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Isolement et identification de bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/63934
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1, 1
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

Summary

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et l’identification de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir de l’eau et la caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques (ARG). L’utilisation de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique) fournit des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans les eaux douces de Mumbai, en Inde.

Abstract

Le développement et la propagation de la résistance aux antibiotiques (RA) par le microbiote associé aux masses d’eau douce est un problème de santé mondial majeur. Dans la présente étude, des échantillons d’eau douce ont été prélevés et analysés en fonction de la diversité bactérienne totale et des gènes AR (ARG) à l’aide de techniques conventionnelles basées sur la culture et d’une approche métagénomique indépendante de la culture à haut débit. Cet article présente un protocole systématique pour le dénombrement des bactéries cultivables totales et résistantes aux antibiotiques à partir d’échantillons d’eau douce et la détermination de la résistance phénotypique et génotypique dans les isolats cultivables. En outre, nous signalons l’utilisation de l’analyse métagénomique complète de l’ADN métagénomique total extrait de l’échantillon d’eau douce pour l’identification de la diversité bactérienne globale, y compris les bactéries non cultivables, et l’identification du pool total de différents ARG (résistome) dans le plan d’eau. En suivant ces protocoles détaillés, nous avons observé une charge bactérienne élevée résistante aux antibiotiques de l’ordre de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC / mL. La plupart des isolats étaient résistants aux multiples antibiotiques testés, y compris la céfotaxime, l’ampicilline, la lévofloxacine, le chloramphénicol, la ceftriaxone, la gentamicine, la néomycine, le triméthoprime et la ciprofloxacine, avec des indices de résistance multiple aux antibiotiques (PMA) de ≥0,2, indiquant des niveaux élevés de résistance dans les isolats. Le séquençage de l’ARNr 16S a identifié des agents pathogènes humains potentiels, tels que Klebsiella pneumoniae, et des bactéries opportunistes, telles que Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. et Aeromonas spp. La caractérisation moléculaire des isolats a montré la présence de divers ARG, tels que blaTEM, blaCTX-M (β-lactamines), aadA, aac (6')-Ib (aminoglycosides) et dfr1 (triméthoprimes), ce qui a également été confirmé par l’analyse de l’ADN métagénomique complet. Une prévalence élevée d’autres ARG codant pour les pompes à efflux d’antibiotiques - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, le gène de la chloramphénicol acétyltransférase catB10 et le gène de résistance à la rifampicine rphB - a également été détectée dans l’ADN métagénomique. À l’aide des protocoles discutés dans cette étude, nous avons confirmé la présence de bactéries MAR d’origine hydrique présentant divers traits phénotypiques et génotypiques de l’AR. Ainsi, l’analyse de l’ADN métagénomique entier peut être utilisée comme technique complémentaire aux techniques conventionnelles basées sur la culture pour déterminer l’état global de la RA d’un plan d’eau.

Introduction

La résistance aux antimicrobiens (RAM) a été identifiée comme l’un des problèmes mondiaux les plus urgents. L’évolution rapide de la RAM et sa propagation mondiale constituent l’une des plus grandes menaces pour la santé humaine et l’économie mondiale en termes de coûts sanitaires qui y sont associés1. La surutilisation et la mauvaise utilisation des antibiotiques ont entraîné une augmentation de l’AR. Cela a été mis en évidence par la pandémie de COVID-19, au cours de laquelle le traitement des infections secondaires associées, dans de nombreux cas, a été considérablement compromis en raison de la RAM chez les patients touchés2. Outre l’utilisation directe ou abusive d’antibiotiques par l’homme, la surutilisation et la mauvaise utilisation des antibiotiques dans l’agriculture et l’élevage et leur rejet inapproprié dans l’environnement, y compris les masses d’eau, constituent une préoccupation majeure3. L’augmentation de nouveaux caractères de résistance et de multirésistance chez les bactéries souligne de toute urgence la nécessité de mieux comprendre les facteurs conduisant au développement de l’AR et à sa dissémination. De multiples bactéries résistantes aux antibiotiques, qui portent souvent plusieurs gènes AR (ARG) sur des éléments génétiques mobiles tels que les plasmides, peuvent transférer ces gènes de résistance à des microorganismes non résistants, y compris des agents pathogènes humains potentiels, conduisant ainsi à l’émergence de superbactéries qui ne peuvent être traitées même avec des antibiotiques de dernier recours4. Ces multiples bactéries résistantes aux antibiotiques, si elles sont présentes dans les écosystèmes aquatiques, peuvent pénétrer directement dans l’intestin humain via la consommation d’aliments contaminés à base d’eau tels que le poisson, les crabes et les mollusques. Des études antérieures ont montré que la propagation des bactéries AR dans les systèmes d’eau naturels peut également atteindre d’autres sources d’approvisionnement en eau, y compris l’eau potable, et, par conséquent, peut entrer dans la chaîne alimentaire humaine 5,6,7.

L’objectif de la présente étude est de fournir un protocole complet utilisant une combinaison de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique complète) pour obtenir des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans un plan d’eau à Mumbai, en Inde. Classiquement, des techniques basées sur la culture ont été utilisées pour étudier la diversité bactérienne dans les plans d’eau. Étant donné que les micro-organismes cultivables ne constituent qu’un faible pourcentage du microbiote total dans n’importe quelle niche, pour mieux comprendre l’état général de la diversité bactérienne et les divers caractères de résistance prévalent dans tout échantillon, diverses techniques basées sur la culture et indépendantes de la culture doivent être utilisées en tandem. L’une de ces techniques robustes et fiables indépendantes de la culture est l’analyse de l’ADN métagénomique entier. Cette méthode à haut débit a été utilisée avec succès dans diverses études sur la diversité bactérienne ou les annotations fonctionnelles de divers ARG 8,9. Cette technique utilise le métagénome (le matériel génétique total d’un échantillon) comme matériau de départ pour diverses analyses et, par conséquent, est indépendante de la culture. Les protocoles de la présente étude peuvent être utilisés pour l’analyse de l’ADN métagénomique entier afin d’obtenir des informations sur la diversité bactérienne totale et divers ARG (résistomes) dans les échantillons d’eau.

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Protocol

1. Prélèvement et traitement des échantillons

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Prélever le volume approprié de l’échantillon d’eau dans un ou plusieurs récipients d’échantillon stériles, en veillant à ce que les 3/4 au plus du contenant ne soient pas remplis.
    2. Transporter les échantillons au laboratoire dans des conditions aseptiques dès que possible après le prélèvement et les traiter immédiatement.
  2. Traitement des échantillons
    1. Filtrer de manière aseptique l’échantillon d’eau à travers un chiffon de mousseline stérile pour éliminer toute particule.
    2. Effectuer des dilutions en série appropriées de l’eau filtrée pour une analyse plus approfondie.

2. Estimation de la charge bactérienne totale et du nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques

  1. Détermination de la charge bactérienne totale
    1. Suspendre 18,12 g de gélose R2A, poudre modifiée dans 1 000 mL d’eau bidistillée et dissoudre le mélange par chauffage. Autoclaver le mélange dissous à 121 °C, 15 psi pendant 20 min. Préparer la gélose R2A, Plaques modifiées en versant la quantité appropriée du mélange autoclavé dans des plaques de Petri stériles (p. ex., ajouter environ 20 mL de milieu stérile autoclavé sur une plaque de Petri stérile de 90 mm).
    2. Répartir uniformément 100 μL des dilutions appropriées de l’échantillon d’eau filtrée sur la gélose R2A, Plaque modifiée une fois que le milieu s’est solidifié. Effectuez l’expérience en double.
    3. Incuber toutes les plaques ci-dessus à 35-37 °C pendant 48 h (faire varier la température et le temps d’incubation en fonction du milieu utilisé pour l’isolement).
    4. Exprimez la charge bactérienne totale en unités formant colonies par millilitre (UFC/mL) à l’aide de l’équation (1) :
      Equation 1(1)
  2. Détermination du nombre de bactéries AR
    1. Suivez les étapes 2.1.1-2.1.4. Cependant, au lieu de la gélose R2A, plaques modifiées, utilisez la gélose R2A, les plaques modifiées complétées individuellement avec cinq antibiotiques différents, à savoir le céfotaxime (3 μg/mL), la ciprofloxacine (0,5 μg/mL), l’érythromycine (20 μg/mL), la kanamycine (15 μg/mL) et la vancomycine (3 μg/mL).
    2. Ajouter les antibiotiques séparément dans des tubes contenant 20 ml de gélose R2A fondue stérile, modifiée (avec la température de la gélose R2A fondue, modifiée à ≤40 °C) pour atteindre la concentration finale d’antibiotique mentionnée à l’étape 2.2.1.
    3. Remuer pour un mélange uniforme et verser sur des plaques de Petri stériles avant que la gélose ne se solidifie. Effectuez l’expérience en double.
    4. Incuber toutes les plaques ci-dessus à 35-37 °C pendant 48 h (si vous utilisez un milieu différent, la température et le temps d’incubation peuvent varier).
    5. Pour le contrôle de la qualité et la vérification de l’efficacité des antibiotiques, étaler 100 μL de suspensions bactériennes des souches ATCC 25922 et Staphylococcus aureus ATCC 29213 d’Escherichia coli sur leur gélose R2A modifiée contenant des antibiotiques respectifs (s’assurer que la densité de la culture fraîche utilisée pour l’inoculation est OD = 0,5 à 600 nm).
    6. Déterminer le nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques en termes d’UFC/ml comme décrit à l’étape 2.1.4.
  3. Stocks de glycérol des isolats
    1. Sélectionnez des colonies de RA morphologiquement distinctes.
    2. Suspendre une seule colonie isolée dans 2 mL de bouillon stérile Luria-Bertani contenant l’antibiotique correspondant (p. ex., si une colonie a été choisie dans une plaque contenant du céfotaxime, inoculer la colonie de l’étape 2.3.1 dans un bouillon Luria-Bertani stérile contenant du céfotaxime à sa concentration respective).
    3. Incuber les tubes inoculés à 37 °C à 80 tr/min jusqu’à ce que le DO600 atteigne 0,5.
    4. Préparer les stocks de glycérol des isolats en mélangeant 750 μL de la suspension de culture de l’étape 2.3.3 dans 250 μL de glycérol stérile à 100 % dans des conditions aseptiques.
    5. Conservez les stocks de glycérol à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
      NOTE: Pour la relance des cultures à partir des stocks de glycérol, décongeler les stocks de glycérol à 4 ° C. Inoculer une boucle de ce bouillon dans 2 ml de bouillon stérile Luria-Bertani contenant l’antibiotique respectif et laisser pousser.

