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Biology

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी रिमोट डेटा संग्रह और सबटोमोग्राम औसत

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63923
Automatic Translation
1, 1, *1, *1,2,3
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल टोमो 5 का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी रिमोट डेटा अधिग्रहण का वर्णन करता है और बाद में डेटा प्रोसेसिंग और सबटोमोग्राम औसत का उपयोग करके ईएमक्लारिटी का उपयोग करता है। एपोफेरिटिन का उपयोग 2.86 ए रिज़ॉल्यूशन पर क्रायो-ईटी संरचना प्राप्त करने के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) हाल के वर्षों में गति प्राप्त कर रहा है, खासकर प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों की शुरूआत के बाद से, स्वचालित अधिग्रहण रणनीतियों में सुधार, तैयारी तकनीकें जो क्रायो-ईटी और नए सबटोमोग्राम औसत सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप क्या छवि कर सकती हैं, इसकी संभावनाओं का विस्तार करती हैं। इसके अतिरिक्त, डेटा अधिग्रहण तेजी से सुव्यवस्थित हो गया है, जिससे यह कई उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ हो गया है। सार्स-सीओवी-2 महामारी ने रिमोट क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) डेटा संग्रह को और तेज कर दिया है, विशेष रूप से वैश्विक स्तर पर कई सुविधाओं में सिंगल-पार्टिकल क्रायो-ईएम के लिए, महामारी के दौरान अत्याधुनिक उपकरणों तक निर्बाध उपयोगकर्ता पहुंच प्रदान करता है। टोमो 5 (3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सॉफ्टवेयर) में हालिया प्रगति के साथ, रिमोट क्रायो-ईटी डेटा संग्रह दुनिया में कहीं से भी मजबूत और संभालना आसान हो गया है। इस आलेख का उद्देश्य विस्तृत समस्या निवारण के साथ (दूरस्थ) क्रायो-ईटी डेटा संग्रह सत्र की प्रक्रिया के लिए टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर में डेटा संग्रह सेटअप से शुरू होने वाला एक विस्तृत वॉक-थ्रू प्रदान करना है। (रिमोट) डेटा संग्रह प्रोटोकॉल को एक उदाहरण के रूप में एपोफेरिटिन का उपयोग करके, ईएमक्लैरिटी के साथ औसत सबटोमोग्राम द्वारा निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन पर संरचना निर्धारण के लिए वर्कफ़्लो के साथ पूरक किया जाता है।

Introduction

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को व्यापक रूप से पुनर्जागरण अवधि का अनुभव करने के लिए जाना जाता है, जो इसे संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक मुख्य और केंद्रीय रूप से उपयोगी उपकरण बनने के लिए तेज करता है। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों का विकास और उपयोग 1,2,3, बेहतर माइक्रोस्कोप और इलेक्ट्रॉन स्रोत 3,4,5, स्वचालन / थ्रूपुट में सुधार 6,7,8,9, और एकल-कण विश्लेषण में कम्प्यूटेशनल प्रगति 10,11,12,13 14 और टोमोग्राफी 15,16,17 सभी, भाग में, तकनीक की हालिया सफलता के लिए जिम्मेदार हैं। इन तकनीकी ड्राइवरों ने क्रायोजेनिक और देशी परिस्थितियों में जैविक मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को हल करने के लिए क्रायो-ईएम की क्षमता विकसित की है। जो संकल्प आसानी से प्राप्य हैं, वे परमाणु रूप से सटीक मॉडलिंग के लिए पर्याप्त हैं और तकनीक को संरचनात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र में सबसे आगे लाए हैं। ब्याज के जैविक लक्ष्य को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक न्यूनतावादी दृष्टिकोण लंबे समय से बुनियादी जैविक अनुसंधान, दवा की खोज और अनुवाद विज्ञान के लिए मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) में सफल साबित हुआ है। उसी दृष्टिकोण में, क्रायो-ईएम अब परिणाम प्रदान कर सकता है जो समानांतर उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएक्स अध्ययन करता है। संरचनात्मक जीव विज्ञान की क्रायो-ईएम शाखा में वर्तमान प्रमुख सफलता को एकल कण विश्लेषण (एसपीए) कहा जाता है, जो जैविक मैक्रोमोलेक्यूल19 के हजारों विचार प्राप्त करने के लिए आमतौर पर शुद्ध प्रोटीन नमूना18 की 2 डी प्रक्षेपण छवियों का अधिग्रहण करता है। इन छवियों (1) में कई दृश्यों से जानकारी होती है जो पूरी तरह से 3 डी स्पेस में लक्ष्य के झुकाव का प्रतिनिधित्व करती हैं और (2) ऑब्जेक्ट विरूपण विषमता को कैप्चर करती हैं, जिसे बाद में अलग और जांच की जा सकती है।

जैविक नमूनों की इन 2 डी प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, यहां तक कि सीटू में और शुद्धिकरण के बिना, क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) है। क्रायो-ईटी यांत्रिक रूप से नमूने को घुमाकर झुके हुए कोणों पर एक ही वस्तु की छवियों की एक श्रृंखला लेता है। इस प्रकार, एसपीए में एकत्र किए गए 2 डी अनुमान, ब्याज के अणु के कोणीय पोज़ का प्रतिनिधित्व करते हैं, स्वाभाविक रूप से क्रायो-ईटी इमेजिंग प्रयोग20 के हिस्से के रूप में एकत्र किए जाते हैं। टोमोग्राफिक झुकाव श्रृंखला को तब एक टोमोग्राम में पुनर्निर्मित किया जाता है जिसमें इमेज किए गए मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के 3 डी अभ्यावेदन होते हैं। टोमोग्राफिक डेटा संग्रह की प्रकृति, एक डिग्री तक, 2 डी छवियों के संग्रह से एक अणु के पूर्ण 3 डी प्रतिनिधित्व को प्राप्त करने के लिए औसत पर निर्भरता को कम करती है। हालांकि, वर्तमान चरण डिजाइनों के कारण, नमूना आमतौर पर -60 ° से +60 ° तक झुका हुआ होता है, जिससे टोमोग्राफिक 3 डी पुनर्निर्माण में जानकारी का एक लापता पच्चर21 छोड़ दिया जाता है।

एक ही टोमोग्राम में 3 डी पुनर्निर्माण में तब सूचना का एक लापता पच्चर और शोर के लिए कम संकेत होता है। व्यक्तिगत मैक्रोमोलेक्यूल्स को सबटोमोग्राम के रूप में निकाला जा सकता है और इससे निपटने के लिए एक साथ औसत किया जा सकता है। जहां एक सबटोमोग्राम में प्रत्येक मैक्रोमोलेक्यूल एक अलग अभिविन्यास पर पाया जाता है, लापता पच्चर लक्ष्य वस्तु के प्रत्येक सबटोमोग्राम में अलग-अलग उन्मुख होता है, इसलिए कई प्रतियों पर औसतन लापता पच्चर के कारण जानकारी भरता है। छवि प्रसंस्करण में हाल के घटनाक्रमों ने सार्थक डेटा22 के साथ लापता पच्चर को भरने के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता तंत्रिका नेटवर्क को प्रशिक्षित करने का भी प्रयास किया है। यह औसत प्रक्रिया शोर के संकेत को भी बढ़ाती है, एकल कण विश्लेषण में औसत के लक्ष्य के समान, इसलिए पुनर्निर्माण की गुणवत्ता और संकल्प में सुधार होता है। यदि ब्याज के अणु में समरूपता होती है, तो उसे भी औसत के दौरान परिभाषित और नियोजित किया जा सकता है, जिससे पुनर्निर्माण संकल्प में और सुधार हो सकता है। एक टोमोग्राम से सबटोमोग्राम के एक सेट में मैक्रोमोलेक्यूल के 3 डी वॉल्यूम की निकासी और उनके बाद के प्रसंस्करण को सबटोमोग्राम एवरेजिंग (एसटीए) 23 के रूप में जाना जाता है। जहां प्रत्येक सबटोमोग्राम अध्ययन किए जा रहे अणु की एक अनूठी प्रति का प्रतिनिधित्व करता है, एसटीए वर्कफ़्लो का उपयोग करके किसी भी संरचनात्मक विषमता से पूछताछ की जा सकती है। जैसा कि आमतौर पर एसपीए वर्कफ़्लो में उपयोग किया जाता है, एसटीए के दौरान ब्याज के परिसर के विरूपण राज्यों को विच्छेदित करने के लिए वर्गीकरण तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। साथ ही एसटीए क्रायो-ईटी में उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण को सक्षम करता है, यह दृष्टिकोण तकनीक को अपने मूल सेलुलर वातावरण में मैक्रोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक तंत्र से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है या लक्ष्यों को अक्सर एसपीए 24,25,26 के लिए उत्तरदायी नहीं होता है।

इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी में कमरे के तापमान27 पर सेलुलर नमूनों के 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चर का निर्धारण करने का एक लंबा इतिहास है। नमूने के भौतिक झुकाव द्वारा विचारों का अधिग्रहण सेलुलर-लंबाई के तराजू पर किसी वस्तु के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है और विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है जब सेलुलर संरचनाओं में औसत के लिए नियमितता की कमी होती है। कोशिकाओं को सेल किनारों पर क्रायो-ईटी इमेजिंग के लिए सब्सट्रेट पर भी जमे हुए किया जा सकता है जहां नमूना इलेक्ट्रॉन पारदर्शी होने के लिए पर्याप्त पतला होता है। इन शर्तों के तहत, एसटीए को सेलुलर वातावरण में मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, यद्यपि जब नमूना इलेक्ट्रॉन पारदर्शी होने के लिए पर्याप्त पतलाहोता है 28. हालांकि, क्रायो-कोरिलेटिव लाइट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-सीएलईएम) और केंद्रित आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) सहित अतिरिक्त तैयारी तकनीकों के साथ संयुक्त होने पर, क्रायो-ईटी का उपयोग क्रायोजेनिक स्थितियों29 के तहत पूरी कोशिकाओं के अंदर छवि के लिए किया जा सकता है। यह एसटीए की शक्ति के साथ सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए क्रायो-ईटी की शक्ति को एक साथ लाता है ताकि उनके सेलुलर स्थान30 की पहचान करते हुए सीटू में मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को निर्धारित किया जा सके और गतिशील प्रक्रियाओं में लगे परिसरों के स्नैपशॉट प्रदान किएजा सकें। सेलुलर नमूनों की छवि बनाने और कई अध्ययनों में एसटीए को नियोजित करने की तकनीक की क्षमता ने सीटू में मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को हल करने के लिए तकनीक की शक्ति पर प्रकाश डाला है, यहां तक कि एसपीए32 की तुलना में संकल्पों पर भी। एक और लाभ मैक्रोमोलेक्यूल के मूल स्थान के ज्ञान में पाया जाता है, जो टोमोग्राम30 में अंतिम वर्गीकृत 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा दर्शाया गया है। इसलिए, मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना को सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। लंबाई के तराजू में ये टिप्पणियां संभवतः महत्वपूर्ण निष्कर्षों को जन्म देंगी जहां संरचनात्मक तंत्र कार्यात्मक अध्ययनों के संदर्भ में सेलुलर परिवर्तनों के साथ सहसंबद्ध हो सकते हैं।

क्रायो-ईटी और एसटीए तीन प्रमुख वर्कफ़्लो में डेटा संग्रह की अनुमति देते हैं: आणविक, सेलुलर और लैमेला टोमोग्राफी। शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को आणविक टोमोग्राफी द्वारा क्रायो-ईटी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। उनके सेलुलर वातावरण में प्रोटीन संरचनाओं का निर्धारण जहां कोशिका काफी पतली होती है, सेलुलर टोमोग्राफी के रूप में वर्णित किया जा सकता है। हाल ही में, क्रायोजेनिक लक्ष्यीकरण और मिलिंग के विकास के साथ, इन समान तकनीकों को लैमेला टोमोग्राफी वर्कफ़्लो में अपने मूल वातावरण में कोशिका के अंदर गहरे प्रोटीन संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि सेलुलर संदर्भ का खुलासा करते हुए जिसमें उन प्रोटीनों को देखा जाता है। उपलब्ध सॉफ़्टवेयर पैकेजों के आधार पर विभिन्न डेटा संग्रह रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है और सबसे महत्वपूर्ण बात, नमूने की आवश्यकता के आधार पर। शुद्ध प्रोटीन के तांबे के टीईएम ग्रिड पर आणविक या गैर-अनुयायी नमूनों को आमतौर पर कम हैंडलिंग की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, आदर्श मामलों में फ्लैट और अक्षतिग्रस्त रहते हैं। इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम को आसानी से एक छेद-कार्बन ग्रिड में श्रृंखला में स्थापित किया जा सकता है ताकि व्यवस्थित तरीके से दसियों से सैकड़ों टोमोग्राम को जल्दी से प्राप्त किया जा सके। उपयोगकर्ताओं के लिए आणविक टोमोग्राफी नमूने स्थापित करने का सबसे आसान तरीका जहां ग्रिड पर प्रोटीन प्रचुर मात्रा में मौजूद हैं, टोमो 5 (वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सॉफ्टवेयर, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करना होगा। अन्य टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर जैसे कि लेगिनॉन9 और सीरियलईएम6 भी उपलब्ध हैं; वे डेटा संग्रह के लिए अधिक व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए अधिक सेटअप विकल्प प्रदान करते हैं लेकिन अधिक जटिल हैं और परिणामस्वरूप नेविगेट करना कठिन हो सकता है, विशेष रूप से टोमोग्राफी के लिए नए उपयोगकर्ताओं और दूरस्थ रूप से अपने सत्र तक पहुंचने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए। एक बड़े और विविध उपयोगकर्ता आधार के साथ एक सुविधा के लिए, टोमो 5 दूरस्थ वातावरण में संचालित करना और उपयोगकर्ताओं को प्रशिक्षित करना आसान है। अनुयायी कोशिकाओं के लिए, ग्रिड को आमतौर पर अधिक हैंडलिंग चरणों की आवश्यकता होती है, और नाजुक सोने के ग्रिड का उपयोग करने की आवश्यकता हैंडलिंग और डेटा संग्रह रणनीतियों में बेहतर देखभाल की आवश्यकता को बढ़ाती है। ब्याज के एक सेलुलर क्षेत्र को खोजने की सुविधा के लिए और उच्च झुकाव कोणों पर ग्रिड से रोड़ा से बचने के लिए, बड़े जाल आकारों का उपयोग करना भी फायदेमंद है, लेकिन इस कीमत पर कि वे स्वाभाविक रूप से अधिक नाजुक हैं। लैमेला नमूनों के लिए, नमूने की नाजुकता लैमेला की गुणवत्ता से निर्धारित होती है, जो परिवर्तनशील हो सकती है। ये कारक सेटअप समय और विचारों को बढ़ाते हैं, लेकिन बढ़ी हुई अनुकूलनशीलता और मजबूती फिर से टोमो 5 को इस प्रकार के डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त बनाती है। हालाँकि, प्रत्येक वर्कफ़्लो के लिए विशेष डेटा संग्रह परिदृश्य मौजूद हैं। बिसेक्ट और पेस-टोमो (दोनों सीरियलईएम में चलते हैं) टोमोग्राफी अधिग्रहण के दौरान विशेष रूप से आणविक टोमोग्राफी में टोमोग्राम संग्रह गति 28 बढ़ाने के लिए स्क्रिप्टेड बीम-इमेज शिफ्टिंग की संभावना का परिचयदेते हैं। सीरियलईएम 6,7,33 में मध्यम आवर्धन असेंबल (एमएमएम) सभी वर्कफ़्लो में आणविक सुविधाओं को बेहतर ढंग से पहचान और सटीक रूप से लक्षित कर सकते हैं, हालांकि, लेखन के समय, इन सुविधाओं को टोमो 5 में लागू किया जाना शुरू हो रहा है।

एसपीए की तरह, क्रायो-ईटी और एसटीए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में किए गए सुधारों और सबटोमोग्राम के लिए उपलब्ध पैकेजों का खजाना औसतन 16,17,32,34,35,36,37,38 के माध्यम से तेजी से सुलभ हो रहे हैं। इसके अलावा, महामारी के दौरान, डायमंड लाइट सोर्स (डीएलएस), यूके में इलेक्ट्रॉन बायो-इमेजिंग सेंटर (ईबीआईसी) जैसी राष्ट्रीय सुविधाओं के निरंतर संचालन के लिए क्रायो-ईएम इंस्ट्रूमेंटेशन तक दूरस्थ पहुंच को सक्षम करना आवश्यक हो गया। इन घटनाओं ने क्रायो-ईटी को तकनीक का उपयोग करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ और मजबूत बना दिया है। एक बार डेटा प्राप्त हो जाने के बाद, एसटीए अधिकतम रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण प्राप्त करने और मैक्रोमोलेक्यूलर विषमता के वर्गीकरण की अनुमति देने के लिए आवर्तक वस्तुओं का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक उपकरण है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य क्रायो-ईटी डेटा संग्रह के लिए क्रायो-टीईएम माइक्रोस्कोप तैयार करने का एक विस्तृत वॉक-थ्रू प्रदान करना है और उदाहरण के रूप में एपोफेरिटिन के आणविक टोमोग्राफी डेटासेट पर ईएमक्लैरिटी का उपयोग करके सबटोमोग्राम औसत कैसे किया जाए। ईएमक्लैरिटी (उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और सबटोमोग्राम औसत के लिए सॉफ्टवेयर, सामग्री की तालिका देखें) के उपयोग के लिए कमांड लाइन से स्क्रिप्ट चलाने की आवश्यकता होती है, इसलिए लिनक्स / यूनिक्स सिस्टम के साथ परिचितता का स्तर माना जाता है।

दूरस्थ कनेक्शन प्रत्येक संस्थान/सुविधा में नेटवर्क वातावरण पर निर्भर करता है। ईबीआईसी में, रिमोट सिस्टम उन प्रोग्रामों का उपयोग करता है जो डायमंड में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट नेटवर्क कॉन्फ़िगरेशन पर दूरस्थ डेटा संग्रह की अनुमति देते हैं। माइक्रोस्कोप के लिए रिमोट कनेक्शन दो प्लेटफार्मों द्वारा सुविधाजनक है: नोमशीन और टीमव्यूअर ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोग्राम NoMachine का उपयोग करके, उपयोगकर्ता दूरस्थ विंडोज डेस्कटॉप पर लॉग ऑन कर सकता है। नोमशीन द्वारा प्रदान किया गया रिमोट विंडोज डेस्कटॉप माइक्रोस्कोप के समान नेटवर्क पर रहता है और इस प्रकार, माइक्रोस्कोप के लिए वर्चुअल सपोर्ट पीसी के रूप में कार्य करता है। वर्चुअल सपोर्ट पीसी से, उपयोगकर्ता टीमव्यूअर के माध्यम से माइक्रोस्कोप से जुड़ता है जो टीयूआई और टोमो चलाने वाले माइक्रोस्कोप पीसी तक सीधी पहुंच और नियंत्रण प्रदान करता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में दो भाग होते हैं (चरण 1 और चरण 2)। चरण 1 टोमो 5 (3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके रिमोट क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण पर केंद्रित है। एक (दूरस्थ) सत्र के लिए वॉक-थ्रू तेजी से उच्च आवर्धन पर छवियों को कैप्चर करता है ताकि अंततः उपयोगकर्ता को टोमोग्राफिक डेटा संग्रह के लिए नमूना क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर को निर्देशित करने की अनुमति मिल सके। चित्रा 1 इस प्रक्रिया को सारांशित करता है। चरण 2 ईएमक्लैरिटी (उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और सबटोमोग्राम औसत के लिए सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके क्रायो-ईटी एसटीए डेटा प्रोसेसिंग का विवरण देता है। चित्रा 9 इस प्रक्रिया को सारांशित करता है।

प्रोटोकॉल दूरस्थ दर्शकों के लिए अभिप्रेत है। यह व्यक्ति को माइक्रोस्कोप पर शारीरिक रूप से मानता है और नमूनों को लोड करने से प्रत्यक्ष संरेखण किया जाता है और कैमरा ट्यूनिंग का ख्याल रखा जाता है और संदर्भ अधिग्रहण प्राप्त होता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक ऑटोलोडर के साथ एक तीन-कंडेनसर लेंस सिस्टम माना जाता है। टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर पर अधिक विस्तृत दिशानिर्देशों के लिए, निर्माता द्वारा एक विस्तृत मैनुअल विंडोज स्टार्ट बटन में उपलब्ध है जहां से सॉफ़्टवेयर लोड किया गया था।

Protocol

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर पैकेज आंशिक रूप से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. टोमो 5 का उपयोग करके रिमोट क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण

  1. यदि सॉफ़्टवेयर लोड नहीं किया गया है, तो इस सॉफ़्टवेयर को टीईएम सर्वर PC से प्रारंभ करके प्रारंभ करें (सामग्री तालिका देखें)।
  2. प्रारंभिक जाँच करें और प्रीसेट का चयन करके इमेजिंग स्थिति को कॉन्फ़िगर करें।
    1. प्रीसेट (चित्रा 2 ए, बी) के तहत "तैयारी" टैब में छवि अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करके सत्र सेटअप शुरू करें।
      1. पर्याप्त गिनती प्राप्त करने के लिए ग्रिड-स्क्वायर आकार और खुराक के अनुरूप "अवलोकन आवर्धन" समायोजित करें।
        नोट:: उपयुक्त आवर्धन ग्रिड प्रकार के लिए अज्ञात है, तो ग्रिड लोड करने के बाद इस चरण पर लौटें।
      2. "यूसेंट्रिक हाइट" और "सर्च आवर्धन" समान हो सकते हैं। पदों को स्थापित करने और यह सुनिश्चित करने के लिए "टोमोग्राफी" टैब में खोज पर क्लिक करें कि आवर्धन ब्याज की पहचान दिखाने और देखने के क्षेत्र में "एक्सपोजर" और "ट्रैकिंग / फोकस" क्षेत्र को फिट करने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 2 सी)।
      3. वांछित लक्ष्य पिक्सेल आकार के लिए "एक्सपोजर आवर्धन" सेट करें। यदि यह अज्ञात है, तो ब्याज के क्षेत्र को फिट करने के लिए वांछित क्षेत्र में आवर्धन को समायोजित करके इसे स्थापित करें।
    2. छवि अधिग्रहण (एक्सपोजर) के मापदंडों को अन्य सभी उच्च-आवर्धन प्रीसेट (ट्रैकिंग, बहाव, फोकस, थॉन रिंग, शून्य हानि,) में कॉपी करें। ऐसा करने के लिए, माइक्रोस्कोप पर "एक्सपोज़र" सेट करने के लिए सेट दबाएं और उन्हें व्यक्तिगत रूप से चुनने के बाद अन्य सभी उच्च आवर्धन के लिए "एक्सपोज़र सेटिंग्स" प्राप्त करें।
      1. एक्सपोज़र समय को समायोजित करें, विशेष रूप से "फोकस" और "ट्रैकिंग" के लिए उचित संख्या में गिनती देने के लिए, 60 ° पर मोटाई पर भी विचार करते हुए, जिसका अर्थ है 0 ° और 60 ° दोनों पर, क्रॉस-सहसंबंध के लिए एक मजबूत संकेत प्रदान करने के लिए नमूने से गुजरने के लिए पर्याप्त इलेक्ट्रॉनों के लिए।
        नोट: एक अनुमान के रूप में, "एक्सपोजर" प्रीसेट के बराबर "ट्रैकिंग" और "फोकस" के लिए एक्सपोज़र समय एक अच्छा पहला उपाय है। "एक्सपोज़र" प्रीसेट के लिए खुराक गणना उदाहरण के लिए, चित्रा 3 देखें। "तैयारी" टैब में "एक्सपोज़र" प्रीसेट के लिए गणना की गई एक्सपोज़र समय सेट करें।
    3. एक उज्ज्वल और बड़े स्पॉट आकार (एक बड़ा स्पॉट आकार एक छोटी संख्या से मेल खाती है) का उपयोग करने के लिए "शून्य हानि प्रीसेट" समायोजित करें, क्योंकि इसके लिए उच्च खुराक की आवश्यकता होती है।
      नोट: इस पूर्व निर्धारित सबसे अच्छा सूक्ष्मदर्शी पर मौजूद है, तो ऊर्जा फिल्टर के भट्ठा संरेखित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एटलस संग्रह करें।
    1. एक एटलस एकत्र करने के लिए, "एटलस" टैब में नए सत्र पर क्लिक करें, सत्र वरीयताओं को सेट करें, भंडारण पथ और आउटपुट प्रारूप दर्ज करें, और लागू करें दबाएं। स्क्रीनिंग (चित्रा 4) का चयन करें और फिर अधिग्रहित किए जाने वाले सभी एटलस पर टिक करें। माइक्रोस्कोप को असुरक्षित छोड़ने के लिए क्लोज कोल वाल्व का चयन करें; यह सभी चयनित एटलस एकत्र होने के बाद कॉलम वाल्व को बंद कर देगा। स्क्रीनिंग प्रारंभ करने के लिए, प्रारंभ बटन दबाएँ .
    2. "स्क्रीनिंग" (चित्रा 4) के तहत बाएं पैनल में ग्रिड पर क्लिक करके लक्ष्य के लिए एकल या एकाधिक एटलस का निरीक्षण करें, फिर बाएं क्लिक करें और माउस को चारों ओर ले जाने के लिए खींचें और ज़ूम इन और आउट करने के लिए मध्य स्क्रॉल करें। लक्ष्य सेटअप के लिए ग्रिड चुनें, इसे चुनें, और सॉफ़्टवेयर के अंदर से लोड नमूना पर क्लिक करें।
    3. छवि शिफ्ट अंशांकन के लिए, लोड ग्रिड के भीतर नेविगेट करने के लिए एटलस स्क्रीनिंग टैब का उपयोग करना जारी रखें। एक पहचानयोग्य विशेषता है कि सभी आवर्धन पूर्व निर्धारित पर पहचानने योग्य हो जाएगा खोजें, यानी, एक बर्फ क्रिस्टल एक छेद या किसी अन्य पहचानने योग्य सुविधा (चित्रा 5) के एक किनारे के साथ अतिव्यापी। एक सही माउस क्लिक द्वारा उस वर्ग पर ले जाएँ, फिर "ग्रिड स्क्वायर के लिए चरण ले जाएँ"..
      नोट: छवि शिफ्ट अंशांकन को सही ढंग से लागू करने के लिए चरण को यूसेंट्रिक ऊंचाई पर होना चाहिए।
  4. छवि शिफ्ट अंशांकन करें।
    1. "ऑटो फ़ंक्शंस" टैब (चित्रा 6) में, प्रीसेट को "यूसेंट्रिक ऊंचाई" पर सेट करें, "स्टेज टिल्ट द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक" पर नेविगेट करें, और स्टार्ट दबाएं। यूसेंट्रिक ऊंचाई को खोजने में सफल होने और सकारात्मक और नकारात्मक झुकाव छवियों पर नज़र रखने के लिए स्थिति विंडो की निगरानी करें; उन्हें सहसंबद्ध होना चाहिए।
      नोट: टोमो सॉफ्टवेयर के संस्करण 5.8 से, यूसेंट्रिक ऊंचाई स्वीकृति के लिए मानदंड को संशोधित किया जा सकता है; डिफ़ॉल्ट 0.25 μm है, और इसे 0.5-0.8 μm पर सेट करने से अधिक छूट मिलती है। मान माइक्रोस्कोप प्रदर्शन पर निर्भर करते हैं, लेकिन उनके लिए जितना संभव हो उतना छोटा होने की सिफारिश की जाती है।
      1. जब यूसेंट्रिक ऊंचाई पर और फोकस में, एक सुविधा पर मंच को केंद्रित करें। "एटलस" प्रीसेट का उपयोग करके पूर्वावलोकन एकत्र करें। "तैयारी" टैब से सभी "प्रीसेट" सेट करें। इसके बाद, अवलोकन के लिए आवर्धन बढ़ाएं > केंद्र सुविधा > पूर्वावलोकन करें, फिर "खोज आवर्धन" दोहराएं और अंत में, एक्सपोजर आवर्धन "।
    2. यदि सुविधा लक्ष्यीकरण के दौरान केंद्रित रही, तो छवि शिफ्ट अंशांकन छोड़ दें। अन्यथा, छवि शिफ्ट को कैलिब्रेट करने के लिए, "तैयारी" टैब पर जाएं, कैलिब्रेट इमेज शिफ्ट का चयन करें, और स्टार्ट (चित्रा 5) दबाएं। यह एक्सपोजर आवर्धन पर केंद्रित सुविधा के लिए कम आवर्धन को पुनरावृत्त रूप से संरेखित करेगा।
      नोट: यदि प्रारंभिक पूर्व निर्धारित "एक्सपोज़र" इस स्तर पर केंद्रित नहीं है, तो पुन: लेखन के लिए, सॉफ़्टवेयर केवल इस चरण के लिए चरण शिफ्ट का उपयोग करेगा।
      1. "एक्सपोज़र" प्रीसेट के लिए आगे बढ़ें दबाएं। दिखाई गई अगली छवि "खोज प्रीसेट" होगी। प्रीसेट के बीच छवि शिफ्ट को कैलिब्रेट करने के लिए, "खोज" पूर्वावलोकन में डबल बाएं क्लिक करें जहां "एक्सपोजर" पूर्वावलोकन का केंद्र है, फिर पुन: अधिग्रहण (चित्रा 5) दबाएं। प्रीसेट की अगली जोड़ी पर जाने के लिए आगे बढ़ें पर क्लिक करें।
        नोट: यदि एटलस आवर्धन पर एक छवि शिफ्ट इस अंशांकन के दौरान लागू किया गया था, तो छवि शिफ्ट अंशांकन पूरा होने के बाद एटलस को फिर से प्राप्त करना सुनिश्चित करें। वांछित एटलस का चयन करें और "एटलस" टैब में शीर्ष पैनल में चयनित रीसेट दबाएं। पुष्टि करें और उस एटलस को फिर से प्राप्त करना शुरू करें।
  5. टोमोग्राफी सेटअप करें।
    1. "टोमोग्राफी" टैब में टोमोग्राफी डेटा संग्रह सेटअप बनाएं।
      नोट: जब तक विशेष रूप से नहीं कहा जाता है, सेटअप पूरी तरह से "टोमोग्राफी" टैब में किया जाता है।
    2. एक नया सत्र शुरू करें। जैविक नमूनों के लिए "सत्र सेटअप" में, नमूना प्रकार के रूप में स्लैब-जैसे चुनें और बैच और कम खुराक का चयन करें, आउटपुट प्रारूप और भंडारण फ़ोल्डर का चयन करें, वैकल्पिक रूप से एक ईमेल प्राप्तकर्ता जोड़ें, और फिर लागू करें दबाएं।
      नोट: एक "बैच स्थिति" मेनू आइटम अब उपलब्ध हो जाता है (चित्रा 7 ए)। वर्तमान में लोड किए गए एटलस स्वचालित रूप से आयात हो जाते हैं। "अवलोकन" और "खोज छवियों" को अधिग्रहित किया जा सकता है और एक नई छवि प्राप्त होने तक फिर से देखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, संस्करण 5.8 से, लक्ष्य खोज और सेटअप को आसान बनाने के लिए "खोज मानचित्र प्राप्त करें" के साथ 3 x 3, 4 x 4 और 5 x 5 टाइल्स के खोज मानचित्र प्राप्त किए जा सकते हैं। वे मध्यम आवर्धन असेंबल के एक संस्करण के अनुरूप हैं।
    3. लक्ष्य सेट अप करने के लिए, "एटलस तीर" पर जाएं, रुचि का एक क्षेत्र ढूंढें, और सही माउस क्लिक के साथ पॉप अप करने वाले विकल्पों का चयन करके वहां जाएं। यूसेंट्रिक ऊंचाई समायोजन के लिए एक अच्छी स्थिति की पुष्टि करने के लिए एक अवलोकन छवि लें, फिर ऑटो यूसेंट्रिक पर दबाएं; यह स्टेज झुकाव दिनचर्या द्वारा यूसेंट्रिक चलाएगा। फिर, यूसेंट्रिक ऊंचाई को अपडेट करने के लिए एक नई अवलोकन छवि को फिर से प्राप्त करें।
      नोट: "ऑटो फोकस" बटन आवश्यक नहीं होना चाहिए यदि स्थिति यूसेंट्रिक ऊंचाई पर है। यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई छवि फोकस से बहुत दूर दिखाई देती है, तो यूसेंट्रिक ऊंचाई शायद सही नहीं है और इसे फिर से करना होगा (यूसेंट्रिक ऊंचाई समस्या निवारण के लिए, चर्चा अनुभाग देखें)।
    4. पहली स्थिति स्थापित करने से पहले "अवलोकन" प्रीसेट का उपयोग करके लक्ष्य की जांच करें; "अवलोकन" पूर्व निर्धारित का चयन करें और ग्रिड सलाखों से किस दूरी पदों (चित्रा 8) स्थापित किया जा सकता है की जाँच करने के लिए ±60 ° करने के लिए मंच झुकाव। "सेट झुकाव" विंडो (चित्रा 8 ए) में वांछित झुकाव कोण मान दर्ज करके ऐसा करें।
    5. वर्ग "अवलोकन" या अधिग्रहीत "खोज मानचित्र" का निरीक्षण करें, रुचि के क्षेत्र में जाएं, और खोज प्राप्त करें दबाएं। "खोज" छवि का निरीक्षण करें। यदि ब्याज का क्षेत्र केंद्रित नहीं है, तो वांछित स्थिति पर राइट-क्लिक करें और फिर चरण यहाँ ले जाएँ और छवि प्राप्त करें दोहराएँ। टोमोग्राम के शुरुआती कोण को परिभाषित करने के लिए झुकाव (°) को 0.00 (या कोई अन्य प्रारंभिक कोण जिसे चरण संभाल सकता है) पर सेट करें।
      1. पहले टोमोग्राम के लिए, प्रत्येक टोमोग्राम के लिए वांछित डिफोकस मान सेट करने के लिए वांछित टोमोग्राम नामकरण सम्मेलन और डिफोकस के लिए नाम दर्ज करें।
      2. वैकल्पिक रूप से, टोमो संस्करण 5.8 से, डिफोकस मानों को व्यवस्थित रूप से एक बार में बदला जा सकता है; उसके लिए, पदों का चयन करें पर क्लिक करें, बदलने के लिए पदों का चयन करें या सभी पदों का चयन करने के लिए चेकमार्क पर टिक करें, और फिर अपडेट डिफोकस पर क्लिक करें और पैरामीटर (चित्रा 7 ए) समायोजित करें।
    6. "फोकस" और "ट्रैकिंग" क्षेत्र (चित्रा 2 सी) समायोजित करें। ट्रैकिंग और फ़ोकस क्षेत्रों (पीले और नीले हलकों) को खींचने के लिए बाएँ-क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि ट्रैकिंग/फोकस क्षेत्र (ज्यादातर) कार्बन या किसी अन्य उपयुक्त ट्रैकिंग सुविधा पर है, अर्थात, ब्याज के क्षेत्र के समान विशेषता; दरारें, बर्फ संदूषण, अत्यधिक मोटे क्षेत्रों और खाली छेद से बचें।
      1. कई ट्रैकिंग सुविधाओं के बिना खाली कार्बन चुनते समय, सुनिश्चित करें कि क्षेत्र फोकस के लिए एक उच्च पर्याप्त खुराक चुनकर टोमोग्राम के माध्यम से आधे रास्ते में जलना शुरू कर देता है, और धीरे-धीरे उच्च झुकाव पर नमूने को जलाने के लिए ट्रैकिंग करता है। यह ट्रैकिंग सटीकता को बनाए रखने के लिए फायदेमंद हो सकता है। सुनिश्चित करें कि ट्रैकिंग/फोकस क्षेत्र बाद के अधिग्रहण क्षेत्र को उजागर नहीं करता है।
        नोट: क्या करीब है और बीम में क्या आएगा, इस बारे में सतर्क रहें। उन सुविधाओं वाले क्षेत्रों से बचें जो ग्रिड बार सहित ट्रैकिंग और / या एक्सपोजर के साथ हस्तक्षेप करेंगे।
    7. सभी पैरामीटर सेट होने के बाद स्थिति जोड़ें दबाएं और ब्याज के वांछित क्षेत्र और "फोकस" और "ट्रैकिंग" परिभाषित किए गए हैं। नए लक्ष्यों के लिए दोहराएं।
      नोट: यूसेंट्रिक ऊंचाई की जाँच करने के लिए बैच पदों के लिए सही ढंग से कैलिब्रेटेड है जो स्थापित किया गया है, वहाँ कई उपलब्ध रणनीतियाँ हैं। प्रदर्शन किए गए टोमोग्राफी सत्र (आणविक, सेलुलर, लैमेला) के प्रकार के आधार पर एक चुनने की सिफारिश की जाती है।
    8. आणविक टोमोग्राफी के लिए, यह मानते हुए कि ग्रिड काफी सपाट हैं और लक्ष्य पदों वाले प्रत्येक वर्ग के केंद्र में यूसेंट्रिक ऊंचाई की गई है, "रिफाइन ऑल" (या परिष्कृत चयनित यदि पदों का चयन किया गया है, तो चित्रा 7 ए) प्रक्रिया को छोड़ दें। यदि टोमो स्टेज झुकाव दिनचर्या द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक के साथ संघर्ष करता है, तो संभवतः स्किप यूसेंट्रिक पर क्लिक करें।
      1. सेलुलर या लैमेला नमूनों के लिए, प्रत्येक बैच की स्थिति एक अलग जेड-ऊंचाई पर हो सकती है। सतर्क रहने के लिए या तो "सभी को परिष्कृत करें" का उपयोग करें या "स्किप यूसेंट्रिक" विकल्प पर टिक न करें।
        नोट: "सभी परिष्कृत करें" उन सभी टोमोग्राम के माध्यम से पुनरावृत्ति करेगा जिन्हें "पदों का चयन करें" के माध्यम से स्थापित या चयनित किया गया है; यूसेंट्रिक ऊंचाई को परिष्कृत करें और डेटा अधिग्रहण से पहले ट्रैकिंग और फोकस करें। यह प्रक्रिया अगले टोमोग्राम फोकस/ट्रैकिंग क्षेत्र (चित्रा 7 बी) से किसी भी अतिव्यापी जोखिम को उजागर कर सकती है, जिसे आगे बढ़ने से पहले माना जाना चाहिए।
      2. उन वर्गों की जाँच करें और फिर से देखें जो शोधन में विफल रहे हैं। सही माउस बटन के साथ, विकल्प देखने के लिए असफल स्थिति पर क्लिक करें। यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई विफल हो जाती है, तो "चरण-झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक" (चरण 1.4.1.) ढूंढें, जेड-ऊंचाई को अपडेट करने के लिए एक नई "खोज" छवि प्राप्त करें, और "स्थिति जोड़ें"। विफल/पहले प्रारंभ की गई स्थिति हटाएँ। स्किप यूसेंट्रिक विकल्प पर क्लिक करें, जिसे "सभी को परिष्कृत करें" के साथ किया गया है।
        नोट: यदि "सभी परिष्कृत करें" नहीं चलाया जाता है, तो "छोड़ें यूसेंट्रिक" की जाँच नहीं की जानी चाहिए। प्रत्येक टोमोग्राम का अधिग्रहण करने से पहले टोमो 5 यूसेंट्रिक शोधन चलाएगा; इस तरह, यूसेंट्रिक शोधन में विफल रहने वाले पदों को छोड़ दिया जाएगा।
  6. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ऑटो फ़ंक्शन करें।
    1. कार्बन के क्षेत्र में एटलस में नेविगेट करके "ऑटो फ़ंक्शंस" टैब के माध्यम से संरेखण करने के लिए सेटिंग्स की जांच करें। उस क्षेत्र को यूसेंट्रिक ऊंचाई पर लाएं और नीचे बताए गए संरेखण के क्रम का पालन करें।
      1. " यूसेंट्रिक ऊंचाई" प्रीसेट के साथ स्टेज झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक चलाएं।
      2. "फोकस" प्रीसेट के साथ ऑटोफोकस रूटीन चलाएं।
      3. "थॉन रिंग" प्रीसेट के साथ ऑटोस्टिगमेट रूटीन चलाएं।
      4. "थॉन रिंग" प्रीसेट के साथ ऑटोकोमा रूटीन चलाएं।
      5. वांछित उद्देश्य एपर्चर (चित्रा 6 बी), संभवतः 100 μm एपर्चर डालें, नमूना विपरीत वृद्धि के लिए एक अच्छा समझौता के रूप में और बहुत उच्च रिज़ॉल्यूशन पर सिग्नल में केवल एक छोटा कट-ऑफ।
      6. एपर्चर सम्मिलन के बाद ऑटोस्टिगमेट दिनचर्या को दोहराएं।
        नोट: 3 ए और कम रिज़ॉल्यूशन के आसपास पिक्सेल आकार के साथ आवर्धन पर, ऑटोकोमा रूटीन विफल हो सकता है; इस स्थिति में, टीईएम उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में प्रत्यक्ष संरेखण के तहत टोमो रोटेशन केंद्र की जाँच करें और संरेखित करें।
    2. अपने नमूने पर ऑटो शून्य-हानि केंद्रित दिनचर्या कार्यों की जाँच करें। यथोचित उच्च खुराक (चरण 1.2.3) पर "शून्य हानि" प्रीसेट के साथ, ऑटो फ़ंक्शंस में दिनचर्या अधिक सफल होने की संभावना होगी।
  7. डेटा संग्रह करें।
    1. "टोमोग्राफी" टैब में स्वचालित अधिग्रहण शुरू करने के लिए, डेटा अधिग्रहण स्लैब-आउट का चयन करें और वांछित पैरामीटर (चित्रा 7 सी) सेट करें। डेटा अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें: झुकाव चरण (°), अधिकतम सकारात्मक कोण (°), अधिकतम नकारात्मक कोण (°), ट्रैकिंग योजना (अनुशंसित: अधिग्रहण से पहले ट्रैक / यूसेंट्रिक ऊंचाई योजना के लिए कॉलम वाल्व बंद करें का चयन करें।
      नोट: शायद ही कभी इस्तेमाल किए जाने वाले पैरामीटर "एक्सपोजर समय समायोजित करें", "जेडएलपी समायोजित करें", "चरण प्लेट का उपयोग करें", और "झुकाव के बाद रोकें" हैं।
      1. टोमोग्राम के लिए समायोजित एक्सपोज़र समय का उपयोग करें जो एसटीए के लिए उच्च झुकाव पर निर्दिष्ट अनुपात में एक्सपोज़र समय बढ़ाने के लिए अभिप्रेत नहीं हैं।
      2. समायोजित जेडएलपी विकल्प प्रत्येक टोमोग्राम के बाद एक जेडएलपी शोधन चलाएगा, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि आवधिकता सेट है। यह धीमा है, कभी-कभी स्पष्ट कारणों के बिना विफल रहता है, और उस स्थिति अधिग्रहण को छोड़ देगा। हालांकि, यह बहुत संकीर्ण भट्ठा चौड़ाई के लिए उपयोगी हो सकता है, अर्थात्, सेलेक्ट्रिस (एक्स) फिल्टर पर 3-5 ईवी।
      3. ऊर्जा फिल्टर के साथ डीईडी की शुरूआत के बाद से चरण प्लेट का उपयोग शायद ही कभी किया जाता है।
      4. झुकाव के बाद रोकें अधिग्रहण को रोकता है लेकिन सॉफ़्टवेयर में किसी भी बदलाव की अनुमति नहीं देता है।
    2. डेटा संग्रह मापदंडों ("तैयारी" टैब में) की दोबारा जांच करें, खुराक गणना और वांछित झुकाव योजना से सहमत हों, "एक्सपोजर" प्रीसेट में अंशों (एनआर) की संख्या निर्दिष्ट करें, और फिर अधिग्रहण शुरू करें।
      नोट: अंशों की संख्या नमूना, अधिग्रहण मापदंडों और नियोजित पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों पर निर्भर करती है, यानी, एसटीए बनाम रूपात्मक विश्लेषण, और उन मूल्यों पर रखा जाना चाहिए जहां गति सुधार और सीटीएफ अनुमान पर्याप्त संकेत प्राप्त करते हैं। 4-10 अंशों की एक सीमा एक अच्छा अनुमान है, जहां 4 मोटे नमूनों के लिए अधिक उपयुक्त है और पतले आणविक नमूनों के लिए 10 है।
      1. फिर, डेटा संग्रह शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें और यह सुनिश्चित करने के लिए पहले टोमोग्राम अधिग्रहण की निगरानी करें कि टोमोग्राम को इरादे के अनुसार अधिग्रहित किया गया है।
        नोट: हाल के टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर संस्करणों में "टोमोग्राफी" टैब में एक अतिरिक्त मूवी प्लेयर स्लैब-आउट है जहां अधिग्रहित टोमोग्राम को देखा जा सकता है। लोडिंग प्रक्रिया के दौरान धैर्य रखें।

