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Engineering

Mikrofluidisches Gerät zur Trennung von nicht-metastasierten (MCF-7) und nicht-tumoralen (MCF-10A) Brustkrebszellen mittels AC-Dielektrophorese

Published: August 11, 2022 doi: 10.3791/63850
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5
1Department of Biomedical Engineering, Foundation University Islamabad, 2College of Medical Technology, The Islamic University Najaf, 3Faculty of Mechanical Engineering, University of Tabriz, 4Department of Engineering Mathematics, University of Bristol, 5School of Life Sciences, University of Warwick

Summary

Brustkrebszellen zeigen unterschiedliche dielektrische Eigenschaften im Vergleich zu Nicht-Tumor-Brustepithelzellen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass aufgrund dieses Unterschieds in den dielektrischen Eigenschaften die beiden Populationen für Immuntherapiezwecke getrennt werden können. Um dies zu unterstützen, modellieren wir ein mikrofluidisches Gerät zur Sortierung von MCF-7- und MCF-10A-Zellen.

Abstract

Dielektrophoretische Geräte sind in der Lage, Krebszellen markierungsfrei, kostengünstig, robust und genau nach dem Prinzip der Polarisation der Krebszellen im Probenvolumen durch Anlegen eines externen elektrischen Feldes zu detektieren und zu manipulieren. Dieser Artikel zeigt, wie eine mikrofluidische Plattform für die kontinuierliche Hochdurchsatzsortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) unter Verwendung hydrodynamischer Dielektrophorese (HDEP) aus der Zellmischung verwendet werden kann. Durch die Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen zwei Elektroden, die nebeneinander mit einem mikrometergroßen Spalt zwischen ihnen in einem mikrofluidischen HDEP-Chip angeordnet sind, können Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) weggedrückt werden, die im Hauptkanal eine negative DEP aufweisen, während die nicht-metastasierten Brustkrebszellen ihrem Verlauf unbeeinflusst folgen, wenn sie im Zellmedium suspendiert sind, da die Leitfähigkeit höher ist als die Membranleitfähigkeit. Um dieses Konzept zu demonstrieren, wurden Simulationen für verschiedene Werte der Medienleitfähigkeit durchgeführt und die Sortierung von Zellen untersucht. Eine parametrische Studie wurde durchgeführt, und eine geeignete Zellmischungsleitfähigkeit wurde mit 0,4 S / m gefunden. Durch Festhalten der Medienleitfähigkeit wurde eine adäquate Wechselstromfrequenz von 0,8 MHz hergestellt, die durch Variation der elektrischen Feldfrequenz eine maximale Sortiereffizienz ergibt. Unter Verwendung des demonstrierten Verfahrens kann nach Auswahl des geeigneten Zellmischsuspensionsmediums Leitfähigkeit und Frequenz des angelegten AC eine maximale Sortiereffizienz erreicht werden.

Introduction

Ein bösartiger Tumor, der sich in und um das Brustgewebe entwickelt, ist eine häufige Ursache für Brustkrebs bei Frauen weltweit und verursacht ein kritisches Gesundheitsproblem1. Brusttumoren vor Metastasen können durch eine Operation behandelt werden, wenn sie in einem frühen Stadium erkannt werden, aber wenn sie ignoriert werden, können sie schwerwiegende Auswirkungen auf das Leben des Patienten haben, indem sie sich auf Lunge, Gehirn und Knochen ausbreiten. Die Behandlungen, die in späteren Stadien angeboten werden, wie Bestrahlung und chemische Therapien, haben schwere Nebenwirkungen2. Neuere Studien haben berichtet, dass eine frühzeitige Diagnose von Brustkrebs die Sterblichkeitsrate um 60% senkt3. Daher ist es unerlässlich, auf personalisierte Früherkennungsmethoden hinzuarbeiten. Zu diesem Zweck haben Forscher aus verschiedenen Bereichen der Wissenschaft und Technologie die Mikrofluidik genutzt, um Geräte zur Früherkennung von Brustkrebs zu entwickeln4. Zu diesen Methoden gehören Zellaffinitätsmikrochromatographie, magnetisch aktivierte Mikrozellsortierer, größenbasierte Krebszellerfassung und -trennung sowie On-Chip-Dielektrophorese (DEP)5,6. Diese in der Literatur beschriebenen mikrofluidischen Techniken ermöglichen eine präzise Zellmanipulation, Echtzeitüberwachung und Sortierung genau definierter Proben, die als Zwischenschritt in vielen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen dienen5. Die Integration dieser Sortiermechanismen mit der Mikrofluidik ermöglicht eine flexible und zuverlässige Manipulation der Zielzellen 7,8,9,10. Einer der Hauptvorteile einer solchen Integration ist die Möglichkeit, mit flüssigen Proben in Nano- bis Mikrolitervolumina zu arbeiten und auch die elektrischen Eigenschaften der Probenflüssigkeit manipulieren zu können. Durch Einstellung der Leitfähigkeit der suspendierenden Flüssigkeit in mikrofluidischen Vorrichtungen können die biologischen Zellen nach ihrer Größe und Unterschieden in ihren dielektrischen Eigenschaften sortiert werden11,12.

Unter diesen Techniken wird häufig die On-Chip-DEP bevorzugt, da es sich um eine markierungsfreie Zellsortiertechnik handelt, die die elektrischen Eigenschaften der biologischen Proben nutzt. Es wurde berichtet, dass DEP Bioproben wie DNA 13, RNA 14, Proteine 15, Bakterien16, Blutzellen 17, zirkulierende Tumorzellen (CTCs)18 und Stammzellen 19 manipuliert. Mikrofluidische Geräte, die DEP zur Sortierung biologischer Proben verwenden, wurden in der Literaturausführlich berichtet 20. Es wurde über reservoirbasierte DEP-Mikrofluidik-Geräte (rDEP) zur Sortierung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hefezellen berichtet, die die Zellen vor den nachteiligen Auswirkungen elektrochemischer Reaktionen schützen21,22. Piacentini et al. berichteten über einen zinnenförmigen mikrofluidischen Zellsortierer, der rote Blutkörperchen von Blutplättchen mit einer Effizienz von 97% trennte23. Es wurde auch berichtet, dass On-Chip-DEP-Geräte mit asymmetrischen Öffnungen und eingebetteten Elektroden lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen sortieren24. Valero und Demierre et al. modifizierten den kastellierten mikrofluidischen Zellsortierer, indem sie zwei Arrays von Mikroelektroden auf beiden Seiten des Kanals25,26 einführten. Dies half bei der Fokussierung der Zellen in der Mitte des Kanals. Zeynep et al. präsentierten ein DEP-basiertes mikrofluidisches Gerät zur Trennung und Konzentration von MCF7-Brustkrebszellen aus Leukozyten27. Sie berichteten über eine Effizienz bei der Extraktion von MCF7-Zellen aus Leukozyten zwischen 74% -98% mit einer Frequenz von 1 MHz und einer angelegten Spannung von 10-12 Vpp. Die ergänzende Tabelle 1 stellt einen qualitativen und quantitativen Vergleich zwischen den DEP-basierten mikrofluidischen Sortiergeräten anhand ihres Designs, ihrer Elektrodenkonfiguration und ihrer Betriebsparameter (angelegte Frequenz und Spannung) dar.

In jüngerer Zeit haben Forscher versucht, die Unterschiede im dielektrischen Verhalten von Brustepithelzellen (MCF-10A) und nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) in einem mikrofluidischen Chip28,29 zu messen. Jithin et al. charakterisierten auch die dielektrischen Reaktionen verschiedener Krebszelllinien mit einer offenen koaxialen Sondentechnik mit Frequenzen zwischen 200 MHz und 13,6 GHz30. Diese Unterschiede in den dielektrischen Antworten von MCF-7- und MCF-10A-Zelllinien können ausgenutzt werden, um sie in der Laufzeit zu trennen und zur Entwicklung personalisierter Frühdiagnosegeräte zu führen.

In diesem Artikel simulieren wir die kontrollierte Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A) mittels AC-Dielektrophorese. Der Bereich der Änderung des elektrischen Feldes beeinflusst die Sortierung innerhalb des mikrofluidischen Chips. Die vorgeschlagene Technik ist einfach zu implementieren und ermöglicht die Integration der Sortiertechnik in verschiedene mikrofluidische Chiplayouts. Computational Fluid Dynamics (CFD) Simulationen wurden durchgeführt, um die Trennung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen zu untersuchen, indem die Leitfähigkeit des flüssigen Mediums, in dem Zellen suspendiert waren, variiert wurde. In diesen Simulationen wird gezeigt, dass durch konstante Leitfähigkeit und durch Veränderung der angelegten Frequenz die Trennung von Krebszellen und gesunden Zellen gesteuert werden kann.

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Protocol

HINWEIS: Das Protokoll hier verwendet COMSOL, eine Multiphysik-Simulationssoftware, um die kontrollierte Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) mittels AC-Dielektrophorese zu simulieren.

1. Chipdesign und Parameterauswahl

  1. Öffnen Sie die Multiphysik-Software und wählen Sie Leeres Modell. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die globalen Definitionen und wählen Sie Parameter. Importieren Sie die in Tabelle 1 angegebenen Parameter als Textdatei in globale Definitionen oder geben Sie die Werte einzeln ein.
  2. Wählen Sie auf der Registerkarte Start die Option Komponente hinzufügen und fügen Sie eine 2D-Komponente hinzu. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Geometrie und importieren Sie die Modelldatei durch Doppelklick auf die Datei.
  3. Wählen Sie ein leeres Material aus, und verwenden Sie die Materialeigenschaften aus Tabelle 1.
  4. Wählen Sie auf der Registerkarte Start die Option Physik hinzufügen aus, und geben Sie AC/DC ein. Wählen Sie unter dem AC/DC-Knoten elektrische Ströme als Physik unter dem Unterknoten Elektrische Felder und Ströme aus.
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den elektrischen Strom und wählen Sie die Unterknoten Stromerhaltung, Isolierung und elektrisches Potential, um die Kanalwände zu isolieren, um den Elektroden ein Potential zuzuweisen.
  6. Wählen Sie auf der Registerkarte Start die Option Physik hinzufügen aus, und wählen Sie unter dem Knoten Fluid Flow die Option Creeping Flow Physics unter dem Unterknoten Single-Phase Flow aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Single-Phase Flow und rendern Sie die Chipgrenzen mithilfe des Unterknotens Wall als Wände.
  7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Single-Phase Flow und fügen Sie zwei Einlassunterknoten und einen Ausgangsunterknoten hinzu.
  8. Weisen Sie die Einlässe mithilfe des Einlassunterknotens zu und verwenden Sie die Normale in Strömungsgeschwindigkeit als Randbedingung. Weisen Sie den Ausgang über den Ausgangsunterknoten zu.
  9. Wählen Sie auf der Registerkarte Start die Option Physik hinzufügen aus, und wählen Sie unter dem Knoten Fluid Flow unter dem Unterknoten Partikelverfolgung die Option Particle Tracing Flow Physics aus.
  10. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Partikelverfolgungsknoten und fügen Sie die Unterknotenwand, Unterknoten mit zwei Partikeleigenschaften, zwei Einlassunterknoten, einen Auslassunterknoten, zwei Unterknoten der Dielektrophoresekraft und einen Unterknoten für die Widerstandskraft hinzu.
    1. Legen Sie Partikeleigenschaften für MCF-7- und MCF-10A-Zellen mithilfe des Unterknotens Partikeleigenschaften fest. Wählen Sie die Partikeleigenschaften aus den Parametern im Abschnitt Globale Definition aus.
    2. Fügen Sie den Unterknoten Drag Force hinzu, um beiden Zelltypen die dielektrophoretische Kraft zuzuweisen.
    3. Fügen Sie in diesem Fall Partikeleigenschaften aus dem Parameterabschnitt hinzu. Fügen Sie den Unterknoten Shell hinzu, um Säugetierzellen zu modellieren.
  11. Wählen Sie auf der Registerkarte Start die Option Netz hinzufügen und dann Feinnetz aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Start die Option Netz erstellen, um ein Netz zu erstellen.
  12. Klicken Sie auf der Registerkarte Start auf Studie hinzufügen, um drei Studienschritte hinzuzufügen. Studienschritt 1 dient der Simulation eines Frequenzgangs; Verwenden Sie einen Frequenzdomänen-Unterknoten.
    1. Um die kriechende Strömung zu simulieren, wählen Sie einen stationären Studienknoten aus. Fügen Sie zwei zeitabhängige Schritte hinzu, um Bedingungen mit dielektrophoretischer Kraft und ohne dielektrophoretische Kraft zu simulieren.
    2. Wählen Sie für die Bedingung no dielectrophoretic (keine dielektrophoretische Bedingung) die Option Physics and Variables Selection (Physik- und Variablenauswahl), aktivieren Sie das Kontrollkästchen Modellkonfiguration für den Studienschritt ändern, und deaktivieren Sie den dielektrophoretischen Schritt. Bei dielektrophoretischen Bedingungen nicht deaktivieren. Speichern Sie die Datei und drücken Sie Berechnen , damit die Simulation ausgeführt wird.
      HINWEIS: Der mikrofluidische Chip, der für die Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) ausgelegt ist, verfügt über zwei separate Einlässe für den Zellmischungsfluss bzw. für die hydrodynamische Strömungsfokussierung mit Breiten von 20 μm bzw. 40 μm, wie in der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt.
    3. Weisen Sie den Hobelelektroden (295 μm Breite), die entlang der oberen Seitenwand der Sortierkammer angebracht sind, die Frequenz (f0) unter dem Unterknoten Frequenzbereich und die Spannung unter Verwendung des Unterknotens " Elektrisches Potential " zu. Verwenden Sie am Auslass die Wandbedingung "Freeze", um die sortierten Partikel zu visualisieren.

