Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cryo-elektron tomografi Fjerndataindsamling og subtomogram gennemsnit

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63923
Automatic Translation
1, 1, *1, *1,2,3
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol beskriver højopløsnings kryo-elektrontomografi fjerndataindsamling ved hjælp af Tomo5 og efterfølgende databehandling og subtomogram gennemsnit ved hjælp af emClarity. Apoferritin bruges som et eksempel til at illustrere detaljerede trin-for-trin processer for at opnå en cryo-ET-struktur ved 2,86 Å opløsning.

Abstract

Cryo-elektrontomografi (cryo-ET) har fået fart i de senere år, især siden introduktionen af direkte elektrondetektorer, forbedrede automatiserede erhvervelsesstrategier, forberedende teknikker, der udvider mulighederne for, hvad elektronmikroskopet kan afbilde i høj opløsning ved hjælp af cryo-ET og ny subtomogram gennemsnitssoftware. Derudover er dataindsamling blevet mere og mere strømlinet, hvilket gør det mere tilgængeligt for mange brugere. SARS-CoV-2-pandemien har yderligere fremskyndet indsamling af eksterne kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), især for enkeltpartikel cryo-EM, i mange faciliteter globalt, hvilket giver uafbrudt brugeradgang til avancerede instrumenter under pandemien. Med de seneste fremskridt inden for Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi) er fjernindsamling af cryo-ET-data blevet robust og nem at håndtere fra hvor som helst i verden. Denne artikel har til formål at give en detaljeret gennemgang, startende fra dataindsamlingsopsætningen i tomografisoftwaren til processen med en (fjern) cryo-ET-dataindsamlingssession med detaljeret fejlfinding. Den (fjerntliggende) dataindsamlingsprotokol suppleres yderligere med arbejdsgangen til strukturbestemmelse ved nær-atomopløsning ved subtomogram gennemsnit med emClarity ved hjælp af apoferritin som et eksempel.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er almindeligt kendt for at have oplevet en renæssanceperiode, der fremskynder den til at blive et centralt og centralt nyttigt værktøj i strukturel biologi. Udvikling og udnyttelse af direkte elektrondetektorer 1,2,3, forbedrede mikroskoper og elektronkilder 3,4,5, forbedringer i automatisering / gennemstrømning 6,7,8,9 og beregningsmæssige fremskridt inden for enkeltpartikelanalyse10,11,12,13 ,14 og tomografi15,16,17 er alle delvist ansvarlige for teknikkens nylige succes. Disse teknologiske drivkræfter har udviklet cryo-EM's evne til at løse biologiske makromolekylære strukturer under kryogene og indfødte forhold. De opløsninger, der er let tilgængelige, er tilstrækkelige til atomnøjagtig modellering og har bragt teknikken i spidsen for den strukturelle biologiske arena. En reduktionistisk tilgang til at udtrykke og rense et biologisk mål af interesse har længe vist sig at være vellykket inden for makromolekylær krystallografi (MX) til grundlæggende biologisk forskning, lægemiddelopdagelse og translationel videnskab. I samme tilgang kan cryo-EM nu levere resultater, der er parallelle MX-studier med høj opløsning. Den nuværende store succes i cryo-EM-grenen af strukturbiologi kaldes enkeltpartikelanalyse (SPA), som erhverver 2D-projektionsbilleder typisk af et renset proteinprøve18 for at opnå tusindvis af visninger af et biologisk makromolekyle19. Disse billeder (1) indeholder information fra en række synspunkter, der fuldt ud repræsenterer målets orienteringer i 3D-rummet og (2) fanger objektets konformationelle heterogenitet, som senere kan adskilles og undersøges.

En alternativ tilgang til at erhverve disse 2D-projektionsbilleder af biologiske prøver, selv in situ og uden oprensning, er kryo-elektrontomografi (cryo-ET). Cryo-ET tager en række billeder af det samme objekt i skrå vinkler ved mekanisk at rotere prøven. Således indsamles de 2D-fremskrivninger, der er indsamlet i SPA, der repræsenterer vinkelstillingerne for det interessante molekyle, i sagens natur som en del af cryo-ET-billeddannelseseksperimentet20. Tomografiske vippeserier rekonstrueres derefter til et tomogram, der indeholder 3D-repræsentationer af de afbildede makromolekylære komplekser. Arten af tomografisk dataindsamling mindsker til en vis grad afhængigheden af gennemsnit for at opnå en fuld 3D-repræsentation af et molekyle fra en samling af 2D-billeder. På grund af nuværende scenedesign vippes prøven imidlertid typisk fra -60 ° til +60 °, hvilket efterlader en manglende kile21 af information i den tomografiske 3D-rekonstruktion.

3D-rekonstruktionerne i et enkelt tomogram har derefter en manglende kile af information og lavt signal til støj. Individuelle makromolekyler kan ekstraheres som subtomogrammer og gennemsnit sammen for at tackle dette. Hvor hvert makromolekyle i et subtomogram findes i en anden retning, er den manglende kile orienteret forskelligt i hvert subtomogram af målobjektet, så gennemsnit over mange kopier udfylder information på grund af den manglende kile. Den seneste udvikling inden for billedbehandling har også forsøgt at træne neurale netværk med kunstig intelligens til at udfylde den manglende kile med meningsfulde data22. Denne gennemsnitsproces øger også signalet til støj, svarende til målet om gennemsnit i enkeltpartikelanalyse, så rekonstruktionens kvalitet og opløsning forbedres. Hvis molekylet af interesse har symmetri, kan det også defineres og anvendes under gennemsnittet, hvilket yderligere forbedrer rekonstruktionsopløsningen. Ekstraktionen af 3D-volumener af et makromolekyle fra et tomogram til et sæt subtomogrammer og deres efterfølgende behandling er kendt som subtomogram averaging (STA)23. Hvor hvert subtomogram repræsenterer en unik kopi af molekylet, der undersøges, kan enhver strukturel heterogenitet forhøres ved hjælp af STA-arbejdsgangen. Som almindeligt anvendt i SPA-arbejdsgangen kan klassificeringsteknikker anvendes under STA til at dissekere konformationstilstandene i interessekomplekset. Ud over at STA muliggør rekonstruktion i høj opløsning i cryo-ET, gør denne tilgang teknikken til et kraftfuldt værktøj til at forhøre de strukturelle mekanismer for makromolekyler i deres oprindelige cellulære miljø eller af mål, der ofte ikke er modtagelige for SPA24,25,26.

Elektrontomografi har en lang historie med at bestemme 3D-ultrastrukturen af cellulære prøver ved stuetemperatur27. Erhvervelsen af visninger ved fysisk hældning af prøven giver tilstrækkelig information til 3D-rekonstruktionen af et objekt på cellelængdeskalaer og er især vigtigt, når cellulære strukturer mangler regelmæssigheden for gennemsnit. Celler kan også fryses på substrater til cryo-ET-billeddannelse ved cellekanterne, hvor prøven er tynd nok til at være elektrongennemsigtig. Under disse forhold kan STA anvendes til at bestemme makromolekylære strukturer i et cellulært miljø, omend når prøven er tynd nok til at være elektrongennemsigtig28. Men når det kombineres med yderligere forberedende teknikker, herunder kryokorrelativ lys- og elektronmikroskopi (cryo-CLEM) og fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB), kan cryo-ET bruges til at afbilde inde i hele celler under kryogene forhold29. Dette samler kraften i cryo-ET til at studere den cellulære ultrastruktur med kraften i STA til at bestemme strukturerne af makromolekylære komplekser in situ , samtidig med at de identificerer deres cellulære placering30 og giver snapshots af komplekser, der er involveret i dynamiske processer31. Teknikkens evne til at afbilde cellulære prøver og anvende STA i flere undersøgelser har fremhævet teknikkens evne til at løse makromolekylære strukturer in situ , selv ved opløsninger, der kan sammenlignes med SPA32. En yderligere fordel findes i kendskabet til makromolekylets oprindelige placering, repræsenteret ved den endelige klassificerede 3D-rekonstruktion i tomogrammet30. Derfor kan den makromolekylære struktur korreleres med den cellulære ultrastruktur. Disse observationer på tværs af længdeskalaer vil formodentlig føre til vigtige fund, hvor strukturelle mekanismer kan korreleres med cellulære ændringer i forbindelse med funktionelle undersøgelser.

Cryo-ET og STA tillader dataindsamling i tre store arbejdsgange: molekylær, cellulær og lameltomografi. Strukturerne af oprensede makromolekylære komplekser kan bestemmes ved kryo-ET ved molekylær tomografi. Bestemmelse af proteinstrukturer i deres cellulære miljø, hvor cellen er tynd nok, kan beskrives som cellulær tomografi. For nylig, med udviklingen af kryogen målretning og fræsning, kan de samme teknikker anvendes i lamellatomografiarbejdsgange for at bestemme proteinstrukturerne dybt inde i cellen i deres oprindelige miljø, samtidig med at de afslører den cellulære kontekst, hvori disse proteiner observeres. Forskellige dataindsamlingsstrategier kan bruges afhængigt af de tilgængelige softwarepakker og vigtigst af alt afhængigt af prøvens krav. Molekylære eller ikke-klæbende prøver på et kobber TEM-gitter af et oprenset protein kræver typisk mindre håndtering og forbliver således fladt og ubeskadiget i ideelle tilfælde. Elektrontomogrammer kan let opsættes i serie på tværs af et hul-kulstofgitter for hurtigt at erhverve titusinder til hundredvis af tomogrammer på en systematisk måde. Den enkleste måde for brugerne at oprette molekylære tomografiprøver, hvor proteiner er rigeligt til stede på nettet, ville være at bruge Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi, der anvendes i denne undersøgelse, se Materialetabel). Anden tomografisoftware såsom Leginon9 og serialEM6 er også tilgængelig; De tilbyder flere opsætningsmuligheder for mere personlige tilgange til dataindsamling, men er mere komplekse og kan derfor være sværere at navigere, især for brugere, der er nye inden for tomografi, og brugere, der får adgang til deres session eksternt. For et anlæg med en stor og forskelligartet brugerbase er Tomo5 let at betjene i et fjernmiljø og at træne brugere i. For klæbende celler kræver gitre typisk flere håndteringstrin, og nødvendigheden af at bruge skrøbelige guldgitter øger behovet for forbedret pleje i håndterings- og dataindsamlingsstrategier. For at gøre det lettere at finde et cellulært område af interesse og undgå okklusion fra selve gitteret ved høje hældningsvinkler, er det også en fordel at bruge større maskestørrelser, men til den pris, at de i sagens natur er mere skrøbelige. For lamellaprøver bestemmes prøvens skrøbelighed af lamellens kvalitet, som kan varieres. Disse faktorer øger opsætningstiden og overvejelserne, men den øgede tilpasningsevne og robusthed gør igen Tomo5 velegnet til denne type dataindsamling. Der findes dog specialiserede dataindsamlingsscenarier for hver arbejdsproces. BISECT og PACE-tomo (begge kørt i SerialEM) introducerer muligheden for scriptet strålebilledskift under tomografioptagelse for at øge tomogramindsamlingshastigheden28, især i molekylær tomografi. Medium forstørrelsesmontager (MMM) i SerialEM 6,7,33 kan bedre identificere og præcist målrette molekylære funktioner i alle arbejdsgange, selvom disse funktioner i skrivende stund begynder at blive implementeret i Tomo5.

Ligesom SPA bliver cryo-ET og STA mere og mere tilgængelige gennem forbedringerne af erhvervelsessoftware og et væld af tilgængelige pakker til subtomogram i gennemsnit 16,17,32,34,35,36,37,38. Derudover blev det under pandemien vigtigt at muliggøre fjernadgang til cryo-EM-instrumentering for den fortsatte drift af nationale faciliteter som electron Bio-Imaging Centre (eBIC) ved Diamond Light Source (DLS), Storbritannien. Denne udvikling har gjort cryo-ET mere tilgængelig og robust for forskere, der ønsker at udnytte teknikken. Når data er erhvervet, er STA et vigtigt værktøj til analyse af tilbagevendende objekter for at opnå rekonstruktion med maksimal opløsning og muliggøre klassificering af makromolekylær heterogenitet. Den nuværende protokol har til formål at give en detaljeret gennemgang af forberedelsen af et kryo-TEM-mikroskop til cryo-ET-dataindsamling, og hvordan man udfører subtomogramgennemsnit ved hjælp af emClarity på et molekylært tomografidatasæt af apoferritin som et eksempel. Brugen af emClarity (software til højopløsnings kryo-elektrontomografi og subtomogramgennemsnit, se Tabel over materialer) kræver kørsel af scripts fra kommandolinjen, så der antages et niveau af fortrolighed med Linux/UNIX-systemer.

Fjernforbindelsen afhænger af netværksmiljøet i hvert institut/facilitet. Hos eBIC bruger fjernsystemet programmer, der tillader fjerndataindsamling på den specifikke netværkskonfiguration, der bruges hos Diamond. Fjernforbindelse til mikroskopet lettes af to platforme: NoMachine og TeamViewer (se Materialetabel). Ved hjælp af programmet NoMachine kan brugeren logge på et eksternt Windows-skrivebord. Det eksterne Windows-skrivebord leveret af NoMachine ligger på samme netværk som mikroskopet og fungerer således som en virtuel support-pc til mikroskopet. Fra den virtuelle support-pc opretter brugeren forbindelse til mikroskopet via TeamViewer, der giver direkte adgang og kontrol til mikroskop-pc'en, der kører TUI og Tomo.

Den nuværende protokol består af to dele (trin 1 og trin 2). Trin 1 fokuserer på ekstern cryo-ET-dataindsamling ved hjælp af Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi). Gennemgangen til en (fjern) session tager billeder med stadig højere forstørrelser for i sidste ende at give brugeren mulighed for at dirigere tomografisoftwaren til at målrette prøveområder til tomografisk dataindsamling. Figur 1 opsummerer denne proces. Trin 2 beskriver cryo-ET STA-databehandling ved hjælp af emClarity (software til højopløsnings kryo-elektrontomografi og subtomogramgennemsnit). Figur 9 opsummerer denne proces.

Protokollen er beregnet til et fjernpublikum. Det forudsætter, at personen fysisk ved mikroskopet og indlæsning af prøverne har foretaget de direkte justeringer og taget sig af kameraindstillingen og fået referenceoptagelse. Til denne protokol antages et trekondensatorlinsesystem med en autoloader. For yderligere detaljerede retningslinjer for tomografisoftwaren er en detaljeret manual fra producenten tilgængelig i Windows Start-knappen, hvor softwaren blev indlæst fra.

Protocol

De softwarepakker, der anvendes i denne undersøgelse, er delvist frit tilgængelige (se Materialeoversigt).

1. Fjernindsamling af cryo-ET-data ved hjælp af Tomo5

  1. Hvis softwaren ikke er indlæst, skal du starte denne software fra TEM-server-pc'en (se Materialetabel).
  2. Udfør indledende kontroller, og konfigurer billedtilstanden ved at vælge Forudindstillinger.
    1. Start sessionsopsætningen ved at justere billedoptagelsesparametrene på fanen "Forberedelse" under forudindstillinger (figur 2A, B).
      1. Juster "Oversigtsforstørrelse", så den passer til gitterkvadratstørrelsen og dosis for at få tilstrækkelige tællinger.
        BEMÆRK: Hvis den passende forstørrelse er ukendt for gittertypen, skal du vende tilbage til dette trin efter indlæsning af et gitter.
      2. "Eucentrisk højde" og "søgeforstørrelse" kan være det samme. Klik på Søg på fanen "Tomografi" for at indstille positioner og sikre, at forstørrelsen er tilstrækkelig til at vise kendetegnende for interesse og til at passe til området "Eksponering" og "Sporing / fokus" i synsfeltet (figur 2C).
      3. Indstil "Eksponeringsforstørrelse" til den ønskede målpixelstørrelse. Hvis dette er ukendt, skal du etablere det ved at justere forstørrelsen til det ønskede synsfelt, så det passer til interesseområdet.
    2. Kopier parametrene for billedoptagelse (eksponering) til alle de andre forudindstillinger med høj forstørrelse (Sporing, Drift, Fokus, Thon Ring, Nul tab,). For at gøre det skal du trykke på Indstil for at indstille "Eksponering" til mikroskopet og få "Eksponeringsindstillinger" til alle andre høje forstørrelser efter at have valgt dem individuelt.
      1. Juster eksponeringstiderne, især for "Fokus" og "Sporing" for at give et passende antal tællinger, også i betragtning af tykkelsen ved 60 °, hvilket betyder både ved 0 ° og 60 °, for nok elektroner til at passere gennem prøven for at give et stærkt signal til krydskorrelation.
        BEMÆRK: Som et skøn er eksponeringstider for "Sporing" og "Fokus" svarende til forudindstillingen "Eksponering" et godt første mål. For et eksempel på dosisberegning for forudindstillingen "Eksponering", se figur 3. Indstil den beregnede eksponeringstid for forudindstillingen "Eksponering" på fanen "Forberedelse".
    3. Juster "Zero Loss Preset" for at bruge en lysere og større spotstørrelse (en større spotstørrelse svarer til et mindre antal), da dette kræver en højere dosis.
      BEMÆRK: Denne forudindstilling bruges bedst til at justere slidsen på energifilteret, hvis den findes på mikroskopet.
  3. Udfør atlasindsamling ved at følge nedenstående trin.
    1. For at indsamle et atlas skal du klikke på Ny session på fanen "Atlas", indstille sessionspræferencerne, indtaste lagringsstien og outputformatet og trykke på Anvend. Vælg Screening (figur 4), og marker derefter alle de atlasser, der skal erhverves. Vælg Luk Col-ventiler for at lade mikroskopet være uden opsyn; Dette lukker søjleventilerne, når alle de valgte atlasser er samlet. For at starte screeningen skal du trykke på Start-knappen .
    2. Undersøg de enkelte eller flere atlasser for mål ved at klikke på gitteret i venstre panel under "Screening" (figur 4), og venstreklik derefter og træk musen for at bevæge sig rundt og midterrulle for at zoome ind og ud. Vælg gitter til målopsætning, vælg det, og klik på Indlæs prøve inde fra softwaren.
    3. For kalibreringer af billedskift skal du fortsætte med at bruge fanen atlasscreening til at navigere inden for det indlæste gitter. Find en identificerbar funktion, der vil være genkendelig ved alle forstørrelsesforudindstillinger, dvs. en iskrystal, der overlapper med en kant af et hul eller en anden genkendelig funktion (figur 5). Flyt til den firkant med et højre museklik og derefter "Flyt fase til gitterfirkant".
      BEMÆRK: Scenen skal være i eucentrisk højde for at implementere kalibreringer af billedskift korrekt.
  4. Udfør kalibrering af billedskift.
    1. På fanen "Autofunktioner" (figur 6) skal du indstille forudindstillingen til "Eucentrisk højde", navigere til "Auto-Eucentrisk ved trinhældning" og trykke på Start. Overvåg statusvinduet for at sikre, at det lykkes at finde den eucentriske højde, og hold øje med de positive og negative vippebilleder; de skal korrelere.
      BEMÆRK: Fra version 5.8 af Tomo-softwaren kan kriteriet for eucentrisk højdeaccept ændres; Standard er 0,25 μm, og indstilling af den til 0,5-0,8 μm giver mere spillerum. Værdier afhænger af mikroskopets ydeevne, men det anbefales, at de er så små som muligt.
      1. Når du er i eucentrisk højde og i fokus, skal du centrere scenen på en funktion. Saml en forhåndsvisning ved hjælp af forudindstillingen "Atlas". Indstil alle "Forudindstillinger" fra fanen "Forberedelse". Forøg derefter forstørrelsen til Oversigt > midterfunktion > forhåndsvisning, gentag derefter "Søgeforstørrelse" og til sidst "Eksponeringsforstørrelse".
    2. Hvis funktionen forblev centreret under målretning, skal du springe kalibreringerne af billedskift over. Ellers skal du gå til fanen "Forberedelse" for at kalibrere billedskiftet, vælge Kalibrer billedskift og trykke på Start (Figur 5). Dette vil iterativt justere lavere forstørrelser til funktionen centreret ved eksponeringsforstørrelse.
      BEMÆRK: Hvis den oprindelige forudindstillede "Eksponering" ikke er centreret på dette tidspunkt, til recentering, bruger softwaren kun faseskift til dette trin.
      1. Tryk på Fortsæt for forudindstillingen "Eksponering". Det næste billede, der vises, er "Søgeforudindstilling". For at kalibrere billedskiftet mellem forudindstillingerne skal du dobbeltklikke til venstre i forhåndsvisningen "Søg" til det sted, hvor midten af forhåndsvisningen "Eksponering" er, og derefter trykke på Gendan (figur 5). Klik på Fortsæt for at gå til det næste par forudindstillinger.
        BEMÆRK: Hvis der blev anvendt et billedskift ved atlasforstørrelse under denne kalibrering, skal du sørge for at generhverve atlasset, når kalibreringen af billedskiftet er afsluttet. Vælg det ønskede atlas, og tryk på Nulstil valgt i toppanelet på fanen "Atlas". Bekræft og begynd at erhverve dette atlas igen.
  5. Udfør tomografiopsætningen.
    1. Opret opsætningen af tomografidataindsamling på fanen "Tomografi".
      BEMÆRK: Medmindre det specifikt er angivet, udføres opsætningen udelukkende på fanen "Tomografi".
    2. Start en ny session. I "Sessionsopsætning" for biologiske prøver skal du vælge Pladelignende som prøvetype og vælge Batch og lav dosis, vælge outputformat og lagringsmappe, eventuelt tilføje en e-mail-modtager og derefter trykke på Anvend.
      BEMÆRK: Menupunktet "Batchpositioner" bliver nu tilgængeligt (figur 7A). Det aktuelt indlæste atlas importeres automatisk. "Oversigt" og "Søgebilleder" kan erhverves og revideres, indtil et nyt billede er erhvervet. Derudover kan søgekort med 3 x 3, 4 x 4 og 5 x 5 felter fra version 5.8 erhverves med "Acquire Search Map" for at lette målfinding og opsætning. De svarer til en version af mellemstore forstørrelsesmontager.
    3. For at oprette mål skal du gå til "Atlas-pilen", finde et interesseområde og flytte dertil ved at vælge de muligheder, der dukker op med et højre museklik. Tag et oversigtsbillede for at bekræfte en god position til eucentrisk højdejustering, og tryk derefter på Auto Eucentric; Dette vil køre den eucentriske ved trin vippe rutine. Derefter generhverve et nyt oversigtsbillede for at opdatere den eucentriske højde.
      BEMÆRK: Knappen "Autofokus" bør ikke være nødvendig, hvis positionen er i eucentrisk højde. Hvis det eucentriske højdebillede vises langt ude af fokus, er den eucentriske højde sandsynligvis ikke korrekt og skal laves om (for fejlfinding af eucentrisk højde, se diskussionsafsnittet).
    4. Kontroller målet ved hjælp af forudindstillingen "Oversigt", før du opretter den første position; vælg forudindstillingen "Oversigt", og vip scenen til ±60° for at kontrollere, hvilken afstand fra gitterbjælkerne positionerne kan indstilles (figur 8). Udfør dette ved at indtaste den ønskede hældningsvinkelværdi i vinduet "Indstil hældning" (figur 8A).
    5. Undersøg firkanten "Oversigt" eller det erhvervede "Søg kort", flyt til et område af interesse, og tryk på Anskaf søgning. Undersøg billedet "Søg". Hvis interesseområdet ikke er centreret, skal du højreklikke på den ønskede position og derefter gentage Flyt fase her og Hent billede. Indstil hældning (°) til 0,00 (eller en hvilken som helst anden startvinkel, som trinnet kan håndtere) for at definere tomogrammets startvinkel.
      1. For det første tomogram skal du indtaste navnet for den ønskede tomogramnavngivningskonvention og defokuseringen for at indstille den ønskede defokuseringsværdi for hvert tomogram.
      2. Valgfrit, fra Tomo version 5.8 og fremefter, kan defokuseringsværdierne systematisk ændres på én gang; for det skal du klikke på Vælg positioner, vælge de positioner, der skal ændres, eller markere fluebenet for at vælge alle positioner og derefter klikke på Opdater defokusering og justere parametrene (figur 7A).
    6. Juster området "Fokus" og "Sporing" (figur 2C). Venstreklik for at trække sporings- og fokusområderne (gule og blå cirkler). Sørg for, at sporings-/fokusområdet (for det meste) er på kulstof eller en anden passende sporingsfunktion, dvs. en lignende funktion som interesseområdet; undgå revner, isforurening, alt for tykke områder og tomme huller.
      1. Når du vælger tomt kulstof uden mange sporingsfunktioner, skal du sikre dig, at området begynder at brænde halvvejs gennem tomogrammet ved at vælge en høj nok dosis til fokus og sporing for langsomt at brænde prøven ved højere hældninger. Dette kan være gavnligt for at opretholde sporingsnøjagtigheden. Sørg for, at sporings-/fokusområdet ikke eksponerer et senere anskaffelsesområde.
        BEMÆRK: Vær forsigtig med, hvad der er tæt på, og hvad der kommer ind i strålen. Undgå områder med funktioner, der griber ind i sporing og/eller eksponering, herunder gitterstænger.
    7. Tryk på Tilføj position , når alle parametre er indstillet, og det ønskede interesseområde og "Fokus" og "Sporing" er defineret. Gentag for nye mål.
      BEMÆRK: For at kontrollere, at den eucentriske højde er korrekt kalibreret til de batchpositioner, der er konfigureret, er der flere tilgængelige strategier. Det anbefales at vælge en baseret på den type tomografisession, der udføres (molekylær, cellulær, lamell).
    8. For molekylær tomografi, forudsat at gitterene er ret flade, og eucentrisk højde er udført i midten af hver firkant, der indeholder målpositioner, skal du springe over proceduren "Forfin alle" (eller Forfin valgt, hvis positioner er valgt, figur 7A). Hvis Tomo kæmper med den auto-eucentriske ved trin vippe rutine, skal du muligvis klikke på Spring eucentrisk over.
      1. For celle- eller lamelprøver kan hver batchposition være i en anden z-højde. Brug enten "Forfin alle" for at være forsigtig, eller marker ikke indstillingen "Spring over eucentrisk".
        BEMÆRK: "Forfin alle" vil gentage gennem alle de tomogrammer, der er oprettet eller valgt via "Vælg positioner"; Forfin den eucentriske højde og udfør sporing og fokus før dataindsamling. Denne procedure kan afsløre enhver overlappende eksponering fra det næste tomogramfokus-/sporingsområde (figur 7B), som bør overvejes, før du fortsætter.
      2. Kontroller og genbesøg de firkanter, der har mislykket forfining. Med højre museknap skal du klikke på den mislykkede position for at se muligheder. Hvis den eucentriske højde mislykkes, skal du finde "Auto-eucentrisk ved trinvis hældning" (trin 1.4.1.), anskaffe et nyt "Søg"-billede for at opdatere z-højden og "Tilføj position". Slet den mislykkede/tidligere initialiserede position. Klik på indstillingen Spring over eucentrisk , hvilket er gjort med "Forfin alle".
        BEMÆRK: Hvis "Forfin alle" ikke køres, må "Spring eucentrisk" over ikke kontrolleres. Tomo5 vil køre eucentrisk raffinement, før hvert tomogram erhverves; På denne måde vil positioner, der fejler eucentrisk raffinement, blive sprunget over.
  6. Udfør automatiske funktioner ved at følge nedenstående trin.
    1. Kontroller indstillingerne for at udføre justeringerne via fanen "Autofunktioner" ved at navigere i atlasset til et område med kulstof. Bring dette område til eucentrisk højde og følg rækkefølgen af justeringer som angivet nedenfor.
      1. Kør Auto-eucentrisk efter trinhældning med forudindstillingen "Eucentric Height".
      2. Kør autofokusrutinen med forudindstillingen "Fokus".
      3. Kør Autostigmate-rutinen med forudindstillingen "Thon Ring".
      4. Kør Autocoma-rutinen med forudindstillingen "Thon Ring".
      5. Indsæt den ønskede objektive blænde (figur 6B), sandsynligvis 100 μm blænde, som et godt kompromis for øget prøvekontrast og kun en lille afskæring i signal ved meget høj opløsning.
      6. Gentag Autostigmate-rutinen efter indsættelse af blænde.
        BEMÆRK: Ved forstørrelser med pixelstørrelser omkring 3 Å og lavere opløsninger kan Autocoma-rutinen mislykkes; i dette tilfælde skal du kontrollere og justere Tomo Rotation Center under Direkte justeringer i TEM-brugergrænsefladen.
    2. Kontroller, at centreringsrutinen for automatisk nultab fungerer på din prøve. Med forudindstillingen "Zero Loss" ved en rimelig høj dosis (trin 1.2.3) vil rutinen i Auto Functions sandsynligvis lykkes.
  7. Udfør dataindsamling.
    1. For at starte den automatiserede erhvervelse på fanen "Tomografi" skal du vælge dataindsamlingspladen og indstille de ønskede parametre (figur 7C). Konfigurer dataindsamlingsparametre: Tilt Step (°), Maks. positiv vinkel (°), Maks. negativ vinkel (°), sporingsskema (anbefales: vælg Spor/fokus før anskaffelse). Vælg Luk søjleventiler for eucentrisk højdeskema.
      BEMÆRK: Sjældent anvendte parametre er "Juster eksponeringstid", "Juster ZLP", "Brug faseplade" og "Pause efter hældning".
      1. Brug justeringseksponeringstiden for tomogrammer, der ikke er beregnet til STA, til at øge eksponeringstiden ved et bestemt forhold ved højere hældninger.
      2. Indstillingen Juster ZLP kører en ZLP-raffinement efter hvert tomogram, uanset periodicitetsindstillingen. Det er langsomt, fejler lejlighedsvis uden åbenlyse grunde og vil springe over denne positionsopkøb. Det kan dog være nyttigt til meget smal slidsbredde, dvs. 3-5 eV på et Selectris(X)-filter.
      3. Brug faseplade bruges sjældent siden introduktionen af DED'er med energifiltre.
      4. Pause After Tilt sætter anskaffelsen på pause, men tillader ingen ændringer i softwaren.
    2. Dobbelttjek dataindsamlingsparametrene (på fanen "Forberedelse"), accepter dosisberegningen og det ønskede hældningsskema, angiv antallet af fraktioner (nr.) i forudindstillingen "Eksponering", og begynd derefter erhvervelsen.
      BEMÆRK: Antallet af fraktioner afhænger af prøven, anskaffelsesparametrene og de planlagte efterbehandlingstrin, dvs. STA vs. morfologisk analyse, og skal holdes til værdier, hvor bevægelseskorrektion og CTF-estimering får nok signal. En række 4-10 fraktioner er et godt skøn, hvor 4 er mere egnet til tykkere prøver og 10 til tyndere molekylære prøver.
      1. Klik derefter på Start for at starte dataindsamling og overvåge den første tomogramoptagelse for at sikre, at tomogrammerne erhverves som beregnet.
        BEMÆRK: Nyere tomografisoftwareversioner har en ekstra Movie Player-plade på fanen "Tomografi", hvor de erhvervede tomogrammer kan ses. Vær tålmodig under indlæsningsprocessen.

2. Cryo-ET STA af apoferritin ved hjælp af emClarity

BEMÆRK: Her bruges emClarity-software17 til at illustrere kryo-ET-strukturbestemmelse af STA. Figur 9 opsummerer denne proces. Seks vippeserier af apoferritin (EMPIAR-10787) blev taget som et eksempel. Oktaedrisk symmetri blev anvendt, og det endelige kort havde en opløsning på 2,86 Å, opnået fra kun 4.800 partikler og tæt på Nyquist-frekvensen (2,68 Å).

  1. Sørg for, at emClarity-softwarepakke39 downloades og installeres (se Materialeoversigt). Installer IMOD til softwarebehandling40.
    BEMÆRK: Grundlæggende kendskab til Linux-kommandoer er påkrævet. En mere detaljeret vejledning findes i reference41, der tager et ribosomdatasæt (EMPIAR-10304) som et eksempel og beskriver de trinvise procedurer. For forskellige typer proteinprøver er en tidligere offentliggjort rapport også tilgængelig42.
  2. Forbered inputfiler og mapper.
    BEMÆRK: De rå rammer blev bevægelseskorrigeret af MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (se Materialetabel). De bevægelseskorrigerede billeder blev stablet for at generere tilt-serien ved hjælp af newstack (IMOD) og manuelt justeret med patch tracking ved hjælp af Etomo (se Table of Materials), efterfulgt af emClarity. For at få bedre justeringer anbefales det at udføre forskydninger og vippekompensation i Etomo. De seks vippeserier omdøbes til TS1 til TS6. Nedenfor er instruktionerne og kommandoerne til den første vippeserie (TS1) som et eksempel.
    1. Opret en projektmappe.
      BEMÆRK: Den nyeste version af softwaren er 1.5.3.11. Alle relaterede softwarelogfiler kan findes i den lokale projektmappe (.../logFile/emClarity.logfile).
    2. Under projektmappen skal du oprette en anden ny mappe, "fixedStacks", og forberede inputfilerne: TS1.fixed, TS1.xf og TS1.tlt.
      BEMÆRK: TS1.fixed: den originale tilt-serie, også kendt som TS1.st i Etomo. TS1.xf: Denne fil indeholder transformationskoordinaterne efter Etomo tiltalign. TS1.tlt: denne fil indeholder hældningsvinkler.
  3. Vurder defokuseringen ved at følge nedenstående trin.
    1. Beregn defokusering. Opdater parameterfilen med mikroskopet og billeddannelsesparametrene i henhold til supplerende tabel 1. Kopiér en parameterfil til projektmappen, skift navn til param_ctf.m, og kør: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.
      BEMÆRK: Parameterfilskabelonen findes i den supplerende fil 1 eller den lokale softwareinstallationsmappe (.../emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/).
  4. Kontroller CTF-estimeringsresultaterne for hver stak.
    1. Kontroller de justerede stakke (for eksempel aliStacks / TS1_ali1.fixed) ved hjælp af 3dmod, og sørg for, at fiducialperlerne slettes korrekt.
    2. Sørg for, at logfilen rapporterer, at afleveringen er korrekt, hvilket kan findes i logfile/emClarity.logfile (figur 9).
    3. Kontroller defokuseringsværdien (f.eks. fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf), og sørg for, at den svarer til det teoretiske CTF-estimat.
  5. Definer underområderne.
    1. Generer et binned tomogram. I projektmappen skal du køre: sh recScript2.sh -1.
      BEMÆRK: Et mindre (i størrelse) tomogram for hver stak gemmes i en ny mappe "bin10". For at fremskynde processen kan koordinaterne for en eller flere underregioner defineres i et bin10-tomogram. Scriptfilen vil være i den lokale softwareinstallationsmappe (.../emClarity_1.5.3.11/docs/).
    2. Bestem grænserne ved at vælge seks punkter, x min, x max, ymin, y max, zmin og z max, for at oprette et underområde. Under mappen "bin10" skal du køre: 3dmod TS1_bin10.rec.
      BEMÆRK: Hvis der skal oprettes fire underregioner i én hældningsserie, skal du vælge 6 × 4 = 24 point. Hver stak skal have en modelfil (*.mod) under mappen "bin10".
    3. Konverter modelfilerne til emClarity-formatet. Dette opretter en ny mapperekognoscering. Gem alle koordinaterne for hvert underområde under denne mappe. I projektmappen skal du køre: sh recScript2.sh TS1.
  6. Vælg partikler.
    1. Find en apoferritinskabelon til plukning af partikler. Download en skabelon fra elektronmikroskopidatabanken (EMD-10101)44. Sørg for, at skabelonens pixelstørrelse svarer til rådataenes. I projektmappen skal du køre: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu.
    2. Generer CTF-korrigerede tomogrammer til partikelplukning. I projektmappen skal du køre: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch.
    3. Kør partikelplukning for hver underregion. For apoferritindatasættet skal du udføre en skabelonsøgning på bin6. Rediger de Tmp_angleSearch parametre (θ ud, Δud, θ ind, Δind) for at bestemme vinkelområdet og intervallerne for søgning i plan eller uden for plan i grader. I projektmappen skal du køre: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      BEMÆRK: Der genereres en mappe "convmap_wedge_Type2_bin6" i dette trin. Csv-filen under denne mappe (for eksempel TS1_1_bin6.csv) indeholder alle oplysninger om de partikler, der er valgt.
    4. Fjern de forkerte partikler ved hjælp af 3dmod. Under mappen "convmap_wedge_Type2_bin6" skal du køre: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.
      BEMÆRK: Det er almindeligt at finde forkerte partikler ved siden af kulstofkanter eller isforureninger i disse områder. Udfør et højre museklik på de forkerte punkter, og tryk på backspace på tastaturet for at slette dem. I dette trin skal du sikre dig, at de fleste af de falske positive punkter fjernes (figur 10).
    5. Skift mappenavnet "convmap_wedge_Type2_bin6" til "convmap", da emClarity vil gå og finde underregionsoplysninger under convmap i de følgende trin.
  7. Initialiser projektet. I projektmappen skal du køre: emClarity init param0.m, for at oprette en database til emClarity, ApoF.mat.
  8. Udfør tomogrammer rekonstruktion før STA og justering. For at generere CTF-korrigerede underregionstomogrammer ved bin4 skal du køre: emClarity ctf 3d param0.m.
    BEMÆRK: CTF-korrigerede tomogrammer (for eksempel cache / TS1_1_bin4.rec)  genereres i en ny mappe "cache".
  9. Udfør STA og justering.
    1. Udfør gennemsnittet ved hjælp af de CTF-korrigerede undertomogrammer, der starter ved bin4. I projektmappen skal du køre: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment.
    2. Fortsæt med at foretage justeringer og kør: emClarity alignRaw param0.m 0.
      BEMÆRK: Gennemsnitstrinnet genererer en reference, som vil blive brugt af emClarity i dette trin til at justere partiklerne. De Raw_angleSearch parametre (θ ud, Δud, θ ind, Δind) kan ændres for at indstille vinkelområdet og trinstørrelserne for hver cyklus. Da de fleste forkerte partikler fjernes fra databasen (trin 2.6.4), kan disse vinkelindstillinger til justering starte med en relativt lille grad.
    3. Opdater de Raw_angleSearch parametre, og kør nogle flere cyklusser (trin 2.9.1 og 2.9.2). For at fremskynde processen skal du udføre justeringer i plan og ud af plan separat.
      BEMÆRK: For hver binning anbefales det at køre flere cyklusser og gradvist reducere vinkelindstillingerne. For ApoF-datasættet blev der udført yderligere fem cyklusser ved bin 4, og yderligere oplysninger findes i supplerende tabel 2. For cycle001 skal du i projektmappen køre: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment efterfulgt af emClarity alignRaw param1.m 1.
    4. Rengør de overlappede partikler. I projektmappen skal du køre: emClarity removeDuplicates param5.m 5.
  10. Udfør forfining af Tilt-serien med tomoCPR.
    BEMÆRK: Dette trin er valgfrit.
    1. Kør tomoCPR for at forfine stakgeometrien. I projektmappen skal du køre: emClarity tomoCPR param5.m 5.
    2. Generer nyligt justerede stakke, og opdater geometrifilerne. I projektmappen skal du køre: emClarity ctf update param6.m.
      BEMÆRK: Sørg for, at de nye geometrifiler (f.eks. fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) og de nyligt justerede stakke (f.eks. aliStacks/TS1_ali2.fixed) genereres korrekt.
    3. Opret nye undertomogrammer på bin2. I projektmappen skal du køre: emClarity ctf 3d param6.m.
      BEMÆRK: Dette efterfølges af et par cyklusser til gennemsnit og justering ved bin2 (trin 2.9.1, 2.9.2 og 2.9.3), duplikatrensning (trin 2.9.4) og valgfri tomoCPR (trin 2.10). På grund af høj symmetri blev der udført yderligere fem cyklusser ved bin2 for apoferritin. Opdater de Raw_angleSearch parametre for hver cyklus.
  11. Udfør endelig rekonstruktion.
    1. Fortsæt med at køre et par cyklusser ved bin1 og tomoCPR (trin 2.9 og trin 2.10). Yderligere 10 cyklusser ved bin1 blev udført for apoferritindatasættet. Flere detaljer om kommandoer og parametre findes i tabel 2.
    2. Udfør den endelige rekonstruktion ved at kombinere de to halve datasæt. I projektmappen skal du køre: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment efterfulgt af emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.
      BEMÆRK: Det endelige kort (for eksempel med en B-faktor på 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) genereres, figur 11.

Representative Results

For cellulære prøver og lamelprøver afhænger dataindsamlingsstrategien i vid udstrækning af prøven og målet med billeddannelsesundersøgelsen (figur 1). Målretningsmetoden afhænger af, om det molekylære mål er in situ eller fremstillet ud fra det oprensede makromolekylære kompleks til rekonstruktionsprøver med høj opløsning, der indeholder molekylære mål. For oprensede komplekser, der er forglasset på hullede (kulstof) gitter, kan målretning simpelthen baseres på billeddannelse i hullerne i (kulstof) støttefilmen. For in situ-arbejde kræver målretningsmetoden viden om placeringen af den molekylære enhed baseret på korrelative data eller kendte cellulære vartegn med lav forstørrelse. Cellulære vartegn vil ideelt set være identificerbare, når du tager oversigtsbilleder, og hvis det er tilstrækkeligt til groft at lokalisere regioner af interesse, kan det give en hurtig måde at bekræfte målidentitet med et søgebillede. Men hvis de observerbare hændelser er sjældne, kan det være nødvendigt med søgebilleder med medium forstørrelse for at kvalificere, at målet er korrekt. Søgekort er mellemstore forstørrelsesmontager af søgebilleder og kan således gøre målfinding meget lettere, hvor de kan erhverves ved en forstørrelse, hvor funktionen af interesse er synlig. Søgekort kan derefter screenes for at finde og konfigurere målbatchpositioner. For prøver, der indeholder cellulære træk til ultrastrukturel rekonstruktion, er målretningsmetoden ens, men lige så afhængig af synligheden af den cellulære begivenhed ved forskellige forstørrelser og dens udbredelse i prøven.

Dataindsamlingsstrategien skal også overvejes; I alle tilfælde bestemmer undersøgelsens mål i vid udstrækning, hvordan dataene indsamles. Til rekonstruktion af den cellulære ultrastruktur kan en lav forstørrelse (20-5 Å / px) og stort synsfelt være passende, men høje forstørrelser er nødvendige for at rekonstruere molekylære eller højopløselige detaljer (5-1 Å / px). Et datasæt indsamlet ved 1,5 Å/px under ideelle forhold vil kun fysisk kunne producere en rekonstruktion ved Nyquist-frekvensen på 3,0 Å/px; Men i virkeligheden påvirker mange faktorer, herunder men ikke begrænset til prøvetykkelse, størrelse og heterogenitet, alle den opnåede rekonstruktionskvalitet. De nøjagtige billeddannelsesparametre balancerer også forstørrelsen baseret på undersøgelsens mål med synsfeltet til at indeholde tilstrækkelig information. Denne artikel præsenterer et subtomogram gennemsnit tilfælde, der når 2,86 Å, men yderligere undersøgelser 17,42,43,44,45 er præsenteret i tabel 1 for at illustrere indsamlingsparametrene forbundet med undersøgelser rettet mod forskellige resultater17,42,45,46.

Når en målretningsarbejdsgang og dataindsamlingsregime for cryo-ET er etableret, er dataindsamling af mange forskellige prøvetyper mulig. Repræsentative tomogrammer af en række prøver præsenteres her: molekylære prøver såsom apoferritin (film 1), tynde cellulære processer (film 2) og FIB-fræset lamell af den tykke cellulære prøve (film 3).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over opsætningen af tomografiarbejdsgangen. Den cryo-ET-billedbehandlingsarbejdsgang, der er beskrevet i protokollen, vises som et rutediagram. De billeder, der forventes at blive erhvervet, vises for den cellulære og molekylære arbejdsgang. Den præsenterede navngivning følger Tomo5-konventionen, selvom de fleste tomografioptagelsessoftware deler fælles principper for indsamling af disse billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fanen Forberedelse og betingelser for forudindstilling af søgning . (A) Oversigtsbillede af hele fanen. Forudindstillinger for billedtilstand er indstillet i denne fane, og "Kalibrer billedskift" og "Indstillinger for billedfilter" kan findes i rullemenuen "Opgaver". (B) Zoom ind på rullemenuen "Forudindstillinger", hvor hver forudindstilling kan vælges til individuel opsætning af billedbetingelser. (C) Billede, der viser en passende forstørrelse, der passer til både eksponeringen og området "Fokus og sporing" i synsfeltet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dosisberegninger. Eksempel på dosisberegninger for mulige tomogramoptagelsesordninger, hvor dosishastigheden er målt over vakuum. De to beregninger bestemmer eksponeringstiden(e) for hver hældning, uanset om den sigter mod en optimal dosis pr. hældning eller en optimal totaldosis for full tilt-serien. I subtomogramgennemsnit er det almindelig praksis at målrette en optimal dosis pr. vippet billede i intervallet 3,0-3,5 e-/Å2. I begge tilfælde er "Brøker (nr.)" indstillet til 6 for at opnå ~0,5 e-/Å2 dosis pr. filmramme af hældningen for tilstrækkeligt signal til at udføre bevægelseskorrektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fanen Atlas. Oversigtsbillede af fanen "Atlas". Billedet er blevet beskåret for at undgå tomme gitterpositionsrum. Menuen "Opgaver" indeholder indstillinger for sessionsopsætning og gittervalgsrum til individuel udvælgelse af alle registrerede gitre og en mulighed for at erhverve et enkelt atlas, efter at kassetten er fjernet fra autoloaderen. Et valgt gitter kan nulstilles og derefter hentes igen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Kalibrerede billedskift. Billedet viser et eksponerings- og søgebillede. Det røde kryds i søgebilledet er den skiftede markør for at korrigere forskydningen mellem eksponering og søgning. Man bør gentage kalibreringer af billedskift ved sessionsstart eller efter ændring af forudindstillingerne for billedtilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Automatiske funktioner og blænder . (A) Fanen "Autofunktioner" viser rullemenuen "Forudindstillinger" og valget "Opgave". Understreget med blåt er den forudindstilling "Thon Ring", der kræves for "Autostigmate" (også understreget med blåt) og "Autocoma". Man skal vælge de respektive forudindstillinger for hver opgave og derefter trykke på Start-knappen . (B) Blænder findes i TEM-brugergrænsefladen. Vælg ønsket "Objektiv blænde", efter at de automatiske funktioner er udført, og kør "Autostigmate" med blænden i. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Oversigt over fanen Tomografi. Billeder viser Tomo 5.8-brugergrænsefladen. (A) Batchpositioner. De seneste funktioner, der er afbildet på billedet: indstillingen "Acquire Search Map"; Tomogrampositioner vises i Atlas-visning med zoom-in-indstillingen; fremhævet øverst til højre er "Vælg positioner"; nedenfor er alle fire positioner valgt til parametrene "Opdater defokusering". (B) Tre positioner vælges på søgekortet, mærket 1, 2 og 3. Position 1 vil ikke udgøre et problem, når "Forfin alle" køres. Men hvis der i en indstilling med høj måltæthed, f.eks. når der vælges lamellerpositioner, som afbildet for position 2 og position 3, vil "Forfine alle" køre rutinen "Sporing" og "Fokus" på "Eksponering" -regionen i position 2 og udsætte målet, før tomogrammet erhverves. Gittertypen er R1.2/1.3. Skalalinje = 1,2 μm. (C) Dataindsamling. Udvalgte stillinger i "Batchpositioner" kan nu erhverves individuelt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Definition af den maksimale hældningsvinkel. Figuren viser en trinvis tilgang til bestemmelse af det maksimale hældningsområde for tomogramanskaffelser. (A) 0° oversigt og et søgekort i midten af gitterfirkanten. For at teste hældningsområdet kan vinklen indstilles i tomografisoftwaren med "Set Tilt (°)" ved at skrive den ønskede værdi og derefter trykke på Indstil. (B) Trinnet er blevet vippet til -60°, hvilket viser, at et hjørne af søgekortet ikke ville være fuldt ud erhvervet ved -60°. (C) Scenen er vippet til 60°. Ved at tælle de huller, der er forsvundet ved ±60°, kan man få en idé om vippeområdet for en gitterfirkant. Skalabjælker = 2,5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: emClarity flowchart. Flowdiagrammet beskrev de forskellige trin for cryo sub-tomogram gennemsnit. Skala søjler = 50 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Skabelonmatchning ved hjælp af emClarity . (A) En typisk mikrograf af apoferritin på et grafenbelagt gitter. Defokusering: -3.430 μm. (B) Et stykke af tomogrammet overlejret med modelpunkter efter skabelonsøgning. (C) En top og (D) en sideprojektionsvisning af modelpunkter, der angiver et enkelt fladt lag af monodisperserede apoferritinpartikler. Skala søjler = 50 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Cryo-ET STA af apoferritin . (A) Det endelige kort efter 21 cyklusser med justering af undertomogram. (B) Det endelige korts Fourier-skalkorrelation (FSC) plot med en rapporteret opløsning på 2,86 Å, der indeholder 38 kegle-FSC'er. (C) Repræsentative tæthedskort (udstyret med PDB-model 6s6147). Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøve Cryo-ET-typen Å/px Hældningsområde (+/-) Vip trin (°) Defokuseringsområde (μm) Total dosis (e-/Å2) Opløsning Rådata Henvisning
Apoferritin Oprenset/molekylær (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 EMPIAR-10787 17 & dette papir
HIV-1 Gag Oprenset/molekylær (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17
Ribosom Oprenset/molekylær (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 EMPIAR-10304 42
SARS-CoV-2 spids Lamell/Molekylær (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 EMPIAR-10753 45
Neuron axon struktur Cellulær (ultrastrukturel) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 N.D. EMPIAR-10922 47

Tabel 1: Indsamlingsparametre for flere cryo-ET-undersøgelser. Undersøgelser rettet mod rekonstruktion af molekylære detaljer fra oprensede eller in situ-proteiner sammenlignet med en undersøgelse, der sigter mod at løse og segmentere de ultrastrukturelle cellulære træk.

Film 1: Et tomogram af apoferritinprøver på et normalt EM-gitter og derefter afbildet med en cryo-TEM udstyret med et ultrahøjopløsningskamera med et kompatibelt filter. Tilt-serien blev erhvervet med et dosissymmetrisk skema med et hældningsspænd på 54° og en total dosis på 134 e-/A2 i elektrontomografisoftwaren. Skala bar = 50 nm. Klik her for at downloade denne film.

Film 2: Et tomogram af en primær neuron dyrket på et EM-gitter og derefter direkte afbildet med en cryo-TEM udstyret med et ultrahøjopløsningskamera med et kompatibelt filter. Vippeserien blev erhvervet med et dosissymmetrisk skema med et hældningsspænd på 60° og en total dosis på 120 e-/A2 i elektrontomografisoftwaren. Skala bar = 100 nm. Klik her for at downloade denne film.

Film 3: Et tomogram af en cyanobakterie på et EM-gitter, udsat for FIB-fræsning og derefter afbildet med en cryo-TEM udstyret med et højhastighedskamera og et kompatibelt filter. Vippeserien blev erhvervet med et dosissymmetrisk skema med et hældningsspænd på 50° og en total dosis på 120 e-/A2 i elektrontomografisoftwaren. Skala bar = 87,2 nm. Klik her for at downloade denne film.

Supplerende fil 1: Parameterfilskabelonen til estimering af defokusering. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Oplysninger om dataindsamling og mikroskopopsætning. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Liste over kommandoer i udførelsesrækkefølgen. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Tomo5
Arbejdsgangsbeskrivelsen af tomografisoftwaren fremhæver en potentiel og mest strømlinet måde til en (fjern) batchtomografisessionsopsætning. Mens softwaren er let for begyndere, kan nogle indledende cryo-EM-erfaringer og grundlæggende tomografiforståelse hjælpe med opsætningen. Kritiske trin er fremhævet i protokollen og bør hjælpe med fejlfinding, selvom der er brugt en anden opsætningsmetode. Udviklingen af softwaren vil lette (fjern) dataindsamling og gøre cryo-ET mere tilgængelig for en bred brugerbase. Et par tip og tricks, der kan hjælpe med at fejlfinde almindeligt opståede problemer, er beskrevet nedenfor.

Et vigtigt punkt at diskutere er valget af gitre, fordi gitterstænger ved høje hældninger kan skjule visningen, når prøven vippes til ±60 ° (figur 8). På et TEM-gitter refererer maskestørrelsen til antallet af gitterkvadrater pr. Enhedslængde af gitteret. Større maskenumre har flere gitterkvadrater pr. Enhedslængde, en højere tæthed af gitterkvadrater og mindre gitterkvadrater, dvs. et gitter med 400 mesh har mindre kvadrater end et 200-maskegitter. Et godt valg af gitter til tomografi er 200-mesh eller 300-mesh gitter. Som vist i figur 8 reduceres det tilgængelige område til indsamling, efterhånden som gitteret vippes. Ved ±60° hældning vil et gitter med 300 mesh have et lille synsfelt, hvorpå der kan erhverves et fuldt tomogram. Fordelene ved 200-mesh gitter er, at de større gitterfirkanter gør molekylær tomografiopsætning hurtigere, og med det øgede gitter-kvadratareal vil en firkant sandsynligvis være nok til en overnatningssamling. Ulempen er, at 200-mesh gitter er mere skrøbelige, så håndtering og klipning kræver mere finesse.

Hvis der anvendes hulstøttefilm (se Materialetabel) på EM-gitre, skal hulafstanden desuden tages i betragtning ved opsætning af fokus- og sporingsområdet i forhold til eksponeringsområdet. Ideelt set bør strålediameteren ved den ønskede forstørrelse være lille nok til at dække kulstofområdet ved siden af eksponeringsområdet langs hældningsaksen for optimal og hurtig opsætning. På denne måde kan potentielle regioner af interesse for hvert hul erhverves.

Da softwarens eucentriske højderutine i øjeblikket ikke er så robust, såsom serialEM-rutinen, kan følgende tip løse dette problem. Hvis den eucentriske højdebestemmelse mislykkes ved hjælp af den eucentriske højdeforudindstilling, kan man bruge oversigtsforudindstillingen i stedet og køre "Auto-eucentrisk ved trinhældning" igen; Dette kan løse problemer, hvis den eucentriske højde er langt væk fra 0. Hvis dette lykkes, kan man køre "Auto-eucentrisk by stage tilt" med "Eucentric Height" forudindstillinger for at forbedre præcisionen. Hvis det mislykkes, kan man køre "Auto-Eucentric by beam tilt" med den eucentriske højdeforudindstilling og derefter køre "Auto-Eucentric by stage tilt" eller manuelt indstille z-højden konsolideret af "Auto-Eucentric by beam tilt" i TEM-brugergrænsefladen under "Stage" -indstillinger. Hvis der anvendes gitre med et gentagende mønster af huller, kan de forhindre identifikation af en enkelt krydskorrelationstop. Man kan prøve at ændre den eucentriske højdeforudindstilling til en lavere defokusforskydning såsom -25 μm og / eller en kortere eksponeringstid for at reducere krydskorrelation fra hulmønstrene. På den anden side giver brug af lacey grids / lameller muligvis ikke tilstrækkeligt signal til en stærk krydskorrelationstop. Man kan prøve at ændre den eucentriske højdeforudindstilling til en større defokusforskydning såsom -75 μm og / eller en forlænget eksponeringstid for at forbedre krydskorrelationstoppen. En anden mulighed er at justere billedfilterindstillinger; de findes på fanen "Forberedelse". Indstillinger til justering af filterindstillingerne kan indstilles for lav (Oversigt / Gridsquare), medium (eucentrisk højde) og høj forstørrelse (sporing / fokus) for at finde den optimale krydskorrelationstop for hver forudindstilling. Det krævede input er et billede, dvs. ved 0° og et ved 5°, efterfulgt af at klikke på Sammenlign for at sammenligne begge billeder. Den anbefalede startværdi for den længste bølgelængde er en fjerdedel af skalalinjen på billedet og for den korteste bølgelængde en fyrretyvendedel af skalalinjen. Hvis toppen ikke er robust identificeret, kan man optimere indstillingerne, indtil der kan findes en overbevisende top. Der er ingen grund til at generhverve billeder hver gang; det er nok blot at trykke på "Sammenlign". Hvis TOMO stadig ikke automatisk kan finde den eucentriske højde, kan den manuelle eucentriske højdekalibrering anvendes. Man skal centrere over en rimelig stor iskrystal i oversigtsforstørrelse på fanen "Forberedelse", derefter gå til "Stage-kontrollen" i TEM-brugergrænsefladen, indstille alfa til -30 ° og justere trin z-værdien for at centrere krystallen igen ved hjælp af det fluorescerende skærmbillede. Hvis du vælger indstillingerne "Høj opløsning" og "Høj kontrast" i TEM-brugergrænsefladen, bliver dette enkelt (knapper nederst i det fluorescerende skærmvindue). Eventuelt, hvis der er adgang til et kamera med live-tilstand, kan dette bruges til at bestemme den eucentriske højde; Det bliver lettere end på den fluorescerende skærm.

De største begrænsninger i Tomo5-versioner før 5.8 er de manglende mellemforstørrelsesmontager, manglende dosissymmetrisk skema og problemer relateret til eucentrisk højdefinding. Disse findes i serialEM, et freeware med hurtig udvikling og fællesskabsstøtte, en robust eucentrisk højderutine og muligheden for at scripte, dvs. et specialbygget dosissymmetrisk skema. Fra version 5.8 og fremefter i Tomo5 er det mest almindeligt forekommende problem med at finde den eucentriske højde, dvs. en mislykket looping omkring målet z-værdi, blevet løst ved at implementere muligheden for at indstille et eucentrisk højdeacceptkriterium. Men med forskellige gitter- og prøvetyper anbefales det stærkt at justere billedfilterindstillingerne for at afspejle de unikke billeddannelsesbetingelser for individuelle sessioner og for at give den bedst mulige krydskorrelationstop for at finde den eucentriske højde og for fokus- og sporingsområdet at fungere pålideligt under tomogramoptagelse.

Samlet set har mange faciliteter hurtigt tilpasset sig fjerndrift under pandemien. Tomo5-softwaren giver en nem adgang og brugervenlig rute til tomografi, som er velegnet til fjernbetjening. De fremskridt, der er gjort i softwaren, vil uden tvivl fortsætte med at gøre fjerndataindsamlinger og tomografiindsamling generelt mere mainstream i samfundet.

emKlarhed
Da emClarity bruger en skabelonbaseret partikelplukningsmetode, har den brug for en skabelon til objektet af interesse. Partikelplukningen (trin 2.6) er meget følsom og nøglen til den endelige struktur. Før gennemsnit og justering (trin 2.9) skal man sørge for at kontrollere omhyggeligt og manuelt fjerne de falske positiver. Når en skabelon ikke er tilgængelig, er emClarity muligvis ikke let at bruge, men det er muligt at bruge anden software, for eksempel Dynamo37 og PEET48, til at oprette en indledende model.

For heterogene prøver er emClarity udstyret med en klassificeringsmetode, der gør det muligt for brugerne at fokusere på specifikke funktioner med forskellige skalaer. Det er nyttigt at køre et par cyklusser med justeringer før klassificering og køre det ved en højere binning (såsom skraldespand 4 eller skraldespand 3).

Den opdaterede version af softwaren (V1.5.3.11) har betydelige opdateringer sammenlignet med den første version (V1.0)17. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, en håndsrækningskontrol under CTF-estimering (trin 2.3); symmetri for justeringer (CX, I, I2, O); beregning af 3D-prøveudtagningsfunktioner pr. partikel (3DSF) et skift til MATLAB 2019a for kompatibilitet og stabilitet; og rekonstruktion ved hjælp af de rå projektionsbilleder (cisTEM). Softwaren vil fortsætte med at forbedre for forskellige prøver, og de nyeste meddelelser kan findes online (se Materialetabel).

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi anerkender Diamond Light Source for adgang til og støtte til cryo-EM-faciliteterne på Storbritanniens nationale Electron Bio-Imaging Center (eBIC), finansieret af Wellcome Trust, MRC og BBRSC. Vi vil også gerne takke Andrew Howe for erhvervelsen af Apoferritin-tomogrammet (film 1), Ishika Kumar for forberedelsen og erhvervelsen af neurontomogrammet (film 2) og Craig MacGregor-Chatwin for cyanobakterierne lamel-tomogrammet (film 3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG - Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil - A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan -
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific -
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ - - Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ - - Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial - - Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software - - Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki - - Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461 (2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. Mastronarde, D. N. The IMOD Home Page. , Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020).
  41. Frosio, T. GitHub: emClarity-tutorial. , Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021).
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. -P., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2. , Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016).
  44. Mills, D. J., Pfeil-Gardiner, O., Vonck, J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022).
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  47. Vonck, J., Pfeil-Gardiner, O., Mills, D. J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019).
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Tags

Biologi udgave 185
Cryo-elektron tomografi Fjerndataindsamling og subtomogram gennemsnit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J.,… More

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter