Summary
Den foreliggende protokol beskriver humant inducerede pluripotente stamcelleafledte type 2 alveolære epitellignende celler (iAT2s). Disse celler kan dyrkes som selvfornyende kugler i 3D-kultur eller tilpasses luft-væske-interface (ALI) kultur.
Abstract
I lungen er det alveolære epitel en fysisk barriere fra miljømæssige stimuli og spiller en væsentlig rolle i homeostase og sygdom. Type 2 alveolære epitelceller (AT2'er) er de fakultative forfædre til det distale lungeepitel. Dysfunktion og skade på AT2'er kan skyldes og bidrage til forskellige lungesygdomme. Forbedret forståelse af AT2-biologi er således afgørende for at forstå lungebiologi og sygdom; primære menneskelige AT2'er er imidlertid generelt vanskelige at isolere og begrænset i udbuddet. For at overvinde disse begrænsninger kan humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte type 2 alveolære epitelceller (iAT2'er) genereres gennem en rettet differentieringsprotokol, der rekapitulerer in vivo lungeudvikling. iAT2'er vokser under feederfrie forhold, deler et transkriptomisk program med humane voksne primære AT2'er og udfører nøglefunktioner i AT2'er såsom produktion, emballering og sekretion af overfladeaktivt stof. Denne protokol beskriver metoderne til opretholdelse af selvfornyende iAT2'er gennem seriel passaging i tredimensionel (3D) kultur eller tilpasning af iAT2'er til luft-væske-interface (ALI) kultur. En enkeltcellesuspension af iAT2'er genereres før plettering i 3D-opløselig kældermembranmatrix (i det følgende benævnt "matrix"), hvor de selv samles i monolagede epitelkugler. iAT2'er i 3D-kultur kan serielt dissocieres i enkeltcellesuspensioner, der skal passeres eller belægges i 2D ALI-kultur. I ALI-kulturen danner iAT2'er et polariseret monolag med den apikale overflade udsat for luft, hvilket gør denne platform let modtagelig for miljøeksponeringer. Derfor genererer denne protokol en uudtømmelig forsyning af iAT2'er, der producerer op mod 1 x 1030 celler pr. Inputcelle over 15 passager, samtidig med at AT2-programmet angivet med SFTPCtdTomato-ekspression opretholdes. De resulterende celler repræsenterer en reproducerbar og relevant platform, der kan anvendes til at studere genetiske mutationer, modellere miljøeksponeringer eller screene lægemidler.
Introduction
I lungen er luftvejene og alveolære epitelceller de første til at støde på inhalerede miljøeksponeringer, herunder patogener, der overføres via inhalerede aerosoler og skadelige stimuli såsom cigaretrøg. Type 2 alveolære epitelceller (AT2'er) er afgørende for at opretholde lungehomeostase, da de er de fakultative forfædre til det distale lungeepitel, producerer overfladeaktive stoffer for at lindre alveolær overfladespænding og monterer det medfødte immunrespons på inhalerede eksponeringer 1,2. Imidlertid kan AT2-dysfunktion skyldes lungeskader eller mutationer i gener, der selektivt udtrykkes i AT2'er, såsom SFTPC, SFTPB og ABCA3 3,4,5. Tidligere tilgange til at studere disse genetiske mutationer har været afhængige af musemodeller6 eller konstruerede, mutationsholdige vektorer indført i udødeliggjorte cellelinjer7. Derfor er der behov for platforme, der kan modellere virkningerne af genetiske og miljømæssige forstyrrelser på AT2'er i de fysiologisk relevante celletyper og i et produktivt in vitro-system, for yderligere at forstå den rolle, AT2'er spiller for sundhed og sygdom.
