Ligadura da Artéria Coronária Descendente Anterior para Pesquisa de Isquemia-Reperfusão: Aprimoramento do Modelo via Modificações Técnicas e Controle de Qualidade

Summary

Neste trabalho, apresentamos um protocolo com foco no controle de qualidade da ligadura da artéria coronária descendente anterior, modificando tecnicamente o procedimento tradicional em ratos para pesquisa de isquemia-reperfusão miocárdica aguda.

Abstract

A doença coronariana é a principal causa de morte no mundo. A cessação completa do fluxo sanguíneo nas artérias coronárias causa infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST (IAMCSST), resultando em choque cardiogênico e arritmia fatal, que estão associados a alta mortalidade. A intervenção coronária primária (ICP) para recanalização da artéria coronária melhora significativamente os desfechos do IAMCSST, mas os avanços obtidos na redução do tempo porta-balão não conseguiram reduzir a mortalidade hospitalar, sugerindo que estratégias terapêuticas adicionais são necessárias. A ligadura da artéria coronária descendente anterior (DA) em ratos é um modelo animal para pesquisa de IR miocárdica aguda comparável ao cenário clínico em que a recanalização coronariana rápida por ICP é usada para IAMCSST; no entanto, o IAMCSST induzido por ICP é uma operação tecnicamente desafiadora e complicada, associada a alta mortalidade e grande variação no tamanho do infarto. Identificamos a posição ideal para a ligadura da ADA, criamos um gadget para controlar uma alça de laço e apoiamos uma manobra cirúrgica modificada, reduzindo o dano tecidual, para estabelecer um protocolo de pesquisa de isquemia-reperfusão (RI) miocárdica aguda confiável e reprodutível para ratos. Trata-se de uma cirurgia sem sobrevida. Também propomos um método para validar a qualidade dos resultados dos estudos, que é uma etapa crítica para determinar a acurácia de análises bioquímicas subsequentes.

Introduction

A doença isquêmica do coração é uma das principais causas de morte no^mundo1,2. Além do controle dos fatores de risco modificáveis para prevenir o desenvolvimento da doença coronariana, estratégias terapêuticas são crucialmente necessárias para a síndrome coronariana^aguda3,4. Choque cardiogênico e arritmia fatal no infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST (IAMCSST) aumentam a probabilidade de mortalidade hospitalar 5,6,7,8. A intervenção coronária percutânea (ICP) primária é o tratamento de escolha para IAMCSST 9,10,11; entretanto, os efeitos terapêuticos têm teto quando o tempo porta-balão é de <90 min^12,13. Estratégias adicionais são necessárias para melhorar ainda mais os desfechos clínicos da doença 14,15,16,17,18,19.

Um experimento de isquemia-reperfusão (IR) miocárdica aguda envolvendo ligadura da artéria descendente anterior (DA) em ratos é um dos modelos animais comparáveis ao cenário clínico em que tempos curtos porta-balão são necessários para pacientes com IAMCSST para resgatar o coração de dano isquêmico. No entanto, o IAMCSST induzido por cirurgia em pequenos animais é frequentemente um desafio técnico, pois é uma operação complexa associada à alta mortalidade e alta variação no tamanho do infarto20,21,22,23,24. Para superar o desafio técnico, o presente estudo desenvolveu um modelo animal abrangente e eficaz em ratos (por serem maiores que camundongos) para estabelecer um protocolo confiável e reprodutível de pesquisa de RI miocárdica aguda por meio de modificação técnica. O protocolo proposto resulta em menos complicações cirúrgicas, menor dano tecidual e menor probabilidade de mortalidade durante a cirurgia. Além disso, foi utilizado um procedimento para medir o tamanho do infarto e a área de risco (RAA) e, assim, verificar a qualidade dos resultados do estudo. O protocolo proposto pode ser utilizado para investigar os processos fisiopatológicos do estresse agudo de IR miocárdica para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra o dano.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo National Institutes of Health dos EUA (publicação NIH no. 85-23, revisada em 1996). O protocolo do estudo foi aprovado e de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Católica de Fu-Jen.

