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Immunology and Infection

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से बाह्य पुटिका संवर्धन

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63895
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

Summary

यह प्रोटोकॉल आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, संस्कृति सतह पर तैरनेवालों से माइकोबैक्टीरियम तपेदिक बाह्य पुटिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन करता है।

Abstract

जीवाणु संक्रमण के संदर्भ में बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) की भूमिका माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए एक नए एवेन्यू के रूप में उभरी है। विशेष रूप से, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) ईवीएस मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत और पर्यावरणीय तनाव की प्रतिक्रिया में भूमिका निभाते हैं। एमटीबी ईवी भी अत्यधिक एंटीजेनिक हैं और वैक्सीन घटकों के रूप में क्षमता दिखाते हैं। एमटीबी ईवीएस को शुद्ध करने का सबसे आम तरीका घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन है। इस प्रक्रिया में कई सीमाएं हैं, जिनमें कम थ्रूपुट, कम उपज, महंगे उपकरणों पर निर्भरता, तकनीकी चुनौतियां शामिल हैं, और यह परिणामी तैयारी को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एक जेंटलर वैकल्पिक विधि है जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की कई सीमाओं का मुकाबला करती है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एसईसी एमटीबी ईवी संवर्धन के लिए प्रभावी है और तेजी से और स्केलेबल तरीके से बढ़ी हुई उपज की उच्च गुणवत्ता वाले एमटीबी ईवी तैयारी का उत्पादन करता है। इसके अतिरिक्त, परिमाणीकरण और योग्यता प्रक्रियाओं द्वारा घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना एसईसी के लाभों को दर्शाती है। जबकि ईवी मात्रा (नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण), फेनोटाइप (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), और सामग्री (पश्चिमी सोख्ता) का मूल्यांकन एमटीबी ईवीएस के अनुरूप है, प्रदान किए गए वर्कफ़्लो को अन्य माइकोबैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

रोगजनकों द्वारा बाह्य पुटिका (ईवी) रिलीज संक्रामक रोगों को नियंत्रित करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों को अनलॉक करने की कुंजी हो सकतीहै 1. माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) उच्च परिणाम का एक रोगज़नक़ है, जो दुनिया की लगभग एक तिहाई आबादी को संक्रमित करता है और हर साल लाखों लोगों के जीवन का दावा करताहै। एमटीबी द्वारा ईवी उत्पादन संक्रमण 3,4,5 के संदर्भ में इन ईवीएस के बायोजेनेसिस और विभिन्न भूमिकाओं (यानी, इम्यूनोस्टिमुलेटरी, इम्यूनोसप्रेसिव, लौह और पोषक तत्व अधिग्रहण) में अभी तक मायावी है। एमटीबी ईवीएस की संरचना को समझने के प्रयासों से प्लाज्मा झिल्ली से प्राप्त 50-150 एनएम लिपिड झिल्ली-संलग्न क्षेत्रों का पता चला जिसमें लिपिड और इम्यूनोलॉजिकल महत्व 3,6 के प्रोटीन होते हैं। जीवाणु शरीर विज्ञान में एमटीबी ईवी की भूमिका की जांच से अस्तित्व के लिए पर्यावरणीय तनाव के जवाब में बैक्टीरिया ईवी मॉड्यूलेशन के महत्व का पता चलाहै 5. मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन अध्ययन व्याख्या करने के लिए अधिक जटिल रहे हैं, लेकिन सबूत बताते हैं कि एमटीबी ईवीएस मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं और संभावित रूप से एक प्रभावी टीकाकरण घटक 3,4,7 के रूप में काम कर सकते हैं।

एमटीबी ईवीएस के अधिकांश अध्ययन इस प्रकार अब तक पुटिका संवर्धन8 के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पर निर्भर हैं। यह छोटे पैमाने पर अध्ययन के लिए प्रभावी रहा है; हालाँकि, इस तकनीक में कई तकनीकी और तार्किक चुनौतियां हैं। वैकल्पिक वर्कफ़्लोजो मल्टीस्टेप सेंट्रीफ्यूजेशन, पूरे कोशिकाओं और बड़े मलबे को हटाने के लिए, गोली ईवीएस के लिए एक अंतिम अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण के साथ। यह पद्धति दक्षता में भिन्न हो सकती है, और अक्सर घुलनशील गैर-पुटिका से जुड़े बायोमोलेक्यूल्स की कम उपज और सह-शुद्धि के परिणामस्वरूप पुटिका अखंडता9 को भी प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रक्रिया समय लेने वाली, मैन्युअल रूप से गहन है, और उपकरण की कमी के कारण थ्रूपुट में बहुत सीमित है।