Med hensyn til modellering af luftbårne eksponeringer er luft-væske-grænseflade (ALI) kulturer af primære luftvejsepitelceller med succes blevet anvendt til at afsløre vigtige molekylære reaktioner på cigaretrøg8 og til at modellere luftvejsinfektion 9,10. Et sammenligneligt ALI-kultursystem for det alveolære epitel, et centralt sted for infektion eller skade i sygdom, er meget mindre udviklet sammenlignet med luftvejsepitelmodelsystemet. Udødeliggjorte cellelinjer er blevet dyrket hos ALI som en proxy for det alveolære epitel 11,12, men disse cellelinjer er transkriptomisk forskellige fra primære alveolære epitelceller13 og mangler vigtige cellulære maskiner, såsom evnen til at udskille overfladeaktive stoffer eller danne tætte kryds ved ALI12. Primære humane AT2'er kan dyrkes i 3D-sfærer i nærvær af fibroblaster 1,14, men er underlagt begrænsninger, herunder den begrænsede tilgængelighed fra eksplanterende lunger og deres tendens til at senesce eller miste cellulær fænotype i de fleste kulturer til dato. Disse karakteristika udgør hindringer for den udbredte vedtagelse af primære AT2 in vitro-undersøgelser, selv om der for nylig er gjort fremskridt med at optimere feederfrie 3D-kulturer til udvidelse af primære AT2'er 15,16,17,18.
Der er udviklet direkte differentieringsprotokoller til at rekapitulere in vivo-udviklingsmæssige milepæle for at generere humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte type 2-alveolære epitelceller (iAT2s)19. iAT2'er vokser som selvfornyende kugler i 3D-serumfri kultur i et defineret medium indeholdende CHIR99021, KGF, dexamethason, cAMP og 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), betegnet "CK + DCI"19, i mangel af fibroblastfødere og kan dyrkes i >20 passager20,21. Desuden deler iAT2'er et transkriptomisk program med humane voksne primære AT2'er, danner lamellære kroppe og producerer og pakker overfladeaktivt stof 19,21,22. Denne protokol beskriver den serielle passaging af iAT2'er ved at adskille cellerne til en enkeltcellesuspension. På dette tidspunkt kan iAT2'er omplades og udvides yderligere i 3D-kultur eller belægges i 2D ALI-kultur23. Disse metoder kan bruges til at studere AT2'ernes iboende biologi i homeostase og sygdom 20,22 og til at forhøre virkningerne af forbindelser eller stimuli i en skalerbar, fysiologisk relevant platform 23,24, som det tidligere er blevet vist.
Protocol
Alle eksperimenter, der involverede differentiering af humane iPSC-linjer, blev udført i overensstemmelse med Institutional Review Board of Boston University (protokol H33122). De dermale fibroblaster, der blev indkøbt til omprogrammering til iPSC'er, blev opnået fra en donor med skriftligt informeret samtykke under godkendelse af Human Research Protection Office of Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. Omprogrammerede iPSC'er blev genereret ved Center for Regenerativ Medicin ved Boston University og Boston Medical Center, Boston, MA.
1. Alveolosfæren dissociation
- Der fremstilles komplette serumfrie differentieringsmedier (cSFDM) i henhold til den sammensætning, der er nævnt i tabel 1.
- Forbered CK + DCI-medier i den forberedte cSFDM-base i henhold til tabel 2.
- Optøning 2D (human embryonal stamcelle-kvalificeret) og/eller 3D (vækstfaktor reduceret) matrix på is efter behov for forsøg.
- Aspirer alt CK + DCI-medium ved hjælp af en pipette eller aspirerende pipette med vakuum fra 3D-matrixdråberne indeholdende alveolosfærer, afledt af rettet differentiering19, i en 12-brønds plade.
- Tilsæt 1 ml dispase (2 mg/ml) pr. dråbe. Rør forsigtigt dråben ind i dispasen ved hjælp af en P1000-pipette. Inkuber ved 37 °C i 1 time, pipetter op og ned én gang efter 30 min.
- Overfør de dissocierede organoider (fra trin 1.5) fra en matrixdråbe i dispasen til et 15 ml konisk rør. For at vaske skal du tilføje 10 ml Iscoves modificerede Dulbecco's Medium (IMDM, se Tabel over materialer).
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten ved hjælp af en pipette eller aspireringspipette med vakuum, og efterlad så lidt supernatant som muligt.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne al dispase, da enhver resterende dispase kan opløse matrixen, som cellerne efterfølgende vil blive podet i. Hvis der ses en klar dis over pelleten, har dispasen ikke helt opløst matrixen, og der kan tilsættes mere dispase til pelleten i yderligere 20-30 minutter ved 37 ° C. - Resuspend cellerne i 1 ml 0,05% trypsin pr. Dråbe og overfør tilbage til 12-brøndspladen. Inkuber ved 37 °C i 12-15 min. Overhold dissociationen under et mikroskop. Undgå overpipettering af cellerne på dette stadium.
BEMÆRK: Ved afslutningen af inkubationen skal cellerne opnå en enkeltcellesuspension efter pipettering 3-5 gange med en P1000-pipette. For at overføre iAT2'er til ALI (trin 3) skal trypsiniseringstiden minimeres (maksimalt 12 minutter), således at cellerne er i 2-3-celleklumper snarere end enkeltcellesuspension, når de er klar til plettering på cellekulturindsatsen. - Stop virkningen af trypsin med et lige stort volumen FBS-holdige medium (10% ES-kvalificeret FBS i DMEM). Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Vask cellerne med 10 ml IMDM. Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Resuspend cellerne i et passende volumen til tælling, og tæl derefter cellerne ved hjælp af et hæmocytometer (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Fra en sammenflydende 50 μL matrixdråbe podet ved 400 celler / μL er det forventede udbytte 500.000 til 1,5 x 106 celler pr. Dråbe. - Brug enkeltcellesuspensionen af iAT2-celler til at generere alveolosfærer ved plettering i 3D-matrixen (trin 2) og/eller plettering på cellekulturindsatser til ALI-kultur (trin 3).
2.3D af iAT2'er
- Efter optælling (trin 1.11) bestemmes antallet af ønskede celler, der skal omplades i 3D-matrixen (400 celler / μL af matrixen med 50-100 μL 3D-matrixdråber pr. Brønd af en 12-brønds plade). Centrifugering af cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern så meget supernatant som muligt ved hjælp af en pipette.
- Resuspend cellerne i 3D-matrixen. Resuspend hurtigt og på is, hvis det er nødvendigt, for at forhindre matrixen i at polymerisere (som opstår, når den er varm).
- Brug en P200-pipette til at dispensere en 3D-matrixdråbe pr. Brønd i en forvarmet plade med 12 brønde. Pipette omhyggeligt for at undgå at skabe bobler i matrixdråben. Lad ikke cellesuspensionen sætte sig, mens du udleverer flere dråber.
- Anbring pladen i en 37 °C inkubator i 20-30 minutter, så matrixdråberne kan polymerisere.
- Tilsæt 1 ml CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium (se materialetabel) pr. brønd for at dække matrixdråben.
- Efter 72 timer skal du ændre mediet til CK + DCI uden 10 μM Y-27632.
- Udskift mediet med frisk CK + DCI hver 48-72 timer.
BEMÆRK: iAT2'er skal typisk passeres ca. hver 10-14 dage afhængigt af cellelinje og belægningstæthed.
3. Overstigelse af iAT2'er til ALI
- Forbered nyovertrukne 6,5 mm cellekulturindsatser 1 time før brug ved at fortynde 2D-matrixen i Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) til arbejdsløsning i henhold til producentens anvisninger til 2D-matrixen (se tabel over materialer). Derefter tilsættes 100 μL af den fortyndede matrix pr. 6,5 mm cellekulturindsats. Matrixen polymeriseres i en 37 °C-inkubator i 30 minutter eller ved stuetemperatur i 1 time.
- Aspirer den overskydende matrix fra cellekulturindsatserne ved hjælp af en pipette eller aspireringspipette med vakuum og skyl en gang med DMEM/ F12. Aspirer denne vask umiddelbart før tilsætning af cellerne.
