Venstre fremre synkende koronararterieligering for iskemi-reperfusjonsforskning: modellforbedring via tekniske modifikasjoner og kvalitetskontroll

Summary

Her presenterer vi en protokoll som fokuserer på kvalitetskontroll av venstre fremre synkende koronararterieligering ved teknisk modifisering av den tradisjonelle prosedyren hos rotter for akutt myokardiskemi-reperfusjonsforskning.

Abstract

Koronar hjertesykdom er den ledende dødsårsaken globalt. Fullstendig opphør av blodstrømmen i koronararteriene forårsaker ST-segmentelevasjonsinfarkt (STEMI), noe som resulterer i kardiogent sjokk og dødelig arytmi, som er forbundet med høy dødelighet. Primær koronar intervensjon (PCI) for rekanalisering av koronararterien forbedrer resultatene av STEMI betydelig, men fremskritt som er gjort for å forkorte dør-til-ballongtiden, har ikke klart å redusere dødeligheten på sykehuset, noe som tyder på at ytterligere terapeutiske strategier er nødvendige. Venstre fremre synkende koronararterie (LAD) ligering hos rotter er en dyremodell for akutt myokardial IR-forskning som er sammenlignbar med det kliniske scenariet der rask koronar rekanalisering gjennom PCI brukes til STEMI; PCI-indusert ST-elevasjonsinfarkt er imidlertid en teknisk utfordrende og komplisert operasjon forbundet med høy dødelighet og stor variasjon i infarktstørrelse. Vi identifiserte den ideelle posisjonen for LAD ligering, opprettet en gadget for å kontrollere en skarptrommesløyfe, og støttet en modifisert kirurgisk manøver, og dermed redusere vevskader, for å etablere en pålitelig og reproduserbar akutt myokardiskemi-reperfusjon (IR) forskningsprotokoll for rotter. Dette er en ikke-overlevelse kirurgi. Vi foreslår også en metode for å validere kvaliteten på studieresultatene, noe som er et kritisk skritt for å bestemme nøyaktigheten av påfølgende biokjemiske analyser.

Introduction

Iskemisk hjertesykdom er en ledende dødsårsak over hele verden ^1,2. I tillegg til kontroll av modifiserbare risikofaktorer for å forebygge utvikling av koronar hjertesykdom, er terapeutiske strategier avgjørende for akutt koronarsyndrom ^3,4. Kardiogent sjokk og fatal arytmi ved akutt ST-elevasjonsinfarkt (STEMI) er funnet å øke sannsynligheten for sykehusdødelighet 5,6,7,8. Primær perkutan koronar intervensjon (PCI) er den foretrukne behandlingen ved ST-elevasjonsinfarkt 9,10,11; De terapeutiske effektene har imidlertid et tak når dør-til-ballong-tiden er <90 min^12,13. Ytterligere strategier er nødvendige for ytterligere å forbedre de kliniske resultatene av sykdommen 14,15,16,17,18,19.

Et akutt myokardiskemi-reperfusjonseksperiment (IR) som involverer venstre fremre synkende arterie (LAD) ligering hos rotter er en av dyremodellene som kan sammenlignes med det kliniske scenariet, hvor korte dør-til-ballongtider kreves for pasienter med ST-elevasjonsinfarkt for å redde hjertet fra iskemisk skade. Operasjonsindusert ST-elevasjonsinfarkt hos små dyr er imidlertid ofte teknisk utfordrende fordi det er en kompleks operasjon forbundet med høy dødelighet og stor variasjon i infarktstørrelse 20,21,22,23,24. For å overvinne den tekniske utfordringen utviklet denne studien en omfattende og effektiv dyremodell hos rotter (fordi de er større enn mus) for å etablere en pålitelig og reproduserbar akutt myokardial IR-forskningsprotokoll gjennom teknisk modifikasjon. Den foreslåtte protokollen resulterer i færre kirurgiske komplikasjoner, mindre vevskader og mindre sannsynlighet for dødelighet under operasjonen. I tillegg ble det brukt en prosedyre for å måle infarktstørrelse og risikoområde (AAR) og dermed verifisere kvaliteten på studieresultatene. Den foreslåtte protokollen kan brukes til å undersøke de patofysiologiske prosessene for akutt myokardial IR-stress for å utvikle nye terapeutiske strategier mot skaden.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, utgitt av US National Institutes of Health (NIH publikasjon nr. 85-23, revidert 1996). Studieprotokollen ble godkjent av og i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Fu-Jen katolske universitet.

1. Forberedelse før kirurgi

1. Tilberedning av saltvann våte bomullsballer
   1. Ta på en kirurgisk maske og hansker.
   2. Klem av en liten porsjon steril bomull og rull den for å danne en ball. Gjenta denne prosedyren.
   3. Dypp bomullsdottene i steril 0,9% saltvann og press ut overflødig saltvann.
   4. Oppbevar bomullsdottene i en ren boks sterilisert med 75% etanol.
2. Forberedelse av holdekroker.
   1. Ta på en kirurgisk maske og hansker.
   2. Steriliser klips og gummibånd med 75% etanol.
   3. Bøy klemmene i form av en krok for brystveggen og vevet.
   4. Koble de bøyde klemmene med en, to eller tre gummibånd for å sikre at spenningen fra såret i operasjonsvinduet er bred nok til LAD ligering.
   5. Forbered og oppbevar minst fem hjemmelagde kroker i en ren boks sterilisert med 75% etanol.
3. Forberedelse av en ligeringssløyfe.
   1. Plasser midten av en 7-0 silkesting i 1/2 sirkelstørrelse 3 fjærøye av en konisk ikke-swaged kirurgisk nål.
4. Forberedelse av en skarpsløyferegulator
   1. Klipp et 5 mm polyetylen (PE)-10-rør med en saks.
   2. Varm opp og myk opp røret under flammen for å glatte begge kantene.
5. Forbereder rottene
   1. Velg 8 uker gamle Sprague-Dawley hannrotter med en minimumsvekt på 250 g.
   2. Hus og hold rottene under en 12 timers lys / mørk syklus ved en kontrollert temperatur (21 ° C ± 2 ° C) med fri tilgang til mat, standard musepellets og vann fra springen.
   3. Bedøv rottene med pentobarbital (50 mg/kg, administrert intraperitonealt).
      MERK: Ytterligere bedøvelse (pentobarbital, 30 mg / kg) bør administreres etter hver time.
   4. Sjekk rottenes reflekser ved å klemme halen og bakføttene for å sikre at dyret er tilstrekkelig bedøvet.
   5. Åpne vevet mellom to patronringer under glottis ved hjelp av saks og sett inn et 3 cm PE-10-rør for å fungere som et endotrakealt rør²⁵.
   6. Koble endotrakealrøret til en ventilator manuelt.
   7. Inspiser dyrets thoraxbevegelse synkronisert med respirasjonssyklusen for å sikre at lungene er tilstrekkelig ventilert.
   8. Åpne nakkeområdet og kanyler halsvenen²⁶.