वर्तमान प्रोटोकॉल घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एक वैकल्पिक तकनीक का वर्णन करता है: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)। इस पद्धति को पर्यावरण माइकोबैक्टीरिया के लिए प्रदर्शित किया गया है, और वर्तमान कार्य में, इसे एमटीबी10 तक एक्सट्रपलेशन किया गया है। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम और स्वचालित अंश कलेक्टर पुटिका तैयारी में स्थिरता में सुधार कर सकता है और विशिष्ट, महंगे उपकरणों की आवश्यकता को कम कर सकता है। घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में समय के एक अंश में इस प्रोटोकॉल को पूरा करना भी संभव है, थ्रूपुट को बढ़ाना। यह तकनीक कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, जिससे मास्टर करना आसान हो जाता है, और अंतर / इंट्रा-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता बढ़ सकती है। अंत में, एसईसी में उच्च पृथक्करण दक्षता है और कोमल है, पुटिकाओं की अखंडता को संरक्षित करता है।

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Protocol

कोलोराडो स्टेट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल बायोसेफ्टी कमेटी ने वर्तमान अध्ययन (19-046 बी) को मंजूरी दी। माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस की खेती और ईवी समृद्ध संस्कृति सतह पर तैरनेवालों की कटाई एक उच्च-नियंत्रण प्रयोगशाला में प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा की गई थी। संस्थागत जैव सुरक्षा नीतियों द्वारा एक वैध निष्क्रियता पद्धति का प्रदर्शन, पुष्टि और अनुमोदन के बाद सामग्रियों को उच्च-नियंत्रण क्षेत्र से बाहर ले जाया गया था। प्रोटोकॉल की प्रतिकृति बनाते समय, यदि मान्य निष्क्रियता या बाँझ निस्पंदन विधि संभव नहीं है, तो निम्नलिखित प्रक्रियाओं को उच्च-रोकथाम प्रयोगशाला में करने की आवश्यकता है।

1. क्रूड एमटीबी ईवी सांद्रता की तैयारी

नोट: एमटीबी की खेती और संस्कृति छानना प्रोटीन (सीएफपी) की तैयारी पर विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए, संदर्भ11,12 देखें। यह अनुशंसा की जाती है कि जीवाणु संस्कृति मीडिया ईवी युक्त या प्रोटीनयुक्त घटकों के साथ विकास की खुराक से मुक्त है, जैसे कि ओलिक एल्बुमिन डेक्सट्रोज कैटालेज़ (ओएडीसी), और ट्वीन जैसे डिटर्जेंट। यह भी अनुशंसा की जाती है कि सीमित कोशिका मृत्यु औरलसीका 13,14 सुनिश्चित करने के लिए जीवाणु संस्कृति की गुणवत्ता और कटाई सीएफपी की जांच की जाए।

  1. फॉस्फेट-बफर खारा (1 एक्स पीबीएस) की पूर्ण मात्रा क्षमता जोड़कर 100 केडीए आणविक भार कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) केन्द्रापसारक फिल्टर (सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,800 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    नोट: यदि कोई मृत स्टॉप वॉल्यूम के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर रहे हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि नमूना वॉल्यूम फ़िल्टर स्तर से नीचे कम न हो, जिसके परिणामस्वरूप सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान पूर्ण फ़िल्टर सुखाने होता है।
  2. एमटीबी सीएफपी के साथ नमूना कक्ष को अपनी अधिकतम क्षमता तक भरने से पहले प्रवाह-थ्रू और किसी भी शेष पीबीएस को त्याग दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,800 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र जब तक कि वॉल्यूम अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस की न्यूनतम मात्रा में कम न हो जाए। आवश्यकतानुसार दोहराएं, इकाई में अधिक सीएफपी जोड़ें जब तक कि पूरे नमूने को पर्याप्त रूप से कम नहीं किया जाता है।
    नोट: यदि वांछित हो तो डाउनस्ट्रीम योग्यता के लिए 100 केडीए फ्लो-थ्रू (100 एफ) सामग्री का एक हिस्सा बनाए रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. कुल डिवाइस क्षमता तक ध्यान केंद्रित करने वाले फिल्टर इकाई में 1 एक्स पीबीएस जोड़ें। 1.2 में वर्णित वॉल्यूम को कम करें। पूर्ण धुलाई और बफर विनिमय सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को पांच बार दोहराएं।
  4. अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस विनिर्देशों के अनुसार 100 केडीए केंद्रित सीएफपी रिटेंटेट (100 आर) पुनर्प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक बार 100 आर बरामद हो जाने के बाद, फिल्टर को कम से कम तीन बार 1x पीबीएस की न्यूनतम मात्रा के साथ धो लें, और वसूली को अधिकतम करने के लिए 100 आर के साथ धोने को पूल करें।
  5. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक बिसिनकोनिक परख (बीसीए) के साथ 100 आर सामग्री की मात्रा निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। परख करने के लिए, पीबीएस में नमूने 1: 2, 1: 5 और 1: 10 के कई कमजोर पड़ने का उपयोग करें। ट्रिप्लिकेट में नमूने का परीक्षण करें।
    नोट: यदि वांछित हो तो डाउनस्ट्रीम योग्यता के लिए 100 आर सामग्री का एक हिस्सा बनाए रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. सीएफपी से एमटीबी ईवीएस के संवर्धन के लिए आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी

नोट: एसईसी कॉलम और स्वचालित अंश कलेक्टर (एएफसी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ 100 आर एमटीबी सीएफपी के 3 मिलीग्राम का उपयोग करने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया विशिष्ट है। निर्माता के विनिर्देशों का पालन करके इसे अन्य प्रारंभिक सांद्रता और स्तंभ प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। साथ ही, उपयोगकर्ताओं को पढ़ने और स्वचालित अंश संग्राहक उपयोगकर्ता मैनुअल को समझने के लिए अनुशंसित हैं।

  1. एसईसी कॉलम को कमरे के तापमान पर संतुलित करने की अनुमति दें।
  2. टॉवर यूनिट के पीछे पावर स्विच का उपयोग करके एएफसी चालू करें और लोड सेल के लिए सेटिंग्स समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, तो मुख्य मेनू टचस्क्रीन पर सेटअप दबाकर। लोड सेल को केवल पहले उपयोग पर कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, प्रत्येक सॉफ़्टवेयर अपडेट के बाद, और यदि अंश संग्रह वॉल्यूम में असंगतता देखी जाती है।
  3. सेटअप स्क्रीन से, कैरोसल > कैलिब्रेट का चयन करके हिंडोला संरेखित करें। एएफसी टॉवर में सामना करने वाले 13 छोटे छेदों के साथ हिंडोला डालें, और हिंडोला समायोजित करें ताकि द्रव नोजल सीधे फ्लश स्थिति से ऊपर हो - और /
  4. संतुलित एसईसी कॉलम से कैप्स निकालें। एसईसी कॉलम को उपयुक्त कॉलम माउंट में स्लाइड करें और सावधानीपूर्वक इसे एएफसी टॉवर पर स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि कॉलम पर रेडियो फ्रीक्वेंसी आइडेंटिफिकेशन (आरएफआईडी) टैग एएफसी का सामना करता है, और जांचें कि कॉलम और वाल्व के बीच कनेक्शन सुरक्षित है। एक संग्रह कंटेनर में अपशिष्ट आउटलेट ट्यूबिंग रखें।
  5. सेटअप स्क्रीन से, संग्रह अनुसूची का चयन करें और गिनती को 13 पर सेट करें और आकार को 0.5 एमएल पर - और / 2.7 एमएल के डिफ़ॉल्ट के रूप में "बफ़र वॉल्यूम" सेटिंग छोड़ दें, और उसके बाद X दबाकर "संग्रह शेड्यूल" विंडो बंद करें।
  6. होम स्क्रीन से संग्रह प्रारंभ करें का चयन करें और हाँ का चयन करके संग्रह मापदंडों की पुष्टि करें। लोड 13 लेबल 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब ढक्कन के साथ खुला और हिंडोला केंद्र की ओर इशारा करते हुए।
  7. ओके का चयन करके एएफसी को आगे बढ़ाएं, फिर कॉलम जलाशय को माउंट करें और ओके दबाकर फिर से आगे बढ़ें। हाँ दबाकर स्तंभ फ्लश करने के लिए विकल्प का चयन करें, और किसी भी भंडारण बफर को हटाने के लिए 0.2 μm फ़िल्टर्ड PBS का एक स्तंभ वॉल्यूम जोड़ें। एक बार फ्लश पूरा हो जाने के बाद, ओके दबाकर एएफसी को आगे बढ़ाएं।
  8. एएफसी के ऊपर हिंडोला कवर रखें और ठीक दबाएं। 0.2 μm फ़िल्टर्ड पीबीएस का एक स्तंभ मात्रा तैयार करें। स्तंभ से किसी भी अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  9. 1x पीबीएस के साथ चरण 1.5 से 500 μL में मात्रा निर्धारित के रूप में 100R नमूना के 3 मिलीग्राम लाओ। कॉलम के शीर्ष पर 3 मिलीग्राम नमूना जोड़ें। एएफसी अग्रिम और नमूना फ्रिट में चलाने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार नमूना पूरी तरह से स्तंभ में प्रवेश कर जाने के बाद, जलाशय में चरण 2.6 में तैयार पीबीएस जोड़ें।
  10. एएफसी के रन की निगरानी करें, जबकि यह पहले शून्य मात्रा और फिर निर्दिष्ट अंशों को एकत्र करता है। रन पूरा होने के बाद और हिंडोला अपशिष्ट स्थिति में लौटता है, कवर को हटा दें, और हिंडोला से अंश ट्यूबों को हटा दें। मात्रा का ठहराव (चरण 3) और योग्यता (चरण 4) से पहले अंशों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. यदि स्तंभ का पुन: उपयोग किया जाना है, तो हाँ दबाकर स्तंभ को साफ करने के विकल्प का चयन करें; अन्यथा, नहीं दबाएँ। एएफसी पर दिए गए निर्देशों का पालन करें।
    नोट: एक बार स्तंभ धोया जाता है और भंडारण बफर के माध्यम से चला गया है, इसे हटाया जा सकता है, छाया हुआ है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. एमटीबी ईवीएस की मात्रा का ठहराव

  1. बीसीए और माइक्रो बीसीए12 का उपयोग करके प्रत्येक अंश के लिए प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
    1. 100 आर एमटीबी सीएफपी के 3 मिलीग्राम से एकत्र किए गए 0.5 एमएल अंशों के लिए, ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक नमूने के 1-7 गिने गए अंशों के लिए 1: 3 कमजोर पड़ने के साथ माइक्रो बीसीए का उपयोग करें।
    2. 5-13 गिने गए 0.5 एमएल अंशों के लिए, ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक नमूने के लिए कोई कमजोर पड़ने के साथ बीसीए का उपयोग करें।
      नोट: 5-7 अंशों के लिए परख ओवरलैपिंग यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि सभी अंशों में पठनीय आउटपुट हो।
  2. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग करके प्रत्येक अंश के लिए कण एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
    1. निम्नलिखित सुझाए गए शुरुआती अनुपातों का उपयोग करके 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल में नमूनों को पतला करें; अंश 1-3 के लिए, 1:100 का उपयोग करें, और फिर शेष अंशों के लिए, 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
    2. पतला समाधान भंवर और फिर एक 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज में नमूना आकर्षित करते हैं। यदि उपलब्ध हो तो सिरिंज को स्वचालित सिरिंज पंप में सेट करें।
    3. मिनट के लिए सिरिंज पंप सेट करें और 10-12 के स्क्रीन लाभ और 10-12 के कैमरा स्तर के साथ वीडियो कैप्चर सेटिंग्स का उपयोग करें। प्रत्येक नमूने के लिए फोकस समायोजित करें।
    4. एक निरंतर प्रवाह का उपयोग कर प्रत्येक 30 एस पर तीन वीडियो की एक न्यूनतम ले लीजिए।
    5. पाँच पर सेट सॉफ़्टवेयर डिटेक्शन थ्रेशोल्ड के साथ विश्लेषण करें।
      नोट: महत्वपूर्ण नमूना वॉल्यूम का त्याग किए बिना नवीनतम अंशों (>7) के लिए एनटीए डेटा प्राप्त करना संभव नहीं हो सकता है।

4. एमटीबी ईवी की योग्यता

  1. चांदी के दाग वाले प्रोटीन जेल का उपयोग करके प्रत्येक अंश के सामान्य प्रोटीन प्रोफाइल की कल्पना करें।
    नोट: एसडीएस-पेज और चांदी के दाग के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं संदर्भ15 में पाई जा सकती हैं।
    1. प्रत्येक अंश के 10 μL और सीएफपी, 100R, और 100F के 5 μg करने के लिए एसडीएस नमूना बफर जोड़ें। 100 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबाललें, फिर पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) के लिए आणविक भार सीढ़ी के साथ 4% -12% बिस-ट्रिस जेल पर लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 1x 2-[एन-मॉर्फोलिनो] एथेनेसल्फोनिक एसिड (एमईएस) रनिंग बफर ( सामग्री की तालिका देखें) और 35 मिनट के लिए 200 वी वर्तमान का उपयोग करके जेल चलाएं।
    3. कैसेट से जेल निकालें और चांदी धुंधला15 के साथ आगे बढ़ें।
  2. पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रत्येक अंश में ईवी मार्करों की उपस्थिति या अनुपस्थिति का मूल्यांकन करें।
    नोट: पश्चिमी सोख्ता के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं संदर्भ15 में पाया जा सकता है।
    1. चरण 4.1.1-4.1.2 में वर्णित के रूप में एक एसडीएस-पेज जेल चलाएँ।
    2. कैसेट से जेल निकालें और कम से कम 1 घंटे के लिए 50 वी वर्तमान लागू करके हल किए गए प्रोटीन को 0.2 μm नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली ( सामग्री की तालिका देखें) में स्थानांतरित करें।
    3. ब्याज के प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करें। एलपीक्यूएच, लिपोआराबिनोमैनन (एलएएम), और ग्रोईएस ( सामग्री की तालिका देखें) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी की सिफारिश की जाती है।
    4. डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए लागू मार्करों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर पूल अंश।
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा बरकरार पुटिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करें।
    1. 4% ईएम ग्रेड पैराफॉर्मलडिहाइड के 15 μL जोड़कर पुटिका नमूने के 15 μL को ठीक करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. सतह को साफ करके और हाइड्रोफिलिक सब्सट्रेट बनाकर 200 जाल फॉर्मवर-कार्बन लेपित तांबा टीईएम ग्रिड तैयार करें।
      नोट: 1 मिनट के लिए 95% आर्गन, 5% ऑक्सीजन और 30% प्लाज्मा शक्ति के साथ प्लाज्मा सफाई की सिफारिश की जाती है।
    3. ग्रिड पर निश्चित नमूने के 10 μL ड्रॉप और नमूना 10 मिनट के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं, तो फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त तरल दूर धब्बा।
    4. 30 एस के लिए अल्ट्राप्योर पानी की एक बूंद पर ग्रिड फ्लोट करें, फिर अतिरिक्त तरल को धब्बा दें।
    5. 2 मिनट के लिए डी% ईएम ग्रेड यूरेनियल एसीटेट ड्रॉप पर ग्रिड फ्लोट करें, फिर अतिरिक्त तरल को दूर करें।
    6. ग्रिड को पूरी तरह से सूखने दें।
    7. 100 केवी या इसी तरह के टीईएम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके छवि।
      नोट: डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर अन्य ईवी मात्रात्मक और लक्षण वर्णन विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए। सभी ईवी अध्ययनों की कठोरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए दिशानिर्देशों के लिए बाह्य पुटिका18 के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी से परामर्श किया जाना चाहिए।

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Representative Results

माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) से संस्कृति छानना प्रोटीन (सीएफपी) केंद्रित, मात्रा निर्धारित किया गया था, और फिर 3 मिलीग्राम सामग्री को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) कॉलम पर लागू किया गया था। प्रोटीन और कण सांद्रता क्रमशः बीसीए और एनटीए द्वारा गणना की गई थी। प्रोटीन और कण वसूली के लिए अपेक्षित श्रेणियां प्लस इन परिणामों के लिए प्राप्त सटीक मूल्यों को तालिका 1 में रिपोर्ट किया गया है। इन श्रेणियों से बहुत अधिक मान संदूषण या स्तंभ अखंडता समस्याओं को इंगित कर सकते हैं। मान अल्ट्राफिल्ट्रेशन चरणों में समस्याओं को काफी कम इंगित करते हैं, और इसलिए प्रवाह-थ्रू की तुलना शुरुआती सीएफपी और 100 आर से की जानी चाहिए ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि एक सफल एकाग्रता हुई या नहीं। एक गैर-विशिष्ट प्रोटीन चांदी के दाग से पता चलता है कि बाद के अंशों में अधिक प्रोटीन होता है और 100 आर सामग्री (चित्रा 1) जैसा दिखता है।

अंशों के पश्चिमी धब्बे दर्शाते हैं कि लिपोआरबिनोमैनन (एलएएम) अंशों में मौजूद है, बाद के अंशों में कम तीव्रता बैंडिंग (चित्रा 2 ए, पूरक चित्रा 1) दिखारहा है। 19 केडीए लिपोप्रोटीन एलपीक्यूएच, जिसे एमटीबी ईवीएस 3,19 में मौजूद होने के लिए जाना जाता है, एसईसी (चित्रा 2 बी, पूरक चित्रा 1) से शुरुआती अंशों में समृद्ध है। एसईसी (चित्रा 2 सी, पूरक चित्रा 1) से शुरुआती अंशों में 10 केडीए चैपरोनिन प्रोटीन ग्रोईएस अनुपस्थित है; यह खोज एमटीबी ईवी संवर्धन12 के दौरान एक संदूषक के रूप में ग्रोईएस के बारे में पहले प्रकाशित अध्ययनों के साथ संरेखित करती है और एमटीबी ईवी उपस्थिति के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करती है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) बंद, झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं (चित्रा 3 ए) की उपस्थिति की पुष्टि करता है। घनत्व ढाल अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा अलग किए गए एमटीबी ईवीएस की तुलना और इस एसईसी विधि को तालिका 2 में बताया गया है। एसईसी एक ही सीएफपी से तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए उच्च प्रोटीन और कण वसूली प्रदान करता है। ये परिणाम सीएफपी के कई बैचों में सुसंगत रहे हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)। दोनों विधियों के परिणामस्वरूप अपेक्षित आकार सीमा में बंद, झिल्ली-बाध्य पुटिकाएं होती हैं, जैसा कि टीईएम (चित्रा 3) और एनटीए (चित्रा 4) द्वारा प्रदर्शित किया गया है।

कुल मिलाकर, ये डेटा प्रारंभिक एसईसी अंशों में एमटीबी ईवीएस के संवर्धन को प्रदर्शित करते हैं। उच्चतम एनटीए मान अंश 1-3 में होते हैं, और प्रोटीन सामग्री बढ़ जाती है क्योंकि अंश संख्या बढ़ जाती है, जो ईवीएस (तालिका 1) से घुलनशील प्रोटीन के पृथक्करण का संकेत देती है। क्योंकि अंश 4 में ग्रोईएस (चित्रा 2 सी, पूरक चित्रा 1) के सबूत हैं, इस अंश को टीईएम के लिए पूल की गई सामग्री में शामिल नहीं किया गया था। डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर, पूलिंग रणनीति के लिए विशिष्ट अंशों के समावेश या बहिष्करण पर विचार किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्र 1: अंश द्वारा चांदी का दाग। चांदी के साथ दाग वाला एक एसडीएस-पेज जेल प्रत्येक अंश के लिए समग्र प्रोटीन प्रोफ़ाइल को दर्शाता है। सीएफपी = एमटीबी सीएफपी का 5 μg, 100R = 100R का 5 μg, 100F = 100F का 5 μg, 1-11 = एसईसी अंशों का 10 μL 1-11। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अंश द्वारा पश्चिमी धब्बे। पश्चिमी धब्बे (ए) एलएएम, (बी) एलपीक्यूएच, और (सी) ग्रोईएस का पता लगाते हैं, जो अंशों में प्रोटीन मार्कर परिवर्तन का प्रदर्शन करते हैं। सीएफपी = एमटीबी सीएफपी का 5 μg, 100R = 100R का 5 μg, 100F = 100F का 5 μg, 1-11 = एसईसी अंशों का 10 μL 1-11। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) छवियां( ए) एसईसी अंश 1-3 निर्धारण से पहले पूल किए गए। (बी) एमटीबी ईवी के घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन को टीईएम इमेजिंग के लिए नकारात्मक रूप से दाग दिया गया था। स्केल सलाखों = 200 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) वितरण( ए) एसईसी अंश 1-3। (बी) नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन एमटीबी ईवीएस का विश्लेषण किया गया था। आकार वितरण प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

खंड प्रोटीन रिकवरी रेंज (μg / कण रिकवरी रेंज (प्रति μL) परिणाम प्रोटीन रिकवरी (μg / परिणाम कण वसूली (प्रति μL)
1 0.01-0.03 1E8 - 3E8 0.013 1.60E +08
2 0.02-0.04 2E8 - 4E8 0.026 2.10ई +08
3 0.02-0.04 2E7 - 6E7 0.024 5.20E +07
4 0.03-0.05 7E6 - 2E7 0.032 1.30E +07
5 0.05-0.09 1E6 - 5E6 0.053 4.20ई +06
6 0.09-0.2 1E6 - 5E6 0.099 5.20ई +06
7 0.1-0.3 1E6 - 3E6 0.234 2.70E +06
8 0.3-0.5 1E6 - 4E6 0.398 4.20ई +06
9 0.4-0.6 1E6 - 3E6 0.543 4.10ई +06
10 0.5-0.7 1E6 - 3E6 0.661 1.70E +06
11 0.6-0.8 1E6 - 3E6 0.736 1.40ई +06

तालिका 1: अंश द्वारा प्रोटीन और कण वसूली। प्रारंभिक सामग्री के 3 मिलीग्राम के आधार पर अपेक्षित प्रोटीन और कण वसूली रेंज प्रति अंश। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सामग्री प्राप्त करने के लिए सटीक मान दो सबसे दाएं स्तंभों में शामिल हैं।

संवर्धन विधि कुल प्रोटीन बरामद (μg) कुल बरामद कणों
घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन 3.14 1.82ई +10
3.88 1.93ई +10
3.20 1.65ई +10
आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी एफ 1-3 12.96 4.05ई +10
14.14 4.15ई +10
14.74 4.35ई +10

तालिका 2: प्रोटीन और कण वसूली की विधि तुलना। बीसीए के साथ मापा गया प्रोटीन उपज और एक ही 100 आर प्रारंभिक सामग्री के 3 मिलीग्राम से उत्पन्न एमटीबी ईवीएस के लिए एनटीए द्वारा मापा गया कुल कण गिनती, संदर्भित घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि8 या इस एसईसी विधि (ट्रिप्लिकेट) का उपयोग करके समृद्ध है।

अनुपूरक चित्रा 1: चित्रा 2 से मूल पश्चिमी धब्बे (अनक्रॉप्ड)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस बाह्य पुटिकाएं अत्यधिक एंटीजेनिक जलाशय हैं, जो उन्हें नैदानिक उपकरण और भविष्य के टीके 4,19,20 विकसित करने के लिए एक आकर्षक एवेन्यू के रूप में प्रस्तुत करती हैं। ऐतिहासिक रूप से, घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग एमटीबी ईवीएस को अन्य घुलनशील, स्रावित सामग्री से अलग करने के लिए किया गयाहै 8. हालांकि यह प्रक्रिया प्रभावी है, यह समय लेने वाली, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण भी है, और परिणामस्वरूप ईवी तैयारी 9,10 की अखंडता को प्रभावित कर सकती है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) के माध्यम से एमटीबी ईवी तैयारी के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है।

इस पद्धति में सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं। प्रारंभिक एमटीबी सीएफपी तैयारी एसईसी के बाद पुटिकाओं की गुणवत्ता और उपज को प्रभावित करेगी। यह अनुशंसा की जाती है कि फसल के समय सेलुलर लिसिस के स्तर को सीमित करने के लिए विकास के मध्य-लॉग चरण में या उससे पहले सीएफपी की कटाई की जाए। लेट-लॉग और स्थिर विकास चरण संस्कृतियों में सेल लिसिस के उच्च स्तर हो सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर प्रोटीन और कृत्रिम ईवी जैसी संरचनाओं की पहचान हो सकती है, जो एकत्रित सीएफपी12,13,14 में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता के रूप में लाइसेड कोशिकाओं के झिल्ली टुकड़ों से अनायास उत्पन्न होती है . यह स्रावित एमटीबी ईवीएस और संभावित तिरछा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के साथ सह शुद्ध होगा के रूप में लाइसेड कोशिकाओं से झिल्ली पुटिकाओं के रूप में इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन के दौरान देखभाल की जानी चाहिए कि फिल्टर झिल्ली बरकरार और गीली रहे। फिल्टर को नुकसान वांछित सामग्री के माध्यम से प्रवाह का कारण बन सकता है। डाउनस्ट्रीम गुणवत्ता मूल्यांकन पर मूल सीएफपी, 100 आर और 100 एफ सहित अल्ट्राफिल्ट्रेशन अखंडता के मूल्यांकन में सहायता मिलेगी।

उच्चतम गुणवत्ता वाले ईवी तैयारी के लिए एसईसी कॉलम का उचित सेटअप और धुलाई आवश्यक है। सेटअप और टेकडाउन के लिए हमेशा उपयोगकर्ता मैनुअल का पालन करें। जबकि अंश एकत्र किए जा रहे हैं, सुनिश्चित करें कि एएफसी टकराया या स्थानांतरित नहीं किया गया है क्योंकि यह प्रक्रिया को बाधित कर सकता है और छोड़े गए या असंगत अंशों को जन्म दे सकता है। योग्यता के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी समृद्ध पुटिकाओं के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग पर निर्भर करेंगे, और इसमें एमटीबी ईवीएस (एलपीक्यूएच) में होने की उम्मीद है और सीएफपी में पाया जाने वाला मार्कर लेकिन एमटीबी ईवी (ग्रोईएस) में समृद्ध नहीं होना चाहिए। यहां प्रस्तुत विधियों की एक सीमा उपयुक्त प्रोटीन नियंत्रण में संभावित भिन्नता है। इस प्रोटोकॉल को मानक संवर्धन विधियों का उपयोग करके विकसित किया गया है। माइकोबैक्टीरियम एवियम के साथ किए गए कार्य ने सुझाव दिया कि विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम के आधार पर सीएफपी और ईवीएस में ग्रोईएस जैसे चैपरोनिन का स्तर बदलताहै। जैसा कि माइकोबैक्टीरियल ईवी संरचना के बारे में अधिक जानकारी उभरती है, विशिष्ट नकारात्मक नियंत्रण मार्कर को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है।

अंत में, सभी मात्रा का ठहराव और योग्यता प्रक्रियाओं और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को जल्दी से किया जाना चाहिए। यदि सामग्री भंडारण की आवश्यकता होती है, तो फ्रीज-पिघलना प्रक्रिया के दौरान पुटिका अखंडता व्यवधान को रोकने के लिए ठंड पर 4 डिग्री सेल्सियस की सिफारिश की जाती है। यदि ठंड का प्रदर्शन किया जाता है, तो बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचने के लिए सामग्री को विभाज्य करें। समृद्ध ईवीएस का मात्रात्मक और गुणात्मक दोनों रूप से पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए यदि प्रारंभिक मूल्यांकन और उपयोग के बीच महत्वपूर्ण मात्रा में समय गुजरता है।

यह विधि एमटीबी ईवीएस को प्रभावी ढंग से समृद्ध करती है, और अन्य माइकोबैक्टीरिया के अनुकूलन के लिए लचीलापन है। अन्य जीवों के लिए इस प्रक्रिया को अपनाते समय, सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक संस्कृति में सीमित सेलुलर लाइसिस है। कॉलम पर लोड की गई सामग्री की मात्रा को समायोजित किया जाना चाहिए, क्योंकि ईवी रिलीज के कैनेटीक्स अलग-अलग होंगे। निर्माता के विनिर्देशों के आधार पर 7 ग्राम प्रति 100 एमएल की अधिकतम प्रोटीन एकाग्रता से अधिक न करें। ईवी से जुड़े मार्करों और दूषित पदार्थों की उपस्थिति के लिए व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अंश का मूल्यांकन करना भी आवश्यक है। प्रोटीन एकाग्रता और एनटीए डेटा विधि अनुकूलन में भ्रामक हो सकता है: बहुत कम प्रोटीन एकाग्रता का मतलब उन अंशों में पुटिकाओं की अनुपस्थिति नहीं है। इसके अतिरिक्त, एसईसी कॉलम और अंश संग्रह पैरामीटर बदलने से उपयोगकर्ता इनपुट और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर प्रोटोकॉल को स्केल करने की अनुमति देता है। इस पद्धति की सीमाओं में एएफसी और उपभोग्य सामग्रियों की लागत, पतला आउटपुट, और, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, गुट पूलिंग योजना का विकास और अनुकूलन शामिल है। जबकि घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अपने फायदे हैं और शायद कुछ प्रयोगों के लिए अधिक लागू होते हैं, एसईसी द्वारा एमटीबी ईवी का संवर्धन गुणवत्ता में तुलनीय है और पहुंच और उपयोग में आसानी में बेहतर है, जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम एनकेजी को कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन एंड बायोमेडिकल साइंसेज एक्सपीरिएंशियल अवार्ड और कॉलेज रिसर्च काउंसिल साझा अनुसंधान कार्यक्रम से समर्थन और केएमडी को एटीसीसी (पुरस्कार # 2016-0550-0002) द्वारा वित्त पोषण स्वीकार करना चाहते हैं। हम निम्नलिखित अभिकर्मकों के लिए तकनीकी सहायता और बीईआई संसाधन, एनआईएआईडी, एनआईएच के लिए ऐनी सिम्पसन को भी स्वीकार करना चाहते हैं: मोनोक्लोनल एंटी-माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस एलपीक्यूएच (जीन आरवी 3763), आईटी -54 (इन विट्रो में उत्पादित), एनआर -13792, मोनोक्लोनल एंटी-माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस ग्रोईएस (जीन आरवी 3418 सी), क्लोन आईटी -3

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x MES SDS Running Buffer ThermoFisher Scientific NP0002
96 well plate Corning 15705-066
Automatic Fraction Collector IZON Science AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder Invitrogen 10748010
Benchtop centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff Millipore Sigma UFC710008 Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System ThermoFisher Scientific 09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids Electron Microscopy Sciences FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL AbCam ab6790 Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Microplate reader BIOTEK Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) BEI Resources NR-49223 Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) BEI Resources NR-13792 Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 BEI Resources NR-13811 Primary antibody
NanoClean 1070 Fischione Instruments For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software Malvern Panalytical NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm BioRad 1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels ThermoFisher Scientific NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium Corning 21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050
qEV Original 35 nm 5/pk IZON Science SP5-USD SEC column
SDS sample buffer Boster AR1112 In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber ThermoFisher Scientific EI0001
Sigmafast BCIP/NBT Millipore Sigma B5655
Silver Stain Plus Kit BioRad 1610449 In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400

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References

  1. Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
  2. World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
  3. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  4. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
  5. Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
  6. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  7. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
  10. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
  11. Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
  12. Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
  13. Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
  14. Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
  15. Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
  16. Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
  17. Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
  20. Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
  21. Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 183
<em>माइकोबैक्टीरियम तपेदिक</em> आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से बाह्य पुटिका संवर्धन
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Ryan, J. M., Dobos, K. M., Kruh-Garcia, N. A. Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography. J. Vis. Exp. (183), e63895, doi:10.3791/63895 (2022).

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