- Efter optælling bestemmes antallet af nødvendige celler til frø af det ønskede antal celler i kulturindsatserne (520.000 levende celler /cm2, svarende til 172.000 levende celler pr. 6,5 mm cellekulturindsats). Centrifugering af cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern så meget supernatant som muligt.
- Resuspend cellerne i det passende volumen til frø med 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 pr. Cellekulturindsats (cellesuspension skal være 1.720 celler / μL ). Tilsæt 100 μL til det apikale rum i cellekulturindsatsen. Omrør forsigtigt pladen i et krydsmønster for at sikre en jævn fordeling af celler på tværs af cellekulturindsatsen, og bekræft dette ved at kontrollere under et mikroskop ved 4x mål.
BEMÆRK: Såningstæthed er kritisk og kan kræve optimering, der spænder fra 160.000-300.000 celler pr. 6,5 mm cellekulturindsats. Calceingrøn (se tabel over materialer) cellegennemtrængeligt farvestof kan tilsættes til cellerne og ses på et omvendt fluorescerende mikroskop for at visualisere cellerne efter såning. - Tilsæt 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 til basolateralrummet for hver cellekulturindsats.
- Aspirerende apikal CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium 48 timer efter såning ved hjælp af en pipette til at starte ALI (kendt som "luftløft").
BEMÆRK: Cellerne skal være 100% sammenflydende på dette tidspunkt. Hvis cellerne ikke er 100% sammenflydende, skal trin 3,7-3,8 stadig udføres på de angivne tidspunkter; sammenflydende cellemonolag kan tage længere tid at danne. - Skift den basolaterale CK + DCI + 10 μM af Y-27632 medium efter 72 timer til CK + DCI uden 10 μM Y-27632.
BEMÆRK: Der skal være minimal, hvis nogen, "lækage" af medium til den apikale side. Men hvis dette sker i de første par dage, skal du fortsætte med at aspirere den apikale side dagligt, indtil der ikke er yderligere lækage. - Udskift det basolaterale medium med frisk CK + DCI hver 48-72 timer.
BEMÆRK: De iAT2'er, der anvendes i ALI-kulturer, modnes maksimalt efter 5-14 dage efter plettering. - Vedligehold cellerne med omhyggelig overvågning i op til 28 dage efter plettering, hvis det er nødvendigt, for mere langvarig eksperimentering.
BEMÆRK: Synlige tegn på ALI-svigt, såsom skrælning af cellerne væk fra kanten af indsatsen eller dannelse af huller i monolaget, kan observeres efter en overudvidet tid i kultur, på hvilket tidspunkt ALI ikke længere kan bruges til forsøg.
Representative Results
iAT2'erne blev passeret til en enkeltcellesuspension og derefter ombelagt i 3D-matrix eller i 2D på cellekulturindsatser til ALI-kultur (figur 1). Efter enkeltcelle dissociation blev iAT2'erne analyseret ved flowcytometri. Kort fortalt blev cellerne, der blev resuspended i 1% føtalt kvægserum (FBS) i fosfatbufret saltvand (PBS) med calceinblå levedygtighedsfarvestof (1: 1000), analyseret på et flowcytometer, gating for ikke-fragmenter, singlets og tdTomato. Her er som et eksempel SPC2-linjen (SPC2-ST-B2-klon20), som har en tdTomato-reporter målrettet mod det endogene SFTPC-locus for at lette visualisering og sporing af AT2-programmet over tid i kultur (figur 2A). iAT2 SFTPC-tdTomato-ekspressionen blev opretholdt, når den blev ombelagt i 3D-matrixen som kugler (figur 2B), og når den blev belagt på cellekulturindsatser (figur 2C). Transepitelelek elektrisk modstand (TEER) kan måles for at bestemme ali-kulturens integritet (figur 2D). Til måling af TEER blev der anvendt et voltohmmeter (se materialetabel) med 100 μL CK + DCI-medium tilsat det apikale kammer. Cellekulturindsatserne belagt med Matrigel i fravær af frøede celler blev behandlet som emner. Aflæsninger blev taget på tre steder i hver brønd.
Figur 1: Skematisk gengivelse af protokolarbejdsgangen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af protokollen. (A) Repræsentative flowcytometriresultater for SFTPC-tdTomato i humant induceret pluripotent stamcelleafledt type 2 alveolære epitellignende celler (iAT2'er) dyrket i 3D. Den viste negative kontrol er ikke-lungeendoderm (CD47lo). (B) Repræsentativ levende cellebilleddannelse af iAT2'er dyrket i 3D på forskellige dage efter passage (dpp) (SFTPC-tdTomato, skalabjælke = 50 μm). C) Repræsentativ levende cellebilleddannelse af iAT2'er belagt ved luft-væske-grænseflade (SFTPC-tdTomato, skalabjælke = 500 nm). D) Repræsentativ transepitelelet elektrisk modstand af iAT2'er belagt ved luft-væske-grænsefladen. n = 3, fejllinjer angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagenser | Volumen til 500 ml | Endelig koncentration |
| Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) | 375 ml | 75% |
| Skinkes F-12 næringsblanding (F12) | 125 ml | 25% |
| B-27 (med RA) supplement | 5 ml | 1% |
| N-2 supplement | 2,5 ml | 0.50% |
| BSA (7,5% aktie) | 3,3 ml | 0.05% |
| Primocin (50 mg/ml lager) | 1 ml | 100 μg/ml |
| Glutamax (100x lager) | 5 ml | 1x |
| Ascorbinsyre (50 mg/ml) | 500 μL | 50 μg/ml |
| 1-thioglycerol (MTG) (fra 26 μL i 2 ml IMDM) | 1,5 ml | 4,5 x 10-4 M |
Tabel 1: Sammensætning af det komplette serumfrie differentieringsmedie (cSFDM).
| Reagens | Endelig koncentration |
| København, 10000 København, S | 3 μM |
| rhKGF | 10 ng/ml |
| Dexamethason | 50 nM |
| 8-bromoadenosin 30,50-cyklisk monophosphatnatriumsalt (cAMP) | 0,1 mM |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) | 0,1 mM |
Tabel 2: Sammensætninger af CK + DCI-mediet.
Discussion
AT2'er opretholder lungehomeostase, og dysfunktion af disse vigtige alveolære celler kan både forårsage og skyldes forskellige lungesygdomme. På grund af vanskeligheden ved at få adgang til og isolere primære menneskelige AT2'er genereres iAT2'er. Ved at anvende de rettede differentieringsmetoder, der er beskrevet andetsteds25 , og den udvidelse og cellesåning, der er beskrevet her, kan iPSC'er, der genereres fra ethvert individ, differentieres til robust selvfornyende iAT2'er og dermed tilvejebringe patientspecifikke celler til biomedicinsk forskning, herunder grundlæggende biomedicinske forskningsudviklingsundersøgelser, sygdomsmodellering, cellebaserede terapier eller lægemiddelskærme. Den nuværende protokol beskriver en metode til dissociering af iAT2'er til en enkeltcellesuspension, som derefter kan omplades i 3D Matrigel for at generere alveolosfærer til celleudvidelse eller omplades i 2D ALI-kultur til yderligere eksperimenter.
Protokollen har flere kritiske trin for at sikre vellykket passaging og replating i både 3D- og ALI-kulturer. Mekanisk trituration skal minimeres, da overdreven pipettering kan reducere cellelevedygtigheden. Derudover er såtætheden af iAT2'er i både 3D- og 2D ALI-kulturer kritisk; til 3D-dyrkning er generelt 400 celler / μL 3D Matrigel optimal for de fleste iPSC-linjer. Imidlertid har en række tætheder fra 100-500 celler / μL til tider været vellykkede, og optimering af densiteten kan være nødvendig for forskellige cellelinjer. For ALI-kultur er optimering af såningstætheden af iAT2'er på cellekulturindsatserne også afgørende for at opnå et sammenflydende monolag af celler 48 timer efter såning (dvs. på dagen for luftløftning). Nogle iAT2-linjer kræver flere celler pr. Indsats; således, hvis fejlfinding er påkrævet, anbefales et interval fra 160.000-300.000 celler / indsats til 24-brønds cellekulturindsatser. 3D-kulturer kan også skaleres til 24- og 48-brøndsplader ved at opretholde såtætheden ved 400 celler / μL 3D-matrix og reducere matrixdråbestørrelsen til henholdsvis 25 μL og 20 μL. ALI-kulturer kan skaleres til 96-brønds cellekulturindsatser ved at belægge hver indsats med 30 μL af matrixen, plettere 80.000 celler i 30 μL pr. Indsats og fodre med 150 μL basolaterale medier pr. Brønd. Såningstæthed og matrix- og medievolumener skal skaleres og optimeres i overensstemmelse hermed til andre pladeformater.
En begrænsning af denne protokol er, at de celler, der anvendes til ALI-plettering, skal være tilstrækkeligt rensede til at være NKX2-1+ og SFTPC + 19,20,21,23 til dannelse af iAT2 ALIs, og ALI-kulturdannelse kan variere fra linje til linje. Derudover tillader denne protokol udvidelse og generering af AT2-eneste kulturer, hvilket giver et reduktionistisk modelsystem baseret på en enkelt nøgle alveolær celletype. Det er vigtigt, at andre relevante alveolære celletyper, såsom alveolære type 1-celler, manglede fra disse platforme. Andre grupper har haft succes med at dyrke primære menneskelige AT2'er som sfæroider eller organotypiske kulturer med eller uden fibroblaster 1,14,15,16,17; Imidlertid har primære menneskelige AT2'er en tendens til at miste deres udtryk for vigtige overfladeaktive stoffer, når de dyrkes i normal 2D-kultur uden ALI-betingelser26. Desuden har nyere arbejde vist, at iAT2'er udtrykker højere proliferative markører og lavere AT2-modningsmarkører end friske, ukultiveret menneskelige primære AT2'er27. På trods af disse forskelle mellem iAT2'er og friske primære humane AT2'er fandt vi, at selv dyrkede primære AT2'er viste transkriptomiske forskelle fra friske, ukultiverede primære AT2'er27 og konkluderer således, at disse in vitro-modeller har forskellige styrker og begrænsninger for modellering in vivo lungebiologi.
iAT2-platformen kan anvendes til at studere genetiske mutationer fra patientafledte iPSC'er19,20. Systemet kan også opskaleres væsentligt for at imødekomme screening af lægemidler med høj kapacitet. Derudover er iAT2 AL'er egnede til miljøeksponeringer såsom viral eller bakteriel infektion eller eksponering for cigaretrøg, e-cigaretdamp eller andre aerosoler23. Sammenfattende giver denne protokol til generering af både 3D- og 2D ALI-kulturer af iAT2'er mulighed for langsigtet dyrkning af en sygdomsrelevant celletype og giver en fysiologisk, skalerbar platform, der muliggør brugen af disse celler i mange applikationer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker oprigtigt medlemmer af Wilson-, Kotton- og Hawkins-laboratorierne for deres nyttige diskussioner. Vi er også meget taknemmelige for Greg Miller (CReM Laboratory Manager) og Marianne James (iPSC Core Manager) for deres uvurderlige støtte. Vi takker Brian Tilton og BUMC Flow Cytometry Core for deres tekniske bistand med cellesortering (støttet af NIH-bevilling #1S10OD021587-01A1). Dette arbejde blev støttet af et CJ Martin Early Career Fellowship fra Australian National Health and Medical Research Council tildelt RBW; NIH giver F30HL147426 til KMA; en I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award fra The Pulmonary Fibrosis Foundation og en Integrated Pilot Grant Award gennem Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) til KDA; Swiss National Science Foundation (P2ELP3_191217) til ABA; NIH yder U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til DNK; og NIH yder U01TR001810, R01DK101510 og R01DK117940 tildelt AAW; iPSC vedligeholdelse, bank og deling understøttes af NIH tilskud NO1 75N92020C00005. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