2. LAD ligering

1. Ta på en kirurgisk maske og hansker.
2. Berør brystet og finn manubrium og sternal vinkel (krysset mellom manubrium og brystben).
3. Identifiser venstre ribbe som forbinder med sternal vinkel (ribbe A) ved å berøre manuelt.
4. Identifiser interkostalrommet rett under ribbe A. Bruk fintupptang til å løfte huden forsiktig nær interkostalrommet, og bruk deretter en kirurgisk skalpell med et blad for å lage et 1 cm skrått snitt langs hudens spenningslinjer fra punktet ca. 5 mm til venstre for sternallegemet.
5. Bruk buet tang for å forsiktig skille hud og muskellag fra snittet. Hekt muskellagene utenfor venstre fremre brystvegg nedover med bøyde klips for å eksponere ribbeina under.
6. Identifiser ribben under ribbe A (ribbe B). Klipp ribbe B med en stump saks fra midten av ribbebrusken (ca. 2-3 mm fra sternalkroppen). Berør og komprimer såret forsiktig med en saltvann våt bomullsdott i flere sekunder hvis blødning oppstår.
7. Åpne brystkassen forsiktig fra kuttet av ribbe B med fire bøyde klips. Hver bøyd klips skal hekte intercostal muskel og ribber for å forsiktig spre brystveggen i fire retninger (nemlig øvre deretter venstre, øvre deretter høyre, venstre nedover og høyre nedover) og skape et rektangulært kirurgisk vindu.
8. Hekt forsiktig mot venstre lunge og andre tilstøtende vev som dekker perikardiet med et annet bøyd klips for å forhindre utilsiktet vevskader under prosedyren.
9. Utsett hjertet ved forsiktig å fjerne det tynne perikardiet med tang. Identifiser 1. gren av venstre hovedkoronararterie (LMCA), som vanligvis er mellom lungearterien og venstre auricle. LMCA og LAD presenterer som en overfladisk lys rød linje som går fra kanten av venstre auricle mot toppunktet.
10. Bruk den forberedte kirurgiske nålen til å lage en åpen ligeringssløyfe ved å sette inn og føre silkestinget under LAD på et sted umiddelbart distalt for 1. gren av LMCA i retning fra venstre mot høyre side av LAD for å unngå utilsiktet punktering av venstre auricle. Med en enkelt sutur opprettes den åpne sløyfen. Vattpinne forsiktig overflaten av hjertet for å visualisere koronararteriene hvis LAD er usynlig på grunn av væske eller blod som dekker overflaten av hjertet.
11. Hold den ene siden av suturen og skill forsiktig nålen fra suturen med en nåleholder.
12. Sett de to endene av silkesuturen på den ene siden av den åpne sløyfen inn i sirkelen på den andre siden for å danne en skarptrommel.
13. Sett de to endene av silkesuturen til skarptrommesløyfen inn i den forberedte skarptrommekontrolleren før du lukker sløyfen.
14. Skyv skarptrommesløyfekontrolleren langs silkesuturen mens du forsiktig strekker silken for å lukke skarptrommeløyfen. Stopp koronarstrømmen av LAD for å indusere midlertidig myokardiskemi i 1 time.
15. Hold silken for å feste posisjonen til skarptrommesløyfekontrolleren med Kelly-tang når løkken er bundet fast. Plasser den andre enden av Kelly-tangen på operasjonsbordet under LAD ligering.
16. Dekk operasjonsvinduet med saltvann våte bomullsdotter under LAD ligering.
17. Åpne Kelly-tangen.
18. Slipp skarpsløyfekontrolleren for reperfusjon av koronarstrømmen i 2 timer.
19. Resect hjertet langs basen og vaskulære grenser forsiktig og unngå å ta tak i vevet.
    MERK: Avlive rotta med CO₂ med en strømningshastighet på 40% merdvolum/min.

Representative Results

Ved slutten av myokardiskemi og reperfusjon bør kvaliteten på LAD-ligering vurderes før ytterligere biokjemiske eller molekylære analyser.

Tilstrekkeligheten av LAD-okklusjon gjennom ligering ble bestemt ved å injisere 1 ml 2% Evans blå fargestoff gjennom det sentrale venekateteret. Deretter ble myokard med koronar perfusjon farget blått sammenliknet med det ikke-perfunderte området, som forble rødt (figur 1A). Den røde regionen er AAR av hjerteinfarkt.

Nøyaktigheten av plasseringen for LAD ligering ble videre evaluert ved å kvantifisere variasjonen i AAR-prosent blant studiedyrene. Etter at hjertet var skåret horisontalt, ble AAR-prosenten bestemt ved å dele AAR med hele myokardmassen (figur 1B). En lav variasjon i AAR-prosent blant studiedyrene indikerte nøyaktig lokalisering av LAD-ligeringen.

Myokardinfarktstørrelsen er det primære resultatet i akutt myokardial IR-forskning. For å kvantifisere denne parameteren ble de skivede hjerteseksjonene inkubert i 1 % 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) i normal saltvann ved 37 °C i 30 minutter og deretter i 10 % formaldehyd i 3 dager. Infarktområdet var hvitt. Infarktstørrelsesprosenten ble beregnet som forholdet mellom infarktområdet og AAR (figur 2).

Figur 1: Validering av LAD ligeringskvalitet med Evans blå. (A) AAR for hjerteinfarkt var den ikke-perfuserte myokardmassen som forble rød selv etter at Evans blå ble injisert, og bekreftet dermed sikker LAD ligering. (B) AAR-prosenten ble beregnet ved å dele AAR (rødt område) med hele myokardmassen (rødt og blått område); en lav variasjon i AAR-prosent blant studiedyrene viste nøyaktig lokalisering av LAD ligering. En mindre infarktstørrelse ble vist i narkotikabehandlede grupper sammenlignet med ikke-behandlede grupper. AAR, område i faresonen; LAD, venstre fremre nedadgående arterie. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 Kvantifisering av hjerteinfarktstørrelse ved TTC-behandling. Infarktstørrelse ble estimert som forholdet mellom infarktområdet (hvitt område) og AAR (rødt område) i LAD ligeringsgruppen. AAR, område i faresonen; TTC, trifenyltetrazoliumklorid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den foreslåtte protokollen har flere særegne egenskaper, for eksempel å identifisere den nøyaktige posisjonen for LAD-ligering, lage en gadget for å kontrollere en skarptrommeløyfe i en enkelt sutur, og støtte en modifisert kirurgisk manøver for å redusere vevskader, og dermed gjøre det mulig for forskere å ligere LAD nøyaktig, sikkert og konsekvent, samt kontrollere tilstanden til skarptrommesløyfen umiddelbart for akutt myokardial IR-forskning.

Plasseringen av LAD ligering påvirker området og størrelsen på hjerteinfarkt. Ligering er generelt foreslått på en viss avstand på den proksimale LAD^27,28. Å overse variansen i koronarforgreningsmønstre kan øke variasjonen i hjerteinfarkt^23,24. I denne studien ble LAD ligert umiddelbart distalt for 1. gren av LMCA, og forhindret dermed utilsiktet ligering av venstre cirkumfleksarterie eller septumarterie og førte til konsistent infarktstørrelse og lavere sannsynlighet for dødelig arytmi 29,30,31.

Sikker LAD ligering er viktig for LAD okklusjon. Eksperter har anbefalt at LAD skal ligeres med bundet for å skape en til tre knop eller med et lite stykke slange for å komprimere koronararterien 32,33,34,35,36. I denne artikkelen foreslår vi en kontrollerbar gadget med en skarptrommeløype for å ligere LAD i en enkelt sutur; denne tilnærmingen muliggjør sikker LAD ligering og øyeblikkelig kontroll av sløyfelukking og frigjøring samtidig som det forhindrer vevsskader, blødninger og brudd på suturens styrke under gjentatt myokardpunktering, arteriell ligering og ligaturfrigivelse. Tilnærmingen er derfor nyttig for eksperimentelle og valideringsprosedyrer i akutt myokardial IR-forskning.

Å gjenkjenne anatomiske egenskaper og histologiske egenskaper under operasjonen er nyttig for å redusere vevskader og forbedre studiereplikasjonen. Når det gjelder åpningen av thoraxen, har forskere foreslått å skille bryst- og 3. eller 4. interkostalmuskulatur ved å bruke saks, en retractor, tang, stump pinsett eller masker for å trekke til side thoraxmusklene og brystkassen 32,33,35,37,38. Den foreliggende studien antyder et snitt langs hudens spenningslinjer (bindevevsrammen i huden)^39,40, kutting av brusk i en enkelt ribbe, som inneholder avaskulært fleksibelt bindevev^41, og hekting av thoraxmuskelen og ribbeholderne for å åpne brystveggen. Denne tilnærmingen bidrar til å opprettholde vevets integritet og reduserer blødningsrisikoen. I tillegg betyr det å starte tilnærmingen ved å identifisere pålitelige overflateprodusenter gjennom berøring at den kirurgiske prosedyren ved hjelp av et hudsnitt er svært repeterbar og konsistent.

Bekreftelse av kvaliteten på hjerteinfarkt indusert av LAD ligering er et kritisk skritt før undersøkelsen av patofysiologiske endringer i akutt myokardial IR-forskning. I litteraturen bekreftes forekomsten av hjerteinfarkt etter LAD ligering ved å observere plutselig regional blekhet i myokardiet^28,33; et akutt ST-segment av forhøyet elektrokardiogram fra baseline³³; forhøyede serumhjerteenzymnivåer som CK-MB, troponin I og troponin T ^28,32,42; eller infarktregioner^{makroskopisk 42}. Konsistensen av LAD ligering bør videre valideres ved å bestemme AAR for infarkt ved å bruke Phthalo eller Evans blå fargestoff^32,35,37,38. Lav variasjon i AAR-prosent blant prøver viser konsistensen og kvaliteten på prosedyren for akutt myokardial IR-forskning. Videre kan infarktområdet skilles fra AAR ved å avgrense hjerteinfarktregioner med TTC^28,36. Evans blå / TTC dobbeltfarging ble tidligere brukt til å evaluere kvaliteten på en myokardial IR-studie ex vivo³⁷. Sammenlignet med kravet i ex vivo-evalueringer om at det isolerte hjertet skal perfuseres under Langendorff-apparatet, støtter denne studien dyreprotokollen for in vivo-evaluering der resultatene oppnås, og kvaliteten på studien valideres umiddelbart og direkte.

Enda viktigere, bruken av Evans blå og TTC for å definere infarktområdet til AAR utelukker bruk av infarkt myokard for biokjemiske analyser, noe som er et krav for å utelukke forstyrrende faktorer og oppnå nøyaktige resultater i akutt myokardial IR-forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator