Venstre forreste nedadgående koronararterieligering til iskæmi-reperfusionsforskning: modelforbedring via tekniske ændringer og kvalitetskontrol

Summary

Heri præsenterer vi en protokol med fokus på kvalitetskontrol af den venstre forreste nedadgående koronararterieligering ved teknisk at ændre den traditionelle procedure hos rotter til akut myokardieiskæmi-reperfusionsforskning.

Abstract

Koronar hjertesygdom er den største dødsårsag globalt. Fuldstændig ophør af blodgennemstrømning i koronararterier forårsager ST-segment elevation myokardieinfarkt (STEMI), hvilket resulterer i kardiogent shock og dødelig arytmi, som er forbundet med høj dødelighed. Primær koronar intervention (PCI) til rekanalisering af koronararterien forbedrer signifikant resultaterne af STEMI, men fremskridt med at forkorte dør-til-ballon-tiden har undladt at reducere dødeligheden på hospitalet, hvilket tyder på, at der kræves yderligere terapeutiske strategier. Venstre anterior nedadgående koronararterie (LAD) ligering hos rotter er en dyremodel for akut myokardie-IR-forskning, der kan sammenlignes med det kliniske scenario, hvor hurtig koronar rekanalisering gennem PCI anvendes til STEMI; PCI-induceret STEMI er imidlertid en teknisk udfordrende og kompliceret operation forbundet med høj dødelighed og stor variation i infarktstørrelse. Vi identificerede den ideelle position til LAD-ligering, skabte en gadget til at kontrollere en snare-sløjfe og understøttede en modificeret kirurgisk manøvre og derved reducerede vævsskade for at etablere en pålidelig og reproducerbar akut myokardieiskæmi-reperfusion (IR) forskningsprotokol for rotter. Dette er en ikke-overlevelsesoperation. Vi foreslår også en metode til validering af kvaliteten af undersøgelsesresultater, hvilket er et kritisk skridt til bestemmelse af nøjagtigheden af efterfølgende biokemiske analyser.

Introduction

Iskæmisk hjertesygdom er en førende dødsårsag på verdensplan ^1,2. Ud over kontrol af modificerbare risikofaktorer til forebyggelse af udvikling af koronar hjertesygdom er terapeutiske strategier afgørende nødvendige for akut koronarsyndrom ^3,4. Kardiogent shock og dødelig arytmi ved akut ST-segment elevation myokardieinfarkt (STEMI) har vist sig at øge sandsynligheden for hospitalsdødelighed 5,6,7,8. Primær perkutan koronar intervention (PCI) er den foretrukne behandling for STEMI 9,10,11; De terapeutiske virkninger har dog et loft, når dør-til-ballon-tiden er <90 min^12,13. Yderligere strategier er nødvendige for yderligere at forbedre de kliniske resultater af sygdommen 14,15,16,17,18,19.

Et akut myokardieiskæmi-reperfusionseksperiment (IR), der involverer ligering af venstre forreste nedadgående arterie (LAD) hos rotter, er en af dyremodellerne, der kan sammenlignes med det kliniske scenario, hvor korte dør-til-ballon-tider er nødvendige for patienter med STEMI for at redde hjertet fra iskæmisk skade. Imidlertid er kirurgisk induceret STEMI hos små dyr ofte teknisk udfordrende, fordi det er en kompleks operation forbundet med høj dødelighed og høj variation i infarktstørrelse 20,21,22,23,24. For at overvinde den tekniske udfordring udviklede denne undersøgelse en omfattende og effektiv dyremodel i rotter (fordi de er større end mus) for at etablere en pålidelig og reproducerbar akut myokardie-IR-forskningsprotokol gennem teknisk modifikation. Den foreslåede protokol resulterer i færre kirurgiske komplikationer, mindre vævsskade og mindre sandsynlighed for dødelighed under operationen. Derudover blev der anvendt en procedure til at måle infarktstørrelse og risikoområde (AAR) og dermed verificere kvaliteten af undersøgelsesresultaterne. Den foreslåede protokol kan bruges til at undersøge de patofysiologiske processer af akut myokardie-IR-stress for at udvikle nye terapeutiske strategier mod skaden.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr, udgivet af US National Institutes of Health (NIH-publikation nr. 85-23, revideret 1996). Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af og i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Fu-Jen Catholic University.

1. Forberedelse før operationen

1. Tilberedning af saltvandsvåde bomuldskugler
   1. Tag en kirurgisk maske og handsker på.
   2. Klem en lille del steril bomuld af og rul den for at danne en kugle. Gentag denne procedure.
   3. Dyp bomuldskuglerne i steril 0,9% saltvand og pres overskydende saltvand ud.
   4. Opbevar bomuldskuglerne i en ren kasse steriliseret med 75% ethanol.
2. Forberedelse af holdekroge.
   1. Tag en kirurgisk maske og handsker på.
   2. Steriliser clips og elastikker med 75% ethanol.
   3. Bøj klemmerne i form af en krog til brystvæggen og vævet.
   4. Forbind de bøjede klemmer med et, to eller tre gummibånd for at sikre, at spændingen fra såret i det kirurgiske vindue er bred nok til LAD-ligering.
   5. Forbered og opbevar mindst fem hjemmelavede kroge i en ren kasse steriliseret med 75% ethanol.
3. Forberedelse af en ligeringssløjfe.
   1. Placer midten af en 7-0 silkesøm i 1/2 cirkelstørrelse 3 fjederøje på en tilspidset ikke-swaged kirurgisk nål.
4. Forberedelse af en snare loop controller
   1. Skær et 5 mm polyethylen (PE) -10 rør ved hjælp af en saks.
   2. Opvarm og blødgør røret under flammen for at glatte begge kanter.
5. Forberedelse af rotterne
   1. Vælg 8 uger gamle Sprague-Dawley hanrotter med en minimumsvægt på 250 g.
   2. Opstalde og vedligehold rotterne under en 12 timers lys/mørk cyklus ved en kontrolleret temperatur (21 °C ± 2 °C) med fri adgang til foder, standard musepiller og postevand.
   3. Bedøv rotterne med pentobarbital (50 mg / kg, administreret intraperitonealt).
      BEMÆRK: Yderligere bedøvelse (pentobarbital, 30 mg / kg) skal administreres efter hver time.
   4. Kontroller rotternes reflekser ved at klemme halen og bagbenene for at sikre, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet.
   5. Åbn vævet mellem to patronringe under glottis ved hjælp af en saks og indsæt et 3 cm PE-10 rør til at fungere som et endotrakealt rør²⁵.
   6. Tilslut endotrachealrøret til en ventilator manuelt.
   7. Undersøg dyrets thoraxbevægelse synkroniseret med respirationscyklussen for at sikre, at lungerne er tilstrækkeligt ventilerede.
   8. Åbn halsregionen og cannulate jugularvenen²⁶.

2. LAD ligering

1. Tag en kirurgisk maske og handsker på.
2. Berør brystet og find manubrium og brystvinkel (krydset mellem manubrium og brystben).
3. Identificer venstre sideribbe, der forbinder med brystvinklen (ribben A) ved at røre manuelt.
4. Identificer det interkostale rum umiddelbart under ribben A. Brug pincet med fin spids til forsigtigt at løfte huden tæt på det interkostale rum, og brug derefter en kirurgisk skalpel med et blad til at skabe et 1 cm skråt snit langs hudspændingslinjerne fra punktet ca. 5 mm til venstre for brystkroppen.
5. Brug buede tang til forsigtigt at adskille hud- og muskellagene fra snittet. Hæng muskellagene uden for venstre forreste brystvæg nedad med bøjede klip for at udsætte ribbenene nedenunder.
6. Identificer ribben under ribben A (ribben B). Skær ribben B med en stump saks fra midten af ribbenbrusk (ca. 2-3 mm fra brystkroppen). Rør forsigtigt ved og komprimer såret med en saltvandsvåd bomuldskugle i flere sekunder, hvis der opstår blødning.
7. Åbn brystkassen forsigtigt fra snittet af ribben B med fire bøjede klip. Hvert bøjet klip skal koble den interkostale muskel og ribben for forsigtigt at sprede brystvæggen i fire retninger (nemlig øvre derefter venstre, øvre derefter højre, venstre nedad og højre nedad) og skabe et rektangulært kirurgisk vindue.
8. Krog forsigtigt mod venstre lunge og andre tilstødende væv, der dækker perikardiet med et andet bøjet klip for at forhindre utilsigtet vævsskade under proceduren.
9. Udsæt hjertet ved forsigtigt at fjerne det tynde perikardium med tang. Identificer den 1. gren af venstre hovedkoronararterie (LMCA), som normalt er mellem lungearterien og venstre auricle. LMCA og LAD præsenterer som en overfladisk lys rød linje, der løber fra kanten af venstre auricle mod toppen.
10. Brug den forberedte kirurgiske nål til at skabe en åben ligeringssløjfe ved at indsætte og føre silkesømmen under LAD på et sted, der umiddelbart er distalt til 1. gren af LMCA i retning fra venstre mod højre side af LAD for at undgå ved et uheld at punktere venstre auricle. Med en enkelt sutur oprettes den åbne sløjfe. Swab forsigtigt overfladen af hjertet for at visualisere kranspulsårerne, hvis LAD er usynlig på grund af væske eller blod, der dækker overfladen af hjertet.
11. Hold den ene side af suturen og adskil forsigtigt nålen fra suturen ved hjælp af en nåleholder.
12. Indsæt de to ender af silkesuturen på den ene side af den åbne sløjfe i cirklen på den anden side for at danne en lilletrommeløkke.
13. Indsæt de to ender af snare loopens silkesutur i den forberedte snare controller, inden du lukker løkken.
14. Skub snare loop-controlleren langs silkesuturen, mens du forsigtigt strækker silken for at lukke snare loop. Stop koronarstrømmen af LAD for at fremkalde midlertidig myokardieiskæmi i 1 time.
15. Hold silken for at fastgøre positionen af snare loop-controlleren med Kelly-tang, når løkken er bundet sikkert. Placer den anden ende af Kelly-tangen på operationsbordet under LAD-ligering.
16. Dæk det kirurgiske vindue med saltvandsvåde bomuldskugler under LAD-ligering.
17. Åbn Kelly-tangen.
18. Slip snare loop-controlleren til reperfusion af koronarstrømmen i 2 timer.
19. Resekter hjertet langs basen og vaskulære grænser omhyggeligt og undgå at gribe vævet.
    BEMÆRK: Aflive rotten med CO₂ med en strømningshastighed på 40% burvolumen / min.

Representative Results

Ved afslutningen af myokardieiskæmi og reperfusion bør kvaliteten af LAD-ligering vurderes før yderligere biokemiske eller molekylære analyser.

Tilstrækkeligheden af LAD-okklusion gennem ligering blev bestemt ved at injicere 1 ml 2% Evans blå farvestof gennem det centrale venekateter. Derefter blev myokardiet med koronar perfusion farvet blåt sammenlignet med den ikke-perfunderede region, som forblev rød (figur 1A). Den røde region er AAR for myokardieinfarkt.

Nøjagtigheden af placeringen for LAD ligering blev yderligere evalueret ved at kvantificere variationen i AAR-procenten blandt forsøgsdyrene. Efter at hjertet blev skåret vandret, blev AAR-procenten bestemt ved at dividere AAR med hele myokardiemassen (figur 1B). En lav variation i AAR-procenten blandt forsøgsdyrene indikerede nøjagtig placering af LAD-ligeringen.

Myokardieinfarktstørrelsen er det primære resultat i akut myokardie-IR-forskning. For at kvantificere denne parameter blev de skiveskårne hjertesektioner inkuberet i 1% 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) i normalt saltvand ved 37 °C i 30 minutter og derefter i 10% formaldehyd i 3 dage. Infarktområdet var hvidt. Infarktstørrelsesprocenten blev beregnet som forholdet mellem infarktarealet og den årlige aktivitetsrapport (figur 2).

Figur 1: Validering af LAD ligeringskvalitet med Evans blå. (A) AAR for myokardieinfarkt var den ikke-perfuserede myokardiemasse, der forblev rød, selv efter at Evans blå blev injiceret, hvilket bekræftede sikker LAD-ligering. (B) AAR-procenten blev beregnet ved at dividere AAR (rødt område) med hele myokardiemassen (rødt og blåt område); en lav variation i AAR-procenten blandt forsøgsdyrene viste nøjagtig placering af LAD-ligeringen. En mindre infarktstørrelse blev påvist i lægemiddelbehandlede grupper sammenlignet med ikke-behandlede grupper. AAR, risikoområde LAD, venstre forreste nedadgående arterie. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Kvantificering af myokardieinfarktstørrelse i TTC-behandling. Infarktstørrelse blev estimeret som forholdet mellem infarktarealet (hvidt område) og AAR (rødt område) i LAD-ligeringsgruppen. AAR, risikoområde TTC, triphenyltetrazoliumchlorid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Den foreslåede protokol har flere karakteristiske træk, såsom at identificere den nøjagtige position for LAD-ligering, skabe en gadget til at kontrollere en snare-sløjfe i en enkelt sutur og understøtte en modificeret kirurgisk manøvre for at reducere vævsskade, hvilket gør det muligt for forskere at ligere LAD nøjagtigt, sikkert og konsekvent samt kontrollere tilstanden af lilletrommesløjfen øjeblikkeligt til akut myokardie-IR-forskning.

Placeringen af LAD ligation påvirker området og størrelsen af myokardieinfarkt. Ligation foreslås generelt i en vis afstand på den proksimale LAD^27,28. At overse variansen i koronararteriens forgreningsmønstre kan øge variabiliteten i myokardieinfarkt^23,24. I denne undersøgelse blev LAD ligeret umiddelbart distalt til 1. gren af LMCA, hvilket forhindrede utilsigtet ligering af venstre circumflexarterie eller septalarterie og førte til konsekvent infarktstørrelse og en lavere sandsynlighed for dødelig arytmi 29,30,31.

Sikker LAD-ligering er afgørende for LAD-okklusion. Eksperter har anbefalet, at LAD skal ligeres med bundetfor at skabe en til tre knuder eller med et lille stykke rør for at komprimere koronararterien 32,33,34,35,36. I dette papir foreslår vi en kontrollerbar gadget med en lilletrommeløkke til ligering af LAD i en enkelt sutur; denne tilgang muliggør sikker LAD-ligering og øjeblikkelig kontrol af sløjfelukning og frigivelse, samtidig med at vævsflængning, blødning og brud på suturens styrke forhindres under gentagen myokardiepunktur, arteriel ligering og ligaturfrigivelse. Tilgangen er således nyttig til eksperimentelle og valideringsprocedurer i akut myokardie-IR-forskning.

Genkendelse af anatomiske træk og histologiske egenskaber under operationen er nyttigt til at reducere vævsskade og forbedre undersøgelsesreplikation. Med hensyn til åbningen af brystkassen har forskere foreslået at adskille brystmusklerne og 3. eller 4. interkostale muskler ved hjælp af saks, en retraktor, tang, stump pincet eller sting til at trække brystmusklerne og brystkassen til side 32,33,35,37,38. Denne undersøgelse foreslår et snit langs hudspændingslinjerne (hudens bindevævsramme)^39,40, skære et enkelt ribbens brusk, som indeholder avaskulært fleksibelt bindevæv ^41, og tilslutte brystmuskel- og ribbenburene for at åbne brystvæggen. Denne tilgang hjælper med at opretholde vævsintegritet og reducerer blødningsrisikoen. Derudover betyder det at starte tilgangen ved at identificere pålidelige overfladeproducenter gennem berøring, at den kirurgiske procedure ved hjælp af et hudsnit er meget gentagelig og konsistent.

Bekræftelse af kvaliteten af myokardieinfarkt induceret af LAD ligering er et kritisk skridt før undersøgelsen af patofysiologiske ændringer i akut myokardie-IR-forskning. I litteraturen bekræftes forekomsten af myokardieinfarkt efter LAD-ligering ved at observere pludselig regional bleghed af myokardiet^28,33; et akut ST-segment af elektrokardiogramforhøjelse fra baseline³³ forhøjede serumhjerteenzymniveauer såsom CK-MB, troponin I og troponin T ^28,32,42; eller infarkterede regioner^{makroskopisk 42}. Konsistensen af LAD-ligering bør yderligere valideres ved at bestemme AAR for infarkt ved anvendelse af Phthalo eller Evans blå farvestof^32,35,37,38. Lav variabilitet i AAR-procent blandt prøver viser konsistensen og kvaliteten af proceduren for akut myokardie-IR-forskning. Desuden kan infarktområdet skelnes fra AAR ved at afgrænse myokardieinfarktregioner med TTC^28,36. Evans blå / TTC dobbeltfarvning blev tidligere anvendt til at evaluere kvaliteten af en myokardie-IR-undersøgelse ex vivo³⁷. Sammenlignet med kravet i ex vivo-evalueringer om, at det isolerede hjerte skal perfuseres under Langendorff-apparatet, understøtter denne undersøgelse dyreprotokollen for in vivo-evaluering, hvor resultaterne opnås, og undersøgelsens kvalitet valideres øjeblikkeligt og direkte.

Endnu vigtigere udelukker brugen af Evans blå og TTC til at definere infarktområdet til AAR brugen af det infarkte myokardium til biokemiske analyser, hvilket er et krav for at udelukke forstyrrende faktorer og opnå nøjagtige resultater i akut myokardie-IR-forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator