale può portare alla perdita di cellule durante il processo di selezione, che a sua volta ha un effetto sull'efficienza complessiva del dispositivo. L'effetto di queste forze può anche causare gravi perdite di vitalità cellulare se esposto per un periodo di tempo più lungo. Yang et al. hanno quantificato l'effetto delle forze DEP su una linea cellulare Listeria monocytogenes esponendoli a un campo elettrico AC di 5 MHz e una tensione di picco a picco di 20 VPP50. I loro risultati hanno indicato una perdita di cellule vitali del 56% -89% quando mantenuta sotto l'effetto della forza DEP per 4 ore. Allo stesso modo, le forze DEP sono state anche segnalate per avere un effetto sul movimento delle cellule quando sospese in un mezzo polarizzabile e sono state utilizzate per immobilizzare le cellule. Ettehad et al. hanno riportato un dispositivo microfluidico con elettrodi interdigitati (IDE) che utilizzava una frequenza CA di 1 MHz e 20 VPP per immobilizzare le cellule di lievito51. Hanno dimostrato che l'immobilizzazione delle loro cellule di lievito dipendeva dal rapporto di aspetto della spaziatura tra i loro IDE e la tensione applicata. L'aumento delle proporzioni della spaziatura IDE ha comportato una forte diminuzione dell'immobilizzazione delle celle e, al fine di immobilizzare le celle in dispositivi con una maggiore spaziatura tra gli IDE, è stato richiesto un VPP più elevato. L'immobilizzazione cellulare è un'applicazione desiderata quando le cellule devono essere intrappolate per l'analisi o la crescita. I risultati precedenti hanno mostrato chiaramente che la frequenza e la tensione CA applicate hanno un effetto sull'immobilizzazione delle celle. Nelle applicazioni in cui lo smistamento o lo screening ad alta produttività è il risultato desiderato, l'immobilizzazione delle celle provoca la perdita di cellule e riduce l'efficienza di output del dispositivo.
Al fine di quantificare l'effetto della frequenza e della tensione applicate sull'immobilizzazione della cella, è stata eseguita una serie di simulazioni dalla gamma di frequenza da kilohertz a megahertz a una tensione applicata fissa di 1,5 VPP. I risultati sono mostrati nella figura supplementare S4. I risultati hanno rivelato che, a frequenze nell'intervallo kHz, l'immobilizzazione delle celle sulle pareti del canale era molto inferiore rispetto alle frequenze nella gamma MHz. Poiché la forza DEP è direttamente proporzionale alla frequenza AC applicata, possiamo dedurre che, ad alta forza DEP, l'immobilizzazione delle cellule è più pronunciata. Per questo dispositivo microfluidico, ci sarà una perdita di cellule durante lo smistamento delle celle MCF7 e MCF-10A in quanto è necessario operare a frequenze superiori a 0,8 MHz. L'effetto della distribuzione casuale delle celle all'ingresso è stato ulteriormente studiato scegliendo una condizione al contorno di distribuzione casuale. In questo caso sono state osservate più interazioni tra parete cellulare e canale, come mostrato nella Figura 5 supplementare.
Figura 4: Ordinamento delle celle con conducibilità media fissa. Effetto della frequenza del campo AC applicato sulla separazione delle cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) nel dispositivo microfluidico simulato. (A) f= 100 KHz; (B) f= 0,8 MHz; (C) f= 100 MHz. La conducibilità del fluido è stata fissata a σ m = 0,4 S/m . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Proprietà dielettriche per la simulazione | εcitoplasma | σcitoplasma (S/m) |
εmembrana | σmembrana (S/m) |
| MCF-7 · | 50 | 0.8 | 11 | 6× 10-6 |
| MCF-10A | 100 | 0.1 | 11 | 6 |
| f0 | 800 [kHz] | 1,2 x 103 Hz | Frequenza del campo elettrico |
| sigma_f | 0.4 [S/m] | 0,8 S/m | Fluido medio conducibilità |
| epsilon_f | 80 | 80 | Permittività relativa del fluido |
| rho_f | 1000 [kg/m3] | 1000 kg/m³ | Densità del fluido |
| mu_f | 1 x 10-3 [Pa·s] | 0,001 Pa·s | Viscosità fluidodinamica |
| rho_p | 1050 [kg/m3] | 1050 kg/m³ | Densità delle particelle |
| DP1 | 17 [μm] | 1,7 x 10-5 m | Diametro delle particelle |
| DP2 | 16 [um] | 1,6 x 10-5 m | Diametro delle particelle |
| sigma_p1 | 0.8 [S/m] | 0,6 S/m | Conduttività delle particelle |
| sigma_p2 | 0.1 [S/m] | 1,1 S/m | Conduttività delle particelle |
| epsilon_p1 | 50 | 55 | Permittività relativa sana |
| epsilon_p2 | 100 | 65 | Permittività relativa del cancro |
| sigma_s1 | 6 x 10-6 [S/m] | 6 x 10-6 S/m | Conduttività elettrica del guscio |
| sigma_s2 | 6 [S/m] | 6 S/m | Conduttività elettrica del guscio |
| epsilon_s1 | 11 | 11 | Permittività relativa del guscio |
| epsilon_s2 | 11 | 11 | Permittività relativa del guscio |
| th_s1 | 7 [NM] | 7 x 10-9 m | Spessore del guscio |
| th_s2 | 7 [NM] | 7 x 10-9 m | Spessore del guscio |
Tabella 1: Parametri operativi. Proprietà dielettriche di MCF-7 e MCF-10A
Video 1: Un video che mostra i passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Video sull'ordinamento delle celle. Clicca qui per scaricare questo video.
File supplementare 1: Le equazioni che governano e il background teorico. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 1: progettazione e parametri del dispositivo. Design del dispositivo microfluidico che evidenzia diverse parti del dispositivo. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Distanza tra gli elettrodi. Lo spazio tra due elettrodi patch. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Studio sull'indipendenza delle maglie. Uno studio sull'indipendenza della mesh che descrive l'effetto di diverse dimensioni di mesh sulla selezione delle celle MCF-7 e MCF-10A. (A) Le diverse dimensioni delle maglie per il dispositivo microfluidico, con indicazione del numero di elementi per ciascuna maglia. Il numero di elementi che costituiscono la maglia aumenta da più grossolano a maglia più fine. (B) La selezione delle celle MCF7 e MCF-10A su maglie di dimensioni diverse mantenendo costanti tutti gli altri parametri operativi. Le dimensioni delle maglie fini e più fini producono i migliori risultati per la selezione. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 4: Test di immobilizzazione cellulare e distribuzione casuale. Simulazioni eseguite per frequenze comprese tra 10 KHz e 6 MHz per validare l'effetto della forza DEP sull'immobilizzazione cellulare. (A) A f = 10 kHz, non si osserva alcuna selezione e immobilizzazione cellulare. (B) A f = 200 kHz, non si osserva l'ordinamento e l'immobilizzazione delle cellule. (C) A f = 0,8 MHz, si osservano lo smistamento e l'immobilizzazione delle celle sulle pareti di uscita. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 5: Distribuzione casuale. Particelle distribuite casualmente all'ingresso del chip. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Confronto tra diversi dispositivi di selezione microfluidica basati su DEP. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Dispositivi microfluidici sono stati descritti in precedenza per la coltura cellulare, l'intrappolamento e lo smistamento 47,52,53. La fabbricazione di questi dispositivi in camera bianca è un processo costoso ed è imperativo quantificare l'output e l'efficienza di un dispositivo microfluidico proposto attraverso simulazioni CFD. Questo studio presenta la progettazione e le simulazioni di un dispositivo microfluidico AC-dielettroforetico per la separazione continua di cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) basate sulle loro proprietà dielettriche23.
Il dispositivo viene azionato applicando un campo elettrico CA tramite una serie di due microelettrodi incorporati in un singolo canale di selezione microfluidica per separare le celle MCF-7 e MCF-10A in base alle loro proprietà dielettriche. L'efficacia di separazione del dispositivo è stata simulata computazionalmente per diversi valori di media conduttività e per una gamma di frequenze AC applicate. I valori ottimali di frequenza CA e conducibilità del fluido applicati sono risultati rispettivamente di 0,8 MHz e 0,4 S/m. Durante le simulazioni è stata utilizzata una bassa tensione di 1,5 Vp-p. La gamma di frequenza CA applicata e la tensione applicata sono paragonabili alla letteratura precedentemente riportata23,47. A frequenze superiori a 1 MHz, è stato osservato l'effetto di immobilizzazione della cella, che dovrebbe essere preso in considerazione per la futura progettazione e fabbricazione del dispositivo. Elenchiamo questa immobilizzazione cellulare come una limitazione del nostro metodo nel contesto delle applicazioni di ordinamento cellulare. Riteniamo che l'immobilizzazione cellulare a frequenze più elevate possa essere utilizzata per la differenziazione cellulare come precedentemente riportato nella letteratura54, dando a questo progetto proposto una nuova direzione. Questa applicazione sarebbe di grande interesse per i ricercatori in biologia sintetica.
I passaggi critici per la corretta implementazione di questo protocollo includono la scelta di nodi e sottonodi fisici adatti (passi 1.5-1.9). Questi passaggi costituiscono la base dell'intero protocollo di simulazione e aiutano a scegliere i valori dei parametri per ciascun tipo di cella, forza applicata e tensione applicata. Un altro passo fondamentale è scegliere la corretta conduttività del fluido e la frequenza applicata. Ciò può essere ottenuto eseguendo una fase di risoluzione dei problemi della sweep parametrica. Lo sweep parametrico di questi due parametri può aiutare a decidere i valori ottimali per eventuali simulazioni future. Infine, uno studio sull'indipendenza della mesh è fondamentale anche nel contesto della scelta della giusta dimensione della mesh per eventuali simulazioni future. Si consiglia vivamente di eseguire uno studio sull'indipendenza della mesh come fase di risoluzione dei problemi prima di finalizzare qualsiasi simulazione futura.
Questo studio fornisce il primo esempio basato sulla simulazione della separazione in linea delle cellule di carcinoma mammario non metastatico (MCF-7) e delle cellule epiteliali mammarie non tumorali (MCF-10A) in base alle loro proprietà dielettriche. Riteniamo che questo design possa essere ulteriormente implementato per la selezione delle celle praticabile e non praticabile.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Commissione per l'istruzione superiore del Pakistan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMSOL | COMSOL | multiphysics simulation software |
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