Summary
Nous présentons ici un protocole axé sur le contrôle de la qualité de la ligature de l’artère coronaire antérieure descendante gauche en modifiant techniquement la procédure traditionnelle chez le rat pour la recherche sur l’ischémie-reperfusion myocardique aiguë.
Abstract
Les maladies coronariennes sont la principale cause de décès dans le monde. L’arrêt complet du flux sanguin dans les artères coronaires provoque un infarctus du myocarde avec élévation du segment ST (STEMI), entraînant un choc cardiogénique et une arythmie mortelle, qui sont associés à une mortalité élevée. L’intervention coronarienne primaire (ICP) pour recanaliser l’artère coronaire améliore considérablement les résultats de STEMI, mais les progrès réalisés dans la réduction du temps de passage de la porte au ballon n’ont pas réussi à réduire la mortalité à l’hôpital, ce qui suggère que des stratégies thérapeutiques supplémentaires sont nécessaires. La ligature de l’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL) chez le rat est un modèle animal pour la recherche sur l’IR myocardique aiguë qui est comparable au scénario clinique dans lequel la recanalisation coronarienne rapide par ICP est utilisée pour STEMI; cependant, le STEMI induit par l’ICP est une opération techniquement difficile et compliquée associée à une mortalité élevée et à une grande variation de la taille de l’infarctus. Nous avons identifié la position idéale pour la ligature LAD, créé un gadget pour contrôler une boucle de caisse claire et soutenu une manœuvre chirurgicale modifiée, réduisant ainsi les lésions tissulaires, afin d’établir un protocole de recherche fiable et reproductible d’ischémie-reperfusion myocardique aiguë (IR) pour les rats. Il s’agit d’une chirurgie de non-survie. Nous proposons également une méthode de validation de la qualité des résultats de l’étude, étape critique pour déterminer la précision des analyses biochimiques ultérieures.
Introduction
Les cardiopathies ischémiques sont l’une des principales causes de décès dans le monde 1,2. En plus du contrôle des facteurs de risque modifiables pour prévenir le développement de la maladie coronarienne, des stratégies thérapeutiques sont cruciales pour le syndrome coronarien aigu 3,4. On a constaté que le choc cardiogénique et l’arythmie mortelle dans l’infarctus aigu du myocarde avec élévation du segment ST (STEMI) augmentent la probabilité de mortalité à l’hôpital 5,6,7,8. L’intervention coronarienne percutanée primaire (ICP) est le traitement privilégié pour STEMI 9,10,11; Cependant, les effets thérapeutiques ont un plafond lorsque le temps de porte à ballon est de <90 min12,13. Des stratégies supplémentaires sont nécessaires pour améliorer encore les résultats cliniques de la maladie 14,15,16,17,18,19.
Une expérience aiguë d’ischémie-reperfusion myocardique (IR) impliquant la ligature de l’artère descendante antérieure gauche (DAL) chez le rat est l’un des modèles animaux comparables au scénario clinique dans lequel de courts temps de porte au ballon sont nécessaires pour les patients atteints de STEMI pour sauver le cœur des dommages ischémiques. Cependant, le STEMI induit par la chirurgie chez les petits animaux est souvent techniquement difficile car il s’agit d’une opération complexe associée à une mortalité élevée et à une forte variation de la taille de l’infarctus 20,21,22,23,24. Pour surmonter le défi technique, la présente étude a développé un modèle animal complet et efficace chez le rat (parce qu’ils sont plus gros que les souris) afin d’établir un protocole de recherche fiable et reproductible sur l’IR myocardique aiguë par modification technique. Le protocole proposé entraîne moins de complications chirurgicales, moins de lésions tissulaires et moins de risques de mortalité pendant la chirurgie. De plus, une procédure a été utilisée pour mesurer la taille de l’infarctus et la zone à risque (RAA) et, ainsi, vérifier la qualité des résultats de l’étude. Le protocole proposé peut être utilisé pour étudier les processus physiopathologiques du stress IR myocardique aigu afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les dommages.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publié par les National Institutes of Health des États-Unis (publication des NIH no 85-23, révisée en 1996). Le protocole d’étude a été approuvé par et conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université catholique Fu-Jen.
1. Préparation avant la chirurgie
- Préparation de boules de coton humides salines
- Mettez un masque chirurgical et des gants.
- Pincez une petite portion de coton stérile et roulez-la pour former une boule. Répétez cette procédure.
- Trempez les boules de coton dans une solution saline stérile à 0,9% et extrayez l’excès de solution saline.
- Conservez les boules de coton dans une boîte propre stérilisée à 75% d’éthanol.
- Préparation des crochets de maintien.
