Summary
يصف هذا البروتوكول كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وهي تقنية سهلة وقابلة للتكرار لإثراء المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية من supernatants الثقافة.
Abstract
ظهر دور الحويصلات خارج الخلية (EVs) في سياق العدوى البكتيرية كوسيلة جديدة لفهم فسيولوجيا الميكروبات. على وجه التحديد ، تلعب المركبات الكهربائية المتفطرة السلية (Mtb) دورا في التفاعل بين المضيف والممرض والاستجابة للإجهاد البيئي. كما أن المركبات الكهربائية Mtb مستضدية للغاية وتظهر إمكانات كمكونات للقاح. الطريقة الأكثر شيوعا لتنقية المركبات الكهربائية Mtb هي الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه العملية لها العديد من القيود ، بما في ذلك الإنتاجية المنخفضة ، والعائد المنخفض ، والاعتماد على المعدات باهظة الثمن ، والتحديات التقنية ، ويمكن أن تؤثر سلبا على التحضير الناتج. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) هي طريقة بديلة ألطف تحارب العديد من قيود الطرد المركزي الفائق. يوضح هذا البروتوكول أن SEC فعالة في إثراء Mtb EV وتنتج مستحضرات Mtb EV عالية الجودة لزيادة الإنتاجية بطريقة سريعة وقابلة للتطوير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقارنة مع الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة من خلال إجراءات القياس الكمي والتأهيل توضح فوائد SEC. في حين أن تقييم كمية EV (تحليل تتبع الجسيمات النانوية) ، والنمط الظاهري (المجهر الإلكتروني للإرسال) ، والمحتوى (النشاف الغربي) مصمم خصيصا ل Mtb EVs ، يمكن تطبيق سير العمل المقدم على المتفطرات الأخرى.
Introduction
قد يكون إطلاق الحويصلة خارج الخلية (EV) بواسطة مسببات الأمراض هو المفتاح لفتح تقنيات جديدة للسيطرة على الأمراض المعدية1. المتفطرة السلية (Mtb) هي عامل ممرض ذو عواقب عالية ، حيث تصيب ما يقرب من ثلث سكان العالم وتودي بحياة الملايين من الناس كل عام2. إنتاج EV بواسطة Mtb موثق جيدا ولكنه بعيد المنال في التكوين الحيوي والأدوار المتنوعة (أي المحفزات المناعية ، المثبطة للمناعة ، اكتساب الحديد والمغذيات) لهذه المركبات الكهربائية في سياق العدوى3،4،5. كشفت الجهود المبذولة لفهم تكوين Mtb EVs عن 50-150 نانومتر من الكرات المغلقة بالغشاء الدهني المشتقة من غشاء البلازما الذي يحتوي على الدهون والبروتينات ذات الأهمية المناعية 3,6. كشف التحقيق في دور Mtb EVs في علم وظائف الأعضاء البكتيرية عن أهمية تعديل EV البكتيري استجابة للإجهاد البيئي للبقاء على قيد الحياة5. كانت دراسات التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض أكثر تعقيدا في تفسيرها ، لكن الأدلة تشير إلى أن Mtb EVs يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية للمضيف وقد تكون بمثابة مكون تطعيم فعال 3,4,7.
اعتمدت معظم الدراسات التي أجريت على المركبات الكهربائية Mtb حتى الآن على الطرد المركزي المتدرج للكثافة لتخصيب الحويصلة8. وكان ذلك فعالا بالنسبة للدراسات الصغيرة النطاق؛ ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لديها العديد من التحديات التقنية واللوجستية. تجمع مهام سير العمل البديلة بين الطرد المركزي متعدد الخطوات ، لإزالة الخلايا الكاملة والحطام الكبير ، مع خطوة الطرد المركزي الفائق النهائية لتكوير المركبات الكهربائية. يمكن أن تختلف هذه المنهجية في الكفاءة ، وغالبا ما تؤدي إلى انخفاض الغلة والتنقية المشتركة للجزيئات الحيوية غير الحويصلة القابلة للذوبان مع التأثير أيضا على سلامة الحويصلة9. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ومكثفة يدويا ومحدودة للغاية في الإنتاجية بسبب قيود المعدات.
يصف البروتوكول الحالي تقنية بديلة للطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة: كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). وقد تم إثبات هذه الطريقة للمتفطرات البيئية ، وفي العمل الحالي ، تم استقرائها إلى Mtb10. يمكن للعمود المتاح تجاريا وجامع الكسور التلقائي تحسين الاتساق في التحضير الحويصلي وتقليل الحاجة إلى معدات محددة ومكلفة. من الممكن أيضا إكمال هذا البروتوكول في جزء صغير من الوقت مقارنة بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، مما يزيد من الإنتاجية. هذه التقنية أقل تحديا من الناحية الفنية ، مما يجعل من السهل إتقانها ، ويمكن أن تزيد من قابلية التكرار بين / داخل المختبر. أخيرا ، تتمتع SEC بكفاءة فصل عالية وهي لطيفة ، مما يحافظ على سلامة الحويصلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية بجامعة ولاية كولورادو على هذه الدراسة (19-046B). تم تنفيذ زراعة المتفطرة السلية وحصاد المواد الفائقة للزراعة الغنية بالمركبات الكهربائية من قبل موظفين مدربين في مختبر عالي الاحتواء. تم نقل المواد من منطقة الاحتواء العالي بعد تنفيذ طريقة تعطيل صالحة وتأكيدها والموافقة عليها من قبل سياسات السلامة الأحيائية المؤسسية. أثناء تكرار البروتوكول ، إذا لم تكن طريقة التعطيل أو الترشيح المعقم التي تم التحقق منها ممكنة ، فيجب تنفيذ الإجراءات التالية في مختبر عالي الاحتواء.
1. إعداد النفط الخام Mtb EV التركيز
ملاحظة: للاطلاع على الإجراءات التفصيلية بشأن زراعة Mtb وإعداد بروتين ترشيح الثقافة (CFP) ، انظر المراجع11،12. يوصى بأن تكون وسائط الزراعة البكتيرية خالية من مكملات النمو التي تحتوي على مكونات تحتوي على EV أو بروتينية ، مثل Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) ، والمنظفات مثل Tween. يوصى أيضا بفحص جودة المستنبتة البكتيرية و CFP المحصود لضمان موت الخلايا المحدود وتحلل13,14.
- قم بإعداد مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة سعة الحجم الكاملة للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (1x PBS). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 2800 × جم عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: في حالة استخدام مرشح بدون حجم توقف ميت، يجب توخي الحذر لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى ما دون مستوى الفلتر، مما يؤدي إلى تجفيف المرشح بالكامل أثناء الطرد المركزي. - تخلص من التدفق وأي PBS متبقي قبل ملء غرفة العينة ب Mtb CFP إلى سعتها القصوى. جهاز طرد مركزي عند 2800 × g عند 4 درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى الحد الأدنى لحجم جهاز الترشيح الفائق. كرر ذلك حسب الضرورة ، مع إضافة المزيد من CFP إلى الوحدة حتى يتم تقليل العينة بأكملها بشكل كاف.
ملاحظة: احتفظ بجزء من المواد المتدفقة (100F) التي تبلغ سعتها 100 كيلوداد (100F) للتأهيل في المراحل النهائية إذا رغبت في ذلك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية. - أضف 1x PBS إلى وحدة التصفية التي تحتوي على التركيز حتى إجمالي سعة الجهاز. تقليل مستوى الصوت كما هو موضح في 1.2. كرر هذه الخطوة خمس مرات لضمان الغسيل الكامل وتبديل المخزن المؤقت.
- استرجع وحدة CFP المركزة بسرعة 100 كيلوداد (100R) وفقا لمواصفات جهاز الترشيح الفائق (انظر جدول المواد). بمجرد استرداد 100R ، اغسل المرشح بأقل حجم 1x PBS ثلاث مرات على الأقل ، وقم بتجميع الغسيل مع 100R لتحقيق أقصى قدر من الاسترداد.
- قم بقياس كمية مادة 100R باستخدام فحص ثنائي التشينكونينيك (BCA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). لإجراء الفحص ، استخدم العديد من التخفيفات للعينات 1: 2 و 1: 5 و 1: 10 في PBS. اختبار العينة في ثلاثة أضعاف.
ملاحظة: احتفظ بجزء من مادة 100R للتأهيل النهائي إذا رغبت في ذلك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لإثراء المركبات الكهربائية Mtb من CFP
ملاحظة: الإجراء التالي محدد لاستخدام 3 ملغ من 100R Mtb CFP مع عمود SEC وجامع الكسور التلقائي (AFC، انظر جدول المواد). يمكن تكييفه مع تركيزات البدء الأخرى وأنواع الأعمدة باتباع مواصفات الشركة المصنعة. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى المستخدمون بقراءة وفهم دليل مستخدم جامع الكسور التلقائي.
- اسمح لعمود SEC بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة.
- قم بتشغيل AFC باستخدام مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من وحدة البرج واضبط إعدادات خلية التحميل، إذا لزم الأمر، عن طريق الضغط على SETUP على شاشة اللمس في القائمة الرئيسية. يجب معايرة خلية التحميل فقط عند الاستخدام الأول، وبعد كل تحديث للبرنامج، وفي حالة ملاحظة عدم تناسق في وحدات تخزين تجميع الكسور.
- من شاشة الإعداد ، قم بمحاذاة الدوار عن طريق تحديد CAROUSEL > CALIBRATE. أدخل الدوار مع 13 فتحة صغيرة متجهة لأعلى في برج AFC ، واضبط الدوار بحيث تكون فوهة السائل فوق موضع التدفق مباشرة عن طريق الضغط على الزرين - و / أو + .
- قم بإزالة الأحرف الكبيرة من عمود SEC المتوازن. حرك عمود SEC في حامل العمود المناسب وقم بتثبيته بعناية على برج الاتحاد الآسيوي لكرة القدم. تأكد من أن علامة تعريف التردد اللاسلكي (RFID) الموجودة على العمود تواجه AFC ، وتحقق من أن الاتصال بين العمود والصمام آمن. ضع أنبوب مخرج النفايات في حاوية تجميع.
- من شاشة الإعداد ، حدد جدول التجميع واضبط العدد على 13 والحجم على 0.5 مل بالضغط على الزرين - و/أو + . اترك إعداد "وحدة التخزين المؤقت" كإعداد افتراضي ل 2.7 مل ، ثم أغلق نافذة "جدول التجميع" بالضغط على X.
- حدد START COLLECTION من الشاشة الرئيسية وقم بتأكيد معلمات المجموعة عن طريق تحديد نعم. تحميل 13 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل مع فتح الأغطية والإشارة نحو مركز الدوار.
- تقدم AFC عن طريق تحديد OK ، ثم قم بتركيب خزان العمود والتقدم مرة أخرى عن طريق الضغط على OK. حدد خيار مسح العمود بالضغط على YES، وإضافة وحدة تخزين عمود واحدة بحجم 0.2 ميكرومتر PBS تمت تصفيتها لإزالة أي مخزن مؤقت للتخزين. بمجرد اكتمال التدفق ، تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم عن طريق الضغط على موافق.
- ضع الغطاء الدوار فوق الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واضغط على موافق. قم بإعداد حجم عمود واحد من 0.2 ميكرومتر PBS المصفاة. استخدم ماصة لإزالة أي مخزن مؤقت زائد من العمود.
- أحضر 3 ملغ من عينة 100R كما هو محدد كميا في الخطوة 1.5 إلى 500 ميكرولتر مع 1x PBS. أضف عينة 3 ملغ إلى أعلى العمود. تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واسمح للعينة بالركض في الفريت. بمجرد إدخال العينة بالكامل إلى العمود ، أضف PBS المعد في الخطوة 2.6 إلى الخزان.
- راقب سير عمل الاتحاد الآسيوي لكرة القدم أثناء قيامه أولا بجمع حجم الفراغ ثم الكسور المحددة. بعد اكتمال التشغيل وعودة الدوار إلى وضع النفايات ، قم بإزالة الغطاء ، وقم بإزالة أنابيب الكسر من الدوار. قم بتخزين الكسور عند 4 درجات مئوية قبل القياس الكمي (الخطوة 3) والتأهيل (الخطوة 4).
- إذا كان سيتم إعادة استخدام العمود ، فحدد خيار تنظيف العمود بالضغط على YES; وإلا، اضغط على NO. اتبع التعليمات الواردة في الاتحاد الآسيوي لكرة القدم.
ملاحظة: بمجرد غسل العمود وتشغيل المخزن المؤقت للتخزين، يمكن إزالته وتغطيته وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
3. القياس الكمي للمركبات الكهربائية Mtb
- قم بقياس تركيز البروتين لكل جزء باستخدام BCA و micro BCA12.
- بالنسبة لكسور 0.5 مل التي تم جمعها من 3 ملغ من 100R Mtb CFP ، استخدم BCA الصغير مع تخفيف 1: 3 للكسور المرقمة 1-7 من كل عينة في ثلاثة أضعاف.
- بالنسبة لكسور 0.5 مل المرقمة من 5 إلى 13 ، استخدم BCA بدون تخفيف لكل عينة في ثلاثة أضعاف.
ملاحظة: سيساعد تداخل المقايسات للكسور 5-7 على ضمان أن يكون لجميع الكسور ناتج قابل للقراءة.
- قياس تركيز الجسيمات لكل كسر باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA).
- تمييع العينات في 1 مل من 1x PBS باستخدام نسب البدء المقترحة التالية ؛ بالنسبة للكسور 1-3 ، استخدم 1:100 ، ثم بالنسبة للكسور المتبقية ، استخدم تخفيفا بنسبة 1:10.
- دوامة المحاليل المخففة ثم سحب العينة إلى حقنة 1 مل يمكن التخلص منها. اضبط المحقنة في مضخة حقنة أوتوماتيكية إن وجدت.
- اضبط مضخة المحقنة على 30 ميكرولتر / دقيقة واستخدم إعدادات التقاط الفيديو مع كسب الشاشة من 10-12 ومستوى الكاميرا من 10-12. اضبط التركيز البؤري لكل عينة.
- اجمع ما لا يقل عن ثلاثة مقاطع فيديو بمعدل 30 ثانية لكل منها باستخدام تدفق ثابت.
- قم بإجراء التحليل مع تعيين عتبة اكتشاف البرنامج إلى خمسة.
ملاحظة: قد لا يكون من الممكن الحصول على بيانات NTA لأحدث الكسور (>7) دون التضحية بحجم عينة كبير.
4. تأهيل المركبات الكهربائية Mtb
- تصور ملف تعريف البروتين العام لكل جزء باستخدام جل البروتين الملون بالفضة.
ملاحظة: يمكن العثور على الإجراءات التفصيلية ل SDS-PAGE وبقعة الفضة في المرجع15.- أضف المخزن المؤقت لعينة SDS إلى 10 ميكرولتر من كل كسر و 5 ميكروغرام من CFP و 100R و 100F. تغلي لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية ، ثم يتم تحميلها على 4٪ -12٪ Bis-Tris Gel مع سلم الوزن الجزيئي للرحلان الكهربائي لهلام البولي أكريلاميد (PAGE) (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل الجل باستخدام 1x 2-[N-morpholino] حمض الإيثان سلفونيك (MES) تشغيل المخزن المؤقت (انظر جدول المواد) وتيار 200 فولت لمدة 35 دقيقة.
- أزل الجل من الكاسيت واستمر في تلطيخ الفضة15.
- تقييم وجود أو عدم وجود علامات EV في كل جزء بواسطة اللطخة الغربية.
ملاحظة: يمكن العثور على الإجراءات التفصيلية للنشاف الغربي في المرجع15.- قم بتشغيل هلام SDS-PAGE كما هو موضح في الخطوات 4.1.1-4.1.2.
- قم بإزالة الجل من الكاسيت ونقل البروتينات التي تم حلها إلى غشاء نيتروسليلوز 0.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد) عن طريق تطبيق تيار 50 فولت لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
- قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية لتقييم البروتينات ذات الاهتمام. يوصى باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد LpqH و lipoarabinomannan (LAM) و GroES (انظر جدول المواد).
- كسور التجمع بناء على وجود أو عدم وجود علامات حسب الاقتضاء للتطبيق النهائي.
- تأكد من وجود حويصلات سليمة عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM).
- إصلاح 15 ميكرولتر من عينة الحويصلة عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من 4٪ من بارافورمالديهايد الصف EM وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- قم بإعداد شبكة TEM من النحاس المطلي بالكربون من 200 شبكة.
ملاحظة: يوصى بتنظيف البلازما باستخدام 95٪ أرجون و 5٪ أكسجين و 30٪ من طاقة البلازما لمدة 1 دقيقة. - أسقط 10 ميكرولتر من العينة الثابتة على الشبكة واسمح للعينة بالالتصاق لمدة 10 دقائق ، ثم امسح السائل الزائد بورق الترشيح.
- قم بتعويم الشبكة على قطرة من الماء فائق النقاء لمدة 30 ثانية ، ثم امسح السائل الزائد.
- تعويم الشبكة على قطرة أسيتات اليورانيل من الدرجة d٪ EM لمدة 2 دقيقة ، ثم مسح السائل الزائد.
- اترك الشبكة لتجف في الهواء تماما.
- صورة باستخدام TEM (انظر جدول المواد) عند 100 كيلو فولت أو ما شابه ذلك.
ملاحظة: ينبغي استخدام طرق أخرى لتحديد كمية وتوصيف المركبات الكهربائية استنادا إلى التطبيقات النهائية. يجب الرجوع إلى الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية18 للحصول على إرشادات لضمان دقة وقابلية تكرار جميع دراسات EV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تركيز بروتين ترشيح الثقافة (CFP) من المتفطرة السلية (Mtb) ، وتحديد كميته ، ثم تم تطبيق 3 ملغ من المواد على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). تم تعداد تركيزات البروتين والجسيمات بواسطة BCA و NTA ، على التوالي. وترد في الجدول 1 النطاقات المتوقعة لاستعادة البروتين والجسيمات بالإضافة إلى القيم الدقيقة التي تم الحصول عليها لهذه النتائج. قد تشير القيم الأعلى بكثير من هذه النطاقات إلى مشكلات التلوث أو سلامة العمود. تشير القيم الأقل بكثير إلى مشاكل في خطوات الترشيح الفائق ، وبالتالي يجب مقارنة التدفق من خلال CFP و 100R لتحديد ما إذا كان التركيز الناجح قد حدث. تظهر بقعة فضية غير محددة للبروتين أن الكسور اللاحقة تحتوي على المزيد من البروتين وتشبه مادة 100R (الشكل 1).
توضح البقع الغربية للكسور أن lipoarabinomannan (LAM) موجود عبر الكسور ، مع الكسور اللاحقة التي تظهر نطاقات أقل كثافة (الشكل 2A ، الشكل التكميلي 1). يتم إثراء البروتين الدهني LpqH 19 kDa ، المعروف بوجوده في Mtb EVs 3,19 ، في الكسور الأولى من SEC (الشكل 2B ، الشكل التكميلي 1). وبروتين الشابيرون GroES البالغ 10 كيلوداد غائب في الكسور الأولى من لجنة الأوراق المالية والبورصات (الشكل 2 جيم، الشكل التكميلي 1)؛ تتوافق هذه النتيجة مع الدراسات المنشورة سابقا بشأن GroES كملوث أثناء تخصيب Mtb EV12 وتعمل كعنصر تحكم سلبي لوجود Mtb EV. يؤكد المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) وجود حويصلات مغلقة مرتبطة بالغشاء (الشكل 3A). وترد في الجدول 2 مقارنة بين المركبات الكهربائية Mtb المفصولة بالترشيح الفائق لتدرج الكثافة وطريقة SEC هذه. يوفر SEC استردادا أعلى للبروتين والجسيمات لثلاثة نسخ تقنية من نفس CFP. كانت هذه النتائج متسقة عبر دفعات متعددة من CFP (البيانات غير معروضة). وتؤدي كلتا الطريقتين إلى حويصلات مغلقة مرتبطة بالغشاء في نطاق الحجم المتوقع، كما هو موضح في TEM (الشكل 3) وNTA (الشكل 4).
إجمالا ، تظهر هذه البيانات إثراء المركبات الكهربائية Mtb في كسور SEC المبكرة. تحدث أعلى قيم NTA في الكسور 1-3 ، ويزداد محتوى البروتين مع ارتفاع عدد الكسور ، مما يشير إلى فصل البروتينات القابلة للذوبان عن EVs (الجدول 1). نظرا لأن الكسر 4 يحتوي على دليل على GroES (الشكل 2C ، الشكل التكميلي 1) ، لم يتم تضمين هذا الكسر في المواد المجمعة ل TEM. اعتمادا على تطبيق المصب ، يجب النظر في إدراج أو استبعاد كسور محددة لاستراتيجية التجميع.
الشكل 1: بقعة الفضة بالكسر. يوضح جل SDS-PAGE الملطخ بالفضة الشكل الكلي للبروتين لكل كسر. CFP = 5 ميكروغرام من Mtb CFP ، 100R = 5 ميكروغرام من 100R ، 100F = 5 ميكروغرام من 100F ، 1-11 = 10 ميكرولتر من كسور SEC 1-11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: البقع الغربية حسب الكسر. بقع غربية تكتشف (A) LAM و (B) LpqH و (C) GroES ، مما يدل على تغيرات علامة البروتين عبر الكسور. CFP = 5 ميكروغرام من Mtb CFP ، 100R = 5 ميكروغرام من 100R ، 100F = 5 ميكروغرام من 100F ، 1-11 = 10 ميكرولتر من كسور SEC 1-11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور المجهر الإلكتروني الناقل (TEM). (أ) كسور SEC 1-3 مجمعة قبل التثبيت. (ب) كان الطرد المركزي الفائق التدرج المكثف لمركبات Mtb EVs ملطخا سلبا لتصوير TEM. أشرطة المقياس = 200 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توزيع تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). (أ) كسور SEC 1-3. (ب) تم تحليل المركبات الكهربائية Mtb EVs للطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية. يتم عرض توزيع الحجم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| جزء | نطاق استعادة البروتين (ميكروغرام / ميكرولتر) | نطاق استرداد الجسيمات (لكل ميكرولتر) | نتيجة استعادة البروتين (ميكروغرام / ميكرولتر) | نتيجة استرداد الجسيمات (لكل ميكرولتر) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1.60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2.10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5.20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2.70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1.40E+06 |
الجدول 1: استعادة البروتين والجسيمات بالكسر. نطاق استرداد البروتين والجسيمات المتوقع لكل جزء على أساس 3 ملغ من المواد الأولية. يتم تضمين القيم الدقيقة للحصول على المواد المستخدمة في هذه الدراسة في العمودين في أقصى اليمين.
| طريقة الإثراء | إجمالي البروتين المسترد (ميكروغرام) | إجمالي الجسيمات المستردة |
| الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1.93E+10 | |
| 3.20 | 1.65E+10 | |
| كروماتوغرافيا استبعاد الحجم F1-3 | 12.96 | 4.05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35E+10 |
الجدول 2: طريقة مقارنة استعادة البروتين والجسيمات. تم قياس إنتاج البروتين باستخدام BCA وإجمالي عدد الجسيمات المقاسة بواسطة NTA ل Mtb EVs الناشئة من 3 ملغ من نفس المادة الأولية 100R ، المخصب باستخدام طريقة الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة المشار إليها8 أو طريقة SEC هذه (ثلاثة أضعاف).
الشكل التكميلي 1: البقع الغربية الأصلية (غير المقصوصة) من الشكل 2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية هي خزانات مستضدية للغاية ، والتي تقدمها كوسيلة جذابة لتطوير أدوات التشخيص واللقاحات المستقبلية4،19،20. تاريخيا ، تم استخدام الطرد المركزي الفائق التدرج للكثافة لفصل Mtb EVs عن المواد الأخرى القابلة للذوبان والمفرزة8. في حين أن هذه العملية فعالة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا ، وتمثل تحديا تقنيا ، وقد تؤثر على سلامة مستحضرات EV الناتجة 9,10. يقدم البروتوكول المقدم طريقة بديلة لتحضيرات Mtb EV من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC).
هناك العديد من النقاط الحرجة للنجاح في هذه الطريقة. سيؤثر إعداد Mtb CFP الأولي على جودة وإنتاجية الحويصلات بعد SEC. يوصى بحصاد CFP في أو قبل مرحلة منتصف السجل من النمو للحد من مستوى التحلل الخلوي في وقت الحصاد. يمكن أن تحتوي مزارع مرحلة النمو المتأخرة والثابتة على مستويات أعلى من تحلل الخلايا ويمكن أن تؤدي إلى تحديد البروتينات داخل الخلايا والهياكل الشبيهة ب EV الاصطناعية ، التي يتم إنشاؤها تلقائيا من شظايا الغشاء للخلايا المحللة ، كمساهم كبير في CFP12,13,14 الذي تم جمعه . يجب تقييم ذلك قبل البدء في هذا البروتوكول حيث أن الحويصلات الغشائية من الخلايا المحللة ستشترك في التنقية مع EVs Mtb المفرز وتحليلات الانحراف المحتملة في اتجاه المصب. يجب توخي الحذر أثناء الترشيح الفائق لضمان بقاء غشاء المرشح سليما ورطبا. يمكن أن يؤدي تلف المرشح إلى تدفق المواد المرغوبة من خلاله. إن تضمين CFP الأصلي و 100R و 100F في تقييمات الجودة النهائية سيساعد في تقييم سلامة الترشيح الفائق.
يعد الإعداد والغسيل المناسبان لعمود SEC ضروريين لإعداد EV عالي الجودة. اتبع دائما أدلة المستخدم للإعداد والإزالة. أثناء جمع الكسور، تأكد من عدم تعرض الاتحاد الآسيوي لكرة القدم للصدمات أو نقلها لأن هذا يمكن أن يقطع العملية ويؤدي إلى تخطي الكسور أو عدم تناسقها. وستعتمد الأجسام المضادة المستخدمة للتأهيل على التطبيق النهائي للحويصلات المخصبة، وينبغي أن تتضمن علامة يتوقع أن تكون في المركبات الكهربائية Mtb (LpqH) وعلامة موجودة في CFP ولكن لا يتم إثراؤها في المركبات الكهربائية Mtb (GroES). أحد القيود على الطرق المعروضة هنا هو التباين المحتمل في ضوابط البروتين المناسبة. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام طرق زراعة قياسية. اقترح العمل المنجز مع المتفطرة avium أن مستويات المرافقين مثل GroES تتغير في CFP و EVs بناء على الوسط المستخدم للنمو21. مع ظهور المزيد من المعلومات حول تكوين EV المتفطرة ، قد يكون من الضروري ضبط علامة التحكم السلبية المحددة.
وأخيرا، ينبغي تنفيذ جميع إجراءات التحديد الكمي والتأهيل والطلبات النهائية بسرعة. إذا كان تخزين المواد مطلوبا ، يوصى ب 4 درجات مئوية على التجميد لمنع تعطل سلامة الحويصلة أثناء عملية التجميد والذوبان. إذا تم تنفيذ التجميد ، فقم باقتباس المادة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. وينبغي إعادة تقييم المركبات الكهربائية المخصبة كما ونوعيا إذا مر قدر كبير من الوقت بين التقييم الأولي والاستخدام.
هذه الطريقة تثري بشكل فعال Mtb EVs ، وهناك مرونة للتكيف مع المتفطرات الأخرى. عند تكييف هذا الإجراء مع الكائنات الحية الأخرى ، تأكد من أن ثقافة البدء لديها تحلل خلوي محدود. يجب ضبط كمية المواد المحملة على العمود ، حيث ستختلف حركية إطلاق EV. لا تتجاوز الحد الأقصى لتركيز البروتين البالغ 7 جم لكل 100 مل بناء على مواصفات الشركة المصنعة. من الضروري أيضا تقييم كل جزء على حدة لوجود علامات وملوثات مرتبطة بالمركبات الكهربائية. قد يكون تركيز البروتين وبيانات NTA مضللة في تحسين الطريقة: تركيز البروتين المنخفض جدا لا يعني عدم وجود حويصلات في تلك الكسور. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح تغيير أعمدة SEC ومعلمات جمع الكسور للمستخدم بتوسيع نطاق البروتوكول استنادا إلى تطبيقات الإدخال والمصب. وتشمل القيود المفروضة على هذه الطريقة تكلفة الاتحاد الآسيوي لكرة القدم والمواد الاستهلاكية، والناتج المخفف، وكما ذكرنا سابقا، تطوير وتحسين مخطط تجميع الفصائل. في حين أن الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة له مزاياه وربما أكثر قابلية للتطبيق على بعض التجارب ، فإن إثراء المركبات الكهربائية Mtb بواسطة SEC قابل للمقارنة من حيث الجودة ومتفوقا في الوصول وسهولة الاستخدام ، كما هو موضح هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشيد بالدعم المقدم من الجائزة التجريبية لكلية الطب البيطري والعلوم الطبية الحيوية وبرنامج البحوث المشتركة لمجلس أبحاث الكلية إلى NKG والتمويل المقدم من ATCC (الجائزة رقم 2016-0550-0002) إلى KMD. نود أيضا أن نشيد بآن سيمبسون على الدعم الفني و BEI Resources و NIAID و NIH على الكواشف التالية: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) ، IT-54 (المنتجة في المختبر) ، NR-13792 ، Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c) ، Clone IT-3 (SA-12) (المنتجة في المختبر) ، NR-49223 ، و Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM ، Clone CS-35 (المنتجة في المختبر) ، NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization.
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al.
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
