Summary
Las células de cáncer de mama exhiben diferentes propiedades dieléctricas en comparación con las células epiteliales de mama no tumorales. Se ha planteado la hipótesis de que, en base a esta diferencia en las propiedades dieléctricas, las dos poblaciones pueden separarse con fines de inmunoterapia. Para apoyar esto, modelamos un dispositivo microfluídico para clasificar las células MCF-7 y MCF-10A.
Abstract
Los dispositivos dielectroforéticos son capaces de detectar y manipular células cancerosas de una manera sin etiquetas, rentable, robusta y precisa utilizando el principio de la polarización de las células cancerosas en el volumen de la muestra mediante la aplicación de un campo eléctrico externo. Este artículo demuestra cómo se puede utilizar una plataforma microfluídica para la clasificación continua de alto rendimiento de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) mediante dielectroforesis hidrodinámica (HDEP) de la mezcla celular. Al generar un campo eléctrico entre dos electrodos colocados uno al lado del otro con un espacio de tamaño micrométrico entre ellos en un chip microfluídico HDEP, las células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) pueden ser expulsadas, exhibiendo DEP negativo dentro del canal principal, mientras que las células de cáncer de mama no metastásico siguen su curso sin verse afectadas cuando se suspenden en el medio celular debido a que tienen una conductividad mayor que la conductividad de la membrana. Para demostrar este concepto, se realizaron simulaciones para diferentes valores de conductividad media y se estudió la clasificación de las células. Se realizó un estudio paramétrico y se encontró una conductividad de mezcla celular adecuada de 0,4 S/m. Al mantener fija la conductividad del medio, se estableció una frecuencia de CA adecuada de 0,8 MHz, lo que proporciona la máxima eficiencia de clasificación, variando la frecuencia del campo eléctrico. Utilizando el método demostrado, después de elegir la conductividad del medio de suspensión de mezcla celular adecuada y la frecuencia de la CA aplicada, se puede lograr la máxima eficiencia de clasificación.
Introduction
Un tumor maligno que se desarrolla dentro y alrededor del tejido mamario es una causa frecuente de cáncer de mama en mujeres de todo el mundo, causando un problema de salud crítico1. Los tumores de mama antes de la metástasis se pueden tratar mediante cirugía si se detectan en una etapa temprana, pero si se ignoran, pueden tener graves implicaciones en la vida del paciente al propagarse a sus pulmones, cerebro y huesos. Los tratamientos ofrecidos en etapas posteriores, como la radiación y las terapias basadas en productos químicos, tienen efectos secundarios graves2. Estudios recientes han reportado que un diagnóstico precoz de cáncer de mama reduce la tasa de mortalidad en un 60%3. Por lo tanto, es imperativo trabajar hacia métodos personalizados de detección temprana. Con este fin, investigadores que trabajan en diferentes campos de la ciencia y la tecnología han utilizado la microfluídica para desarrollar dispositivos para el diagnóstico precoz del cáncer de mama4. Estos métodos incluyen microcromatografía de afinidad celular, clasificadores de microcélulas activadas magnéticamente, captura y separación de células cancerosas basadas en el tamaño y dielectroforesis en chip (DEP)5,6. Estas técnicas microfluídicas relatadas en la literatura permiten la manipulación celular precisa, el monitoreo en tiempo real y la clasificación de muestras bien definidas, que sirven como un paso intermedio en muchas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas5. La integración de estos mecanismos de clasificación con microfluídica ofrece una manipulación flexible y fiable de las células diana 7,8,9,10. Una de las principales ventajas de tal integración es la capacidad de trabajar con muestras de fluido en volúmenes de nano a microlitros y también poder manipular las propiedades eléctricas del fluido de muestra. Al ajustar la conductividad del fluido en suspensión dentro de los dispositivos microfluídicos, las células biológicas se pueden clasificar en función de sus tamaños y diferencias en sus propiedades dieléctricas11,12.
Entre estas técnicas, a menudo se prefiere DEP en chip, ya que es una técnica de clasificación celular sin etiquetas que explota las propiedades eléctricas de las muestras biológicas. Se ha informado que la DEP manipula muestras biológicas como el ADN 13, el ARN 14, las proteínas 15, las bacterias16, las células sanguíneas 17, las células tumorales circulantes (CTC)18 y las células madre 19. Los dispositivos microfluídicos que emplean DEP para la clasificación de muestras biológicas han sido ampliamente descritos en la literatura20. Se han descrito dispositivos microfluídicos DEP (rDEP) basados en reservorios para clasificar células de levadura viables y no viables que protegen las células de los efectos adversos de las reacciones electroquímicas21,22. Piacentini et al. relataron un clasificador de células microfluídicas almenadas que separó los glóbulos rojos de las plaquetas con una eficiencia del 97%23. También se ha informado que los dispositivos DEP en chip con orificios asimétricos y electrodos integrados clasifican células viables y no viables24. Valero y Demierre et al. modificaron el clasificador de células microfluídicas almenadas introduciendo dos matrices de microelectrodos a ambos lados del canal25,26. Esto ayudó a enfocar las células en el centro del canal. Zeynep et al. presentaron un dispositivo microfluídico basado en DEP para separar y concentrar células de cáncer de mama MCF7 de leucocitos27. Informaron una eficiencia de extracción de células MCF7 de leucocitos entre 74% -98% con una frecuencia de 1 MHz y un voltaje aplicado que varía de 10-12 Vpp. La Tabla Suplementaria 1 representa una comparación cualitativa y cuantitativa entre los dispositivos de clasificación microfluídica basados en DEP en función de su diseño, configuración de electrodos y parámetros de funcionamiento (frecuencia y voltaje aplicados).
Más recientemente, los investigadores han tratado de medir las diferencias en el comportamiento dieléctrico de las células epiteliales de mama (MCF-10A) y las células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) dentro de un chip microfluídico28,29. Jithin et al. también caracterizaron las respuestas dieléctricas de diferentes líneas celulares de cáncer utilizando una técnica de sonda coaxial abierta con frecuencias entre 200 MHz y 13.6 GHz30. Estas diferencias en las respuestas dieléctricas de las líneas celulares MCF-7 y MCF-10A pueden explotarse para separarlas en tiempo de ejecución y pueden conducir al desarrollo de dispositivos de diagnóstico personalizados en etapa temprana.
En este artículo, simulamos la clasificación controlada de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) mediante dielectroforesis AC. La región de cambio en el campo eléctrico influye en la clasificación dentro del chip microfluídico. La técnica propuesta es fácil de implementar y permite la integración de la técnica de clasificación en varios diseños de chips microfluídicos. Se realizaron simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) para estudiar la separación de células de cáncer de mama no metastásico y células epiteliales de mama no tumorales variando la conductividad del medio fluido en el que se suspendieron las células. En estas simulaciones, se demuestra que, manteniendo la conductividad constante y cambiando la frecuencia aplicada, se puede controlar la separación de las células cancerosas y las células sanas.
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Protocol
NOTA: El protocolo aquí utiliza COMSOL, un software de simulación multifísica, para simular la clasificación controlada de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) mediante dielectroforesis AC.
1. Diseño del chip y selección de parámetros
- Abra el software multifísico y seleccione Modelo en blanco. Haga clic con el botón derecho en Definiciones globales y seleccione Parámetros. Importe los parámetros indicados en la Tabla 1 en definiciones globales como un archivo de texto o introduzca los valores individualmente.
- Seleccione Agregar componente en la pestaña de inicio y agregue un componente 2D. Haga clic con el botón derecho en geometría e importe el archivo de modelo haciendo doble clic en el archivo.
- Elija un material en blanco y utilice las propiedades del material de la Tabla 1.
- Seleccione Agregar física en la pestaña de inicio y escriba AC/DC. En el nodo AC/DC, elija corrientes eléctricas como Física bajo el subnodo de campos eléctricos y corrientes.
- Haga clic derecho en los subnodos Corriente eléctrica y elija los subnodos Conservación de corriente, Aislar y Potencial eléctrico para aislar las paredes del canal para asignar potencial a los electrodos.
- Seleccione Agregar física en la pestaña de inicio y, en el nodo Flujo de fluidos , elija Física de flujo progresivo en el subnodo de Flujo monofásico. Haga clic con el botón derecho en Flujo monofásico y represente los límites del chip como paredes utilizando el subnodo Muro .
- Haga clic derecho en Flujo monofásico y agregue dos subnodos de entrada y un subnodo de salida.
- Asigne las entradas utilizando el subnodo de entrada y use normal en Velocidad de flujo como condición de límite. Asigne la salida utilizando el subnodo de salida.
- Seleccione Agregar física en la pestaña de inicio y, en el nodo Flujo de fluidos , elija Física de flujo de seguimiento de partículas en el subnodo de Trazado de partículas.
- Haga clic con el botón derecho en el nodo Seguimiento de partículas y agregue la pared de subnodos, los subnodos de propiedad de dos partículas, dos subnodos de entrada, un subnodo de salida, dos subnodos de fuerza de dielectroforesis y un subnodo de fuerza de arrastre.
- Establezca las propiedades de partícula para las celdas MCF-7 y MCF-10A utilizando el subnodo Propiedades de partículas. Elija las propiedades de partícula de los parámetros de la sección Definición global.
- Agregue el subnodo Fuerza de arrastre para asignar la fuerza dielectroforética a ambos tipos de celdas.
- Agregue propiedades de partícula en este caso desde la sección de parámetros. Agregue el subnodo Shell para modelar células de mamíferos.
- En la pestaña de inicio, elija Add Mesh (Agregar malla ) y seleccione Fine Mesh. Elija Build Mesh en la pestaña de inicio para crear una malla.
- Desde la pestaña de inicio, haga clic en Agregar estudio para agregar tres pasos de estudio . El paso 1 del estudio es para simular una respuesta de frecuencia; utilice un subnodo de dominio de frecuencia .
- Para simular el flujo progresivo, elija un nodo Estudio estacionario . Agregue dos pasos dependientes del tiempo para simular condiciones con fuerza dielectroforética y sin fuerza dielectroforética.
- Para la condición sin dielectroforética, elija Selección de física y variables, marque la casilla titulada Modificar configuración del modelo para el paso de estudio y deshabilite el paso dielectroforético. Para condiciones dielectroforéticas, no desactivar. Guarde el archivo y presione Computar para que se ejecute la simulación.
NOTA: El chip microfluídico diseñado para la clasificación de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) tiene dos entradas separadas para el flujo de mezcla celular y para el enfoque de flujo hidrodinámico, respectivamente, con anchos de 20 μm y 40 μm, respectivamente, como se muestra en la Figura suplementaria 1 y la Figura complementaria 2. - Asigne frecuencia (f0) bajo el subnodo del dominio de frecuencia y voltaje utilizando el subnodo de potencial eléctrico a los electrodos cepilladores (295 μm de ancho) colocados a lo largo de la pared lateral superior de la cámara de clasificación. En la salida, use la condición de pared de "congelación" para visualizar las partículas clasificadas.
2. Modelo matemático y análisis computacional
- Verifique los parámetros operativos para separar las células de cáncer de mama no metastásico y las células epiteliales de mama no tumorales dentro del dispositivo microfluídico mediante la creación de un estudio de dinámica de fluidos computacional (CFD).
NOTA: Para ello se utilizó software multifísico (módulos AC/DC, Microfluídica y Seguimiento de Partículas). Las ecuaciones rectoras y los antecedentes teóricos se detallan en el Archivo Suplementario 1. El modelo se probó utilizando las propiedades dieléctricas de las células de cáncer de mama no metastásico (MCF7) y las células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) reportadas en la literatura31,32, que se resumen en la Tabla 1. - Realice las simulaciones CFD introduciendo líneas celulares de cáncer de mama no metastásico (MCF7) y epitelial de mama no tumoral (MCF-10A) con una proporción de 1:1 en la entrada de la mezcla celular.
- Inicialmente, realizar un estudio de independencia de malla para optimizar el tamaño de malla para las simulaciones33.
NOTA: Se realizó un estudio de independencia de malla para encontrar la mejor solución para los parámetros de operación. Se eligió un conjunto de cinco tamaños de malla diferentes para cuantificar el mejor tamaño de elemento posible para la convergencia de la solución. Se observó que, cuando el número total de elementos que definen una malla era 635 (malla más gruesa), como se muestra en la figura complementaria 3A, la eficiencia de clasificación estaba en su punto más bajo, con algunas de las celdas MCF7 moviéndose hacia la salida inferior, como se muestra en la figura complementaria 3B. Cuando el tamaño de la malla se aumentó a fino, el número de elementos que definen la malla también aumentó a 2.288. La eficiencia de clasificación fue máxima en este caso, con las células MCF7 y MCF-10A moviéndose hacia sus respectivas salidas. También se simuló la malla más fina, y el número de elementos que definen la malla aumentó a 3.188. La eficiencia de clasificación no se vio afectada más allá de este punto. Por lo tanto, podemos decir con seguridad que el tamaño de malla fina funciona mejor en nuestro caso. - Resuelve dos conjuntos de estudios CFD.
- Para el primer conjunto, haga clic derecho en Estudio 1 y agregue el subnodo Barrido paramétrico . Pulse el signo + para añadir la conductividad del medio fluido "σm" como variable de barrido. Realizar un estudio de barrido paramétrico para la conductividad del medio fluido σ m que oscile entre 0,01 S/m y 2,5 S/m , manteniendo constante la frecuencia aplicada, f (Hz), en un valor de 800 kHz.
- Para el segundo conjunto, realice un estudio de barrido paramétrico variando la frecuencia de CA aplicada de 100 kHz a 100 MHz manteniendo la conductividad del medio fluido, σ m, fija en 0,4 S /m para cada caso. Este valor de σm se eligió en función de los resultados del primer estudio de CFD, ya que se observó una separación máxima entre MCF-7 y MCF-10A en este valor.
- La fuerza de la fuerza de dielectroforesis (DEP), FDEP (-), ejercida sobre una partícula esférica dieléctrica en un medio conductor viene dada por la Ecuación 1T34:
FDEP
[1]
Utilice la ecuación 1 bajo el subnodo de fuerza dielectroforética. En la ecuación 1, r muestra el radio de la partícula sobre la que se aplica FDEP; K (-) se conoce como el factor Clausius-Mossotti; εm(-) muestra la permitividad dieléctrica del medio; y E(V/m) es el valor cuadrático medio del campo eléctrico. - Utilice la ecuación 2 para una partícula esférica bajo el subnodo de fuerza dielectroforética.
[2]
En la ecuación 2,
(-) muestra la permitividad compleja de la partícula sobre la que se aplica la fuerza DEP; 
(-) muestra la permitividad compleja del fluido que rodea a la partícula. La permitividad compleja y se definen de la siguiente manera35: - Utilice la ecuación 3 para una partícula esférica bajo el subnodo de fuerza dielectroforética:
[3]
En la ecuación 3, εp (-) muestra la parte real de la permitividad compleja de la partícula; εm (-) muestra la parte real de la compleja permitividad del fluido que rodea la partícula; σp (S/m) muestra la conductividad de la partícula; σ m (S/m ) muestra la conductividad del medio que rodea la partícula; y ω (Hz) es la frecuencia del campo eléctrico aplicado.
NOTA: El signo de Re(K) determina la polaridad delDEP F. Si el signo de Re(K) es negativo, entonces la partícula experimenta una fuerza dielectroforética negativa (nDEP); contrariamente a esto, si el signo de Re(K) es positivo, implica una fuerza dielectroforética positiva (pDEP). Para el factor Clausius-Mossotti (K), la variación se encuentra dentro del rango de -1 a 1.
- Inicialmente, realizar un estudio de independencia de malla para optimizar el tamaño de malla para las simulaciones33.
- Utilice una forma modificada de la Ecuación 3 para modelar células biológicas como las células de mamíferos, que son más complejas y tienen una estructura de múltiples capas.
K (
) = 
[4]
En la Ecuación 4, (-) incorpora tanto la permitividad compleja del citoplasma, (-), como la permitividad compleja de la membrana celular,
(-), y se da de la siguiente manera:36 - Usa la ecuación 5 para resolver ""
:
[5]
En la ecuación 5, R cyto (m) y Rmem (m) muestran el radio del citoplasma celular y la membrana celular, respectivamente. - Luego, use la Ecuación 4 para trazar Re(K) como una función del campo eléctrico aplicado tanto para el cáncer como para las células sanas. Calcule la parte real del factor Clausius-Mossotti (CM), Re(K), para cuantificar la fuerza dielectroforética (DEP) que experimenta la partícula.
- Haga clic con el botón secundario en el nodo Resultados, agregue el subnodo Evaluación de partículas y, en la sección de expresión, escriba fpt.deff1.K para trazar el factor CM para la partícula 1 y fpt.deff2.K para la partícula 2.
NOTA: Todos los pasos del protocolo enumerados en el texto principal se pueden ver en el video del protocolo (Video 1).
[1]
[2]
(-) muestra la permitividad compleja de la partícula sobre la que se aplica la fuerza DEP; 
(-) muestra la permitividad compleja del fluido que rodea a la partícula. La permitividad 
[3]
) = 
[4]
(-), y se da de la siguiente manera:36
:
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Representative Results
Investigar los parámetros operativos óptimos para la clasificación eficaz basada en DEP de células epiteliales de mama no metastásicas (MCF-7) y no tumorales (MCF-10A)
Para lograr una separación exitosa de las células epiteliales de mama no metastásicas (MCF-7) y no tumorales (MCF-10A) con propiedades dieléctricas divergentes cuando se someten a dielectroforesis, sus factores K deben ser distintos manteniendo fija la frecuencia aplicada37,38. La cuantificación de las respuestas dieléctricas de células de cáncer de mama no metastásico y células epiteliales de mama no tumorales bajo un campo eléctrico aplicado y el cálculo del factor "K" en función de la frecuencia aplicada para ambas líneas celulares se lograron utilizando la Ecuación 4. Los resultados mostrados en la Figura 1 se generaron manteniendo fijos todos los parámetros dieléctricos de las células de cáncer de mama no metastásico y las células epiteliales de mama no tumorales, mientras que la frecuencia aplicada del campo eléctrico varió para tres valores diferentes de conductividad de los medios de suspensión celular, σm.
Como se muestra en la Figura 1, en cada caso, el valor de K está dentro del rango de -1 a 1, en línea con estudios previos39,40. No obstante, la gráfica de real(K) versus la frecuencia cambia tanto para las células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) como para las células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) según el valor de la conductividad media (σm). Los resultados mostrados en la Figura 1 están de acuerdo con un estudio reciente en el que se cuantificó el efecto de σm sobre Re(K) para células MCF-741.
Figura 1: Factor Clausius-Mossotti. La parte real del factor Clausius-Mossotti, K, trazada en función de la frecuencia, para células MCF-7 y MCF-10A suspendidas en un medio caracterizado por una conductividad de (A) σ m = 0,01 S/m ; (B) σ m = 0,4 S/m ; (C) σ m = 1.2 S/m . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 1 se trazó utilizando la herramienta MyDEP para tres valores diferentes de σm, manteniendo y variando la frecuencia de CA aplicada de 100 kHz a 100MHz. Inicialmente, se eligió que el σ m fuera de 0,01 S/m, y la frecuencia de CA aplicada varió entre 100 kHz y 100 MHz, como se muestra en la Figura 1A. A una frecuencia AC aplicada de 100 kHz, el valor de Re(K) para las células MCF-10A resultó ser 0.82, lo que significa que experimentan dielectroforesis positiva (pDEP) y deben moverse hacia un área de alta intensidad de campo eléctrico. Del mismo modo, las células MCF-7 a 100 kHz también experimentan pDEP con un valor de Re(K) de 0,76. La frecuencia se incrementó en pasos de 100 kHz, y el valor del factor CM para ambos tipos de células se mantuvo en el lado positivo en todo el espectro de frecuencias aplicadas. Al mantener constantes todos los demás parámetros de funcionamiento, la conductividad del medio se incrementó a 0,4 S/m para trazar el Re(K), como se muestra en la Figura 1B. MCF-10A y MCF-7 demostraron un comportamiento negativo de dielectroforesis (nDEP) con valores de Re(k) de -0,46 y -0,31, respectivamente, a 100 kHz. A medida que la frecuencia se incrementó a 0,8 MHz, la respuesta DEP de las células MCF-10 cambió, y experimentaron pDEP con un valor de Re(K) de 0,014. Este comportamiento de las células MCF-7 es causado por la polarización de Maxwell-Wagner en la interfaz entre la membrana celular y el medio de suspensión celular circundante39,41. La frecuencia en la que se observa este cambio en la respuesta DEP se conoce como frecuencia cruzada, como se muestra en la figura 1A42,22. Las células MCF-7, en este caso, experimentaron nDEP. La frecuencia se incrementó aún más hasta 100 MHz, pero ambos tipos de células no cambiaron su comportamiento DEP y, por lo tanto, no se vieron afectados por las variaciones en la frecuencia del campo eléctrico aplicado. Cuando la conductividad se incrementó a 1,2 S/m, las células MCF-10A y MCF-7 experimentaron nDEP a 100 kHz. Los valores de Re(k) para las células MCF-10A y MCF-7, en este caso, fueron -0,49 y -0,43, respectivamente, como se muestra en la Figura 1C. A medida que la frecuencia se incrementó a 0,8 MHz, la respuesta DEP de las células no cambió, ya que siguieron experimentando nDEP. El comportamiento DEP negativo de las líneas celulares MCF-7 y MCF-10A a valores altos de conductividad del medio de suspensión celular está de acuerdo con estudios previamente reportados 39,43,44. El comportamiento DEP de las células a frecuencias superiores a la primera frecuencia de cruce se rige por la interacción entre la conductividad citoplasmática y la solución de suspensión45,46. Por otro lado, a frecuencias inferiores a la primera frecuencia cruzada, la respuesta dieléctrica de las células está determinada por la interacción entre la conductividad de la membrana celular y el medio de suspensión celular.
Sobre la base de los resultados mostrados en la Figura 1, se configuraron simulaciones COMSOL. Inicialmente, la intensidad del campo eléctrico se cuantificó utilizando este software de simulación, como se muestra en la Figura 2. Se puede ver que los máximos de la magnitud del campo eléctrico total generado por dos electrodos colocados uno al lado del otro en la pared superior del canal de clasificación se encuentran cerca de los bordes del electrodo. Las flechas muestran la dirección del campo eléctrico.
Figura 2: Intensidad de campo eléctrico. El campo eléctrico generado por dos electrodos colocados uno al lado del otro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las simulaciones para clasificar las celdas MCF-7 y MCF-10A se configuraron manteniendo la frecuencia de CA aplicada fija en 0,8 MHz (frecuencia cruzada) y cambiando el valor de σm. Se eligieron tres valores para σm de acuerdo con los gráficos Re(K) que se muestran en la Figura 1. Inicialmente, cuando σ m era 0.01 S /m, ambos tipos de células experimentaron DEP positivo, se movieron hacia la región de alta intensidad de campo eléctrico y salieron de la salida superior, como se muestra en la Figura 3A. Las conductividades citoplasmáticas σcitoplasma para ambas líneas celulares fueron mayores que la conductividad del medio σm en este caso particular, obligando así a ambas líneas celulares a acercarse a los electrodos en la parte superior del canal microfluídico47. La respuesta DEP de las células MCF-10A cambió, y experimentaron DEP negativo, cuando el σ m se incrementó a 0,4 S /m con la frecuencia aplicada fijada en 0,8 MHz. La Figura 3B muestra que las células MCF-10A se mueven a la salida superior, mientras que las células MCF-7 se mueven a la salida inferior. La razón de esta separación es que las células MCF-7 están más polarizadas en comparación con MCF-10A, ya que su conductividad citoplasmática σcitoplasma es mayor que la conductividad media σm, como se muestra en el video de clasificación celular (Video 2).
Figura 3: Frecuencia fija de clasificación celular. Simulación de MCF-7 y separación de células sanas a lo largo del tiempo mediante DEP en el dispositivo microfluídico diseñado. MCF-7 y separación de células sanas a tres valores diferentes de conductividad del medio suspendido: (A) 0,01 S/m; (B) 0.4 S/m; (C) 1.2 S/m. En cada caso, la frecuencia aplicada fue de 0,8 MHz, el voltaje aplicado Vpp fue de 1,5 V y la velocidad de flujo en la entrada de inyección fue de 184 μm/s y 853 μm/s en la entrada de enfoque de flujo. En la simulación, las células MCF-7 y MCF-10A se representan con círculos azules y rojos, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A medida que la conductividad del medio se incrementó aún más a 1,2 S / m, tanto las células MCF-7 como las MCF-10A se volvieron menos polarizables que el medio que las rodeaba debido a la menor conductividad citoplasmática σ los valorescitoplasmáticos . En consecuencia, experimentaron nDEP y se alejaron de las regiones de alto campo eléctrico, como se muestra en la Figura 3C.
Estos resultados demuestran que la conductividad del medio juega un papel importante en la separación de las células de cáncer de mama no metastásico MCF-7 de las células epiteliales de mama no tumorales MCF-10A basadas en DEP. Además, como se muestra en la Figura 3B, para lograr una separación efectiva, la conductividad del medio debe ajustarse de manera que las células experimenten pDEP o nDEP, en función de sus respectivas propiedades dieléctricas.
Finalmente, se investigó el efecto de la fuerza dielectroforética aplicada, F DEP, en el comportamiento de clasificación de ambas líneas celulares manteniendo constante la conductividad del medio en 0,4 S/m. FDEP es una función de la frecuencia del campo eléctrico aplicado48,49, y a medida que cambia la frecuencia del campo eléctrico aplicado, las células cambian su comportamiento DEP. Las simulaciones se iniciaron ajustando la frecuencia a 100 kHz, y se observó que tanto las líneas celulares MCF-10A como MCF-7 experimentaron nDEP y se alejaron de la región de alto campo eléctrico hacia la salida inferior, como se muestra en la Figura 4A. A medida que aumentaba la frecuencia, el comportamiento DEP de ambas líneas celulares se mantuvo sin cambios hasta 0,8 MHz, cuando MCF-10A cambió su comportamiento DEP y cruzó a la región pDEP. Este es el punto con la separación máxima entre las células de respuesta DEP bajo investigación y la máxima eficiencia de clasificación, como se muestra en la Figura 4B. Cuando la frecuencia se incrementó a 100 MHz, se observó que ambas líneas celulares experimentaron pDEP y se movieron hacia la salida superior, como se muestra en la Figura 4C. A frecuencias más altas por encima de 0,8 MHz, las células comenzaron a inmovilizarse en las paredes del canal. La inmovilización de células en las paredes del canal puede conducir a la pérdida de células durante el proceso de clasificación, lo que, a su vez, tiene un efecto en la eficiencia general del dispositivo. El efecto de estas fuerzas también puede causar una pérdida grave en la viabilidad celular si se expone durante un período de tiempo más largo. Yang et al. cuantificaron el efecto de las fuerzas DEP en una línea celular de Listeria monocytogenes exponiéndolas a un campo eléctrico de CA de 5 MHz y un voltaje pico a pico de 20 VPP50. Sus resultados indicaron una pérdida celular viable del 56% -89% cuando se mantuvo bajo el efecto de la fuerza DEP durante 4 h. Del mismo modo, también se ha informado que las fuerzas DEP tienen un efecto sobre el movimiento de las células cuando están suspendidas en un medio polarizable y se han utilizado para inmovilizar las células. Ettehad et al. relataron un dispositivo microfluídico con electrodos interdigitados (IDEs) que utilizó una frecuencia AC de 1 MHz y 20 VPP para inmovilizar las células de levadura51. Demostraron que la inmovilización de sus células de levadura dependía de la relación de aspecto del espaciado entre sus IDE y el voltaje aplicado. El aumento en la relación de aspecto del espaciado IDE resultó en una fuerte disminución en la inmovilización celular, y para inmovilizar las células en dispositivos con mayor espaciado entre IDE, se requirió un mayorV PP. La inmovilización celular es una aplicación deseada cuando se requiere que las células sean atrapadas para su análisis o crecimiento. Los resultados anteriores mostraron claramente que la frecuencia y el voltaje de CA aplicados tienen un efecto sobre la inmovilización celular. En aplicaciones donde la clasificación o cribado de alto rendimiento es el resultado deseado, la inmovilización celular resulta en pérdida celular y reduce la eficiencia de salida del dispositivo.
Para cuantificar el efecto de la frecuencia y el voltaje aplicados en la inmovilización celular, se ejecutó un conjunto de simulaciones desde el rango de frecuencia de kilohercios a megahercios a un voltaje aplicado fijo de 1.5 VPP. Los resultados se muestran en la figura suplementaria S4. Los resultados revelaron que, a frecuencias en el rango de kHz, la inmovilización de las células en las paredes del canal era mucho menor en comparación con las frecuencias en el rango de MHz. Como la fuerza DEP es directamente proporcional a la frecuencia AC aplicada, podemos deducir que, a alta fuerza DEP, la inmovilización de las células es más pronunciada. Para este dispositivo microfluídico, habrá una pérdida celular durante la clasificación de las células MCF7 y MCF-10A, ya que se requiere operar a frecuencias superiores a 0,8 MHz. El efecto de la distribución aleatoria de las células en la entrada se investigó más a fondo eligiendo una condición de límite de distribución aleatoria. En este caso se observaron más interacciones entre la pared del canal celular, como se muestra en la Figura complementaria 5.
Figura 4: Clasificación celular con conductividad de medio fijo. Efecto de la frecuencia del campo AC aplicado sobre la separación de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) en el dispositivo microfluídico simulado. (A) f= 100 KHz; B) f= 0,8 MHz; (C) f= 100 MHz. La conductividad del medio fluido se fijó en σ m = 0,4 S/m . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Propiedades dieléctricas para simulación | εcitoplasma | σcitoplasma (S/m) |
membrana ε | membrana σ (S/m) |
| MCF-7 | 50 | 0.8 | 11 | 6× 10-6 |
| MCF-10A | 100 | 0.1 | 11 | 6 |
| f0 | 800 [kHz] | 1,2 x 103 Hz | Frecuencia del campo eléctrico |
| sigma_f | 0,4 [S/m] | 0,8 S/m | Conductividad del medio fluido |
| epsilon_f | 80 | 80 | Permitividad relativa del fluido |
| rho_f | 1000 [kg/m3] | 1000 kg/m³ | Densidad del fluido |
| mu_f | 1 x 10-3 [Pa·s] | 0,001 Pa·s | Viscosidad fluidodinámica |
| rho_p | 1050 [kg/m3] | 1050 kg/m³ | Densidad de partículas |
| DP1 | 17 [μm] | 1,7 x 10-5 m | Diámetro de partícula |
| dp2 | 16 [mmm] | 1,6 x 10-5 m | Diámetro de partícula |
| sigma_p1 | 0,8 [S/m] | 0,6 S/m | Conductividad de partículas |
| sigma_p2 | 0,1 [S/m] | 1,1 S/m | Conductividad de partículas |
| epsilon_p1 | 50 | 55 | Permitividad relativa saludable |
| epsilon_p2 | 100 | 65 | Permitividad relativa al cáncer |
| sigma_s1 | 6 x 10-6 [S/m] | 6 x 10-6 S/m | Conductividad eléctrica de la carcasa |
| sigma_s2 | 6 [S/m] | 6 S/m | Conductividad eléctrica de la carcasa |
| epsilon_s1 | 11 | 11 | Permitividad relativa de la cáscara |
| epsilon_s2 | 11 | 11 | Permitividad relativa de la cáscara |
| th_s1 | 7 [nm] | 7 x 10-9 m | Grosor de la carcasa |
| th_s2 | 7 [nm] | 7 x 10-9 m | Grosor de la carcasa |
Tabla 1: Parámetros de funcionamiento. Propiedades dieléctricas de MCF-7 y MCF-10A
Video 1: Un video que muestra los pasos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Video de clasificación de celdas. Haga clic aquí para descargar este video.
Archivo complementario 1: Las ecuaciones rectoras y los antecedentes teóricos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 1: Diseño y parámetros del dispositivo. Diseño del dispositivo microfluídico que resalta diferentes partes del dispositivo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Espacio entre electrodos. El espacio entre dos electrodos de parche. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Estudio de independencia de malla. Un estudio de independencia de malla que representa el efecto de diferentes tamaños de malla en la clasificación de células MCF-7 y MCF-10A. (A) Los diferentes tamaños de malla para el dispositivo microfluídico, que representan el número de elementos para cada malla. El número de elementos que constituyen la malla aumenta de malla más gruesa a malla más fina. (B) La clasificación de celdas MCF7 y MCF-10A en diferentes tamaños de malla manteniendo constantes todos los demás parámetros de funcionamiento. Los tamaños de malla finos y más finos producen los mejores resultados para la clasificación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4: Prueba de inmovilización celular y distribución aleatoria. Simulaciones realizadas para frecuencias entre 10 KHz y 6 MHz para validar el efecto de la fuerza DEP en la inmovilización celular. (A) A f = 10 kHz, no se observa clasificación ni inmovilización celular. (B) A f = 200 kHz, no se observa clasificación ni inmovilización celular. (C) A f = 0,8 MHz, se observa clasificación e inmovilización celular en las paredes de salida. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 5: Distribución aleatoria. Partículas distribuidas aleatoriamente en la entrada del chip. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 1: Comparación de diferentes dispositivos de clasificación microfluídica basados en DEP. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Los dispositivos microfluídicos han sido reportados previamente para cultivo celular, captura y clasificación 47,52,53. La fabricación de estos dispositivos en la sala limpia es un proceso costoso, y es imperativo cuantificar la salida y la eficiencia de un dispositivo microfluídico propuesto a través de simulaciones CFD. Este estudio presenta el diseño y simulaciones de un dispositivo microfluídico AC-dielectroforético para la separación continua de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) en función de sus propiedades dieléctricas23.
El dispositivo se opera aplicando un campo eléctrico de CA a través de un conjunto de dos microelectrodos integrados en un solo canal de clasificación microfluídica para separar las celdas MCF-7 y MCF-10A en función de sus propiedades dieléctricas. La eficacia de separación del dispositivo se simuló computacionalmente para diferentes valores de conductividad media y para un rango de frecuencias de CA aplicadas. Se encontró que los valores óptimos de frecuencia de CA y conductividad de medios aplicados eran 0.8 MHz y 0.4 S / m, respectivamente. Se utilizó un bajo voltaje de 1,5 Vp-p en todas las simulaciones. El rango de frecuencia de CA aplicado y el voltaje aplicado son comparables a la literatura previamente reportada23,47. A frecuencias superiores a 1 MHz, se observó el efecto de inmovilización celular, que debe tenerse en cuenta para futuros diseños y fabricación de dispositivos. Enumeramos esta inmovilización celular como una limitación de nuestro método en el contexto de las aplicaciones de clasificación celular. Creemos que la inmovilización celular a frecuencias más altas puede ser utilizada para la diferenciación celular como se informó previamente en la literatura54, dando a este diseño propuesto una nueva dirección. Esta aplicación sería de gran interés para los investigadores en biología sintética.
Los pasos críticos para la correcta implementación de este protocolo incluyen la elección de nodos y subnodos físicos adecuados (pasos 1.5-1.9). Estos pasos forman la base de todo el protocolo de simulación y ayudan a elegir los valores de los parámetros para cada tipo de celda, fuerza aplicada y voltaje aplicado. Otro paso crítico es elegir la conductividad fluida del medio fluido y la frecuencia aplicada correctas. Esto se puede lograr ejecutando un paso de solución de problemas del barrido paramétrico. El barrido paramétrico de estos dos parámetros puede ayudar a decidir los valores óptimos para cualquier simulación futura. Por último, un estudio de independencia de malla también es fundamental en el contexto de la elección del tamaño de malla adecuado para cualquier simulación futura. Se recomienda encarecidamente que se realice un estudio de independencia de malla como paso de solución de problemas antes de finalizar cualquier simulación futura.
Este estudio proporciona el primer ejemplo basado en simulación de separación en línea de células de cáncer de mama no metastásico (MCF-7) y células epiteliales de mama no tumorales (MCF-10A) en función de sus propiedades dieléctricas. Creemos que este diseño se puede implementar aún más para la clasificación celular viable y no viable.
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Disclosures
Los autores declaran no tener posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Comisión de Educación Superior de Pakistán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMSOL | COMSOL | multiphysics simulation software |
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