- Mettez un masque chirurgical et des gants.
- Stérilisez les clips et les élastiques avec de l’éthanol à 75%.
- Pliez les clips en forme de crochet pour la paroi thoracique et le tissu.
- Connectez les clips pliés avec un, deux ou trois élastiques pour vous assurer que la tension de la plaie de la fenêtre chirurgicale est suffisamment large pour la ligature LAD.
- Préparez et conservez au moins cinq crochets faits maison dans une boîte propre stérilisée à 75 % d’éthanol.
- Préparation d’une boucle de ligature.
- Placez le milieu d’un point de soie 7-0 dans l’œil de ressort de taille 3 de cercle 1/2 d’une aiguille chirurgicale effilée non évasée.
- Préparation d’un contrôleur de boucle claire
- Coupez un tube en polyéthylène (PE)-10 de 5 mm à l’aide de ciseaux.
- Chauffer et ramollir le tube sous la flamme pour lisser ses deux bords.
- Préparation des rats
- Choisissez des rats mâles Sprague-Dawley âgés de 8 semaines pesant au moins 250 g.
- Hébergez et entretenez les rats sous un cycle lumière/obscurité de 12 h à une température contrôlée (21 °C ± 2 °C) avec un accès gratuit à la nourriture, aux granulés de souris standard et à l’eau du robinet.
- Anesthésier les rats avec du pentobarbital (50 mg/kg, administré par voie intrapéritonéale).
NOTE: Un anesthésique supplémentaire (pentobarbital, 30 mg / kg) doit être administré après chaque heure. - Vérifiez les réflexes des rats en pinçant la queue et les pattes postérieures pour vous assurer que l’animal est suffisamment anesthésié.
- Ouvrez le tissu entre deux anneaux de cartouche sous la glotte à l’aide de ciseaux et insérez un tube PE-10 de 3 cm pour agir comme un tube endotrachéal25.
- Connectez manuellement le tube endotrachéal à un ventilateur.
- Inspectez les mouvements thoraciques de l’animal synchronisés avec le cycle respiratoire pour vous assurer que les poumons sont correctement ventilés.
- Ouvrez la région du cou et canulez la veine jugulaire26.
2. Ligature LAD
- Mettez un masque chirurgical et des gants.
- Touchez la poitrine et trouvez le manubrium et l’angle sternal (la jonction du corps du manubrium et du sternum).
- Identifiez la côte gauche qui se connecte à l’angle sternal (côte A) en touchant manuellement.
- Identifiez l’espace intercostal immédiatement sous la côte A. Utilisez une pince à pointe fine pour soulever doucement la peau près de l’espace intercostal, puis utilisez un scalpel chirurgical avec une lame pour créer une incision oblique de 1 cm le long des lignes de tension cutanée à partir du point d’environ 5 mm à gauche du corps sternal.
- Utilisez des pinces incurvées pour séparer doucement la peau et les couches musculaires de l’incision. Accrochez les couches musculaires à l’extérieur de la paroi thoracique antérieure gauche vers le bas avec des pinces pliées pour exposer les côtes en dessous.
- Identifier la côte sous la côte A (côte B). Couper la côte B avec un ciseau émoussé à partir du milieu du cartilage des côtes (à environ 2-3 mm du corps sternal). Touchez doucement et comprimez la plaie avec une boule de coton humide saline pendant plusieurs secondes en cas de saignement.
- Ouvrez soigneusement le thorax de la coupe de la côte B avec quatre clips pliés. Chaque pince pliée doit accrocher le muscle intercostal et les côtes pour écarter doucement la paroi thoracique dans quatre directions (à savoir, supérieure puis gauche, supérieure puis droite, gauche vers le bas et droite vers le bas) et créer une fenêtre chirurgicale rectangulaire.
- Accrocher doucement contre le poumon gauche et d’autres tissus adjacents recouvrant le péricarde avec une autre pince pliée pour éviter les dommages tissulaires accidentels pendant la procédure.
- Exposez le cœur en retirant doucement le péricarde mince à l’aide d’une pince. Identifiez la 1ère branche de l’artère coronaire principale gauche (LMCA), qui se trouve généralement entre l’artère pulmonaire et l’oreillette gauche. Le LMCA et le LAD se présentent comme une ligne rouge vif superficielle qui va du bord de l’oreillette gauche vers l’apex.
- Utilisez l’aiguille chirurgicale préparée pour créer une boucle de ligature ouverte en insérant et en passant le point de soie sous le DAL à un endroit immédiatement distal à la 1ère branche du LMCA dans la direction allant de la gauche vers le côté droit du LAD pour éviter de perforer accidentellement l’oreillette gauche. Avec une seule suture, la boucle ouverte est créée. Frottez doucement la surface du cœur pour visualiser les artères coronaires si le DAL est invisible en raison du liquide ou du sang recouvrant la surface du cœur.
- Tenez un côté de la suture et séparez doucement l’aiguille de la suture à l’aide d’un porte-aiguille.
- Insérez les deux extrémités de la suture en soie d’un côté de la boucle ouverte dans le cercle de l’autre côté pour former une boucle de caisse claire.
- Insérez les deux extrémités de la suture en soie de la boucle de caisse claire dans le contrôleur de caisse claire préparé avant de fermer la boucle.
- Faites glisser le contrôleur de la boucle de caisse claire le long de la suture de soie tout en étirant doucement la soie pour fermer la boucle de caisse claire. Arrêter le flux coronaire du DAL pour induire une ischémie myocardique temporaire pendant 1 h.
- Tenez la soie pour fixer la position du contrôleur de la boucle de caisse claire avec une pince Kelly une fois que la boucle a été solidement attachée. Placez l’autre extrémité de la pince Kelly sur la table chirurgicale pendant la ligature LAD.
- Couvrez la fenêtre chirurgicale avec des boules de coton humides salines pendant la ligature LAD.
- Ouvrez la pince Kelly.
- Relâchez le contrôleur de la boucle de caisse claire pour la reperfusion de l’écoulement coronaire pendant 2 h.
- Réséquez soigneusement le cœur le long de la base et des bordures vasculaires et évitez de saisir le tissu.
REMARQUE : Euthanasier le rat avec du CO2 à un débit de 40 % du volume de la cage/min.
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Representative Results
À la fin de l’ischémie myocardique et de la reperfusion, la qualité de la ligature LAD doit être évaluée avant d’autres analyses biochimiques ou moléculaires.
La suffisance de l’occlusion du DAL par ligature a été déterminée en injectant 1 mL de colorant bleu d’Evan à 2 % à travers le cathéter veineux central. Ensuite, le myocarde avec perfusion coronaire a été coloré en bleu par rapport à la région non perfusée, qui est restée rouge (Figure 1A). La région rouge est l’AAR de l’infarctus du myocarde.
L’exactitude de l’emplacement de la ligature du DAL a été évaluée en quantifiant la variation du pourcentage de RAA parmi les animaux à l’étude. Après que le cœur a été tranché horizontalement, le pourcentage d’AAR a été déterminé en divisant l’AAR par la masse myocardique entière (Figure 1B). Une faible variation du pourcentage de RAA parmi les animaux de l’étude indiquait une localisation précise de la ligature du DAL.
La taille de l’infarctus du myocarde est le principal résultat de la recherche sur l’IR myocardique aiguë. Pour quantifier ce paramètre, les sections de cœur tranchées ont été incubées dans du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) à 1% dans une solution saline normale à 37 °C pendant 30 minutes, puis dans du formaldéhyde à 10% pendant 3 jours. La zone de l’infarctus était blanche. Le pourcentage de taille de l’infarctus a été calculé comme le rapport entre la surface de l’infarctus et le RAA (figure 2).
Figure 1 : Validation de la qualité de la ligature LAD avec le bleu d’Evan. (A) L’AAR pour l’infarctus du myocarde était la masse myocardique non perfusée qui restait rouge même après l’injection du bleu d’Evan, confirmant ainsi la ligature sécurisée du DAL. (B) Le pourcentage de RAA a été calculé en divisant l’AAR (zone rouge) par la masse myocardique totale (zone rouge et bleue); une faible variation du pourcentage de RAA parmi les animaux de l’étude a démontré une localisation précise de la ligature du DAL. Une taille d’infarctus plus petite a été démontrée dans les groupes traités par le médicament par rapport aux groupes non traités. RAA, zone à risque; LAD, artère descendante antérieure gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification de la taille de l’infarctus du myocarde dans le traitement TTC. La taille de l’infarctus a été estimée comme le rapport entre la zone de l’infarctus (zone blanche) et l’AAR (zone rouge) dans le groupe de ligature LAD. RAA, zone à risque; TTC, chlorure de triphényltétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole proposé présente plusieurs caractéristiques distinctives, telles que l’identification de la position exacte pour la ligature LAD, la création d’un gadget pour contrôler une boucle de caisse claire dans une seule suture et le soutien d’une manœuvre chirurgicale modifiée pour réduire les lésions tissulaires, permettant ainsi aux chercheurs de ligaturer le LAD avec précision, sécurité et cohérence, ainsi que de contrôler instantanément l’état de la boucle de caisse claire pour la recherche sur les IR myocardiques aiguës.
L’emplacement de la ligature LAD influence la zone et la taille de l’infarctus du myocarde. La ligature est généralement suggérée à une certaine distance sur le DAL proximal27,28. Négliger la variance dans les ramifications des artères coronaires peut augmenter la variabilité de l’infarctus du myocarde23,24. Dans cette étude, le DAL a été ligaturé immédiatement distal à la 1ère branche du LMCA, empêchant ainsi la ligature accidentelle de l’artère circonflexe gauche ou de l’artère septale et conduisant à une taille constante de l’infarctus et à une probabilité plus faible d’arythmie mortelle 29,30,31.
La ligature sécurisée du DAL est essentielle pour l’occlusion du DAL. Les experts ont recommandé que le LAD soit ligaturé avec attaché pour créer un à trois nœuds ou avec un petit morceau de tube pour comprimer l’artère coronaire 32,33,34,35,36. Dans cet article, nous suggérons un gadget contrôlable avec une boucle de caisse claire pour ligaturer le DAL en une seule suture; cette approche permet une ligature LAD sécurisée et un contrôle instantané de la fermeture et de la libération de la boucle tout en empêchant la lacération tissulaire, les saignements et la rupture de la force de la suture lors de ponctions myocardiques répétées, de ligatures artérielles et de libération de ligature. L’approche est donc utile pour les procédures expérimentales et de validation dans la recherche sur la RI aiguë du myocarde.
La reconnaissance des caractéristiques anatomiques et des propriétés histologiques pendant la chirurgie est utile pour réduire les lésions tissulaires et améliorer la réplication de l’étude. En ce qui concerne l’ouverture du thorax, les chercheurs ont suggéré de séparer les muscles pectoraux et 3e ou 4e intercostaux à l’aide de ciseaux, d’un rétracteur, de forceps, d’une pince à épiler ou de points de suture pour écarter les muscles thoraciques et la cage thoracique 32,33,35,37,38. La présente étude suggère une incision le long des lignes de tension cutanée (le cadre du tissu conjonctif de la peau)39,40, coupant le cartilage d’une seule côte, qui contient du tissu conjonctif flexible avasculaire41, et accrochant le muscle thoracique et les cages thoraciques pour ouvrir la paroi thoracique. Cette approche aide à maintenir l’intégrité des tissus et réduit le risque de saignement. De plus, commencer l’approche en identifiant des fabricants de surfaces fiables par le toucher signifie que la procédure chirurgicale utilisant une incision cutanée est hautement reproductible et cohérente.
La confirmation de la qualité de l’infarctus du myocarde induit par la ligature LAD est une étape critique avant l’étude des changements physiopathologiques dans la recherche sur les IR myocardiques aiguës. Dans la littérature, la survenue d’un infarctus du myocarde après ligature LAD est confirmée par l’observation d’une pâleur régionale soudaine du myocarde28,33 ; un segment ST aigu d’élévation de l’électrocardiogramme par rapport à la ligne de base33; taux élevés d’enzymes cardiaques sériques telles que CK-MB, troponine I et troponine T 28,32,42; ou régions infarctus macroscopiquement42. La cohérence de la ligature LAD devrait également être validée en déterminant le RAA pour l’infarctus à l’aide du colorant bleu Phthaloou Evan 32,35,37,38. La faible variabilité du pourcentage d’AAR entre les échantillons prouve la cohérence et la qualité de la procédure pour la recherche sur l’IR aiguë du myocarde. De plus, la zone de l’infarctus peut être distinguée de l’AAR en délimitant les régions d’infarctus du myocarde avec TTC28,36. La double coloration bleu Evans/TTC a déjà été utilisée pour évaluer la qualité d’une étude IR myocardique ex vivo37. Par rapport à l’exigence dans les évaluations ex vivo que le cœur isolé soit perfusé sous l’appareil de Langendorff, cette étude soutient le protocole animal d’évaluation in vivo dans lequel les résultats sont obtenus, et la qualité de l’étude est validée instantanément et directement.
Plus important encore, l’utilisation du bleu d’Evan et du TTC pour définir la zone de l’infarctus à l’AAR empêche l’utilisation du myocarde infarctus pour les analyses biochimiques, ce qui est une exigence pour exclure les facteurs de confusion et obtenir des résultats précis dans la recherche sur l’IR myocardique aiguë.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Acknowledgments
Ce modèle a été développé avec le soutien financier du ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evan’s blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Forceps | Shinva | ||
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Scalpel handles | Shinva | ||
| Silk sutures | SharpointTM | DC-2150N | |
| Surgical needle | AnchorTM | ||
| Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution | Solarbio | T8170-1 | |
| Ventilator | Harvard Rodent Ventilator |
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