2. एपोफेरिटिन का क्रायो-ईटी एसटीए ईएमक्लैरिटी का उपयोग कर

नोट: यहाँ, emClarity सॉफ्टवेयर17 का उपयोग एसटीए द्वारा क्रायो-ईटी संरचना निर्धारण को चित्रित करने के लिए किया जाता है। एपोफेरिटिन (ईएमपीआईएआर -10787) की छह झुकाव श्रृंखला को एक उदाहरण के रूप में लिया गया था। ऑक्टाहेड्रल समरूपता लागू की गई थी, और अंतिम मानचित्र में 2.86 ए का रिज़ॉल्यूशन था, जो केवल 4,800 कणों से प्राप्त हुआ था और नाइक्विस्ट आवृत्ति (2.68 ए) के करीब था।

  1. सुनिश्चित करें कि emClarity सॉफ़्टवेयर पैकेज39 डाउनलोड और स्थापित किया गया है ( सामग्री की तालिका देखें)। सॉफ्टवेयर प्रसंस्करण40 के लिए आईएमओडी स्थापित करें।
    नोट: लिनक्स कमांड का बुनियादी ज्ञान आवश्यक है। एक अधिक विस्तृत ट्यूटोरियल संदर्भ41 में पाया जा सकता है, जो एक उदाहरण के रूप में राइबोसोम डेटासेट (ईएमपीआईएआर -10304) लेता है और चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। विभिन्न प्रकार के प्रोटीन नमूनों के लिए, पहले प्रकाशित एक रिपोर्ट भी उपलब्ध है।
  2. इनपुट फ़ाइलें और निर्देशिकाएँ तैयार करें।
    नोट: कच्चे फ्रेम मोशनकोर 2 (पैच 5 x 5)43 ( सामग्री की तालिका देखें) द्वारा गति-सही किए गए थे। गति-सुधारित छवियों को न्यूज़टैक (आईएमओडी) का उपयोग करके झुकाव-श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए स्टैक किया गया था और मैन्युअल रूप से एटोमो का उपयोग करके पैच ट्रैकिंग के साथ गठबंधन किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें), इसके बाद ईएमक्लैरिटी। बेहतर संरेखण प्राप्त करने के लिए, एटोमो में ऑफसेट और झुकाव मुआवजा करने की सिफारिश की जाती है। छह झुकाव श्रृंखला का नाम बदलकर टीएस 1 से टीएस 6 कर दिया गया है। नीचे एक उदाहरण के रूप में पहली झुकाव श्रृंखला (टीएस 1) के लिए निर्देश और आदेश दिए गए हैं।
    1. कोई प्रोजेक्ट फ़ोल्डर स्थापित करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर का नवीनतम संस्करण 1.5.3.11 है। सभी संबंधित सॉफ़्टवेयर लॉग स्थानीय प्रोजेक्ट फ़ोल्डर (.../लॉगफ़ाइल/emClarity.logfile) में पाए जा सकते हैं।
    2. प्रोजेक्ट फ़ोल्डर के तहत, एक और नया फ़ोल्डर बनाएं, "फिक्स्डस्टैक्स", और इनपुट फ़ाइलें तैयार करें: TS1.फिक्स्ड, TS1.xf, और TS1.tlt।
      नोट: TS1.फिक्स्ड: मूल झुकाव-श्रृंखला, जिसे एटोमो में TS1.st के रूप में भी जाना जाता है। TS1.xf: इस फ़ाइल में एटोमो टिल्टलिग्न के बाद परिवर्तन निर्देशांक शामिल हैं। TS1.tlt: इस फ़ाइल में झुकाव-कोण होते हैं।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए डिफोकस का अनुमान लगाएं।
    1. डिफोकस की गणना करें। पूरक तालिका 1 के बाद माइक्रोस्कोप और इमेजिंग मापदंडों के साथ पैरामीटर फ़ाइल का अद्यतन करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में पैरामीटर फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएँ, इसका नाम param_ctf में बदलें, और चलाएँ: emClarity ctf अनुमान param_ctf.m TS1।
      नोट: पैरामीटर फ़ाइल टेम्पलेट पूरक फ़ाइल 1 या स्थानीय सॉफ़्टवेयर स्थापना निर्देशिका (.../emClarity_1.5.3.11/दस्तावेज़/उदाहरण पैरामीटर और रनस्क्रिप्ट/) में पाया जा सकता है।
  4. प्रत्येक स्टैक के लिए सीटीएफ अनुमान परिणामों की जाँच करें।
    1. 3dmod का उपयोग करके संरेखित ढेर (उदाहरण के लिए, aliStacks/TS1_ali1.फिक्स्ड) की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि फिड्यूशियल मोतियों को सही ढंग से मिटा दिया गया है।
    2. सुनिश्चित करें कि लॉगफ़ाइल रिपोर्ट करता है कि हैंडनेस सही है, जिसे लॉगफ़ाइल/emClarity.logfile (चित्रा 9) में पाया जा सकता है।
    3. डिफोकस मान की जांच करें (उदाहरण के लिए, फिक्स्डस्टैक्स / सीटीएफ / TS_ali1_psRadial_1.pdf), और सुनिश्चित करें कि यह सैद्धांतिक सीटीएफ अनुमान से मेल खाता है।
  5. उप-क्षेत्रों को परिभाषित करें।
    1. एक बिन किए गए टोमोग्राम उत्पन्न करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: श recScript2.sh -1।
      नोट: प्रत्येक स्टैक के लिए एक छोटा (आकार में) टोमोग्राम एक नए फ़ोल्डर "बिन 10" में संग्रहीत किया जाएगा। प्रक्रिया को गति देने के लिए, एक या कई उप-क्षेत्रों के निर्देशांक को बिन 10 टोमोग्राम में परिभाषित किया जा सकता है। स्क्रिप्ट फ़ाइल स्थानीय सॉफ़्टवेयर स्थापना निर्देशिका (.../emClarity_1.5.3.11/दस्तावेज़/) में होगी।
    2. एक उप-क्षेत्र बनाने के लिए छह अंक, एक्समिनट, एक्सअधिकतम, वाईमिनट, वाईअधिकतम, जेडमिनट और जेडअधिकतम चुनकर सीमाओं का निर्धारण करें। फ़ोल्डर "बिन 10" के तहत, चलाएँ: 3dmod TS1_bin10.rec।
      नोट: यदि एक झुकाव-श्रृंखला में चार उप-क्षेत्र बनाए जाने हैं, तो 6 × 4 = 24 अंक चुनें। प्रत्येक स्टैक फ़ोल्डर "bin10" के तहत एक मॉडल फ़ाइल (*.mod) होना चाहिए।
    3. मॉडल फ़ाइलों को ईएमक्लैरिटी प्रारूप में कनवर्ट करें। यह एक नया फ़ोल्डर टोही बनाएगा। इस फ़ोल्डर के अंतर्गत प्रत्येक उप-क्षेत्र के सभी निर्देशांक संग्रहीत करें. प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: श recScript2.sh TS1।
  6. कणों उठाओ.
    1. कणों को चुनने के लिए एक एपोफेरिटिन टेम्पलेट ढूंढें। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा बैंक (ईएमडी -10101)44 से एक टेम्पलेट डाउनलोड करें। सुनिश्चित करें कि टेम्पलेट का पिक्सेल आकार कच्चे डेटा से मेल खाता है। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarity रीस्केल एपीओएफ.एमआरसी ApoF_Template_rescale.एमआरसी 3.60 1.34 सीपीयू।
    2. कण पिकिंग के लिए सीटीएफ-सही टोमोग्राम उत्पन्न करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emclarity ctf 3d param_ts.m टेम्पलेट खोज।
    3. प्रत्येक उप-क्षेत्र के लिए कण उठाओ। एपोफेरिटिन डेटासेट के लिए, बिन 6 पर एक टेम्पलेट खोज करें। डिग्रीमें इन-प्लेन याआउट-ऑफ-प्लेन खोज के लिए कोण सीमा और अंतराल निर्धारित करने के लिए Tmp_angleSearch पैरामीटर (θ आउट, Δ आउट, θ इन, Δ इन) को संशोधित करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emclarity टेम्पलेट खोज param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      नोट:: इस चरण में एक फ़ोल्डर "convmap_wedge_Type2_bin6" जनरेट किया जाएगा। इस फ़ोल्डर के तहत सीएसवी फ़ाइल (उदाहरण के लिए, TS1_1_bin6.csv) में उठाए गए कणों के बारे में सभी जानकारी शामिल है।
    4. 3dmod का उपयोग कर गलत कणों को निकालें। फ़ोल्डर "convmap_wedge_Type2_bin6" के तहत, चलाएँ: 3dmod .. /कैश/TS1_1_bin6.आरईसी TS1_1_bin6.मॉड।
      नोट: उन क्षेत्रों में कार्बन किनारों या बर्फ संदूषण के बगल में गलत कणों को ढूंढना आम है। गलत बिंदुओं पर एक सही माउस क्लिक करें और उन्हें हटाने के लिए कीबोर्ड पर बैकस्पेस दबाएं। इस चरण में, सुनिश्चित करें कि अधिकांश झूठे सकारात्मक बिंदु हटा दिए गए हैं (चित्रा 10)।
    5. फ़ोल्डर का नाम "convmap_wedge_Type2_bin6" को "कन्वमैप" में बदलें, क्योंकि emClarity जाएगा और निम्न चरणों में कॉन्वमैप के तहत उप-क्षेत्र जानकारी ढूंढेगा।
  7. प्रोजेक्ट प्रारंभ करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarity परम0.m में ईएमक्लैरिटी, एपीओएफ.मैट के लिए डेटाबेस बनाने के लिए।
  8. एसटीए और संरेखण से पहले टोमोग्राम पुनर्निर्माण करें। बिन 4 पर सीटीएफ-सही उप-क्षेत्र टोमोग्राम उत्पन्न करने के लिए, चलाएं: ईएमक्लैरिटी सीटीएफ 3 डी पैराम0.एम।
    नोट: सीटीएफ-सही टोमोग्राम (उदाहरण के लिए, कैश/TS1_1_bin4.आरईसी)  एक नए फ़ोल्डर "कैश" में उत्पन्न किया जाएगा।
  9. एसटीए और संरेखण करें।
    1. बिन 4 से शुरू होने वाले सीटीएफ-सही उप-टोमोग्राम का उपयोग करके औसतन पूरा करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarity औसत परम0.m 0 रॉअलाइनमेंट।
    2. संरेखण करना और चलाना जारी रखें: ईएमक्लारिटी संरेखितरॉ पैराम0.एम 0।
      नोट: औसत चरण एक संदर्भ उत्पन्न करता है, जिसका उपयोग कणों को संरेखित करने के लिए इस चरण में ईएमक्लैरिटी द्वारा किया जाएगा। प्रत्येक चक्र के लिए कोण सीमा और चरण आकार निर्धारित करने के लिए Raw_angleSearch पैरामीटर (θआउट, Δआउट, δइन, Δइन) को बदला जा सकता है। चूंकि अधिकांश गलत कणडेटाबेस (चरण 2.6.4) से हटा दिए जाते हैं, संरेखण के लिए ये कोणीय सेटिंग्स अपेक्षाकृत कम डिग्री से शुरू हो सकती हैं।
    3. Raw_angleSearch पैरामीटर अद्यतन करें और कुछ और चक्र चलाएँ (चरण 2.9.1 और 2.9.2)। प्रक्रिया को गति देने के लिए, इन-प्लेन और आउट-ऑफ-प्लेन संरेखण अलग-अलग करें।
      नोट: प्रत्येक बिनिंग के लिए, कई चक्र चलाने और धीरे-धीरे कोणीय सेटिंग्स को कम करने की सिफारिश की जाती है। एपीओएफ डेटासेट के लिए, बिन 4 पर पांच और चक्र किए गए थे, और आगे का विवरण पूरक तालिका 2 में उपलब्ध है। चक्र001 के लिए, प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarity औसत परम1.m 1 रॉअलाइनमेंट, इसके बाद emक्लारिटी संरेखितRaw पैरा1.m 1.
    4. ओवरलैप किए गए कणों को साफ करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emक्लारिटी निकालेंडुप्लिकेट्स परम5.m 5।
  10. टोमोसीपीआर के साथ झुकाव-श्रृंखला शोधन करें।
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है।
    1. स्टैक ज्यामिति को परिष्कृत करने के लिए टोमोसीपीआर चलाएं। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarITY तोmoCPPR परम5.m 5.
    2. नए संरेखित स्टैक उत्पन्न करें और ज्यामिति फ़ाइलों को अपडेट करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emक्लारिटी ctf अद्यतन परम6.m।
      नोट: सुनिश्चित करें कि नई ज्यामिति फ़ाइलें (उदाहरण के लिए, फिक्स्डस्टैक्स/सीटीएफ/TS1_ali2_ctf.टीएलटी) और नए संरेखित स्टैक (उदाहरण के लिए, aliStacks/TS1_ali2.फिक्स्ड) सही ढंग से उत्पन्न होते हैं।
    3. बिन 2 पर नए उप-टोमोग्राम बनाएं। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarity ctf 3d परम6.m.
      नोट: इसके बाद बिन 2 (चरण 2.9.1, 2.9.2, और 2.9.3), डुप्लिकेट सफाई (चरण 2.9.4), और वैकल्पिक टोमोसीपीआर (चरण 2.10) पर औसत और संरेखण के लिए कुछ चक्र होंगे। उच्च समरूपता के कारण, बिन 2 में एक और पांच चक्र एपोफेरिटिन के लिए किए गए थे। प्रत्येक चक्र के लिए Raw_angleSearch पैरामीटर अद्यतन करें।
  11. अंतिम पुनर्निर्माण करें।
    1. बिन 1 और टोमोसीपीआर (चरण 2.9 और चरण 2.10) पर कुछ चक्र चलाना जारी रखें। बिन 1 पर एक और 10 और चक्र एपोफेरिटिन डेटासेट के लिए किए गए थे। आदेशों और मापदंडों के बारे में अधिक जानकारी तालिका 2 में पाई जा सकती है।
    2. दो आधे डेटासेट के संयोजन से अंतिम पुनर्निर्माण करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में, चलाएँ: emClarity औसत परम 21.m 21 रॉअलाइनमेंट, इसके बाद emक्लारिटी औसत परम21.m 21 अंतिम संरेखण।
      नोट: अंतिम मानचित्र (उदाहरण के लिए, 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.एमआरसी के बी-कारक के साथ) उत्पन्न किया जाएगा, चित्रा 11।

Representative Results

सेलुलर और लैमेला नमूनों के लिए, डेटा संग्रह रणनीति काफी हद तक नमूना और इमेजिंग अध्ययन (चित्रा 1) के लक्ष्य पर निर्भर करती है। लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण इस बात पर निर्भर करता है कि आणविक लक्ष्य सीटू में है या आणविक लक्ष्यों वाले उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण नमूनों के लिए शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स से तैयार किया गया है। छेद (कार्बन) ग्रिड पर विट्रीफाइड शुद्ध परिसरों के लिए, लक्ष्यीकरण बस (कार्बन) समर्थन फिल्म के छेद में इमेजिंग पर आधारित हो सकता है। सीटू काम के लिए, लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण को सहसंबंधी डेटा या ज्ञात कम-आवर्धन सेलुलर स्थलों के आधार पर आणविक इकाई के स्थान के ज्ञान की आवश्यकता होती है। अवलोकन छवियों को लेते समय सेलुलर स्थलों को आदर्श रूप से पहचाना जा सकता है और, यदि ब्याज के क्षेत्रों को लगभग स्थानीयकृत करने के लिए पर्याप्त है, तो खोज छवि के साथ लक्ष्य पहचान की पुष्टि करने का एक त्वरित तरीका प्रदान कर सकता है। हालांकि, यदि अवलोकन योग्य घटनाएं दुर्लभ हैं, तो लक्ष्य को अर्हता प्राप्त करने के लिए मध्यम आवर्धन खोज छवियों की आवश्यकता हो सकती है। खोज मानचित्र खोज छवियों के मध्यम आवर्धन असेंबल हैं और इस प्रकार, लक्ष्य खोज को बहुत आसान बना सकते हैं, जहां उन्हें एक आवर्धन पर अधिग्रहित किया जा सकता है जिस पर ब्याज की विशेषता दिखाई देती है। खोज मानचित्रों को तब लक्ष्य बैच पदों को खोजने और सेट करने के लिए स्क्रीन किया जा सकता है। अल्ट्रास्ट्रक्चरल पुनर्निर्माण के लिए सेलुलर विशेषताओं वाले नमूनों के लिए, लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण समान है, हालांकि विभिन्न आवर्धनों पर सेलुलर घटना की दृश्यता और नमूने में इसकी व्यापकता पर समान रूप से निर्भर करता है।

डेटा अधिग्रहण रणनीति पर भी विचार किया जाना चाहिए; सभी मामलों में, अध्ययन का लक्ष्य काफी हद तक निर्धारित करता है कि डेटा कैसे एकत्र किया जाता है। सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के पुनर्निर्माण के लिए, एक कम आवर्धन (20-5 ए / पीएक्स) और देखने का बड़ा क्षेत्र उपयुक्त हो सकता है, लेकिन आणविक या उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवरण (5-1 ए / पीएक्स) के पुनर्निर्माण के लिए उच्च आवर्धन की आवश्यकता होती है। आदर्श परिस्थितियों में 1.5 ए / पीएक्स पर एकत्र किया गया डेटासेट केवल भौतिक रूप से 3.0 ए / पीएक्स की नाइक्विस्ट आवृत्ति पर पुनर्निर्माण का उत्पादन करने में सक्षम होगा; हालांकि, वास्तव में, कई कारक, जिनमें नमूना मोटाई, आकार और विषमता तक सीमित नहीं है, सभी प्राप्त पुनर्निर्माण गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं। सटीक इमेजिंग पैरामीटर पर्याप्त जानकारी रखने के लिए दृश्य के क्षेत्र के साथ अध्ययन के लक्ष्य के आधार पर आवर्धन को भी संतुलित करते हैं। यह लेख 2.86 ए तक पहुंचने वाला एक सबटोमोग्राम औसत मामला प्रस्तुत करता है, लेकिन विभिन्न परिणामों 17,42,45,46 को लक्षित करने वाले अध्ययनों से जुड़े संग्रह मापदंडों को चित्रित करने के लिए तालिका 1 में अतिरिक्त अध्ययन 17,42,44,45 प्रस्तुत किए गए हैं।

एक बार क्रायो-ईटी के लिए एक लक्ष्यीकरण वर्कफ़्लो और डेटा अधिग्रहण शासन स्थापित हो जाने के बाद, कई अलग-अलग नमूना प्रकारों का डेटा संग्रह संभव है। विभिन्न प्रकार के नमूनों के प्रतिनिधि टोमोग्राम यहां प्रस्तुत किए गए हैं: आणविक नमूने जैसे कि एपोफेरिटिन (मूवी 1), पतली सेलुलर प्रक्रियाएं (मूवी 2), और मोटी सेलुलर नमूने (मूवी 3) के एफआईबी मिल्ड लैमेला।

Figure 1
चित्रा 1: टोमोग्राफी वर्कफ़्लो सेटअप का अवलोकन। प्रोटोकॉल में वर्णित क्रायो-ईटी इमेजिंग वर्कफ़्लो को फ्लो चार्ट के रूप में दिखाया गया है। अधिग्रहित की जाने वाली छवियों को सेलुलर और आणविक वर्कफ़्लो के लिए दिखाया गया है। प्रस्तुत नामकरण टोमो 5 सम्मेलन का अनुसरण करता है, हालांकि अधिकांश टोमोग्राफी अधिग्रहण सॉफ्टवेयर इन छवियों को इकट्ठा करने के लिए सामान्य सिद्धांतों को साझा करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: तैयारी टैब और खोज पूर्व निर्धारित शर्तें. (ए) पूरे टैब की अवलोकन छवि। इमेजिंग स्थिति प्रीसेट इस टैब में सेट किए गए हैं, और "कैलिब्रेट इमेज शिफ्ट" और "इमेज फ़िल्टर सेटिंग्स" को "टास्क" ड्रॉप-डाउन में पाया जा सकता है। (बी) "प्रीसेट" ड्रॉप-डाउन का ज़ूम-इन जहां प्रत्येक प्रीसेट को व्यक्तिगत इमेजिंग स्थितियों सेटअप के लिए चुना जा सकता है। (सी) दृश्य के क्षेत्र में एक्सपोजर और "फोकस और ट्रैकिंग" क्षेत्र दोनों को फिट करने के लिए पर्याप्त आवर्धन को दर्शाती छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: खुराक गणना। संभावित टोमोग्राम अधिग्रहण योजनाओं के लिए उदाहरण खुराक गणना जहां खुराक दर को वैक्यूम पर मापा गया है। दो गणना प्रत्येक झुकाव के लिए एक्सपोजर समय (ओं) को निर्धारित करती है, चाहे झुकाव प्रति इष्टतम खुराक या पूर्ण झुकाव श्रृंखला के लिए इष्टतम कुल खुराक को लक्षित करना हो। सबटोमोग्राम औसत में, 3.0-3.5 ई-/ ए2 की सीमा में झुकी हुई छवि प्रति इष्टतम खुराक को लक्षित करना आम बात है। दोनों मामलों में, गति सुधार करने के लिए पर्याप्त संकेत के लिए झुकाव के फिल्म फ्रेम प्रति खुराक के ~ 0.5 ई-/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एटलस टैब। "एटलस" टैब की अवलोकन छवि। खाली ग्रिड स्थिति रिक्त स्थान से बचने के लिए छवि को क्रॉप किया गया है। "कार्य" मेनू में सभी ग्रिड के व्यक्तिगत चयन के लिए सत्र सेटअप प्राथमिकताएं और ग्रिड चयन रिक्त स्थान शामिल हैं और ऑटोलोडर से कैसेट को हटाए जाने के बाद एक एकल एटलस प्राप्त करने का विकल्प है। एक चयनित ग्रिड को रीसेट किया जा सकता है और फिर पुन: अधिग्रहित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: कैलिब्रेटेड छवि बदलाव। छवि एक एक्सपोजर और खोज छवि को दर्शाती है। खोज छवि में लाल क्रॉस एक्सपोज़र और खोज के बीच ऑफसेट को सही करने के लिए स्थानांतरित मार्कर है। सत्र शुरू होने पर या इमेजिंग स्थिति प्रीसेट बदलने के बाद छवि शिफ्ट अंशांकन को फिर से करना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: ऑटो फ़ंक्शंस और एपर्चर (ए) "ऑटो फ़ंक्शंस" टैब "प्रीसेट" ड्रॉप-डाउन और "टास्क" चयन को दर्शाता है। नीले रंग में रेखांकित "ऑटोस्टिगमेट" (नीले रंग में भी रेखांकित) और "ऑटोकोमा" के लिए आवश्यक "थॉन रिंग" प्रीसेट है। प्रत्येक कार्य के लिए संबंधित प्रीसेट का चयन करना चाहिए और फिर स्टार्ट बटन दबाना चाहिए। (बी) एपर्चर टीईएम यूजर इंटरफेस में पाए जाते हैं। ऑटो फ़ंक्शंस किए जाने के बाद वांछित "उद्देश्य एपर्चर" का चयन करें और एपर्चर के साथ "ऑटोस्टिगमेट" चलाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: टोमोग्राफी टैब अवलोकन। छवियां टोमो 5.8 उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस दिखाती हैं। (ए) बैच पदों। छवि में दर्शाए गए नवीनतम कार्य: "खोज मानचित्र प्राप्त करें" विकल्प; टोमोग्राम पदों को ज़ूम-इन विकल्प के साथ एटलस दृश्य में दिखाया गया है; शीर्ष दाईं ओर हाइलाइट किया गया "पदों का चयन करें" है; नीचे सभी चार पदों को "अपडेट डिफोकस" मापदंडों के लिए चुना गया है। (बी) खोज मानचित्र पर तीन पदों का चयन किया जाता है, 1, 2 और 3 लेबल किया जाता है। "सभी परिष्कृत करें" चलाए जाने पर स्थिति 1 कोई समस्या उत्पन्न नहीं करेगा। हालांकि, यदि उच्च लक्ष्य घनत्व सेटिंग में जैसे कि लैमेला पदों का चयन किया जाता है, जैसा कि स्थिति 2 और स्थिति 3 के लिए दर्शाया गया है, तो "रिफाइन ऑल" स्थिति 2 के "एक्सपोजर" क्षेत्र पर "ट्रैकिंग" और "फोकस" दिनचर्या चलाएगा, टोमोग्राम अधिग्रहित होने से पहले लक्ष्य को उजागर करेगा। ग्रिड प्रकार R1.2/ स्केल बार = 1.2 μm. (C) डेटा अधिग्रहण। "बैच पदों" में सेटअप चयनित पदों को अब व्यक्तिगत रूप से अधिग्रहित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: अधिकतम झुकाव कोण को परिभाषित करना। चित्रा टोमोग्राम अधिग्रहण के लिए अधिकतम झुकाव सीमा निर्धारित करने के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण को दर्शाता है। (ए) 0 ° अवलोकन और ग्रिड वर्ग के केंद्र में एक खोज मानचित्र। झुकाव सीमा का परीक्षण करने के लिए, वांछित मूल्य टाइप करके और फिर सेट दबाकर "सेट टिल्ट (°)" के साथ टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर में कोण सेट किया जा सकता है। (बी) चरण को -60 ° तक झुका दिया गया है, यह दर्शाता है कि खोज मानचित्र का एक कोना -60 ° पर पूरी तरह से अधिग्रहित नहीं किया जाएगा। (सी) चरण 60 ° तक झुका हुआ है। ±60 ° पर गायब हो गए छेदों की गिनती करके, कोई ग्रिड वर्ग की झुकाव सीमा के बारे में एक विचार प्राप्त कर सकता है। स्केल सलाखों = 2.5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: ईएमक्लैरिटी फ्लोचार्ट। फ्लोचार्ट ने क्रायो सब-टोमोग्राम औसत के लिए विभिन्न चरणों का वर्णन किया। स्केल सलाखों = 50 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: ईएमक्लैरिटी का उपयोग करके टेम्पलेट मिलान( ए) ग्राफीन-लेपित ग्रिड पर एपोफेरिटिन का एक विशिष्ट माइक्रोग्राफ। (बी) टेम्पलेट खोज के बाद मॉडल बिंदुओं के साथ मढ़ा टोमोग्राम का एक टुकड़ा। (सी) एक शीर्ष और (डी) मॉडल बिंदुओं का एक साइड प्रोजेक्शन दृश्य, मोनोडिस्पेरिटिन कणों की एक एकल सपाट परत का संकेत देता है। स्केल सलाखों = 50 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्रा 11: एपोफेरिटिन का क्रायो-ईटी एसटीए (ए) उप-टोमोग्राम संरेखण के 21 चक्रों के बाद अंतिम मानचित्र। (बी) अंतिम मानचित्र का फूरियर शेल सहसंबंध (एफएससी) प्लॉट 2.86 ए के रिपोर्ट किए गए रिज़ॉल्यूशन के साथ, जिसमें 38 शंकु एफएससी शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना क्रायो-ईटी प्रकार ए/ झुकाव रेंज (+/-) झुकाव कदम (°) डिफोकस रेंज (μm) कुल खुराक (ई-/ प्रस्ताव कच्चा डेटा संदर्भ
एपोफेरिटिन आणविक (एसटीए) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 ईएमपीआईएआर-10787 17 और यह पेपर
एचआईवी -1 गैग आणविक (एसटीए) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 ईएमपीआईएआर-10164 17
राइबोसोम आणविक (एसटीए) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 ईएमपीआईएआर-10304 42
सार्स-सीओवी-2 का स्पाइक लैमेला/आणविक (एसटीए) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 ईएमपीआईएआर-10753 45
न्यूरॉन अक्षतंतु संरचना सेलुलर (अल्ट्रास्ट्रक्चरल) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 एन.डी. ईएमपीआईएआर-10922 47

तालिका 1: कई क्रायो-ईटी अध्ययनों के लिए संग्रह पैरामीटर। अल्ट्रास्ट्रक्चरल सेलुलर विशेषताओं को हल करने और खंडित करने के उद्देश्य से एक अध्ययन की तुलना में शुद्ध या सीटू प्रोटीन से आणविक विस्तार के पुनर्निर्माण को लक्षित करने वाले अध्ययन।

मूवी 1: एक सामान्य ईएम ग्रिड पर एपोफेरिटिन नमूनों का एक टोमोग्राम और फिर एक संगत फिल्टर के साथ अल्ट्रा-हाई-रिज़ॉल्यूशन कैमरे से लैस क्रायो-टीईएम के साथ चित्रित किया गया। झुकाव श्रृंखला को एक खुराक-सममित योजना के साथ अधिग्रहित किया गया था, जिसमें 54 ° की झुकाव अवधि और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफीसॉफ्टवेयर में 134 ई-/ स्केल बार = 50 एनएम। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: एक ईएम ग्रिड पर उगाए गए प्राथमिक न्यूरॉन का एक टोमोग्राम और फिर सीधे एक संगत फिल्टर के साथ अल्ट्रा-हाई-रिज़ॉल्यूशन कैमरे से लैस क्रायो-टीईएम के साथ चित्रित किया गया। झुकाव श्रृंखला को एक खुराक-सममित योजना के साथ अधिग्रहित किया गया था, जिसमें 60 ° की झुकाव अवधि और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर में120 ई-/ स्केल बार = 100 एनएम। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 3: एक ईएम ग्रिड पर साइनोबैक्टीरिया का एक टोमोग्राम, एफआईबी मिलिंग के अधीन और फिर एक उच्च गति वाले कैमरे और एक संगत फिल्टर से लैस क्रायो-टीईएम के साथ चित्रित किया गया। झुकाव श्रृंखला को एक खुराक-सममित योजना के साथ अधिग्रहित किया गया था, जिसमें 50 ° की झुकाव अवधि और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर में120 ई-/ स्केल बार = 87.2 एनएम। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 1: डिफोकस का अनुमान लगाने के लिए पैरामीटर फ़ाइल टेम्पलेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: डेटा संग्रह और माइक्रोस्कोप सेटअप विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 2: निष्पादन के क्रम में आदेशों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

टोमो 5
टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर का वर्कफ़्लो विवरण (दूरस्थ) बैच टोमोग्राफी सत्र सेटअप के लिए एक संभावित और सबसे सुव्यवस्थित तरीके पर प्रकाश डालता है। जबकि सॉफ्टवेयर शुरुआती लोगों के लिए आसान है, कुछ प्रारंभिक क्रायो-ईएम अनुभव और बुनियादी टोमोग्राफी समझ सेटअप के साथ मदद कर सकती है। महत्वपूर्ण चरणों को प्रोटोकॉल में हाइलाइट किया गया है और समस्या निवारण में मदद करनी चाहिए, भले ही एक अलग सेटअप दृष्टिकोण का उपयोग किया गया हो। सॉफ्टवेयर की उन्नति (दूरस्थ) डेटा संग्रह को आसान बनाएगी और क्रायो-ईटी को व्यापक उपयोगकर्ता आधार के लिए अधिक सुलभ बनाएगी। कुछ युक्तियाँ और चालें जो आमतौर पर सामना की जाने वाली समस्याओं के निवारण में मदद कर सकती हैं, नीचे वर्णित हैं।

चर्चा करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु ग्रिड की पसंद है क्योंकि, नमूने को ±60 ° तक झुकाते समय, उच्च झुकाव पर ग्रिड बार दृश्य (चित्रा 8) को अस्पष्ट कर सकते हैं। एक टीईएम ग्रिड पर, जाल का आकार ग्रिड की प्रति यूनिट लंबाई ग्रिड वर्गों की संख्या को संदर्भित करता है। बड़ी जाल संख्याओं में प्रति यूनिट लंबाई में अधिक ग्रिड वर्ग होते हैं, ग्रिड वर्गों का उच्च घनत्व होता है, और छोटे ग्रिड वर्ग होते हैं, अर्थात, 400-मेष ग्रिड में 200-मेष ग्रिड की तुलना में छोटे वर्ग होते हैं। टोमोग्राफी के लिए ग्रिड का एक अच्छा विकल्प 200-मेष या 300-मेष ग्रिड है। जैसा कि चित्रा 8 में दिखाया गया है, ग्रिड झुका हुआ है के रूप में इकट्ठा करने के लिए उपलब्ध क्षेत्र कम हो जाता है। ±60 ° झुकाव पर, 300-मेष ग्रिड में देखने का एक छोटा सा क्षेत्र होगा जिस पर एक पूर्ण टोमोग्राम प्राप्त किया जा सकता है। 200-मेष ग्रिड के फायदे यह हैं कि बड़े ग्रिड वर्ग आणविक टोमोग्राफी सेटअप को तेजी से बनाते हैं, और बढ़े हुए ग्रिड-स्क्वायर क्षेत्र के साथ, एक वर्ग संभवतः रातोंरात संग्रह के लिए पर्याप्त होगा। नुकसान यह है कि 200-मेष ग्रिड अधिक नाजुक होते हैं, इसलिए हैंडलिंग और क्लिपिंग के लिए अधिक चालाकी की आवश्यकता होती है।

इसके अलावा, यदि ईएम ग्रिड पर होली सपोर्ट फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हुए, एक्सपोजर क्षेत्र के संबंध में फोकस और ट्रैकिंग क्षेत्र के सेटअप के लिए छेद रिक्ति पर विचार किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, वांछित आवर्धन पर बीम व्यास इष्टतम और तेज़ सेटअप के लिए झुकाव अक्ष के साथ एक्सपोजर क्षेत्र से सटे कार्बन क्षेत्र को कवर करने के लिए काफी छोटा होना चाहिए। इस तरह, प्रत्येक छेद में रुचि के संभावित क्षेत्रों का अधिग्रहण किया जा सकता है।

चूंकि सॉफ़्टवेयर की यूसेंट्रिक ऊंचाई दिनचर्या वर्तमान में उतनी मजबूत नहीं है, जैसे कि सीरियलईएम रूटीन, निम्नलिखित युक्तियां उस समस्या के आसपास काम कर सकती हैं। यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई निर्धारण यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट का उपयोग करने में विफल रहता है, तो कोई इसके बजाय अवलोकन प्रीसेट का उपयोग कर सकता है और "स्टेज झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक" को फिर से चला सकता है; यह मुद्दों को हल कर सकता है यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई 0 से बहुत दूर है। यदि यह सफल होता है, तो परिशुद्धता में सुधार के लिए "यूसेंट्रिक हाइट" प्रीसेट के साथ "स्टेज टिल्ट द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक" को फिर से चलाया जा सकता है। यदि यह विफल रहता है, तो कोई यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट के साथ "बीम झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक" चला सकता है और फिर "स्टेज झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक" को फिर से चला सकता है या मैन्युअल रूप से "स्टेज" सेटिंग्स के तहत टीईएम यूजर इंटरफेस में "ऑटो-यूसेंट्रिक बाय बीम टिल्ट" द्वारा समेकित जेड-ऊंचाई सेट कर सकता है। यदि छेद के दोहराए जाने वाले पैटर्न वाले ग्रिड का उपयोग किया जाता है, तो वे एक एकल क्रॉस-सहसंबंध शिखर की पहचान को रोक सकते हैं। छेद पैटर्न से क्रॉस-सहसंबंध को कम करने के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट को कम डिफोकस ऑफसेट जैसे -25 μm और / या कम एक्सपोज़र समय में बदलने की कोशिश कर सकते हैं। दूसरी ओर, लेसी ग्रिड / लैमेला का उपयोग करना एक मजबूत क्रॉस-सहसंबंध शिखर के लिए पर्याप्त संकेत प्रदान नहीं कर सकता है। क्रॉस-सहसंबंध शिखर को बढ़ाने के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट को अधिक डिफोकस ऑफसेट जैसे -75 μm और / या विस्तारित एक्सपोज़र समय में बदलने की कोशिश कर सकते हैं। एक अन्य विकल्प छवि फ़िल्टर सेटिंग्स को समायोजित करना है; वे "तैयारी" टैब में पाए जा सकते हैं। फ़िल्टर सेटिंग्स को समायोजित करने के विकल्प प्रत्येक पूर्व निर्धारित के लिए इष्टतम क्रॉस-सहसंबंध शिखर खोजने के लिए कम (अवलोकन / ग्रिडस्क्वायर), मध्यम (यूसेंट्रिक ऊंचाई), और उच्च आवर्धन (ट्रैकिंग / फोकस) के लिए सेट किए जा सकते हैं। आवश्यक इनपुट एक छवि है, अर्थात्, 0 ° पर और 5 ° पर एक, इसके बाद दोनों छवियों की तुलना करने के लिए तुलना करें पर क्लिक करें। सबसे लंबे तरंग दैर्ध्य के लिए अनुशंसित प्रारंभिक मूल्य छवि में स्केल बार का एक-चौथाई है और सबसे कम तरंग दैर्ध्य के लिए स्केल बार का एक-चालीसवां हिस्सा है। यदि चोटी को मजबूती से पहचाना नहीं जाता है, तो कोई भी सेटिंग्स को अनुकूलित कर सकता है जब तक कि एक ठोस चोटी नहीं मिल जाती। हर बार छवियों को फिर से प्राप्त करने की आवश्यकता नहीं है; बस "तुलना करें" दबाना पर्याप्त है। यदि टीओएमओ अभी भी स्वचालित रूप से यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने में विफल रहता है, तो मैनुअल यूसेंट्रिक ऊंचाई अंशांकन का उपयोग किया जा सकता है। किसी को "तैयारी" टैब में अवलोकन आवर्धन में यथोचित बड़े बर्फ क्रिस्टल पर केंद्रित होना चाहिए, फिर टीईएम यूजर इंटरफेस के "स्टेज कंट्रोल" पर जाना चाहिए, अल्फा को -30 ° पर सेट करना चाहिए, और फ्लोरोसेंट स्क्रीन छवि का उपयोग करके क्रिस्टल को फिर से केंद्रित करने के लिए चरण जेड-वैल्यू को समायोजित करना चाहिए। टीईएम यूजर इंटरफेस में "उच्च रिज़ॉल्यूशन" और "उच्च कंट्रास्ट" सेटिंग्स का चयन करना इसे सरल बना देगा (फ्लोरोसेंट स्क्रीन विंडो के नीचे बटन)। वैकल्पिक रूप से, यदि लाइव मोड के साथ कैमरे तक पहुंच है, तो इसका उपयोग यूसेंट्रिक ऊंचाई निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है; यह फ्लोरोसेंट स्क्रीन की तुलना में आसान होगा।

5.8 से पहले टोमो 5 संस्करणों में सबसे बड़ी सीमाएं लापता मध्यम आवर्धन असेंबल, लापता खुराक सममित योजना और यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने से संबंधित समस्याएं हैं। ये सीरियलईएम में मौजूद हैं, तेजी से विकास और सामुदायिक समर्थन के साथ एक फ्रीवेयर, एक मजबूत यूसेंट्रिक ऊंचाई दिनचर्या, और स्क्रिप्ट का विकल्प, यानी, एक कस्टम-निर्मित खुराक सममित योजना। टोमो 5 में संस्करण 5.8 के बाद से, यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने के लिए सबसे अधिक सामना की जाने वाली समस्या, यानी, लक्ष्य जेड-वैल्यू के चारों ओर एक असफल लूपिंग, एक यूसेंट्रिक ऊंचाई स्वीकृति मानदंड सेट करने के विकल्प को लागू करके हल किया गया है। हालांकि, विभिन्न ग्रिड और नमूना प्रकारों के साथ, व्यक्तिगत सत्रों की अद्वितीय इमेजिंग स्थितियों को प्रतिबिंबित करने के लिए छवि फ़िल्टर सेटिंग्स को समायोजित करने और यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने के लिए सर्वोत्तम संभव क्रॉस-सहसंबंध चोटी देने और टोमोग्राम अधिग्रहण के दौरान मज़बूती से काम करने के लिए फोकस और ट्रैकिंग क्षेत्र के लिए अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

कुल मिलाकर, कई सुविधाएं महामारी के दौरान रिमोट ऑपरेशन के लिए तेजी से अनुकूलित हुई हैं। टोमो 5 सॉफ्टवेयर टोमोग्राफी के लिए एक आसान पहुंच और उपयोगकर्ता के अनुकूल मार्ग प्रदान करता है जो रिमोट ऑपरेशन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। सॉफ़्टवेयर में की गई प्रगति निस्संदेह समुदाय में सामान्य रूप से दूरस्थ डेटा संग्रह और टोमोग्राफी संग्रह को अधिक मुख्यधारा बनाना जारी रखेगी।

स्पष्टता
चूंकि एमक्लैरिटी टेम्पलेट-आधारित कण पिकिंग विधि का उपयोग करता है, इसलिए इसे ब्याज की वस्तु के लिए एक टेम्पलेट की आवश्यकता होती है। कण उठा (चरण 2.6) बहुत संवेदनशील और अंतिम संरचना की कुंजी है। औसत और संरेखण (चरण 2.9) से पहले, किसी को ध्यान से जांचना और मैन्युअल रूप से झूठी सकारात्मकता को हटाना सुनिश्चित करना चाहिए। जब कोई टेम्पलेट उपलब्ध नहीं होता है, तो ईएमक्लैरिटी का उपयोग करना आसान नहीं हो सकता है, लेकिन प्रारंभिक मॉडल बनाने के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना संभव है, उदाहरण के लिए, डायनेमो37 और पीईईटी48।

विषम नमूनों के लिए, ईएमक्लैरिटी एक वर्गीकरण विधि से लैस है जो उपयोगकर्ताओं को विभिन्न पैमानों के साथ विशिष्ट सुविधाओं पर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम बनाता है। वर्गीकरण से पहले संरेखण के कुछ चक्रों को चलाना और इसे उच्च बिनिंग (जैसे बिन 4 या बिन 3) पर चलाना सहायक होता है।

सॉफ़्टवेयर के अप-टू-डेट संस्करण (V1.5.3.11) में पहले रिलीज़ (V1.0)17 की तुलना में महत्वपूर्ण अपडेट हैं। इनमें सीटीएफ अनुमान (चरण 2.3) के दौरान एक हैंडनेस चेक शामिल है, लेकिन इन तक सीमित नहीं है; संरेखण के लिए समरूपता (सीएक्स, आई, आई 2, ओ); प्रति-कण 3 डी नमूनाकरण कार्यों (3 डीएसएफ) की गणना; संगतता और स्थिरता के लिए मैटलैब 2019 ए पर स्विच; और कच्चे प्रक्षेपण छवियों (सीआईएसटीईएम) का उपयोग करके पुनर्निर्माण। सॉफ़्टवेयर विभिन्न नमूनों के लिए सुधार करना जारी रखेगा, और नवीनतम घोषणाएं ऑनलाइन पाई जा सकती हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम वेलकम ट्रस्ट, एमआरसी और बीबीआरएससी द्वारा वित्त पोषित यूके के राष्ट्रीय इलेक्ट्रॉन बायो-इमेजिंग सेंटर (ईबीआईसी) में क्रायो-ईएम सुविधाओं तक पहुंच और समर्थन के लिए डायमंड लाइट सोर्स को स्वीकार करते हैं। हम एपोफेरिटिन टोमोग्राम (मूवी 1) के अधिग्रहण के लिए एंड्रयू होवे, न्यूरॉन टोमोग्राम (मूवी 2) की तैयारी और अधिग्रहण के लिए इशिका कुमार और साइनोबैक्टीरिया लैमेला-टोमोग्राम (मूवी 3) के लिए क्रेग मैकग्रेगर-चैटविन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG - Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil - A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan -
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific -
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ - - Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ - - Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial - - Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software - - Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki - - Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity

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References

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जीव विज्ञान अंक 185
क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी रिमोट डेटा संग्रह और सबटोमोग्राम औसत
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Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J.,… More

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).

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