1. Preparo antes da cirurgia

1. Preparo de bolas de algodão úmidas salinas
   1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas.
   2. Aperte uma pequena porção de algodão estéril e enrole-o para formar uma bola. Repita este procedimento.
   3. Mergulhe as bolas de algodão em soro fisiológico 0,9% estéril e esprema o excesso de soro fisiológico.
   4. Guarde as bolinhas de algodão em caixa limpa esterilizada com etanol 75%.
2. Preparação de ganchos de contenção.
   1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas.
   2. Esterilizar clipes e elásticos com etanol 75%.
   3. Dobre os clipes na forma de um gancho para a parede torácica e tecido.
   4. Conecte os clipes dobrados com um, dois ou três elásticos para garantir que a tensão da ferida da janela cirúrgica seja larga o suficiente para a ligadura da ADA.
   5. Prepare e guarde pelo menos cinco ganchos caseiros em uma caixa limpa esterilizada com etanol 75%.
3. Preparo de uma alça de ligadura.
   1. Coloque o meio de um ponto de seda 7-0 no olho de mola 1/2 círculo tamanho 3 de uma agulha cirúrgica cônica não enfaixada.
4. Preparação de um controlador de laço de laço
   1. Corte um tubo de polietileno (PE)-10 de 5 mm com uma tesoura.
   2. Aqueça e suavize o tubo sob chama para suavizar ambas as bordas.
5. Preparação dos ratos
   1. Selecionar ratos machos Sprague-Dawley de 8 semanas com peso mínimo de 250 g.
   2. Alojar e manter os ratos sob um ciclo claro/escuro de 12 h a uma temperatura controlada (21 °C ± 2 °C) com livre acesso a alimentos, pellets de rato padrão e água da torneira.
   3. Anestesiar os ratos com pentobarbital (50 mg/kg, administrado por via intraperitoneal).
      NOTA: Anestésico adicional (pentobarbital, 30 mg/kg) deve ser administrado após cada hora.
   4. Verifique os reflexos dos ratos beliscando a cauda e as patas traseiras para garantir que o animal esteja suficientemente anestesiado.
   5. Abra o tecido entre dois anéis de cartucho abaixo da glote com tesoura e insira um tubo PE-10 de 3 cm para atuar como tubo endotraqueal²⁵.
   6. Conecte o tubo endotraqueal a um ventilador manualmente.
   7. Inspecione o movimento torácico do animal sincronizado com o ciclo respiratório para garantir que os pulmões sejam ventilados adequadamente.
   8. Abrir a região do pescoço e canular a veia jugular²⁶.

2. Ligadura da DA

1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas.
2. Toque o tórax e encontre o manúbrio e o ângulo esternal (a junção do corpo do manúbrio e do esterno).
3. Identifique a costela do lado esquerdo que se conecta com o ângulo esternal (costela A) tocando manualmente.
4. Identificar o espaço intercostal imediatamente abaixo da costela A. Use pinça de ponta fina para levantar suavemente a pele perto do espaço intercostal e, em seguida, use um bisturi cirúrgico com uma lâmina para criar uma incisão oblíqua de 1 cm ao longo das linhas de tensão da pele a partir do ponto aproximadamente 5 mm à esquerda do corpo esternal.
5. Use pinças curvas para separar suavemente a pele e as camadas musculares da incisão. Ganhe as camadas musculares fora da parede torácica anterior esquerda para baixo com clipes dobrados para expor as costelas abaixo.
6. Identifique a costela abaixo da costela A (costela B). Corte a costela B com uma tesoura romba do meio da cartilagem da costela (aproximadamente 2-3 mm do corpo esternal). Toque suavemente e comprima a ferida com uma bola de algodão molhada de soro fisiológico por vários segundos se ocorrer sangramento.
7. Abra o tórax cuidadosamente a partir do corte da costela B com quatro clipes dobrados. Cada clipe dobrado deve prender o músculo intercostal e as costelas para espalhar suavemente a parede torácica em quatro direções (ou seja, superior e esquerda, superior e direita, esquerda para baixo e direita para baixo) e criar uma janela cirúrgica retangular.
8. Gancho suavemente contra o pulmão esquerdo e outros tecidos adjacentes cobrindo o pericárdio com outro clipe dobrado para evitar danos teciduais acidentais durante o procedimento.
9. Exponha o coração removendo suavemente o pericárdio fino com pinças. Identificar o 1º ramo do tronco da coronária esquerda (TCE), que geralmente fica entre a artéria pulmonar e a aurícula esquerda. O TCE e a DAE apresentam-se como uma linha vermelha brilhante superficial que vai da borda da aurícula esquerda em direção ao ápice.
10. Use a agulha cirúrgica preparada para criar uma alça de ligadura aberta, inserindo e passando o ponto de seda sob a DA em um local imediatamente distal ao 1º ramo do TCE na direção da esquerda para o lado direito da DAE para evitar a punção acidental da aurícula esquerda. Com uma única sutura, cria-se a alça aberta. Esfregue suavemente a superfície do coração para visualizar as artérias coronárias se a LAD for invisível por causa do líquido ou sangue que cobre a superfície do coração.
11. Segure um lado da sutura e separe suavemente a agulha da sutura usando um suporte para agulha.
12. Insira as duas extremidades da sutura de seda de um lado da alça aberta no círculo do outro lado para formar uma alça de laço.
13. Insira as duas extremidades da sutura de seda da alça de laço no controlador de laço preparado antes de fechar a alça.
14. Deslize o controlador de laço de laço ao longo da sutura de seda enquanto estica suavemente a seda para fechar o laço de laço. Cessar o fluxo coronariano da DAE para induzir isquemia miocárdica temporária por 1 h.
15. Segure a seda para fixar a posição do controlador de laço com pinça Kelly, uma vez que o laço tenha sido amarrado com segurança. Coloque a outra extremidade da pinça Kelly na mesa cirúrgica durante a ligadura da DAD.
16. Cobrir a janela cirúrgica com algodão úmido soro fisiológico durante a ligadura do DAD.
17. Abra a pinça Kelly.
18. Solte o controlador de alça para reperfusão do fluxo coronariano por 2 h.
19. Ressecção do coração ao longo da base e bordas vasculares cuidadosamente e evitar agarrar o tecido.
    NOTA: Eutanasiar o rato com CO₂ a uma taxa de fluxo de 40% do volume da gaiola/min.

Representative Results

Ao final da isquemia e reperfusão miocárdica, a qualidade da ligadura da DAE deve ser avaliada antes de análises bioquímicas ou moleculares adicionais.

A suficiência da oclusão da DAE através da ligadura foi determinada injetando-se 1 mL de corante azul de Evan a 2% através do cateter venoso central. Em seguida, o miocárdio com perfusão coronariana foi corado de azul em relação à região não perfundida, que permaneceu vermelha (Figura 1A). A região vermelha é o RAA do infarto do miocárdio.

A acurácia do local para a ligadura da DAA foi posteriormente avaliada quantificando-se a variação na porcentagem de RAA entre os animais do estudo. Após o corte horizontal do coração, a porcentagem de RAA foi determinada dividindo-se a RAA por toda a massa miocárdica (Figura 1B). Uma baixa variação na porcentagem de RAA entre os animais do estudo indicou a localização precisa da ligadura da LAD.

O tamanho do infarto do miocárdio é o resultado primário na pesquisa de IR miocárdica aguda. Para quantificar esse parâmetro, os cortes cardíacos fatiados foram incubados em cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) a 1% em solução fisiológica a 37 °C por 30 min e, em seguida, em formaldeído a 10% por 3 dias. A área de infarto era branca. A porcentagem do tamanho do infarto foi calculada como a razão entre a área do infarto e o RAA (Figura 2).

Figura 1: Validação da qualidade da ligadura da LAD com azul de Evan. (A) O RA para infarto do miocárdio foi a massa miocárdica não perfundida que permaneceu vermelha mesmo após a injeção do azul de Evan, confirmando a ligadura segura da ADA. (B) A porcentagem de RAA foi calculada dividindo-se a RAA (área vermelha) pela massa miocárdica total (área vermelha e azul); uma baixa variação na porcentagem de RAA entre os animais do estudo demonstrou a localização precisa da ligadura da LAD. Um menor tamanho de infarto foi demonstrado nos grupos tratados com drogas em comparação com os grupos não tratados. RAA, área de risco; DAE, artéria descendente anterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação do tamanho do infarto do miocárdio no tratamento da CTT. O tamanho do infarto foi estimado como a razão entre a área do infarto (área branca) e a RAA (área vermelha) no grupo ligadura da ADA. RAA, área de risco; TTC, cloreto de trifeniltetrazólio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo proposto tem várias características distintas, como identificar a posição exata para a ligadura da ADA, criar um dispositivo para controlar uma alça de laço em uma única sutura e apoiar uma manobra cirúrgica modificada para reduzir o dano tecidual, permitindo que os pesquisadores liguem a LAD com precisão, segurança e consistência, bem como controlem o estado da alça de laço instantaneamente para pesquisa de IR miocárdica aguda.

A localização da ligadura da DA influencia a área e o tamanho do infarto do miocárdio. A ligadura é geralmente sugerida a uma certa distância na DA proximal^27,28. Ignorar a variância nos padrões de ramificação das artérias coronárias pode aumentar a variabilidade no infarto do miocárdio^23,24. Neste estudo, a DAE foi ligada imediatamente distal ao 1º ramo do TCE, evitando a ligadura acidental da artéria circunflexa ou septal esquerda e levando a infarto de tamanho consistente e menor probabilidade de arritmia fatal29,30,31.

A ligadura segura do DAE é essencial para a oclusão do ADA. Especialistas têm recomendado que a DAE seja ligada com amarração para criar de um a três nós ou com um pequeno pedaço de tubo para comprimir a artéria coronária 32,33,34,35,36. Neste trabalho, sugerimos um dispositivo controlável com alça de laço para ligar a DA em uma única sutura; essa abordagem permite a ligadura segura da DA e o controle instantâneo do fechamento e liberação da alça, evitando laceração tecidual, sangramento e quebra da força da sutura durante a punção miocárdica repetida, ligadura arterial e liberação da ligadura. A abordagem é, portanto, útil para procedimentos experimentais e de validação na pesquisa de RI miocárdica aguda.

Reconhecer características anatômicas e propriedades histológicas durante a cirurgia é útil para reduzir o dano tecidual e melhorar a replicação do estudo. Em relação à abertura do tórax, estudiosos têm sugerido separar os músculos peitoral e 3º ou 4º intercostais com o uso de tesoura, afastador, pinça, pinça romba ou pontos para afastar a musculatura torácica e a caixa torácica 32,33,35,37,38. O presente estudo sugere uma incisão ao longo das linhas de tensão da pele (estrutura de tecido conjuntivo da pele)^39,40, cortando a cartilagem de uma única costela, que contém tecido conjuntivo flexível avascular41^, e prendendo o músculo torácico e as caixas torácicas para abrir a parede torácica. Essa abordagem ajuda a manter a integridade dos tecidos e reduz o risco de sangramento. Além disso, iniciar a abordagem identificando fabricantes de superfície confiáveis por meio do toque significa que o procedimento cirúrgico utilizando uma incisão na pele é altamente repetível e consistente.

A confirmação da qualidade do infarto do miocárdio induzido pela ligadura da ADA é um passo crítico antes da investigação das alterações fisiopatológicas na pesquisa de IR miocárdica aguda. Na literatura, a ocorrência de infarto do miocárdio após ligadura da DAE é confirmada pela observação de palidez regional súbita do^{miocárdio28,33}; supradesnivelamento agudo do segmento ST do eletrocardiograma em relação ao valor basal³³; níveis séricos elevados de enzimas cardíacas como CK-MB, troponina I e troponina T ^28,32,42; ou regiões infartadas macroscopicamente⁴². A consistência da ligadura da LAD deve ainda ser validada pela determinação da RAA para infarto com o uso do corante Phthalo ou azul de Evan^32,35,37,38. A baixa variabilidade na porcentagem de RAA entre as amostras comprova a consistência e a qualidade do procedimento para pesquisa de IR miocárdica aguda. Além disso, a área de infarto pode ser distinguida da RAA pela demarcação das regiões de infarto do miocárdio com^CTT28,36. A dupla coloração com azul de Evans/TTC foi previamente empregada para avaliar a qualidade de um estudo de IR miocárdica ex vivo³⁷. Comparado com a exigência em avaliações ex vivo de que o coração isolado seja perfundido sob o aparelho de Langendorff, este estudo suporta o protocolo animal de avaliação in vivo em que os resultados são obtidos, e a qualidade do estudo é validada instantânea e diretamente.

Mais importante, o uso do azul de Evan e do TTC para definir a área de infarto para RAA impede o uso do miocárdio infartado para análises bioquímicas, o que é um requisito para excluir fatores de confusão e obter resultados precisos na pesquisa de IR miocárdica aguda.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator