Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kryoelektrontomografi Fjärrdatainsamling och subtomogrammedelvärde

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63923
Automatic Translation
1, 1, *1, *1,2,3
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver högupplöst kryoelektrontomografi fjärrdatainsamling med hjälp av Tomo5 och efterföljande databehandling och subtomogrammedelvärde med emClarity. Apoferritin används som exempel för att illustrera detaljerade steg-för-steg-processer för att uppnå en kryo-ET-struktur vid 2,86 Å-upplösning.

Abstract

Kryoelektrontomografi (kryo-ET) har fått fart de senaste åren, särskilt sedan introduktionen av direkta elektrondetektorer, förbättrade automatiserade förvärvsstrategier, preparativa tekniker som utökar möjligheterna för vad elektronmikroskopet kan avbilda med hög upplösning med kryo-ET och ny subtomogrammedelvärdesprogramvara. Dessutom har datainsamlingen blivit alltmer strömlinjeformad, vilket gör den mer tillgänglig för många användare. SARS-CoV-2-pandemin har ytterligare påskyndat datainsamlingen för kryoelektronmikroskopi (kryo-EM), särskilt för kryo-EM med en partikel, i många anläggningar globalt, vilket ger oavbruten användaråtkomst till toppmoderna instrument under pandemin. Med de senaste framstegen inom Tomo5 (programvara för 3D-elektrontomografi) har fjärrinsamling av kryo-ET-data blivit robust och lätt att hantera var som helst i världen. Den här artikeln syftar till att ge en detaljerad genomgång, med utgångspunkt från datainsamlingsinställningen i tomografiprogramvaran för processen med en (fjärr) kryo-ET-datainsamlingssession med detaljerad felsökning. Det (avlägsna) datainsamlingsprotokollet kompletteras ytterligare med arbetsflödet för strukturbestämning vid nästan atomär upplösning genom subtomogrammedelvärde med emClarity, med apoferritin som exempel.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) är allmänt känd för att ha upplevt en renässansperiod, vilket påskyndar den till att bli ett centralt och centralt användbart verktyg inom strukturbiologi. Utveckling och användning av direkta elektrondetektorer 1,2,3, förbättrade mikroskop och elektronkällor 3,4,5, förbättringar i automatisering/genomströmning 6,7,8,9 och beräkningsframsteg inom enpartikelanalys10,11,12,13 ,14 och tomografi15,16,17 är alla delvis ansvariga för teknikens senaste framgång. Dessa tekniska drivkrafter har utvecklat kryo-EM: s förmåga att lösa biologiska makromolekylära strukturer under kryogena och inhemska förhållanden. De upplösningar som är lätta att få är tillräckliga för atomärt korrekt modellering och har fört tekniken i framkant på den strukturbiologiska arenan. Ett reduktionistiskt tillvägagångssätt för att uttrycka och rena ett biologiskt mål av intresse har länge visat sig vara framgångsrikt inom makromolekylär kristallografi (MX) för grundläggande biologisk forskning, läkemedelsupptäckt och translationell vetenskap. På samma sätt kan cryo-EM nu leverera resultat som parallella högupplösta MX-studier. Den nuvarande stora framgången inom kryo-EM-grenen av strukturbiologi kallas enkelpartikelanalys (SPA), som förvärvar 2D-projektionsbilder vanligtvis av ett renat proteinprov18 för att få tusentals visningar av en biologisk makromolekyl19. Dessa bilder (1) innehåller information från en rad vyer som fullt ut representerar målets orienteringar i 3D-rymden och (2) fångar objektets konformationella heterogenitet, som senare kan separeras och undersökas.

Ett alternativt tillvägagångssätt för att förvärva dessa 2D-projektionsbilder av biologiska prover, även på plats och utan rening, är kryoelektrontomografi (kryo-ET). Cryo-ET tar en serie bilder av samma objekt i lutande vinklar genom att mekaniskt rotera provet. Således samlas de 2D-projektioner som samlas in i SPA, som representerar vinkelställningarna för molekylen av intresse, i sig som en del av kryo-ET-avbildningsexperimentet20. Tomografiska lutningsserier rekonstrueras sedan till ett tomogram som innehåller 3D-representationer av de avbildade makromolekylära komplexen. Arten av tomografisk datainsamling minskar i viss mån beroendet av medelvärde för att uppnå en fullständig 3D-representation av en molekyl från en samling 2D-bilder. På grund av nuvarande scendesign lutas dock provet vanligtvis från −60 ° till +60 °, vilket lämnar en saknad kil21 av information i den tomografiska 3D-rekonstruktionen.

3D-rekonstruktionerna i ett enda tomogram har då en saknad kil av information och låg signal till brus. Enskilda makromolekyler kan extraheras som subtomogram och medelvärdet tillsammans för att hantera detta. Där varje makromolekyl i ett subtomogram finns i en annan riktning, är den saknade kilen orienterad annorlunda i varje subtomogram av målobjektet, så medelvärde över många kopior fyller i information på grund av den saknade kilen. Den senaste utvecklingen inom bildbehandling har också försökt träna neurala nätverk med artificiell intelligens för att fylla i den saknade kilen med meningsfulla data22. Denna medelvärdesprocess ökar också signalen till brus, liknande målet att medelvärde i enpartikelanalys, så rekonstruktionens kvalitet och upplösning förbättras. Om molekylen av intresse har symmetri kan även den definieras och användas under medelvärdet, vilket ytterligare förbättrar rekonstruktionsupplösningen. Extraktionen av 3D-volymer av en makromolekyl från ett tomogram till en uppsättning subtomogram och deras efterföljande bearbetning är känd som subtomogrammedelvärde (STA)23. Om varje subtomogram representerar en unik kopia av molekylen som studeras, kan eventuell strukturell heterogenitet förhöras med hjälp av STA-arbetsflödet. Som vanligtvis används i SPA-arbetsflödet kan klassificeringstekniker användas under STA för att dissekera konformationstillstånden för komplexet av intresse. Förutom STA som möjliggör högupplöst rekonstruktion i kryo-ET, gör detta tillvägagångssätt tekniken till ett kraftfullt verktyg för att förhöra de strukturella mekanismerna hos makromolekyler i deras ursprungliga cellulära miljö eller av mål som ofta inte är mottagliga för SPA24,25,26.

Elektrontomografi har en lång historia av att bestämma 3D-ultrastrukturen hos cellulära prover vid rumstemperatur27. Förvärvet av vyer genom fysisk lutning av provet ger tillräckligt med information för 3D-rekonstruktion av ett objekt i celllängdsskalor och är särskilt viktigt när cellulära strukturer saknar regelbundenhet för medelvärde. Celler kan också frysas på substrat för kryo-ET-avbildning vid cellkanterna där provet är tillräckligt tunt för att vara elektrontransparent. Under dessa förhållanden kan STA användas för att bestämma makromolekylära strukturer i en cellulär miljö, om än när provet är tillräckligt tunt för att vara elektrontransparent28. Men i kombination med ytterligare preparativa tekniker, inklusive kryo-korrelativt ljus och elektronmikroskopi (kryo-CLEM) och fokuserad jonstrålefräsning (kryo-FIB), kan kryo-ET användas för att avbilda inuti hela celler under kryogena förhållanden29. Detta sammanför kraften i kryo-ET för att studera den cellulära ultrastrukturen med kraften i STA för att bestämma strukturerna för makromolekylära komplex på plats samtidigt som de identifierar deras cellulära plats 30 och ger ögonblicksbilder av komplex som är engagerade i dynamiska processer31. Teknikens förmåga att avbilda cellulära prover och använda STA i flera studier har belyst teknikens kraft att lösa makromolekylära strukturer in situ, även vid upplösningar jämförbara med SPA32. En ytterligare fördel finns i kunskapen om makromolekylens ursprungliga placering, representerad av den slutliga klassificerade 3D-rekonstruktionen i tomogrammet30. Därför kan den makromolekylära strukturen korreleras med den cellulära ultrastrukturen. Dessa observationer över längdskalor kommer förmodligen att leda till viktiga fynd där strukturella mekanismer kan korreleras med cellulära förändringar i samband med funktionella studier.

Cryo-ET och STA tillåter datainsamling i tre stora arbetsflöden: molekylär, cellulär och lamelltomografi. Strukturerna för renade makromolekylära komplex kan bestämmas av kryo-ET genom molekylär tomografi. Att bestämma proteinstrukturer i deras cellulära miljö där cellen är tillräckligt tunn kan beskrivas som cellulär tomografi. På senare tid, med utvecklingen av kryogen inriktning och fräsning, kan samma tekniker tillämpas i lamelltomografiarbetsflöden för att bestämma proteinstrukturerna djupt inne i cellen i deras ursprungliga miljö samtidigt som de avslöjar det cellulära sammanhanget där dessa proteiner observeras. Olika datainsamlingsstrategier kan användas beroende på tillgängliga programvarupaket och, viktigast av allt, beroende på provets krav. Molekylära eller icke-vidhäftande prover på ett koppar-TEM-rutnät av ett renat protein kräver vanligtvis mindre hantering och förblir därför plana och oskadade i ideala fall. Elektrontomogram kan enkelt ställas in i serie över ett håligt kolnät för att snabbt förvärva tiotals till hundratals tomogram på ett systematiskt sätt. Det enklaste sättet för användare att ställa in molekylära tomografiprover där proteiner finns rikligt på nätet skulle vara att använda Tomo5 (programvara för 3D-elektrontomografi som används i denna studie, se Materialförteckning). Andra tomografiprogram som Leginon9 och serialEM6 finns också tillgängliga; De erbjuder fler installationsalternativ för mer personliga metoder för datainsamling men är mer komplexa och kan därför vara svårare att navigera, särskilt för användare som är nya inom tomografi och användare som har åtkomst till sin session på distans. För en anläggning med en stor och mångsidig användarbas är Tomo5 lätt att använda i en avlägsen miljö och att utbilda användare i. För vidhäftande celler kräver rutnät vanligtvis fler hanteringssteg, och behovet av att använda ömtåliga guldgaller ökar behovet av förbättrad vård i hanterings- och datainsamlingsstrategier. För att underlätta att hitta ett cellulärt område av intresse och undvika ocklusion från själva gallret i höga lutningsvinklar är det också fördelaktigt att använda större maskstorlekar, men till kostnaden att de i sig är mer ömtåliga. För lamellprover bestäms provets bräcklighet av lamellens kvalitet, som kan vara variabel. Dessa faktorer ökar installationstiden och övervägandena, men den ökade anpassningsförmågan och robustheten gör återigen Tomo5 lämplig för denna typ av datainsamling. Det finns dock specialiserade datainsamlingsscenarier för varje arbetsflöde. BISECT och PACE-tomo (båda körs i SerialEM) introducerar möjligheten till skriptad strålbildsförskjutning under tomografiförvärv för att öka tomograminsamlingshastigheten28, särskilt vid molekylär tomografi. Medelstora förstoringsmontage (MMM) i SerialEM 6,7,33 kan bättre identifiera och exakt rikta in sig på molekylära funktioner i alla arbetsflöden, även om dessa funktioner i skrivande stund börjar implementeras i Tomo5.

Liksom SPA blir kryo-ET och STA alltmer tillgängliga genom de förbättringar som gjorts av förvärvsprogramvara och en mängd tillgängliga paket för subtomogram i genomsnitt 16,17,32,34,35,36,37,38. Dessutom, under pandemin, blev det viktigt att möjliggöra fjärråtkomst till kryo-EM-instrumentering för den fortsatta driften av nationella anläggningar som electron Bio-Imaging Center (eBIC) vid Diamond Light Source (DLS), Storbritannien. Denna utveckling har gjort kryo-ET mer tillgängligt och robust för forskare som vill använda tekniken. När data har förvärvats är STA ett viktigt verktyg för att analysera återkommande objekt för att uppnå maximal upplösningsrekonstruktion och möjliggöra klassificering av makromolekylär heterogenitet. Det nuvarande protokollet syftar till att ge en detaljerad genomgång av att förbereda ett kryo-TEM-mikroskop för kryo-ET-datainsamling och hur man utför subtomogrammedelvärde med emClarity på en molekylär tomografidatauppsättning av apoferritin som ett exempel. Användningen av emClarity (programvara för högupplöst kryoelektrontomografi och subtomogrammedelvärde, se Materialförteckning) kräver att skript körs från kommandoraden, så en nivå av förtrogenhet med Linux / UNIX-system antas.

Fjärranslutningen beror på nätverksmiljön i varje institut/anläggning. På eBIC använder fjärrsystemet program som tillåter fjärrdatainsamling på den specifika nätverkskonfigurationen som används på Diamond. Fjärranslutning till mikroskopet underlättas av två plattformar: NoMachine och TeamViewer (se Materialförteckning). Med hjälp av programmet NoMachine kan användaren logga in på ett fjärrskrivbord i Windows. Det fjärranslutna Windows-skrivbordet som tillhandahålls av NoMachine finns i samma nätverk som mikroskopet och fungerar därmed som en virtuell support-dator till mikroskopet. Från den virtuella supportdatorn ansluter användaren till mikroskopet via TeamViewer som ger direkt åtkomst och kontroll till mikroskopdatorn som kör TUI och Tomo.

Detta protokoll består av två delar (steg 1 och steg 2). Steg 1 fokuserar på fjärrinsamling av kryo-ET-data med Tomo5 (programvara för 3D-elektrontomografi). Genomgången för en (fjärr) session tar bilder vid allt högre förstoringar för att i slutändan låta användaren rikta tomografiprogramvaran till målprovområden för tomografisk datainsamling. Figur 1 sammanfattar denna process. Steg 2 beskriver kryo-ET STA-databehandling med emClarity (programvara för högupplöst kryoelektrontomografi och subtomogrammedelvärde). Figur 9 sammanfattar denna process.

Protokollet är avsett för en fjärrpublik. Det förutsätter att personen fysiskt vid mikroskopet och laddar proverna har gjort direktinriktningarna och tagit hand om kamerainställningen och fått referensförvärv. För detta protokoll antas ett linssystem med tre kondensorer med en autoloader. För ytterligare detaljerade riktlinjer för tomografiprogramvaran finns en detaljerad manual från tillverkaren tillgänglig i Windows Start-knapp där programvaran laddades från.

Protocol

De programvarupaket som används i denna studie är delvis fritt tillgängliga (se materialförteckningen).

1. Fjärr kryo-ET-datainsamling med Tomo5

  1. Om programvaran inte är laddad, börja med att starta den här programvaran från TEM-serverdatorn (se Materialförteckning).
  2. Utför inledande kontroller och konfigurera avbildningsvillkoret genom att välja Förinställningar.
    1. Starta sessionsinställningen genom att justera bildförvärvsparametrarna på fliken "Förberedelse" under Förinställningar (bild 2A,B).
      1. Justera "Översiktsförstoring" så att den passar rutnätets kvadratstorlek och dos för att få tillräckliga räkningar.
        OBS: Om lämplig förstoring är okänd för rutnätstypen, återgå till detta steg efter att ha laddat ett rutnät.
      2. "Eucentrisk höjd" och "sökförstoring" kan vara desamma. Klicka på Sök på fliken "Tomografi" för att ställa in positioner och se till att förstoringen är tillräcklig för att visa kännetecknet för intresse och för att passa "Exponering" och "Spårning / fokus" i synfältet (figur 2C).
      3. Ställ in "Exponeringsförstoring" till önskad målpixelstorlek. Om detta är okänt, upprätta det genom att justera förstoringen till önskat synfält för att passa intresseområdet.
    2. Kopiera parametrarna för bildförvärv (exponering) till alla andra förstoringsförstoringsförinställningar (spårning, drift, fokus, thonring, nollförlust,). För att göra det, tryck på Set för att ställa in "Exponering" till mikroskopet och få för att få "Exponeringsinställningar" till alla andra höga förstoringar efter att ha valt dem individuellt.
      1. Justera exponeringstiderna, särskilt för "Fokus" och "Spårning" för att ge ett lämpligt antal räkningar, även med tanke på tjockleken vid 60 °, vilket betyder både vid 0 ° och 60 °, för att tillräckligt många elektroner ska passera genom provet för att ge en stark signal för korskorrelation.
        OBS: Som en uppskattning är exponeringstider för "Spårning" och "Fokus" lika med förinställningen "Exponering" ett bra första mått. Ett exempel på dosberäkning för förinställningen "Exponering" finns i figur 3. Ställ in den beräknade exponeringstiden för förinställningen "Exponering" på fliken "Förberedelse".
    3. Justera "Zero Loss Preset" för att använda en ljusare och större spotstorlek (en större spotstorlek motsvarar ett mindre antal), eftersom detta behöver en högre dos.
      OBS: Denna förinställning används bäst för att justera slitsen på energifiltret om det finns på mikroskopet.
  3. Utför atlasinsamling enligt stegen nedan.
    1. För att samla in en atlas, klicka på Ny session på fliken "Atlas", ställ in sessionsinställningarna, ange lagringsvägen och utdataformatet och tryck på Apply. Välj Screening (figur 4) och markera sedan alla atlaser som ska förvärvas. Välj Stäng kolventiler för att lämna mikroskopet utan tillsyn; Detta stänger kolonnventilerna efter att alla valda atlaser har samlats in. För att starta screeningen, tryck på Start-knappen .
    2. Inspektera den ena eller flera atlaserna för mål genom att klicka på rutnätet i den vänstra panelen under "Screening" (figur 4), vänsterklicka sedan och dra musen för att flytta runt och mitten bläddra för att zooma in och ut. Välj rutnät för målinställning, välj det och klicka på Ladda prov inifrån programvaran.
    3. För bildskiftskalibreringarna fortsätter du att använda fliken för atlasscreening för att navigera i det inlästa rutnätet. Hitta en identifierbar funktion som kommer att kännas igen vid alla förstoringsförstoringsförinställningar, dvs en iskristall som överlappar med en kant av ett hål eller en annan igenkännlig funktion (figur 5). Flytta till den fyrkanten med ett högerklick och sedan "Flytta scenen till Grid Square".
      OBS: Scenen måste vara i eucentrisk höjd för att implementera bildskiftkalibreringar korrekt.
  4. Utför bildskiftskalibrering.
    1. På fliken "Autofunktioner" (figur 6) ställer du in förinställningen på "Eucentrisk höjd", navigerar till "Auto-Eucentric by Stage Tilt" och trycker på Start. Övervaka statusfönstret för att säkerställa att det är framgångsrikt att hitta den eucentriska höjden och håll ett öga på de positiva och negativa lutningsbilderna; de måste korrelera.
      OBS: Från version 5.8 av Tomo-programvaran kan kriteriet för eucentrisk höjdacceptans ändras; Standardvärdet är 0,25 μm, och att ställa in det på 0,5-0,8 μm ger mer spelrum. Värdena beror på mikroskopets prestanda, men det rekommenderas att de är så små som möjligt.
      1. När du är på eucentrisk höjd och i fokus, centrera scenen på en funktion. Samla in en förhandsgranskning med förinställningen "Atlas". Ställ in alla "Förinställningar" från fliken "Förberedelse". Därefter ökar du förstoringen till Översikt > centerfunktionen > förhandsgranska, upprepar sedan "Sökförstoring" och slutligen "Exponeringsförstoring".
    2. Om funktionen förblev centrerad under inriktningen hoppar du över bildskiftskalibreringarna. Annars, för att kalibrera bildskiftet, gå till fliken "Förberedelse", välj Kalibrera bildskift och tryck på Start (figur 5). Detta kommer iterativt att justera lägre förstoringar till funktionen centrerad vid exponeringsförstoring.
      OBS: Om den ursprungliga förinställda "Exponering" inte är centrerad i detta skede, för omcentrering, kommer programvaran endast att använda scenförskjutning för detta steg.
      1. Tryck på Fortsätt för förinställningen "Exponering". Nästa bild som visas är "Sök förinställning". För att kalibrera bildförskjutningen mellan förinställningarna, dubbelklicka i förhandsgranskningen "Sök" till där mitten av förhandsgranskningen "Exponering" är och tryck sedan på Hämta igen (Figur 5). Klicka på Fortsätt för att gå till nästa par förinställningar.
        OBS: Om en bildförskjutning vid atlasförstoring tillämpades under denna kalibrering, se till att hämta atlasen igen efter att bildskiftkalibreringen har slutförts. Välj önskad atlas och tryck på Återställ vald i den övre panelen på fliken "Atlas". Bekräfta och börja skaffa den atlasen igen.
  5. Utför tomografiinställningen.
    1. Skapa inställningen för datainsamling för tomografi på fliken "Tomografi".
      OBS: Om inget specifikt anges görs installationen helt på fliken "Tomografi".
    2. Starta en ny session. I "Session Setup" för biologiska prover väljer du Slab-like som provtyp och väljer Batch och Low Dose, väljer utdataformat och lagringsmapp, lägger eventuellt till en e-postmottagare och trycker sedan på Apply.
      OBS: Menyalternativet "Batchpositioner" blir nu tillgängligt (figur 7A). Den inlästa atlasen importeras automatiskt. "Översikt" och "Sök bilder" kan förvärvas och ses över tills en ny bild förvärvas. Dessutom, från version 5.8, kan sökkartor med 3 x 3, 4 x 4 och 5 x 5 brickor förvärvas med "Skaffa sökkarta" för att underlätta målsökning och installation. De motsvarar en version av medelförstoringsmontage.
    3. För att ställa in mål, gå till "Atlaspilen", hitta en region av intresse och flytta dit genom att välja de alternativ som dyker upp med ett högerklick. Ta en översiktsbild för att bekräfta en bra position för eucentrisk höjdjustering och tryck sedan på Auto Eucentric; Detta kommer att köra den eucentriska lutningsrutinen efter steg. Skaffa sedan en ny översiktsbild för att uppdatera den eucentriska höjden.
      OBS: Knappen "Autofokus" bör inte vara nödvändig om positionen är i eucentrisk höjd. Om den eucentriska höjdbilden verkar långt ur fokus är den eucentriska höjden förmodligen inte korrekt och måste göras om (för felsökning av eucentrisk höjd, se diskussionsavsnittet).
    4. Kontrollera målet med förinställningen "Översikt" innan du ställer in den första positionen; välj förinställningen "Översikt" och luta scenen till ±60 ° för att kontrollera vilket avstånd från rutnätsstaplarna positionerna kan ställas in (figur 8). Utför detta genom att ange önskat lutningsvinkelvärde i fönstret "Ställ in lutning" (figur 8A).
    5. Inspektera torget "Översikt" eller den förvärvade "Sökkartan", flytta till en region av intresse och tryck på Skaffa sökning. Inspektera bilden "Sök". Om intresseområdet inte är centrerat högerklickar du på önskad position och upprepar sedan Flytta scenen hit och hämta bild. Ställ in Tilt (°) på 0,00 (eller någon annan startvinkel som scenen kan hantera) för att definiera tomogrammets startvinkel.
      1. För det första tomogrammet anger du Namn för önskad namngivningskonvention för tomogram och Defocus för att ställa in önskat defokuseringsvärde för varje tomogram.
      2. Alternativt, från Tomo version 5.8 och framåt, kan defokuseringsvärdena systematiskt ändras på en gång; för det, klicka på Välj positioner, välj de positioner som ska ändras eller markera kryssrutan för att välja alla positioner och klicka sedan på Uppdatera oskärpa och justera parametrarna (Figur 7A).
    6. Justera området "Fokus" och "Spårning" (bild 2C). Vänsterklicka för att dra spårnings- och fokusområdena (gula och blå cirklar). Se till att spårnings- / fokusområdet (mestadels) är på kol eller annan lämplig spårningsfunktion, dvs. en liknande funktion som intresseområdet; Undvik sprickor, isförorening, alltför tjocka områden och tomma hål.
      1. När du väljer tomt kol utan många spårningsfunktioner, se till att området börjar brinna halvvägs genom tomogrammet genom att välja en tillräckligt hög dos för fokus och spåra för att långsamt bränna provet vid högre lutningar. Detta kan vara fördelaktigt för att upprätthålla spårningsnoggrannheten. Se till att spårnings-/fokusområdet inte exponerar ett senare förvärvsområde.
        OBS: Var försiktig med vad som är nära och vad som kommer in i strålen. Undvik områden med funktioner som kommer att ingripa med spårning och / eller exponering, inklusive rutnätsfält.
    7. Tryck på Lägg till position när alla parametrar är inställda och önskad region av intresse och "Fokus" och "Spårning" har definierats. Upprepa för nya mål.
      OBS: För att kontrollera att den eucentriska höjden är korrekt kalibrerad för de batchpositioner som har ställts in finns det flera tillgängliga strategier. Att välja en baserat på vilken typ av tomografisession som utförs (molekylär, cellulär, lamell) rekommenderas.
    8. För molekylär tomografi, förutsatt att rutnäten är ganska plana och eucentrisk höjd har gjorts i mitten av varje kvadrat som innehåller målpositioner, hoppa över proceduren "Förfina alla" (eller Förfina vald om positioner har valts, figur 7A). Om Tomo kämpar med den auto-eucentriska lutningsrutinen efter steg, klicka eventuellt på Skip Eucentric.
      1. För cell- eller lamellprover kan varje satsposition vara i olika z-höjd. Använd antingen "Förfina alla" för att vara försiktig eller markera inte alternativet "Hoppa över eucentrisk".
        OBS: "Förfina alla" kommer att iterera genom alla tomogram som har ställts in eller valts via "Välj positioner"; Förfina den eucentriska höjden och utför spårning och fokus före datainsamling. Denna procedur kan exponera eventuell överlappande exponering från nästa tomogramfokus/spårningsregion (figur 7B), vilket bör övervägas innan du fortsätter.
      2. Kontrollera och gå tillbaka till rutorna som har misslyckats med förfining. Med höger musknapp klickar du på den misslyckade positionen för att se alternativ. Om eucentrisk höjd misslyckas, hitta "Auto-eucentric by stage-tilt" (steg 1.4.1.), skaffa en ny "Sök" -bild för att uppdatera z-höjden och "Lägg till position". Ta bort den misslyckade/tidigare initierade positionen. Klicka på alternativet Hoppa över eucentriskt , vilket har gjorts med "Förfina alla".
        OBS: Om "Förfina alla" inte körs, får "Hoppa över Eucentric" inte kontrolleras. Tomo5 kommer att köra eucentrisk förfining innan varje tomogram förvärvas; På detta sätt kommer positioner som misslyckas med eucentrisk förfining att hoppas över.
  6. Utför automatiska funktioner enligt stegen nedan.
    1. Kontrollera inställningarna för att utföra justeringarna via fliken "Auto Functions" genom att navigera i atlasen till ett kolområde. Ta det området till eucentrisk höjd och följ ordningen för inriktningar som anges nedan.
      1. Kör auto-eucentrisk efter steglutning med förinställningen "Eucentric Height".
      2. Kör autofokusrutinen med förinställningen "Fokus".
      3. Kör Autostigmate-rutinen med förinställningen "Thon Ring".
      4. Kör Autocoma-rutinen med förinställningen "Thon Ring".
      5. Sätt in önskad objektiv bländare (figur 6B), troligen 100 μm bländare, som en bra kompromiss för ökad provkontrast och endast en liten avstängning i signalen vid mycket hög upplösning.
      6. Upprepa Autostigmate-rutinen efter bländarinsättning.
        OBS: Vid förstoringar med pixelstorlekar runt 3 Å och lägre upplösningar kan Autocoma-rutinen misslyckas; i det här fallet, kontrollera och justera Tomo Rotation Center under Direct Alignments i TEM-användargränssnittet.
    2. Kontrollera att Auto Zero-Loss-centreringsrutinen fungerar på ditt prov. Med förinställningen "Zero Loss" vid en rimligt hög dos (steg 1.2.3) kommer rutinen i Auto Functions mer sannolikt att lyckas.
  7. Utför datainsamling.
    1. För att starta det automatiska förvärvet på fliken "Tomografi", välj datainsamlingsplattan och ställ in önskade parametrar (figur 7C). Ställ in datainsamlingsparametrar: Lutningssteg (°), Max positiv vinkel (°), Max negativ vinkel (°), spårningsschema (rekommenderas: välj Spår / fokus före förvärv). Välj Stäng kolumnventiler för eucentriskt höjdschema.
      OBS: Sällan använda parametrar är "Justera exponeringstid", "Justera ZLP", "Använd fasplatta" och "Pausa efter lutning".
      1. Använd Justera exponeringstiden för tomogram som inte är avsedda för STA för att öka exponeringstiden vid ett angivet förhållande vid högre lutningar.
      2. Alternativet Justera ZLP kör en ZLP-förfining efter varje tomogram, oavsett periodicitetsuppsättning. Det är långsamt, misslyckas ibland utan uppenbara skäl och kommer att hoppa över det positionsförvärvet. Det kan dock vara användbart för mycket smal slitsbredd, dvs 3-5 eV på ett Selectris (X) -filter.
      3. Använd fasplatta används sällan sedan introduktionen av DED med energifilter.
      4. Pause After Tilt pausar förvärvet men tillåter inga ändringar i programvaran.
    2. Dubbelkolla datainsamlingsparametrarna (på fliken "Förberedelse"), godkänn dosberäkningen och önskat lutningsschema, ange antalet fraktioner (Nr.) i förinställningen "Exponering" och börja sedan förvärva.
      OBS: Antalet fraktioner beror på provet, förvärvsparametrarna och de planerade efterbehandlingsstegen, dvs. STA kontra morfologisk analys, och måste hållas till värden där rörelsekorrigering och CTF-uppskattning får tillräckligt med signal. Ett intervall på 4-10 fraktioner är en bra uppskattning, där 4 är mer lämplig för tjockare prover och 10 för tunnare molekylära prover.
      1. Klicka sedan på Start för att påbörja datainsamlingen och övervaka det första tomogramförvärvet för att säkerställa att tomogrammen förvärvas som avsett.
        OBS: De senaste versionerna av programvaran för tomografi har en extra filmspelare som läggs ut på fliken "Tomografi" där de förvärvade tomogrammen kan ses. Var tålamod under laddningsprocessen.

2. Cryo-ET STA av apoferritin med emClarity

OBS: Här används emClarity-programvara17 för att illustrera kryo-ET-strukturbestämning av STA. Figur 9 sammanfattar denna process. Sex tilt-serier av apoferritin (EMPIAR-10787) togs som exempel. Oktaedrisk symmetri tillämpades och den slutliga kartan hade en upplösning på 2,86 Å, erhållen från endast 4 800 partiklar och nära Nyquistfrekvensen (2,68 Å).

  1. Se till att emClarity-programvarupaketet39 har laddats ned och installerats (se Materialförteckning). Installera IMOD för programvarubearbetning40.
    OBS: Grundläggande kunskaper om Linux-kommandon krävs. En mer detaljerad handledning finns i referens41, som tar en ribosomdatauppsättning (EMPIAR-10304) som ett exempel och beskriver steg-för-steg-procedurerna. För olika typer av proteinprover finns också en tidigare publicerad rapport42.
  2. Förbered indatafilerna och katalogerna.
    OBS: De råa ramarna var rörelsekorrigerade av MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (se Materialförteckning). De rörelsekorrigerade bilderna staplades för att generera tilt-serien med hjälp av newstack (IMOD) och manuellt justerades med patchspårning med Etomo (se Materialförteckning), följt av emClarity. För att få bättre inriktningar rekommenderas att man utför förskjutningar och lutningskompensation i Etomo. De sex tilt-serierna döps om till TS1 till TS6. Nedan följer instruktioner och kommandon för den första tiltserien (TS1) som ett exempel.
    1. Upprätta en projektmapp.
      OBS: Den senaste versionen av programvaran är 1.5.3.11. Alla relaterade programvaruloggar finns i den lokala projektmappen (.../logFile/emClarity.logfile).
    2. Under projektmappen skapar du en annan ny mapp, "fixedStacks", och förbereder inmatningsfilerna: TS1.fixed, TS1.xf och TS1.tlt.
      OBS: TS1.fixed: den ursprungliga tilt-serien, även känd som TS1.st i Etomo. TS1.xf: den här filen innehåller transformationskoordinaterna efter Etomo tiltalign. TS1.tlt: den här filen innehåller lutningsvinklar.
  3. Uppskatta oskärpan enligt stegen nedan.
    1. Beräkna oskärpan. Uppdatera parameterfilen med mikroskopet och avbildningsparametrarna enligt tilläggstabell 1. Kopiera en parameterfil till projektmappen, ändra dess namn till param_ctf.m och kör: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.
      Parameterfilmallen finns i tilläggsfil 1 eller den lokala programvaruinstallationskatalogen (.../emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/).
  4. Kontrollera CTF-uppskattningsresultaten för varje stack.
    1. Kontrollera de justerade staplarna (till exempel aliStacks/TS1_ali1.fixed) med 3dmod och se till att fiducialpärlorna raderas korrekt.
    2. Se till att loggfilen rapporterar att handligheten är korrekt, vilket finns i logfile/emClarity.logfile (bild 9).
    3. Kontrollera oskärpavärdet (till exempel fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) och se till att det matchar den teoretiska CTF-uppskattningen.
  5. Definiera underregionerna.
    1. Generera ett binned tomogram. I projektmappen kör du: sh recScript2.sh -1.
      OBS: Ett mindre (i storlek) tomogram för varje stack lagras i en ny mapp "bin10". För att påskynda processen kan koordinaterna för en eller flera delregioner definieras i ett bin10-tomogram. Skriptfilen finns i den lokala programvaruinstallationskatalogen (.../emClarity_1.5.3.11/docs/).
    2. Bestäm gränserna genom att välja sex punkter, x min, x max, y min, y max, z min och z max, för att skapa en underregion. Under mappen "bin10", kör: 3dmod TS1_bin10.rec.
      OBS: Om fyra underregioner ska skapas i en tilt-serie, välj 6 × 4 = 24 poäng. Varje stack måste ha en modellfil (*.mod) under mappen "bin10".
    3. Konvertera modellfilerna till emClarity-format. Detta skapar en ny mapp recon. Lagra alla koordinater för varje underregion under den här mappen. I projektmappen kör du: sh recScript2.sh TS1.
  6. Plocka partiklar.
    1. Hitta en apoferritinmall för att plocka partiklar. Ladda ner en mall från Electron Microscopy Data Bank (EMD-10101)44. Se till att pixelstorleken på mallen matchar rådata. I projektmappen kör du: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu.
    2. Generera CTF-korrigerade tomogram för partikelplockning. I projektmappen kör du: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch.
    3. Kör partikelplockning för varje underregion. För apoferritindatauppsättningen utför du en mallsökning på bin6. Ändra de Tmp_angleSearch parametrarna (θ ut, Δut, θ in, Δin) för att bestämma vinkelområdet och intervallen för sökning i plan eller utanför plan i grader. I projektmappen kör du: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      OBS: En mapp "convmap_wedge_Type2_bin6" kommer att genereras i det här steget. Csv-filen under den här mappen (till exempel TS1_1_bin6.csv) innehåller all information om de partiklar som valts.
    4. Ta bort de felaktiga partiklarna med 3dmod. Under mappen "convmap_wedge_Type2_bin6", kör: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.
      OBS: Det är vanligt att hitta fel partiklar bredvid kolkanter eller isföroreningar i dessa områden. Utför ett högerklick på de felaktiga punkterna och tryck på backspace på tangentbordet för att radera dem. I det här steget ser du till att de flesta av de falska positiva punkterna tas bort (figur 10).
    5. Ändra mappnamnet "convmap_wedge_Type2_bin6" till "convmap", eftersom emClarity kommer att hitta information om underregioner under convmap i följande steg.
  7. Initiera projektet. I projektmappen kör du: emClarity init param0.m för att skapa en databas för emClarity, ApoF.mat.
  8. Utför tomogramrekonstruktion före STA och justering. För att generera CTF-korrigerade delregiontomogram vid bin4, kör: emClarity ctf 3d param0.m.
    OBS: CTF-korrigerade tomogram (till exempel cache / TS1_1_bin4.rec)  kommer att genereras i en ny mapp "cache".
  9. Utför STA och justering.
    1. Utför medelvärdet med hjälp av de CTF-korrigerade subtomogrammen som börjar vid bin4. I projektmappen kör du: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment.
    2. Fortsätt att göra justeringar och kör: emClarity alignRaw param0.m 0.
      Medelvärdessteget genererar en referens som kommer att användas av emClarity i det här steget för att justera partiklarna. De Raw_angleSearch parametrarna (θ ut, Δut, θ in, Δ in) kan ändras för att ställain vinkelintervall och stegstorlekar för varje cykel. Eftersom de flesta felaktiga partiklar tas bort från databasen (steg 2.6.4) kan dessa vinkelinställningar för justering börja med en relativt liten grad.
    3. Uppdatera Raw_angleSearch parametrar och kör några fler cykler (steg 2.9.1 och 2.9.2). För att påskynda processen, utför inriktningar i plan och utanför planet separat.
      OBS: För varje binning rekommenderas att köra flera cykler och gradvis minska vinkelinställningarna. För ApoF-datasetet genomfördes ytterligare fem cykler vid bin 4, och ytterligare information finns i tilläggstabell 2. För cycle001 kör du: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, följt av emClarity alignRaw param1.m 1.
    4. Rengör de överlappande partiklarna. I projektmappen kör du: emClarity removeDuplicates param5.m 5.
  10. Utför Tilt-seriens förfining med tomoCPR.
    OBS: Detta steg är valfritt.
    1. Kör tomoCPR för att förfina stackgeometrin. I projektmappen kör du: emClarity tomoCPR param5.m 5.
    2. Generera nyligen justerade stackar och uppdatera geometrifilerna. I projektmappen kör du: emClarity ctf update param6.m.
      Se till att de nya geometrifilerna (till exempel fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) och de nyligen justerade stackarna (till exempel aliStacks/TS1_ali2.fixed) genereras korrekt.
    3. Skapa nya undertomogram på bin2. I projektmappen kör du: emClarity ctf 3d param6.m.
      OBS: Detta kommer att följas av några cykler för medelvärde och justering vid bin2 (steg 2.9.1, 2.9.2 och 2.9.3), duplicerad rengöring (steg 2.9.4) och valfri tomoCPR (steg 2.10). På grund av hög symmetri utfördes ytterligare fem cykler vid bin2 för apoferritin. Uppdatera Raw_angleSearch parametrar för varje cykel.
  11. Utför slutlig rekonstruktion.
    1. Fortsätt att köra några cykler på bin1 och tomoCPR (steg 2.9 och steg 2.10). Ytterligare 10 cykler vid bin1 utfördes för apoferritindatasetet. Mer information om kommandon och parametrar finns i tabell 2.
    2. Utför slutlig rekonstruktion genom att kombinera de två halva datauppsättningarna. I projektmappen kör du: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, följt av emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.
      OBS: Den slutliga kartan (till exempel med en B-faktor på 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) kommer att genereras, figur 11.

Representative Results

För cell- och lamellprover beror datainsamlingsstrategin till stor del på provet och målet med bildstudien (figur 1). Inriktningsmetoden beror på om det molekylära målet är in situ eller framställt från det renade makromolekylära komplexet för högupplösta rekonstruktionsprover som innehåller molekylära mål. För renade komplex som förglasats på håliga (kol) galler kan inriktning helt enkelt baseras på avbildning i hålen i (kol) stödfilmen. För in situ-arbete kräver inriktningsmetoden kunskap om placeringen av den molekylära enheten baserat på korrelativa data eller kända cellulära landmärken med låg förstoring. Cellulära landmärken skulle helst kunna identifieras när du tar översiktsbilder och, om det är tillräckligt för att grovt lokalisera intressanta regioner, kan ge ett snabbt sätt att bekräfta målidentitet med en sökbild. Men om de observerbara händelserna är sällsynta kan sökbilder med medelstor förstoring behövas för att kvalificera att målet är korrekt. Sökkartor är medelstora förstoringsmontage av sökbilder och kan därmed göra målsökning mycket enklare, där de kan förvärvas med en förstoring där funktionen av intresse är synlig. Sökkartor kan sedan screenas för att hitta och ställa in målbatchpositioner. För prover som innehåller cellulära egenskaper för ultrastrukturell rekonstruktion är inriktningsmetoden liknande, men lika beroende av synligheten av cellulära händelsen vid olika förstoringar och dess förekomst i provet.

Datainsamlingsstrategin måste också övervägas; I samtliga fall avgör studiens mål till stor del hur data samlas in. För rekonstruktion av den cellulära ultrastrukturen kan en låg förstoring (20-5 Å/px) och stort synfält vara lämpligt, men höga förstoringar krävs för att rekonstruera molekylära eller högupplösta detaljer (5-1 Å/px). Ett dataset som samlas in vid 1,5 Å/px under ideala förhållanden kommer endast fysiskt att kunna producera en rekonstruktion vid Nyquistfrekvensen 3,0 Å/px; Men i verkligheten påverkar många faktorer, inklusive men inte begränsat till provtjocklek, storlek och heterogenitet, alla den erhållna rekonstruktionskvaliteten. De exakta avbildningsparametrarna balanserar också förstoringen baserat på studiens mål med synfältet att innehålla tillräckligt med information. Denna artikel presenterar ett subtomogram medelvärdesfall som når 2,86 Å, men ytterligare studier 17,42,43,44,45 presenteras i tabell 1 för att illustrera insamlingsparametrarna associerade med studier som riktar sig mot olika resultat17,42,45,46.

När ett inriktningsarbetsflöde och datainsamlingsregim för kryo-ET har upprättats är datainsamling av många olika provtyper möjlig. Representativa tomogram av en mängd olika prover presenteras här: molekylära prover såsom apoferritin (film 1), tunna cellulära processer (film 2) och FIB-fräst lamell av det tjocka cellulära provet (film 3).

Figure 1
Bild 1: Översikt över konfigurationen av tomografiarbetsflödet. Kryo-ET-bildarbetsflödet som beskrivs i protokollet visas som ett flödesschema. De bilder som förväntas förvärvas visas för det cellulära och molekylära arbetsflödet. Den presenterade namngivningen följer Tomo5-konventionen, även om de flesta programvaror för insamling av tomografi delar gemensamma principer för att samla in dessa bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Förberedelseflik och sökförinställda villkor . (A) Översiktsbild av hela fliken. Förinställningar för bildvillkor ställs in på den här fliken och "Kalibrera bildskift" och "Bildfilterinställningar" finns i rullgardinsmenyn "Uppgifter". (B) Zooma in i rullgardinsmenyn "Förinställningar" där varje förinställning kan väljas för individuella bildförhållanden. (C) Bild som visar en tillräcklig förstoring för att passa både exponeringen och området "Fokus och spårning" i synfältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Dosberäkningar. Exempel på dosberäkningar för möjliga tomogramanskaffningsscheman där dosraten har mätts över vakuum. De två beräkningarna bestämmer exponeringstiden (erna) för varje lutning, oavsett om de är inriktade på en optimal dos per tilt eller en optimal total dos för full tilt-serien. Vid subtomogrammedelvärde är det vanligt att rikta in sig på en optimal dos per lutad bild i intervallet 3,0-3,5 e-/Å2. I båda fallen är "Fraktioner (Nr.)" inställda på 6 för att uppnå ~ 0,5 e-/Å2 dos per filmram av lutningen för tillräcklig signal för att utföra rörelsekorrigering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Fliken Atlas. Översiktsbild på fliken "Atlas". Bilden har beskurits för att undvika tomma rutnätspositionsutrymmen. Menyn "Uppgifter" innehåller inställningar för sessionsinställningar och rutnätsvalsutrymmen för individuellt urval av alla rutnät som inventerats och ett alternativ att skaffa en enda atlas efter att kassetten har tagits bort från autoladdaren. Ett valt rutnät kan återställas och sedan förvärvas igen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Kalibrerade bildförskjutningar. Bilden visar en exponerings- och sökbild. Det röda korset i sökbilden är den förskjutna markören för att korrigera förskjutningen mellan exponering och sökning. Man bör göra om bildskiftskalibreringar vid sessionens start eller efter att ha ändrat förinställningarna för bildtillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: Autofunktioner och bländare. (A) Fliken "Autofunktioner" visar rullgardinsmenyn "Förinställningar" och valet "Uppgift". Understruken i blått är förinställningen "Thon Ring" som krävs för "Autostigmate" (även understruken i blått) och "Autocoma". Man bör välja respektive förinställningar för varje uppgift och sedan trycka på Start-knappen. (B) Bländare finns i TEM-användargränssnittet. Välj önskad "Objektiv bländare" efter att autofunktionerna har utförts och kör "Autostigmate" med bländaren i. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Bild 7: Översikt över fliken Tomografi. Bilder visar Tomo 5.8-användargränssnittet. A) Partipositioner. De senaste funktionerna som visas i bilden: alternativet "Skaffa sökkarta"; Tomogrampositioner visas i atlasvyn med inzoomningsalternativet; markerad längst upp till höger är "Välj positioner"; nedan har alla fyra positionerna valts till parametrarna "Uppdatera oskärpa". (B) Tre positioner väljs på sökkartan, märkta 1, 2 och 3. Position 1 kommer inte att utgöra ett problem när "Förfina alla" körs. Men om i en inställning med hög måltäthet, till exempel när lamellpositioner väljs, som visas för position 2 och position 3, kommer "Förfina alla" att köra "Tracking" och "Focus" -rutinen på "Exponering" -regionen i position 2 och exponera målet innan tomogrammet förvärvas. Rutnätstypen är R1.2/1.3. Skalstreck = 1,2 μm. (C) Datainsamling. Valda positioner i "Batchpositioner" kan nu förvärvas individuellt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Bild 8: Definiera maximal lutningsvinkel. Figuren visar en steg-för-steg-metod för att bestämma det maximala lutningsområdet för tomogramförvärv. (A) 0° översikt och en sökkarta i mitten av rutnätet. För att testa lutningsområdet kan vinkeln ställas in i tomografiprogramvaran med "Set Tilt (°)" genom att skriva önskat värde och sedan trycka på Set. (B) Scenen har lutats till −60°, vilket visar att ett hörn av sökkartan inte skulle förvärvas fullt ut vid −60°. (C) Steget har lutats till 60°. Genom att räkna hålen som har försvunnit vid ±60° kan man få en uppfattning om lutningsområdet för en rutnätsruta. Skalstreck = 2,5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Bild 9: emClarity flödesschema. Flödesschemat beskrev de olika stegen för kryo-subtomogrammedelvärde. Skalstänger = 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Bild 10: Mallmatchning med emClarity . (A) En typisk mikrograf av apoferritin på ett grafenbelagt rutnät. Oskärpa: −3.430 μm. (B) En bit av tomogrammet överlagrat med modellpunkter efter mallsökning. (C) En topp och (D) en sidoprojektionsvy av modellpunkter, som indikerar ett enda plant lager av monodisperserade apoferritinpartiklar. Skalstänger = 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: Cryo-ET STA för apoferritin . (A) Den slutliga kartan efter 21 cykler av subtomograminriktning. (B) Den slutliga kartans Fourierskalkorrelationsdiagram (FSC) med en rapporterad upplösning på 2,86 Å, innehållande 38 koniska FSC:er. (C) Representativa densitetskartor (utrustade med PDB-modell 6s6147). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prov Cryo-ET-typ Å/px Lutningsområde (+/-) Lutningssteg (°) Oskärpa (μm) Total dos (e-/Å2) Resolution Rådata Hänvisning
Apoferritin Renad/molekylär (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 EMPIAR-10787 17 & detta dokument
HIV-1 Gag Renad/molekylär (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17
Ribosom Renad/molekylär (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 EMPIAR-10304 42
SARS-CoV-2 spik Lamell/molekylär (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 EMPIAR-10753 45
Neuron axon struktur Cellulär (ultrastrukturell) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 N.D. EMPIAR-10922 47

Tabell 1: Insamlingsparametrar för flera kryo-ET-studier. Studier inriktade på rekonstruktion av molekylära detaljer från renade eller in situ-proteiner jämfört med en studie som syftar till att lösa och segmentera de ultrastrukturella cellulära egenskaperna.

Film 1: Ett tomogram av apoferritinprover på ett normalt EM-rutnät och sedan avbildat med en kryo-TEM utrustad med en ultrahögupplöst kamera med ett kompatibelt filter. Tilt-serien förvärvades med ett dossymmetriskt schema, med ett lutningsspann på 54° och en total dos på 134 e-/A2 i elektrontomografiprogramvaran. Skalstreck = 50 nm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 2: Ett tomogram av en primär neuron som odlas på ett EM-rutnät och sedan avbildas direkt med en kryo-TEM utrustad med en ultrahögupplöst kamera med ett kompatibelt filter. Tilt-serien förvärvades med ett dossymmetriskt schema, med ett lutningsspann på 60° och en total dos på 120 e-/A2 i elektrontomografiprogramvaran. Skalfält = 100 nm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 3: Ett tomogram av en cyanobakterie på ett EM-rutnät, utsatt för FIB-fräsning och sedan avbildat med en kryo-TEM utrustad med en höghastighetskamera och ett kompatibelt filter. Tilt-serien förvärvades med ett dossymmetriskt schema, med ett lutningsspann på 50° och en total dos på 120 e-/A2 i elektrontomografiprogramvaran. Skalstreck = 87,2 nm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Tilläggsfil 1: Parameterfilmallen för uppskattning av oskärpan. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Uppgifter om datainsamling och mikroskopinställning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 2: Lista över kommandon i exekveringsordningen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Tomo5
Arbetsflödesbeskrivningen av tomografiprogramvaran belyser ett potentiellt och mest strömlinjeformat sätt för en (fjärr) batchtomografisession. Även om programvaran är lätt för nybörjare, kan viss initial kryo-EM-upplevelse och grundläggande tomografiförståelse hjälpa till med installationen. Kritiska steg markeras i protokollet och bör hjälpa till att felsöka även om en annan installationsmetod har använts. Utvecklingen av programvaran kommer att underlätta (fjärr) datainsamling och göra cryo-ET mer tillgänglig för en bred användarbas. Några tips och tricks som kan hjälpa till att felsöka vanliga problem beskrivs nedan.

En viktig punkt att diskutera är valet av rutnät eftersom gallerstänger vid höga lutningar kan dölja utsikten (figur 8) när du lutar provet till ±60 °. På ett TEM-rutnät avser maskstorleken antalet rutnätsrutor per längdenhet på rutnätet. Större maskantal har fler rutnätsrutor per längdenhet, en högre densitet av rutnätsrutor och mindre rutnätsrutor, dvs. ett rutnät med 400 maskor har mindre rutor än ett rutnät med 200 maskor. Ett bra val av galler för tomografi är 200-mesh eller 300-mesh galler. Som visas i figur 8 minskas det tillgängliga området att samla in när rutnätet lutas. Vid ±60 ° lutning kommer ett 300-maskigt rutnät att ha ett litet synfält på vilket ett fullständigt tomogram kan förvärvas. Fördelarna med 200-maskiga rutnät är att de större rutnätsrutorna gör molekylär tomografiinställning snabbare, och med den ökade rutnätskvadratytan kommer en kvadrat sannolikt att räcka för en samling över natten. Nackdelen är att 200-nätsgaller är mer ömtåliga, så hantering och klippning kräver mer finess.

Dessutom, om man använder hålig stödfilm (se materialtabell) på EM-rutnät, måste hålavståndet beaktas för att ställa in fokus- och spårningsområdet i förhållande till exponeringsområdet. Helst bör stråldiametern vid önskad förstoring vara tillräckligt liten för att täcka kolområdet intill exponeringsområdet längs lutningsaxeln för optimal och snabb installation. På så sätt kan potentiella regioner av intresse i varje hål förvärvas.

Eftersom programvarans eucentriska höjdrutin för närvarande inte är lika robust, till exempel serialEM-rutinen, kan följande tips lösa det problemet. Om den eucentriska höjdbestämningen misslyckas med den eucentriska höjdförinställningen kan man istället använda översiktsförinställningen och köra om "Auto-eucentrisk genom steglutning"; Detta kan lösa problem om den eucentriska höjden är långt ifrån 0. Om detta lyckas kan man köra om "Auto-eucentric by stage tilt" med "Eucentric Height" förinställningar för att förbättra precisionen. Om det misslyckas kan man köra "Auto-Eucentric by beam tilt" med den eucentriska höjden förinställd och sedan köra om "Auto-Eucentric by stage tilt" eller manuellt ställa in z-höjden konsoliderad med "Auto-Eucentric by beam tilt" i TEM-användargränssnittet under "Stage" -inställningarna. Om rutnät med ett upprepande hålmönster används kan de förhindra identifiering av en enda korskorrelationstopp. Man kan försöka ändra den eucentriska höjdförinställningen till en lägre oskärpaförskjutning som −25 μm och/eller en kortare exponeringstid för att minska korskorrelationen från hålmönstren. Å andra sidan kan det hända att användning av spetsiga galler / lameller inte ger tillräcklig signal för en stark korskorrelationstopp. Man kan försöka ändra den eucentriska höjdförinställningen till en större oskärpaförskjutning som −75 μm och/eller en förlängd exponeringstid för att förbättra korskorrelationstoppen. Ett annat alternativ är att justera bildfilterinställningarna; de finns på fliken "Förberedelse". Alternativ för att justera filterinställningarna kan ställas in för låg (Översikt/rutnät), medium (Eucentrisk höjd) och hög förstoring (Spårning/Fokus) för att hitta den optimala korskorrelationstoppen för varje förinställning. Den önskade inmatningen är en bild, dvs vid 0 ° och en vid 5 °, följt av att klicka på Jämför för att jämföra båda bilderna. Rekommenderat startvärde för den längsta våglängden är en fjärdedel av skalstrecket i bilden och för den kortaste våglängden är en fyrtiondel av skalstrecket. Om toppen inte är robust identifierad kan man optimera inställningarna tills en övertygande topp kan hittas. Det finns inget behov av att skaffa bilder varje gång; att bara trycka på "Jämför" räcker. Om TOMO fortfarande inte automatiskt hittar den eucentriska höjden kan den manuella eucentriska höjdkalibreringen användas. Man bör centrera över en någorlunda stor iskristall i översiktsförstoring på fliken "Förberedelse", sedan gå till "Scenkontrollen" i TEM-användargränssnittet, ställa in alfa på −30° och justera steg z-värdet för att centrera om kristallen med hjälp av den fluorescerande skärmbilden. Om du väljer inställningarna "Hög upplösning" och "Hög kontrast" i TEM-användargränssnittet blir det enkelt (knappar längst ner i det fluorescerande skärmfönstret). Alternativt, om det finns tillgång till en kamera med live-läge, kan detta användas för att bestämma den eucentriska höjden; Det blir enklare än på den fluorescerande skärmen.

De största begränsningarna i Tomo5-versioner före 5.8 är de saknade medelstora förstoringsmontagena, saknat dossymmetriskt schema och problem relaterade till eucentrisk höjdsökning. Dessa finns i serialEM, ett freeware med snabb utveckling och samhällsstöd, en robust eucentrisk höjdrutin och möjligheten att skripta, dvs ett specialbyggt dossymmetriskt schema. Från version 5.8 och framåt i Tomo5 har det vanligaste problemet för att hitta den eucentriska höjden, dvs. en misslyckad looping runt mål-z-värdet, lösts genom att implementera alternativet att ställa in ett eucentriskt höjdacceptanskriterium. Men med olika rutnäts- och provtyper rekommenderas det starkt att justera bildfilterinställningarna för att återspegla de unika bildförhållandena för enskilda sessioner och för att ge bästa möjliga korskorrelationstopp för att hitta den eucentriska höjden och för att fokus- och spårningsregionen ska fungera tillförlitligt under tomogramförvärv.

Sammantaget har många anläggningar snabbt anpassat sig till fjärrdrift under pandemin. Tomo5-programvaran ger en enkel åtkomst och användarvänlig väg till tomografi som är väl lämpad för fjärrstyrning. De framsteg som gjorts inom programvaran kommer utan tvekan att fortsätta att göra fjärrdatainsamlingar och tomografiinsamling i allmänhet mer vanliga i samhället.

emClarity
Eftersom emClarity använder en mallbaserad partikelplockningsmetod behöver den en mall för objektet av intresse. Partikelplockningen (steg 2.6) är mycket känslig och nyckeln till den slutliga strukturen. Innan medelvärde och justering (steg 2.9) måste man se till att kontrollera noggrant och manuellt ta bort de falska positiva resultaten. När en mall inte är tillgänglig kanske emClarity inte är lätt att använda, men det är möjligt att använda annan programvara, till exempel Dynamo37 och PEET48, för att skapa en första modell.

För heterogena prover är emClarity utrustad med en klassificeringsmetod som gör det möjligt för användare att fokusera på specifika funktioner med olika skalor. Det är bra att köra några cykler med justeringar före klassificering och köra den vid en högre binning (till exempel bin 4 eller bin 3).

Den uppdaterade versionen av programvaran (V1.5.3.11) har betydande uppdateringar jämfört med den första versionen (V1.0)17. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, en handenhetskontroll under CTF-uppskattning (steg 2.3); symmetri för inriktningar (CX, I, I2, O); beräkning av 3D-provtagningsfunktioner per partikel (3DSF); en övergång till MATLAB 2019a för kompatibilitet och stabilitet; och rekonstruktion med hjälp av råprojektionsbilderna (cisTEM). Programvaran kommer att fortsätta att förbättras för olika prover, och de senaste meddelandena finns online (se materialförteckning).

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi erkänner Diamond Light Source för tillgång till och stöd för kryo-EM-anläggningarna vid Storbritanniens nationella Electron Bio-Imaging Center (eBIC), finansierat av Wellcome Trust, MRC och BBRSC. Vi vill också tacka Andrew Howe för förvärvet av Apoferritin-tomogrammet (film 1), Ishika Kumar för beredningen och förvärvet av neurontomogrammet (film 2) och Craig MacGregor-Chatwin för cyanobakteriernas lamelltomogram (film 3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG - Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil - A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan -
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific -
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ - - Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ - - Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial - - Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software - - Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki - - Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461 (2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. Mastronarde, D. N. The IMOD Home Page. , Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020).
  41. Frosio, T. GitHub: emClarity-tutorial. , Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021).
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. -P., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2. , Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016).
  44. Mills, D. J., Pfeil-Gardiner, O., Vonck, J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022).
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  47. Vonck, J., Pfeil-Gardiner, O., Mills, D. J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019).
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Tags

Biologi utgåva 185
Kryoelektrontomografi Fjärrdatainsamling och subtomogrammedelvärde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J.,… More

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter