Summary
פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.
Abstract
תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בהקשר של זיהום חיידקי התגלה כאפיק חדש להבנת הפיזיולוגיה המיקרוביאלית. באופן ספציפי, כלי רכב חשמליים של Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ממלאים תפקיד באינטראקציה בין מארח לפתוגן ובתגובה ללחץ סביבתי. כלי רכב חשמליים מסוג Mtb הם גם אנטיגניים מאוד ומראים פוטנציאל כמרכיבי חיסון. השיטה הנפוצה ביותר לטיהור רכבים חשמליים מסוג Mtb היא אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות. לתהליך זה יש מספר מגבלות, כולל תפוקה נמוכה, תפוקה נמוכה, הסתמכות על ציוד יקר, אתגרים טכניים, והוא יכול להשפיע לרעה על ההכנה המתקבלת. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) היא שיטה חלופית עדינה יותר הנלחמת ברבות מהמגבלות של אולטרה-צנטריפוגציה. פרוטוקול זה מדגים כי SEC יעיל להעשרת Mtb EV ומייצר תכשירי Mtb EV באיכות גבוהה של תפוקה מוגברת באופן מהיר ומדרגי. בנוסף, השוואה ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות על ידי כימות והליכי הסמכה מדגימה את היתרונות של SEC. בעוד שההערכה של כמות EV (ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים), פנוטיפ (מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה) ותוכן (כתם מערבי) מותאמת לרכבים חשמליים מסוג Mtb, ניתן ליישם את זרימת העבודה המסופקת על מיקובקטריות אחרות.
Introduction
שחרור שלפוחית חוץ-תאית (EV) על ידי פתוגנים עשוי להיות המפתח לפתיחת טכנולוגיות חדשות לשליטה במחלות זיהומיות1. מיקובקטריום שחפת (Mtb) הוא פתוגן בעל השלכות גבוהות, מדביק כשליש מאוכלוסיית העולם וגובה את חייהם של מיליוני אנשים בכל שנה2. ייצור EV על ידי Mtb מתועד היטב ועם זאת חמקמק בביוגנזה ובתפקידים המגוונים (כלומר, אימונוסטימולטוריים, מדכאי חיסון, ברזל ורכישת חומרים מזינים) של כלי רכב חשמליים אלה בהקשר של זיהום 3,4,5. מאמצים להבין את הרכבם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb חשפו כדורים סגורים של 50-150 ננומטר של ממברנת השומנים הנגזרים מממברנת הפלזמה המכילים שומנים וחלבונים בעלי משמעות אימונולוגית 3,6. חקירת תפקידם של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb בפיזיולוגיה של חיידקים גילתה את החשיבות של אפנון ר"ח חיידקי בתגובה ללחץ סביבתי להישרדות5. מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגנים היו מסובכים יותר לפענוח, אך הראיות מצביעות על כך שרכבים חשמליים מסוג Mtb יכולים להשפיע על התגובה החיסונית של המארח ועשויים לשמש כמרכיב חיסון יעיל 3,4,7.
רוב המחקרים על כלי רכב חשמליים מסוג Mtb עד כה הסתמכו על אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות להעשרת שלפוחית8. זה היה יעיל למחקרים בקנה מידה קטן; עם זאת, לטכניקה זו יש מספר אתגרים טכניים ולוגיסטיים. זרימות עבודה חלופיות מצמידות צנטריפוגה מרובת שלבים, להסרת תאים שלמים ופסולת גדולה, עם שלב אולטרה-צנטריפוגציה סופי לרכבים חשמליים כדוריים. מתודולוגיה זו יכולה להשתנות ביעילותה, ולעתים קרובות גורמת לתפוקה נמוכה ולטיהור משותף של ביו-מולקולות מסיסות שאינן קשורות לשלפוחית, תוך השפעה על שלמותהשלפוחית 9. בנוסף, תהליך זה גוזל זמן רב, אינטנסיבי באופן ידני ומוגבל מאוד בתפוקה בשל אילוצי ציוד.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה חלופית ל-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות: כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). שיטה זו הוכחה עבור מיקובקטריה סביבתית, ובעבודה הנוכחית, היא עברה אקסטרפולציה ל- Mtb10. עמודה זמינה מסחרית ואספן שברים אוטומטי יכולים לשפר את העקביות בהכנת שלפוחית ולהפחית את הצורך בציוד ספציפי ויקר. ניתן גם להשלים פרוטוקול זה בשבריר מהזמן בהשוואה לאולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמגדיל את התפוקה. טכניקה זו פחות מאתגרת מבחינה טכנית, מה שמקל על השליטה בה, ויכולה להגביר את יכולת השכפול הבין-מעבדתית. לבסוף, ל-SEC יש יעילות הפרדה גבוהה והיא עדינה, תוך שמירה על שלמות הבועיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה לביו-בטיחות מוסדית של אוניברסיטת מדינת קולורדו אישרה את המחקר הנוכחי (19-046B). טיפוח שחפת מיקובקטריום וקצירת סופרנאטים עשירים ב-EV בוצעו על ידי צוות מיומן במעבדה להכלה גבוהה. החומרים הועברו אל מחוץ לאזור ההכלה הגבוהה לאחר ששיטת השבתה תקפה בוצעה, אושרה ואושרה על ידי מדיניות הבטיחות הביולוגית המוסדית. בעוד ששכפול הפרוטוקול, אם שיטת ההשבתה או הסינון הסטרילית המאומתת אינה אפשרית, יש לבצע את ההליכים הבאים במעבדה עם הכלה גבוהה.
1. הכנת תרכיז Mtb EV גולמי
הערה: להליכים מפורטים על גידול Mtb והכנת חלבון תסיסה תרבית (CFP), ראה הפניות11,12. מומלץ כי מדיית תרביות החיידקים תהיה נקייה מתוספי גדילה עם רכיבים המכילים EV או חלבוניים, כגון אלבומין דקסטרוז קטלאז (OADC), ודטרגנטים כגון Tween. כמו כן, מומלץ לבדוק את איכות תרבית החיידקים ואת ה-CFP שנקטף כדי להבטיח מוות מוגבל של תאים וליזה13,14.
- הכינו מסנן צנטריפוגלי לחתוך משקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO) (ראו טבלת חומרים) על ידי הוספת קיבולת הנפח המלאה של מי מלח עם מאגר פוספט (1x PBS). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 2,800 x g ב 4 °C (64 °F).
הערה: אם משתמשים במסנן ללא נפח עצירה מת, יש להקפיד על כך שנפח הדגימה לא יקטן מתחת לרמת המסנן, וכתוצאה מכך יתייבש המסנן באופן מלא במהלך צנטריפוגה. - יש להשליך את הזרימה-דרך ואת כל ה-PBS הנותרים לפני מילוי תא הדגימה ב-Mtb CFP עד לקיבולת המרבית שלו. צנטריפוגה ב 2,800 x g ב 4 °C עד הנפח הצטמצם לנפח המינימלי של התקן סינון אולטרה. חזור על הפעולה לפי הצורך, והוסף עוד CFP ליחידה עד שהמדגם כולו הופחת מספיק.
הערה: שמור על חלק מהחומר של 100 kDa לזרימה דרך (100F) להסמכה במורד הזרם במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. - הוסף 1x PBS ליחידת המסנן המכילה את התרכיז עד לקיבולת ההתקן הכוללת. הקטן את עוצמת הקול כמתואר ב- 1.2. חזור על שלב זה חמש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה והחלפת חיץ.
- שחזר את 100 kDa מרוכז CFP retentate (100R) על פי מפרטי התקן סינון אולטרה (ראה טבלת חומרים). לאחר שחזור ה-100R, שטפו את המסנן בנפח מינימלי של 1x PBS לפחות שלוש פעמים, ואגרו את השטיפה עם ה-100R כדי למקסם את ההתאוששות.
- הוסיפו את החומר 100R ל-100R עם בדיקה דו-צ'ינכונינית (BCA) בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). כדי לבצע את הבדיקה, השתמש במספר דילולים של דגימות 1:2, 1:5 ו- 1:10 ב- PBS. בדוק את המדגם במשולש.
הערה: שמור חלק מחומר ה- 100R להסמכה במורד הזרם במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. כרומטוגרפיית אי הכללת גודל להעשרת כלי רכב חשמליים מסוג Mtb מ-CFP
הערה: ההליך הבא הוא ספציפי לשימוש ב- 3 מ"ג של 100R Mtb CFP עם עמודת SEC ואספן שברים אוטומטי (AFC, ראה טבלת חומרים). ניתן להתאים אותו לריכוזי התחלה וסוגי עמודות אחרים על ידי ביצוע מפרט היצרן. בנוסף, מומלץ למשתמשים לקרוא ולהבין את המדריך האוטומטי למשתמש של אספן שברים.
- אפשרו לעמודת ה-SEC להתאיף לטמפרטורת החדר.
- הפעילו את ה-AFC באמצעות מתג ההפעלה בחלק האחורי של יחידת המגדל והתאימו את ההגדרות לתא העומס, במידת הצורך, על-ידי לחיצה על SETUP במסך המגע הראשי של התפריט. יש לכייל את תא העומס רק בעת השימוש הראשון, לאחר כל עדכון תוכנה, ואם ניתן להבחין בחוסר עקביות באמצעי האחסון של איסוף השברים.
- ממסך SETUP , יישרו את הקרוסלה על ידי בחירה ב-CAROUSEL >-CALIBRATE. הכנס את הקרוסלה עם 13 החורים הקטנים הפונים כלפי מעלה למגדל AFC, והתאים את הקרוסלה כך שזרבובית הנוזל תהיה ישירות מעל מיקום הסומק על ידי לחיצה על הכפתורים - ו / או + .
- הסר את המכסות מעמודת ה- SEC המשוזנת. החלק את עמודת ה- SEC לתוך תושבת העמודה המתאימה והתקין אותה בקפידה במגדל AFC. ודא שתג זיהוי תדר הרדיו (RFID) בעמודה פונה ל- AFC, ובדוק שהחיבור בין העמודה לשסתום מאובטח. מניחים את צינורות שקע הפסולת במיכל איסוף.
- ממסך SETUP , בחר לוח זמנים לאיסוף והגדר את הספירה ל- 13 ואת הגודל ל- 0.5 מ"ל על-ידי לחיצה על הלחצנים - ו / או + . השאר את ההגדרה "אמצעי אחסון מאגר" כברירת המחדל של 2.7 מ"ל ולאחר מכן סגור את החלון "לוח זמנים לאיסוף" על-ידי הקשה על X.
- בחר התחל אוסף ממסך הבית ואשר את פרמטרי האוסף על-ידי בחירה ב- YES. טען 13 מסומן 1.7 מ"ל צינורות microcentrifuge עם המכסים פתוחים ומצביעים לכיוון מרכז הקרוסלה.
- קדם את ה- AFC על-ידי בחירת אישור, ולאחר מכן הרכיב את מאגר העמודות והתקדם שוב על-ידי לחיצה על אישור. בחר באפשרות לשטוף את העמודה על-ידי הקשה על YES, והוסף נפח עמודה אחד של PBS מסונן של 0.2 μm כדי להסיר כל מאגר אחסון. לאחר השלמת ההדחה, קדם את ה- AFC על ידי לחיצה על אישור.
- הניחו את כיסוי הקרוסלה מעל ה-AFC ולחצו על OK. הכן נפח עמודה אחד של 0.2 מיקרומטר מסונן PBS. השתמש בפיפטה כדי להסיר כל מאגר עודף מהעמודה.
- הביאו 3 מ"ג של דגימת 100R כפי שמכומתת בשלב 1.5 עד 500 μL עם 1x PBS. הוסף את הדגימה של 3 מ"ג לראש העמודה. קדם את ה- AFC ואפשר לדוגמה לרוץ לתוך הפריט. לאחר שהדגימה נכנסה במלואה לעמודה, הוסף את ה- PBS שהוכן בשלב 2.6 למאגר.
- נטר את הרצת ה- AFC בזמן שהוא אוסף תחילה את נפח הריק ולאחר מכן את השברים שצוינו. לאחר שהריצה מסתיימת והקרוסלה חוזרת למצב פסולת, הסירו את הכיסוי והסירו את צינורות השבר מהקרוסלה. אחסן את השברים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הכימות (שלב 3) וההסמכה (שלב 4).
- אם יש לעשות שימוש חוזר בעמודה, בחר באפשרות לנקות את העמודה על-ידי הקשה על כן; אחרת, לחץ על לא. בצע את ההוראות ב- AFC.
הערה: לאחר שהעמודה נשטפת ומאגר האחסון פועל, ניתן להסיר אותה, לכסותה ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4 °C (7 °F).
3. כימות כלי הרכב החשמליים של Mtb
- מדוד את ריכוז החלבון עבור כל שבר באמצעות BCA ו- micro BCA12.
- עבור שברים של 0.5 מ"ל שנאספו מ-3 מ"ג של 100R Mtb CFP, השתמש במיקרו BCA עם דילול של 1:3 עבור שברים הממוספרים 1-7 מכל דגימה במשולש.
- עבור שברים של 0.5 מ"ל הממוספרים 5-13, השתמש ב- BCA ללא דילול עבור כל דגימה במשולש.
הערה: חפיפה בין המבחנים עבור שברים 5-7 תסייע להבטיח שלכל השברים יש פלט קריא.
- יש למדוד את ריכוז החלקיקים עבור כל שבר באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA).
- לדלל את הדגימות ב-1 מ"ל של 1x PBS באמצעות יחסי ההתחלה המוצעים הבאים; עבור שברים 1-3, השתמש ב- 1:100 ולאחר מכן עבור השברים הנותרים, השתמש בדילול של 1:10.
- מערבולת את הפתרונות המדוללים ולאחר מכן שואבים את הדגימה למזרק חד פעמי של 1 מ"ל. הגדר את המזרק במשאבת מזרק אוטומטית אם היא זמינה.
- הגדר את משאבת המזרק ל- 30 μL /min והשתמש בהגדרות לכידת הווידאו עם רווח מסך של 10-12 ורמת מצלמה של 10-12. התאם את המיקוד עבור כל דגימה.
- אסוף מינימום של שלושה סרטונים ב-30 שניות כל אחד באמצעות זרימה קבועה.
- בצע את הניתוח כאשר סף זיהוי התוכנה מוגדר לחמישה.
הערה: ייתכן שלא ניתן יהיה לקבל נתוני נת"ע עבור השברים האחרונים (>7) מבלי להקריב נפח דגימה משמעותי.
4. הסמכת רכבים חשמליים מסוג Mtb
- דמיינו את פרופיל החלבון הכללי של כל שבר באמצעות ג'ל חלבון מוכתם בכסף.
הערה: ניתן למצוא נהלים מפורטים עבור SDS-PAGE וכתם כסף בהפניה15.- הוסף מאגר דגימות SDS ל- 10 μL של כל שבר ו- 5 מיקרוגרם של CFP, 100R ו- 100F. מרתיחים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס, ואז מעמיסים על ג'ל Bis-Tris של 4%-12% עם סולם משקל מולקולרי לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) (ראו טבלת חומרים).
- הפעל את הג'ל באמצעות 1x 2-[N-morpholino]חומצה אתנסולפונית (MES) רץ (ראה טבלת חומרים) וזרם של 200 וולט למשך 35 דקות.
- מוציאים את הג'ל מהקלטת וממשיכים עם צביעת כסף15.
- הערך את נוכחותם או היעדרם של סמני EV בכל שבר לפי כתם מערבי.
הערה: נהלים מפורטים לכתם מערבי ניתן למצוא בהפניה15.- הפעל ג'ל SDS-PAGE כמתואר בשלבים 4.1.1.1-4.1.2.
- מוציאים את הג'ל מהקלטת ומעבירים את החלבונים שנפתרו לממברנה ניטרוצלולוז של 0.2 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) על ידי מריחת זרם של 50 וולט למשך שעה לפחות.
- בצע ניתוח כתמים מערביים כדי להעריך חלבונים בעלי עניין. מומלץ להשתמש בנוגדנים ראשוניים נגד LpqH, ליפוראבינומנאן (LAM) ו-GroES (ראו טבלת חומרים).
- חלקי מאגר המבוססים על נוכחותם או היעדרם של סמנים לפי העניין עבור היישום במורד הזרם.
- אשר את נוכחותם של בועיות שלמות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).
- תקן 15 μL של דגימת השלפוחית על ידי הוספת 15 μL של 4% כיתה EM paraformaldehyde ולאחסן ב 4 ° C לילה.
- הכינו רשת TEM מנחושת מצופה 200 Mesh formvar-carbon על ידי ניקוי המשטח ויצירת מצע הידרופילי.
הערה: מומלץ לנקות פלזמה עם 95% ארגון, 5% חמצן ו-30% הספק פלזמה למשך דקה אחת. - שחררו 10 μL מהדגימה הקבועה על הרשת ואפשרו לדגימה להידבק למשך 10 דקות, ואז הכתימו את הנוזל העודף עם נייר מסנן.
- צפו את הרשת על טיפת מים אולטרה-אפורים במשך 30 שניות, ואז הורידו את עודפי הנוזלים.
- צפו את הרשת על טיפת אורניל אצטט בדרגה d% EM למשך 2 דקות, ואז הורידו את הנוזל העודף.
- אפשרו לרשת להתייבש לחלוטין באוויר.
- תמונה באמצעות TEM (ראה טבלת חומרים) ב- 100 kV או דומה.
הערה: יש להשתמש בשיטות אחרות של כמות ואפיון של EV בהתבסס על יישומים במורד הזרם. יש לעיין במידע המינימלי למחקרים של שלפוחית חוץ-תאית18 לקבלת הנחיות כדי להבטיח את ההקפדה ויכולת השכפול של כל מחקרי הרכב החשמלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חלבון ניעול תרבית (CFP) מ-Mycobacterium tuberculosis (Mtb) היה מרוכז, כומת, ולאחר מכן הוחלו 3 מ"ג של חומר על עמודת כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל (SEC). ריכוזי החלבון והחלקיקים נמנו על ידי BCA ו-NTA, בהתאמה. הטווחים הצפויים להתאוששות חלבונים וחלקיקים בתוספת הערכים המדויקים שהתקבלו עבור תוצאות אלה מדווחים בטבלה 1. ערכים גבוהים בהרבה מטווחים אלה עשויים להצביע על בעיות זיהום או שלמות עמודה. הערכים נמוכים משמעותית מצביעים על בעיות בשלבי הסינון האולטרה-סינון, ולכן יש להשוות את הזרימה-דרך ל-CFP ההתחלתי ול-100R כדי לקבוע אם התרחש ריכוז מוצלח. כתם כסף חלבון לא ספציפי מראה ששברים מאוחרים יותר מכילים יותר חלבון ודומים לחומר 100R (איור 1).
כתמים מערביים של השברים מראים כי ליפואראבינומנאן (LAM) נמצא על פני השברים, כאשר שברים מאוחרים יותר מראים פסים בעוצמה נמוכה יותר (איור 2A, איור משלים 1). ליפופרוטאין LpqH של 19 kDa, הידוע כנמצא ברכבים חשמליים מסוג Mtb 3,19, מועשר בשברים המוקדמים ביותר מה-SEC (איור 2B, איור משלים 1). חלבון ה-GroES של 10 kDa נעדר בשברים המוקדמים ביותר מה-SEC (איור 2C, איור משלים 1); ממצא זה מתיישב עם מחקרים שפורסמו בעבר לגבי GroES כמזהם במהלך העשרת Mtb EV12 ומשמש כבקרה שלילית לנוכחות Mtb EV. מיקרוסקופיית אלקטרונים תמסורת (TEM) מאשרת את נוכחותן של שלפוחיות סגורות הקשורות לממברנה (איור 3A). השוואה של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb המופרדים על ידי סינון אולטרה הדרגתי של צפיפות ושיטת SEC זו מדווחת בטבלה 2. SEC מספקת שחזור גבוה יותר של חלבונים וחלקיקים עבור שלושה שכפולים טכניים מאותו CFP. תוצאות אלה היו עקביות בין קבוצות מרובות של CFP (נתונים שלא הוצגו). שתי השיטות יוצרות שלפוחיות סגורות הקשורות לממברנה בטווח הגודל הצפוי, כפי שהדגימו TEM (איור 3) ו-NTA (איור 4).
בסך הכל, נתונים אלה מדגימים העשרה של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb בשברים המוקדמים של ה-SEC. ערכי ה-NTA הגבוהים ביותר מופיעים בשברים 1-3, ותכולת החלבון עולה ככל שמספר השברים עולה, מה שמעיד על הפרדת חלבונים מסיסים מהרכבים החשמליים (טבלה 1). מאחר ששבר 4 מכיל עדויות ל-GroES (איור 2C, איור משלים 1), חלק זה לא נכלל בחומר המאוגד עבור TEM. בהתאם ליישום במורד הזרם, יש לקחת בחשבון הכללה או אי הכללה של שברים ספציפיים עבור אסטרטגיית האיגום.
איור 1: כתם כסף לפי שבר. ג'ל SDS-PAGE המוכתם בכסף מדגים את פרופיל החלבון הכולל של כל שבר. CFP = 5 מיקרוגרם של Mtb CFP, 100R = 5 מיקרוגרם של 100R, 100F = 5 מיקרוגרם של 100F, 1-11 = 10 μL של שברים SEC 1-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: כתמים מערביים לפי שבר. כתמים מערביים המזהים (A) LAM, (B) LpqH ו-(C) GroES, המדגימים שינויים בסמן החלבון על פני השברים. CFP = 5 מיקרוגרם של Mtb CFP, 100R = 5 מיקרוגרם של 100R, 100F = 5 מיקרוגרם של 100F, 1-11 = 10 μL של שברים SEC 1-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: צילומי מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) הולכה. (B) אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות של כלי רכב חשמליים מסוג Mtb הוכתמה לרעה עבור הדמיית TEM. סרגלי קנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: התפלגות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) (A) SEC שברים 1-3. (B) ה-Mtb Etb Evs Etb Etb של שיפוע הצפיפות נותחו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. התפלגות הגודל מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| שבר | טווח התאוששות חלבונים (מיקרוגרם/מיקרול) | טווח שחזור חלקיקים (לכל μL) | תוצאה של התאוששות חלבון (מיקרוגרם/מיקרול) | תוצאה שחזור חלקיקים (לכל μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1.60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2.10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5.20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2.70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1.40E+06 |
טבלה 1: התאוששות חלבונים וחלקיקים לפי שבר. טווח ההתאוששות הצפוי של חלבון וחלקיקים לכל שבר בהתבסס על 3 מ"ג של חומר התחלתי. הערכים המדויקים לקבלת החומר המשמש במחקר זה נכללים בשתי העמודות הימניות ביותר.
| שיטת העשרה | סה"כ חלבון משוחזר (מיקרוגרם) | סך כל החלקיקים שהתאוששו |
| צפיפות הדרגתית אולטרה-צנטריפוגציה | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1.93E+10 | |
| 3.20 | 1.65E+10 | |
| כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל F1-3 | 12.96 | 4.05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35E+10 |
טבלה 2: השוואת שיטות של התאוששות חלבונים וחלקיקים. תפוקת החלבון נמדדה עם BCA וספירת החלקיקים הכוללת שנמדדה על ידי NTA עבור כלי רכב חשמליים מסוג Mtb שמקורם ב-3 מ"ג מאותו חומר התחלתי של 100R, מועשרים באמצעות שיטת האולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע הצפיפות הייחוס8 או בשיטת SEC זו (טריפליקט).
איור משלים 1: כתמים מערביים מקוריים (לא חתוכים) מתוך איור 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריום שחפת הן מאגרים אנטיגניים מאוד, המציגים אותן כאפיק אטרקטיבי לפיתוח כלי אבחון וחיסונים עתידיים 4,19,20. מבחינה היסטורית, אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות שימשה להפרדת כלי רכב חשמליים מסוג Mtb מחומרים מסיסים ומופרשים אחרים8. בעוד שתהליך זה יעיל, הוא גם גוזל זמן רב, מאתגר מבחינה טכנית, ועלול להשפיע על שלמותם של תכשירי הרכב החשמלי המתקבלים 9,10. הפרוטוקול המוצג מציע שיטה חלופית להכנת Mtb EV באמצעות כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC).
ישנן מספר נקודות קריטיות להצלחה בשיטה זו. ההכנה הראשונית של Mtb CFP תשפיע על האיכות והתפוקה של שלפוחיות בעקבות SEC. מומלץ לקצור CFP בשלב אמצע הלוג של הגידול או לפניו כדי להגביל את רמת התזה התאית בזמן הקציר. תרביות שלב גדילה מאוחרות ונייחות יכולות להכיל רמות גבוהות יותר של תזת תאים ויכולות לגרום לזיהוי של חלבונים תוך-תאיים ומבנים דמויי EV, הנוצרים באופן ספונטני מקטעי הממברנה של התאים המכוסים, כתורם משמעותי ל-CFPשנאסף 12,13,14 . יש להעריך זאת לפני תחילת פרוטוקול זה, שכן שלפוחיות ממברנה מתאים שעברו טיהור משותף עם כלי רכב חשמליים מופרשים מסוג Mtb וניתוחים פוטנציאליים של הטיה במורד הזרם. יש להקפיד במהלך סינון אולטרה כדי להבטיח כי קרום המסנן נשאר שלם ורטוב. נזק למסנן יכול לגרום לחומר הרצוי לזרום דרכו. הכללת ה-CFP המקורי, 100R ו-100F בהערכות איכות במורד הזרם תסייע בהערכת שלמות סינון האולטרה-סינון.
התקנה נכונה ושטיפה של עמודת ה- SEC נחוצות להכנת EV באיכות הגבוהה ביותר. עקוב תמיד אחר המדריכים למשתמש לצורך התקנה והסרה. בזמן שהשברים נאספים, ודא שה-AFC לא יתנגש או יוזז מכיוון שהדבר עלול להפריע לתהליך ולהוביל לשברים מדלגים או לא עקביים. הנוגדנים המשמשים להסמכה יהיו תלויים ביישום במורד הזרם של הבועיות המעשרות, וצריכים לכלול סמן שצפוי להיות ברכבים חשמליים מסוג Mtb (LpqH) וסמן שנמצא ב-CFP אך אינו מועשר ברכבים חשמליים מסוג Mtb (GroES). מגבלה אחת לשיטות המוצגות כאן היא שונות פוטנציאלית בבקרות חלבונים מתאימות. פרוטוקול זה פותח בשיטות תרבות סטנדרטיות. עבודה שבוצעה עם Mycobacterium avium העלתה את האפשרות שרמות של מלווים כמו GroES משתנות ב-CFP וברכבים חשמליים בהתבסס על המדיום המשמש לצמיחה21. ככל שמתגלה מידע נוסף לגבי הרכב EV מיקובקטריאלי, ייתכן שיהיה צורך בהתאמת סמן הבקרה השלילי הספציפי.
לבסוף, כל הליכי הכימות וההסמכה והיישומים במורד הזרם צריכים להתבצע במהירות. אם יש צורך באחסון חומרים, מומלץ להקפיא 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע הפרעה לשלמות השלפוחית במהלך תהליך ההפשרה בהקפאה. אם מתבצעת הקפאה, יש להשתמש בחומר כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. יש להעריך מחדש כלי רכב חשמליים מועשרים הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית אם עובר פרק זמן משמעותי בין ההערכה הראשונית לבין השימוש.
שיטה זו מעשירה ביעילות את כלי הרכב החשמליים של Mtb, ויש גמישות להסתגלות למיקובקטריה אחרת. בעת התאמת הליך זה עבור אורגניזמים אחרים, ודא שלתרבית ההתחלה יש תזה תאית מוגבלת. יש להתאים את כמות החומר הנטען על העמודה, שכן הקינטיקה של שחרור EV תשתנה. אין לחרוג מריכוז חלבון מרבי של 7 גרם ל-100 מ"ל בהתאם למפרט היצרן. כמו כן, יש צורך להעריך כל שבר בנפרד עבור נוכחות של סמנים ומזהמים הקשורים EV. ריכוז החלבון ונתוני NTA עשויים להטעות באופטימיזציה של השיטה: ריכוז חלבון נמוך מאוד אינו אומר היעדר שלפוחיות בשברים אלה. בנוסף, שינוי עמודות SEC ופרמטרים של איסוף שברים מאפשרים למשתמש לשנות את קנה המידה של הפרוטוקול בהתבסס על יישומי קלט ולמטה. המגבלות של שיטה זו כוללות את העלות של AFC וחומרים מתכלים, את התפוקה המדוללת, וכאמור, את הפיתוח והאופטימיזציה של תוכנית איגום הסיעות. בעוד של-ultracentrifugation של שיפוע צפיפות יש יתרונות ואולי ישים יותר עבור ניסויים מסוימים, העשרת כלי רכב חשמליים Mtb על ידי SEC דומה באיכותה ומעולה בגישה ובקלות השימוש, כפי שהוצג כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות על תמיכת המכללה לרפואה וטרינרית ומדעים ביו-רפואיים פרס חווייתי ותוכנית מחקר משותפת של מועצת המחקר של המכללה ל- NKG ומימון על ידי ATCC (פרס # 2016-0550-0002) ל- KMD. אנו רוצים גם להודות לאן סימפסון על תמיכה טכנית ומשאבי BEI, NIAID, NIH עבור הריאגנטים הבאים: שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LpqH (גן Rv3763), IT-54 (מיוצר במבחנה), NR-13792, שחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום GroES (גן Rv3418c), שיבוט IT-3 (SA-12) (מיוצר במבחנה), NR-49223, ושחפת מונוקלונלית נגד מיקובקטריום LAM, שיבוט CS-35 (מיוצר במבחנה), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization.
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al.
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