2. Mathematische Modell- und Computeranalyse

  1. Überprüfen Sie die Betriebsparameter für die Trennung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen innerhalb des mikrofluidischen Geräts, indem Sie eine CFD-Studie (Computational Fluid Dynamics) einrichten.
    HINWEIS: Zu diesem Zweck wurde Multiphysik-Software (AC / DC-, Mikrofluidik- und Partikelverfolgungsmodule) verwendet. Die maßgeblichen Gleichungen und der theoretische Hintergrund sind im Zusatzdossier 1 ausführlich wiedergegeben. Das Modell wurde unter Verwendung der dielektrischen Eigenschaften von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A) getestet, die in Literatur31,32 berichtet werden und in Tabelle 1 zusammengefasst sind.
  2. Führen Sie die CFD-Simulationen durch, indem Sie nicht-metastasierende Brustkrebs- (MCF7) und nicht-tumor-Brustepithelzelllinien (MCF-10A) mit einem Verhältnis von 1:1 am Zellmischeinlass einführen.
    1. Führen Sie zunächst eine Netzunabhängigkeitsstudie durch, um die Maschenweite für die Simulationenzu optimieren 33.
      HINWEIS: Es wurde eine Netzunabhängigkeitsstudie durchgeführt, um die beste Lösung für die Betriebsparameter zu finden. Ein Satz von fünf verschiedenen Maschenweiten wurde ausgewählt, um die bestmögliche Elementgröße für die Konvergenz der Lösung zu quantifizieren. Es wurde beobachtet, dass, wenn die Gesamtzahl der Elemente, die ein Netz definieren, 635 (gröbere Maschen) betrug, wie in der ergänzenden Abbildung 3A gezeigt, die Sortiereffizienz am niedrigsten war, wobei sich einige der MCF7-Zellen zum unteren Auslass bewegten, wie in der ergänzenden Abbildung 3B dargestellt. Wenn die Maschenweite auf fein erhöht wurde, erhöhte sich auch die Anzahl der Elemente, die das Netz definieren, auf 2.288. Die Sortiereffizienz war in diesem Fall maximal, wobei sich sowohl MCF7- als auch MCF-10A-Zellen in Richtung ihrer jeweiligen Ausgänge bewegten. Das feinere Netz wurde ebenfalls simuliert, wobei die Anzahl der Elemente, die das Netz definieren, auf 3.188 erhöht wurde. Die Sortiereffizienz blieb über diesen Zeitpunkt hinaus unbeeinflusst. Daher können wir mit Sicherheit sagen, dass die feine Maschenweite in unserem Fall am besten funktioniert.
    2. Lösen Sie zwei Sätze von CFD-Studien.
    3. Klicken Sie für den ersten Satz mit der rechten Maustaste auf Studie 1 und fügen Sie den Unterknoten Parametric Sweep hinzu. Drücken Sie das + -Zeichen, um die Leitfähigkeit des Flüssigkeitsmediums "σm" als Sweep-Variable hinzuzufügen. Führen Sie eine parametrische Sweep-Studie für die Leitfähigkeit des Fluidmediums σ m im Bereich von 0,01 S/m bis 2,5 S/m durch, wobei die angelegte Frequenz f (Hz) konstant bei einem Wert von 800 kHz gehalten wird.
    4. Führen Sie für den zweiten Satz eine parametrische Sweep-Studie durch, indem Sie die angelegte Wechselfrequenz von 100 kHz bis 100 MHz variieren, während die Leitfähigkeit des Flüssigkeitsmediums σ m für jeden Fall auf 0,4 S /m festgelegt wird. Dieser σm-Wert wurde basierend auf den Ergebnissen der ersten CFD-Studie gewählt, da bei diesem Wert ein maximaler Abstand zwischen MCF-7 und MCF-10A beobachtet wurde.
    5. Die Stärke der Dielektrophorese (DEP)-Kraft, FDEP (-), die auf ein dielektrisches sphärisches Teilchen in einem leitfähigen Medium ausgeübt wird, ist in Gleichung 1T34 angegeben:
      FDEP Equation 1 [1]
      Verwenden Sie Gleichung 1 unter dem Unterknoten dielektrophoretische Kraft. In Gleichung 1 zeigt r den Radius des Teilchens, auf das FDEPangewendet wird; K (-) ist als Clausius-Mossotti-Faktor bekannt; εm(-) zeigt die dielektrische Dielektrizitätskonstante des Mediums; und E(V/m) ist der quadratische Mittelwert des elektrischen Feldes.
    6. Verwenden Sie Gleichung 2 für ein sphärisches Teilchen unter dem dielektrophoretischen Kraftunterknoten.
      Equation 2[2]
      In Gleichung 2 zeigt (-) die komplexe Permittivität des Partikels, auf das die DEP-Kraft angewendet wird; Equation 3 Equation 4 (-) zeigt die komplexe Dielektrizitätskonstante der das Partikel umgebenden Flüssigkeit. Die komplexe Dielektrizitätskonstante Equation 3 und Equation 4 sind wie folgt definiert35:
    7. Verwenden Sie Gleichung 3 für ein sphärisches Teilchen unter dem dielektrophoretischen Kraftunterknoten:
      Equation 6[3]
      In Gleichung 3 zeigt εp (-) den Realteil der komplexen Dielektrizitätskonstante des Teilchens; εm (-) zeigt den realen Teil der komplexen Dielektrizitätskonstante der das Partikel umgebenden Flüssigkeit; σp (S/m) zeigt die Partikelleitfähigkeit; σ m (S/m ) zeigt die Leitfähigkeit des Mediums, das das Partikel umgibt; und ω (Hz) ist die Frequenz des angelegten elektrischen Feldes.
      HINWEIS: Das Vorzeichen von Re(K) bestimmt die Polarität derF-DEP. Wenn das Vorzeichen von Re(K) negativ ist, erfährt das Teilchen eine negative dielektrophoretische Kraft (nDEP); Im Gegensatz dazu impliziert das Vorzeichen von Re(K) eine positive dielektrophoretische Kraft (pDEP). Für den Clausius-Mossotti-Faktor (K) liegt die Variation im Bereich von -1 bis 1.
  3. Verwenden Sie eine modifizierte Form von Gleichung 3, um biologische Zellen wie Säugetierzellen zu modellieren, die komplexer sind und eine mehrschichtige Struktur haben.
    K (Equation 7) = Equation 8 [4]
    In Gleichung 4 Equation 9 beinhaltet (-) sowohl die komplexe Permittivität des Zytoplasmas Equation 10 (-) als auch die komplexe Permittivität der Zellmembran Equation 11 (-) und wird wie folgt angegeben:36
  4. Verwenden Sie Gleichung 5, um ""Equation 12 zu lösen:
    Equation 13[5]
    In Gleichung 5 zeigen R cyto (m) und Rmem (m) den Radius des Zellzytoplasmas bzw. der Zellmembran.
  5. Verwenden Sie dann Gleichung 4, um Re (K) als Funktion des angelegten elektrischen Feldes sowohl für Krebs als auch für gesunde Zellen darzustellen. Berechnen Sie den realen Teil des Clausius-Mossotti (CM)-Faktors, Re(K), um die dielektrophoretische Kraft (DEP) zu quantifizieren, die das Teilchen erfährt.
  6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Knoten Ergebnisse, fügen Sie den Unterknoten Partikelauswertung hinzu, und geben Sie im Ausdrucksabschnitt fpt.deff1.K ein, um den CM-Faktor für Partikel 1 und fpt.deff2.K für Partikel 2 darzustellen.
    HINWEIS: Alle im Haupttext aufgeführten Protokollschritte können im Protokollvideo (Video 1) angezeigt werden.

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Representative Results

Untersuchung der optimalen operativen Parameter für eine effektive DEP-basierte Sortierung von nicht-metastasierten Brustkrebs- (MCF-7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A)
Um eine erfolgreiche Trennung von nicht-metastasierendem Brustkrebs (MCF-7) und nicht-tumoralem Brustepithel (MCF-10A) Zellen mit divergenten dielektrischen Eigenschaften während der Dielektrophorese zu erreichen, sollten ihre K-Faktoren unterschieden werden, indem die angewandte Frequenzfest 37,38 gehalten wird. Die Quantifizierung der dielektrischen Reaktionen von nicht-metastasierten Brustkrebszellen und nicht-tumoralen Brustepithelzellen unter einem angelegten elektrischen Feld und die Berechnung des "K"-Faktors als Funktion der angelegten Frequenz für beide Zelllinien wurden mit Gleichung 4 erreicht. Die in Abbildung 1 gezeigten Ergebnisse wurden erzeugt, indem alle dielektrischen Parameter der nicht-metastasierten Brustkrebszellen und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen fixiert wurden, während die angelegte Frequenz des elektrischen Feldes für drei verschiedene Leitfähigkeitswerte des Zellsuspensionsmediums σm variiert wurde.

Wie in Abbildung 1 gezeigt, liegt der Wert von K jeweils im Bereich von -1 bis 1, was früheren Studienentspricht 39,40. Nichtsdestotrotz ändert sich die Darstellung von real(K) gegenüber der Frequenz sowohl für nicht-metastasierte Brustkrebszellen (MCF-7) als auch für nicht-tumorale Brustepithelzellen (MCF-10A) entsprechend dem Wert der Mediumsleitfähigkeit (σm). Die in Abbildung 1 gezeigten Ergebnisse stimmen mit einer aktuellen Studie überein, in der die Wirkung von σm auf Re(K) für MCF-7-Zellen quantifiziert wurde41.

Figure 1
Abbildung 1: Clausius-Mossotti-Faktor. Der reale Teil des Clausius-Mossotti-Faktors, K, aufgetragen als Funktion der Frequenz, für MCF-7- und MCF-10A-Zellen, die in einem Medium suspendiert sind, das durch eine Leitfähigkeit von (A) σ m = 0,01 S/m gekennzeichnet ist; b) σ m = 0,4 S/m ; (C) σ m = 1,2 S/m . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 1 wurde mit dem MyDEP-Tool für drei verschiedeneσ-m-Werte dargestellt, wobei die angewandte Wechselstromfrequenz von 100 kHz bis 100 MHz beibehalten und variiert wurde. Anfangs wurde die σ m auf 0,01 S/m gewählt, und die angelegte Wechselfrequenz wurde zwischen 100 kHz und 100 MHz variiert, wie in Abbildung 1A dargestellt. Bei einer angelegten Wechselstromfrequenz von 100 kHz betrug der Wert von Re(K) für MCF-10A-Zellen 0,82, was bedeutet, dass sie eine positive Dielektrophorese (pDEP) erfahren und sich in Richtung eines Bereichs mit hoher elektrischer Feldstärke bewegen sollten. In ähnlicher Weise erfahren die MCF-7-Zellen bei 100 kHz auch pDEP mit einem Re(K)-Wert von 0,76. Die Frequenz wurde in Schritten von 100 kHz erhöht, und der Wert des CM-Faktors blieb für beide Zelltypen im gesamten angelegten Frequenzspektrum positiv. Durch die Beibehaltung aller anderen Betriebsparameter wurde die Leitfähigkeit des Mediums auf 0,4 S/m erhöht, um das Re(K) darzustellen, wie in Abbildung 1B dargestellt. MCF-10A und MCF-7 zeigten ein negatives Dielektrophoreseverhalten (nDEP) mit Re(k)-Werten von -0,46 bzw. -0,31 bei 100 kHz. Als die Frequenz auf 0,8 MHz erhöht wurde, änderte sich die DEP-Antwort der MCF-10-Zellen und sie erlebten pDEP mit einem Re(K)-Wert von 0,014. Dieses Verhalten von MCF-7-Zellen wird durch die Maxwell-Wagner-Polarisation an der Grenzfläche zwischen der Zellmembran und dem umgebenden Zellsuspensionsmedium39,41 verursacht. Die Frequenz, mit der diese Änderung der DEP-Antwort beobachtet wird, wird als Übergangsfrequenz bezeichnet, wie in Abbildung 1A42,22 dargestellt. Die MCF-7-Zellen erlebten in diesem Fall nDEP. Die Frequenz wurde weiter auf 100 MHz erhöht, aber beide Zelltypen änderten ihr DEP-Verhalten nicht und blieben somit von den Schwankungen der angelegten elektrischen Feldfrequenz unberührt. Wenn die Leitfähigkeit auf 1,2 S / m erhöht wurde, erlebten die MCF-10A- und MCF-7-Zellen nDEP bei 100 kHz. Die Re(k)-Werte für MCF-10A- und MCF-7-Zellen betrugen in diesem Fall -0,49 bzw. -0,43, wie in Abbildung 1C dargestellt. Als die Frequenz auf 0,8 MHz erhöht wurde, änderte sich die DEP-Antwort der Zellen nicht, da sie weiterhin nDEP erlebten. Das negative DEP-Verhalten von MCF-7- und MCF-10A-Zelllinien bei hohen Werten der Suspensionsmediumleitfähigkeit der Zellen stimmt mit den zuvor berichteten Studien überein 39,43,44. Das DEP-Verhalten der Zellen bei Frequenzen, die höher als die erste Übergangsfrequenz sind, wird durch die Wechselwirkung zwischen zytoplasmatischer Leitfähigkeit und der suspendierenden Lösung45,46 bestimmt. Andererseits wird bei Frequenzen kleiner als die erste Übergangsfrequenz die dielektrische Antwort der Zellen durch die Wechselwirkung zwischen der Leitfähigkeit der Zellmembran und dem Zellsuspensionsmedium bestimmt.

Basierend auf den in Abbildung 1 gezeigten Ergebnissen wurden COMSOL-Simulationen aufgebaut. Zunächst wurde die elektrische Feldstärke mit dieser Simulationssoftware quantifiziert, wie in Abbildung 2 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass sich die Maxima der Größe des gesamten elektrischen Feldes, das von zwei nebeneinander an der oberen Wand des Sortierkanals platzierten Elektroden erzeugt wird, in der Nähe der Elektrodenkanten befinden. Die Pfeile zeigen die Richtung des elektrischen Feldes.

Figure 2
Abbildung 2: Elektrische Feldstärke. Das elektrische Feld, das von zwei nebeneinander angeordneten Elektroden erzeugt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Simulationen zur Sortierung von MCF-7- und MCF-10A-Zellen wurden eingerichtet, indem die angelegte Wechselfrequenz bei 0,8 MHz (Übergangsfrequenz) fixiert blieb und der Wert von σ m geändert wurde. Drei Werte für σm wurden in Übereinstimmung mit den in Abbildung 1 gezeigten Re(K)-Diagrammen gewählt. Anfangs, als σ m 0,01 S /m betrug, erlebten beide Zelltypen eine positive DEP, bewegten sich in Richtung des Bereichs hoher elektrischer Feldstärke und bewegten sich aus dem oberen Auslass, wie in Abbildung 3A gezeigt. Die zytoplasmatischen Leitfähigkeiten σZytoplasmas für beide Zelllinien waren in diesem speziellen Fall höher als die mittlere Leitfähigkeit σm , wodurch beide Zelllinien gezwungen wurden, sich den Elektroden an der Spitze des mikrofluidischen Kanals47 anzunähern. Die DEP-Antwort der MCF-10A-Zellen änderte sich, und sie erlebten eine negative DEP, wenn die σm auf 0,4 S / m erhöht wurde, wobei die angelegte Frequenz bei 0,8 MHz festgelegt war. Abbildung 3B zeigt, dass sich MCF-10A-Zellen zum oberen Ausgang bewegen, während sich MCF-7-Zellen zum unteren Ausgang bewegen. Der Grund für diese Trennung ist, dass MCF-7-Zellen im Vergleich zu MCF-10A stärker polarisiert sind, da ihre zytoplasmatische Leitfähigkeit σZytoplasma größer ist als die mittlere Leitfähigkeit σm, wie im Zellsortiervideo (Video 2) gezeigt.

Figure 3
Abbildung 3: Feste Frequenz der Zellsortierung. Simulation von MCF-7 und gesunder Zelltrennung über die Zeit durch DEP in der entwickelten mikrofluidischen Vorrichtung. MCF-7 und gesunde Zelltrennung bei drei verschiedenen Leitfähigkeitswerten des suspendierten Mediums: (A) 0,01 S/m; b) 0,4 S/m; (C) 1,2 S/m. In jedem Fall betrug die angelegte Frequenz 0,8 MHz, die angelegte Spannung Vpp betrug 1,5 V und die Strömungsgeschwindigkeit am Einspritzeinlass betrug 184 μm/s und 853 μm/s am strömungsfokussierenden Einlass. In der Simulation werden MCF-7-Zellen und MCF-10A-Zellen mit blauen bzw. roten Kreisen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Da die Leitfähigkeit des Mediums weiter auf 1,2 S/m erhöht wurde, wurden sowohl MCF-7- als auch MCF-10A-Zellen aufgrund der niedrigeren zytoplasmatischen Leitfähigkeit σ derZytoplasmaspiegel weniger polarisierbar als das sie umgebende Medium. Folglich erlebten sie nDEP und entfernten sich von Regionen mit hohem elektrischem Feld, wie in Abbildung 3C gezeigt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Leitfähigkeit des Mediums eine wichtige Rolle bei der Trennung der nicht-metastasierten MCF-7-Brustkrebszellen von MCF-10A-Nicht-Tumor-Brustepithelzellen auf Basis von DEP spielt. Darüber hinaus muss, wie in Abbildung 3B gezeigt, die Leitfähigkeit des Mediums so eingestellt werden, dass die Zellen entweder pDEP oder nDEP erfahren, basierend auf ihren jeweiligen dielektrischen Eigenschaften.

Schließlich wurde die Wirkung der angelegten dielektrophoretischen Kraft, F DEP, auf das Sortierverhalten beider Zelllinien untersucht, indem die Leitfähigkeit des Mediums konstant bei 0,4 S/m gehalten wurde. FDEP ist eine Funktion der Frequenz des angelegten elektrischen Feldes48,49, und wenn die Frequenz des angelegten elektrischen Feldes geändert wird, Die Zellen ändern ihr DEP-Verhalten. Die Simulationen wurden gestartet, indem die Frequenz auf 100 kHz eingestellt wurde, und es wurde beobachtet, dass sowohl MCF-10A- als auch MCF-7-Zelllinien nDEP erlebten und sich vom Bereich des hohen elektrischen Feldes in Richtung des unteren Ausgangs bewegten, wie in Abbildung 4A gezeigt. Als die Frequenz erhöht wurde, blieb das DEP-Verhalten beider Zelllinien bis 0,8 MHz unverändert, als MCF-10A ihr DEP-Verhalten änderte und in die pDEP-Region überging. Dies ist der Punkt mit der maximalen Trennung zwischen den untersuchten DEP-Antwortzellen und der maximalen Sortiereffizienz, wie in Abbildung 4B dargestellt. Wenn die Frequenz auf 100 MHz erhöht wurde, wurde beobachtet, dass beide Zelllinien pDEP erfuhren und sich in Richtung des oberen Ausgangs bewegten, wie in Abbildung 4C gezeigt. Bei höheren Frequenzen über 0,8 MHz begannen die Zellen an den Kanalwänden zu immobilisieren. Die Immobilisierung von Zellen an den Kanalwänden kann während des Sortierprozesses zu Zellverlust führen, was sich wiederum auf die Gesamteffizienz des Geräts auswirkt. Die Wirkung dieser Kräfte kann auch zu einem ernsthaften Verlust der Zelllebensfähigkeit führen, wenn sie über einen längeren Zeitraum exponiert werden. Yang et al. quantifizierten die Wirkung von DEP-Kräften auf eine Listeria monocytogenes-Zelllinie, indem sie sie einem elektrischen Wechselstromfeld von 5 MHz und einer Spitzen-Spitzenspannung von 20 VPP50 aussetzten. Ihre Ergebnisse zeigten einen lebensfähigen Zellverlust von 56%-89%, wenn sie 4 h lang unter dem Einfluss der DEP-Kraft gehalten wurden. In ähnlicher Weise wurde auch berichtet, dass DEP-Kräfte einen Einfluss auf die Bewegung von Zellen haben, wenn sie in einem polarisierbaren Medium suspendiert sind, und wurden verwendet, um Zellen zu immobilisieren. Ettehad et al. berichteten über ein mikrofluidisches Gerät mit interdigitierten Elektroden (IDEs), das eine Wechselfrequenz von 1 MHz und 20 VPP verwendete, um Hefezellen51 zu immobilisieren. Sie zeigten, dass die Immobilisierung ihrer Hefezellen vom Aspektverhältnis des Abstands zwischen ihren IDEs und der angelegten Spannung abhängig war. Die Erhöhung des Aspektverhältnisses des IDE-Abstands führte zu einer starken Abnahme der Zellimmobilisierung, und um Zellen in Geräten mit größerem Abstand zwischen IDEs zu immobilisieren, war ein höherer VPP erforderlich. Die Zellimmobilisierung ist eine erwünschte Anwendung, wenn Zellen für die Analyse oder das Wachstum eingeschlossen werden müssen. Die bisherigen Ergebnisse zeigten deutlich, dass angelegte Wechselfrequenz und -spannung einen Einfluss auf die Zellimmobilisierung haben. In Anwendungen, bei denen eine Sortierung oder ein Screening mit hohem Durchsatz das gewünschte Ergebnis ist, führt die Zellimmobilisierung zu Zellverlust und verringert die Ausgabeeffizienz des Geräts.

Um den Einfluss von angelegter Frequenz und Spannung auf die Zellimmobilisierung zu quantifizieren, wurde eine Reihe von Simulationen vom Kilohertz- bis Megahertz-Frequenzbereich bei einer fest angelegten Spannung von 1,5 VPP durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Frequenzen im kHz-Bereich die Immobilisierung der Zellen an den Kanalwänden im Vergleich zu Frequenzen im MHz-Bereich deutlich geringer war. Da die DEP-Kraft direkt proportional zur angelegten Wechselfrequenz ist, können wir daraus schließen, dass bei hoher DEP-Kraft die Immobilisierung der Zellen ausgeprägter ist. Für dieses mikrofluidische Gerät kommt es bei der Sortierung von MCF7- und MCF-10A-Zellen zu einem Zellverlust, da es erforderlich ist, mit Frequenzen größer als 0,8 MHz zu arbeiten. Der Effekt der zufälligen Verteilung von Zellen am Einlass wurde weiter untersucht, indem eine zufällige Verteilungsrandbedingung gewählt wurde. In diesem Fall wurden mehr Zell-Kanal-Wand-Wechselwirkungen beobachtet, wie in der ergänzenden Abbildung 5 gezeigt.

Figure 4
Abbildung 4: Zellsortierung mit fester Medienleitfähigkeit. [Einfluss der Frequenz des angelegten Wechselstromfeldes auf die Trennung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A) in der simulierten mikrofluidischen Vorrichtung. (A) f= 100 KHz; (B) f= 0,8 MHz; (C) f= 100 MHz. Die Leitfähigkeit des Fluidmediums wurde auf σ m = 0,4 S/m festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dielektrische Eigenschaften für die Simulation εZytoplasma σZytoplasma
(S/m)		 εMembran σMembran
(S/m)
MCF-7 50 0.8 11 6× 10-6
MCF-10A 100 0.1 11 6
F0 800 [kHz] 1,2 x 103 Hz Frequenz des elektrischen Feldes
sigma_f 0,4 [S/m] 0,8 S/m Leitfähigkeit des flüssigen Mediums
epsilon_f 80 80 Relative Dielektrizitätskonstante Flüssigkeit
rho_f 1000 [kg/m3] 1000 kg/m³ Fluiddichte
mu_f 1 x 10-3 [Pa·s] 0,001 Pa·s Fluiddynamische Viskosität
rho_p 1050 [kg/m3] 1050 kg/m³ Partikeldichte
dp1 17 [μm] 1,7 x 10-5 m Partikeldurchmesser
dp2 16 [um] 1,6 x 10-5 m Partikeldurchmesser
sigma_p1 0,8 [S/m] 0,6 S/m Partikelleitfähigkeit
sigma_p2 0,1 [S/m] 1,1 S/m Partikelleitfähigkeit
epsilon_p1 50 55 Gesunde relative Dielektrizitätskonstante
epsilon_p2 100 65 Relative Dielektrizitätskonstante von Krebs
sigma_s1 6 x 10-6 [S/m] 6 x 10-6 S/m Elektrische Leitfähigkeit der Schale
sigma_s2 6 [S/m] 6 S/m Elektrische Leitfähigkeit der Schale
epsilon_s1 11 11 Relative Dielektrizitätskonstante der Schale
epsilon_s2 11 11 Relative Dielektrizitätskonstante der Schale
th_s1 7 [nm] 7 x 10-9 m Dicke der Schale
th_s2 7 [nm] 7 x 10-9 m Dicke der Schale

Tabelle 1: Betriebsparameter. Dielektrische Eigenschaften von MCF-7 und MCF-10A

Video 1: Ein Video, das die Protokollschritte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Video zur Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Die maßgeblichen Gleichungen und der theoretische Hintergrund. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Gerätedesign und Parameter. Mikrofluidisches Gerätedesign, das verschiedene Teile des Geräts hervorhebt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Abstand zwischen den Elektroden. Der Spalt zwischen zwei Patch-Elektroden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Studie zur Netzunabhängigkeit. Eine Netzunabhängigkeitsstudie, die den Einfluss verschiedener Maschengrößen auf die Sortierung von MCF-7- und MCF-10A-Zellen darstellt. (A) Die verschiedenen Maschenöffnungen für die mikrofluidische Vorrichtung, die die Anzahl der Elemente für jedes Netz darstellen. Die Anzahl der Elemente, aus denen das Netz besteht, steigt von gröberem zu feinerem Netz. (B) Sortierung von MCF7- und MCF-10A-Zellen auf verschiedenen Maschenweiten unter Beibehaltung aller anderen Betriebsparameter. Die feinen und feineren Maschenweiten liefern die besten Ergebnisse bei der Sortierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Zellimmobilisierung und Zufallsverteilungstest. Simulationen wurden für Frequenzen zwischen 10 KHz und 6 MHz durchgeführt, um den Effekt der DEP-Kraft auf die Zellimmobilisierung zu validieren. (A) Bei f = 10 kHz wird keine Sortierung und Zellimmobilisierung beobachtet. (B) Bei f = 200 kHz werden keine Sortierung und Zellimmobilisierung beobachtet. (C) Bei f = 0,8 MHz werden Sortierung und Zellimmobilisierung an den Auslasswänden beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Zufallsverteilung. Zufällig verteilte Partikel am Einlass des Chips. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Vergleich verschiedener DEP-basierter mikrofluidischer Sortiergeräte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Mikrofluidische Geräte wurden zuvor für Zellkultur, Fangen und Sortieren berichtet 47,52,53. Die Herstellung dieser Geräte im Reinraum ist ein teurer Prozess, und es ist unerlässlich, die Leistung und Effizienz eines vorgeschlagenen mikrofluidischen Geräts durch CFD-Simulationen zu quantifizieren. Diese Studie präsentiert das Design und die Simulationen eines AC-dielektrophoretischen mikrofluidischen Geräts zur kontinuierlichen Trennung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und nicht-tumoralen Brustepithelzellen (MCF-10A) basierend auf ihren dielektrischen Eigenschaften23.

Das Gerät wird betrieben, indem ein elektrisches Wechselstromfeld über einen Satz von zwei Mikroelektroden angelegt wird, die in einen einzigen mikrofluidischen Sortierkanal eingebettet sind, um MCF-7- und MCF-10A-Zellen basierend auf ihren dielektrischen Eigenschaften zu trennen. Die Trennwirkung des Geräts wurde rechnerisch für verschiedene Werte der Mediumsleitfähigkeit und für einen Bereich von angelegten Wechselstromfrequenzen simuliert. Die optimal angewandten AC-Frequenz- und Medienleitfähigkeitswerte lagen bei 0,8 MHz bzw. 0,4 S/m. Während der gesamten Simulationen wurde eine Niederspannung von 1,5 Vp-p verwendet. Der angelegte AC-Frequenzbereich und die angelegte Spannung sind vergleichbar mit der bisher berichteten Literatur23,47. Bei Frequenzen über 1 MHz wurde der Zellimmobilisierungseffekt beobachtet, der bei zukünftigen Gerätedesigns und -herstellungen berücksichtigt werden sollte. Wir führen diese Zellimmobilisierung als Einschränkung unserer Methode im Zusammenhang mit Zellsortieranwendungen auf. Wir glauben, dass die Zellimmobilisierung bei höheren Frequenzen für die Zelldifferenzierung verwendet werden kann, wie bereits in Literatur54 berichtet, was diesem vorgeschlagenen Design eine neue Richtung verleiht. Diese Anwendung wäre für Forscher der synthetischen Biologie von großem Interesse.

Zu den kritischen Schritten für die korrekte Implementierung dieses Protokolls gehört die Auswahl geeigneter Physikknoten und Unterknoten (Schritte 1.5-1.9). Diese Schritte bilden die Grundlage des gesamten Simulationsprotokolls und helfen bei der Auswahl der Parameterwerte für jeden Zelltyp, die aufgebrachte Kraft und die angelegte Spannung. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Auswahl der richtigen Leitfähigkeit des Flüssigkeitsmediums und der angelegten Frequenz. Dies kann durch Ausführen eines Fehlerbehebungsschritts des parametrischen Sweeps erreicht werden. Der parametrische Sweep dieser beiden Parameter kann bei der Entscheidung über die optimalen Werte für zukünftige Simulationen helfen. Schließlich ist eine Netzunabhängigkeitsstudie auch im Zusammenhang mit der Auswahl der richtigen Maschenweite für zukünftige Simulationen von entscheidender Bedeutung. Es wird dringend empfohlen, eine Netzunabhängigkeitsstudie als Schritt zur Fehlerbehebung durchzuführen, bevor zukünftige Simulationen abgeschlossen werden.

Diese Studie liefert das erste simulationsbasierte Beispiel für die Inline-Trennung von nicht-metastasierten Brustkrebszellen (MCF-7) und Nicht-Tumor-Brustepithelzellen (MCF-10A) basierend auf ihren dielektrischen Eigenschaften. Wir glauben, dass dieses Design für eine lebensfähige und nicht lebensfähige Zellsortierung weiter implementiert werden kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der Higher Education Commission of Pakistan unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

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Engineering Ausgabe 186
Mikrofluidisches Gerät zur Trennung von nicht-metastasierten (MCF-7) und nicht-tumoralen (MCF-10A) Brustkrebszellen mittels AC-Dielektrophorese
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