3. Identification de bactéries cultivables par séquençage du gène de l’ARNr 16S

  1. Préparation d’un modèle d’ADN à partir des isolats pour la PCR
    NOTE: Le protocole décrit pour la préparation du modèle d’ADN pour la PCR pour l’isolement de l’ADN brut de la bactérie est donné par Carlson et al.10.
    1. À l’aide d’un cure-dent stérile, prélever une seule colonie isolée et pure de l’isolat qui pousse sur une plaque de Petri. Suspendre la colonie bactérienne dans 100 μL d’eau stérile bidistillée dans un tube microcentrifuge stérile et faire bouillir pendant 10 min.
    2. Centrifuger la suspension à 10 000 × g pendant 2 minutes pour enrober les débris et transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge frais et stérile pour l’utiliser comme matrice d’ADN brut.
  2. Amplification PCR ciblée de la région V3 du gène de l’ARNr 16S et séquençage
    1. Préparer 40 μL du mélange réactionnel dans un tube de PCR pour l’amplification par PCR, comme mentionné dans le tableau 1.
      NOTE: La préparation de l’ADN doit être effectuée sur un bloc de glace tout en minimisant les risques de contamination (porter des gants lors de la manipulation des réactifs et nettoyer soigneusement la surface de travail avec de l’éthanol à 70%).
    2. Placez le tube dans le bloc thermique et exécutez le programme approprié dans le cycleur thermique PCR. Voir le tableau 2 pour les conditions de cycle PCR normalisées et les informations d’amorce pour l’amplification des régions V3 des gènes de l’ARNr 16S.
    3. Pour résoudre les amplicons et visualiser, effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose (AGE). Mélanger 10 μL du produit de PCR amplifié et 2 μL du tampon de chargement de gel 6x (tableau 3), et charger ce mélange dans des puits sur du gel d’agarose à 1,5 % (dissoudre 1,5 g de poudre d’agarose dans 100 mL de 1x tampon TAE [Tableau 3]) contenant 5 μL de bromure d’éthidium (EtBr) à une concentration finale de 0,5 μg/mL d’EtBr dans 100 mL du gel d’agarose.
      ATTENTION : L’EtBr est un cancérogène puissant. Les gants doivent être portés en tout temps lors de la manipulation de l’EtBr et des gels contenant de l’EtBr.
    4. Ajouter une échelle d’ADN pour l’estimation de la taille des amplicons.
    5. Effectuer l’électrophorèse du gel dans un tampon de réservoir TAE à 80-100 V.
    6. Une fois que le colorant de suivi exécute les 3/4 du gel, arrêtez l’électrophorèse et visualisez les bandes d’amplicon sous un transilluminateur UV.
    7. Utilisez le produit PCR (amplicon) pour le séquençage du gène de l’ARNr 16S afin d’identifier l’isolat.
    8. Quantifier l’amplicon en le soumettant à une analyse spectrophotométrique à l’aide de l’équation (2).
      Equation 2(2)
    9. Pour vérifier la pureté de l’ADN, calculez le rapport A260/A280.
      REMARQUE: Idéalement, ce nombre devrait être supérieur à 1,5 et, de préférence, compris entre 1,8 et 2,0.
    10. Pour identifier les isolats, comparez les séquences obtenues avec les bases de données de séquences à l’aide d’un outil de recherche d’alignement approprié.

4. Détection de la résistance aux antibiotiques dans les isolats à l’aide de tests de sensibilité aux antibiotiques

REMARQUE : Ce protocole décrit la méthode de test de sensibilité aux antibiotiques (AST) par diffusion discale. Les disques antibiotiques suivants ont été utilisés : céfotaxime (5 μg), ampicilline (10 μg), lévofloxacine (5 μg), chloramphénicol (30 μg), tigécycline (15 μg), ceftriaxone (30 μg), imipénème (10 μg), gentamicine (10 μg), néomycine (10 μg), triméthoprime (5 μg) et ciprofloxacine (5 μg).

  1. Préparation de l’inoculum pour l’AST
    1. Inoculer de manière aseptique une seule colonie de RA purifiée isolée à l’aide d’une boucle stérile dans 2 mL d’un milieu stérile non sélectif, tel que le bouillon Luria-Bertani (sans antibiotique), et incuber à 37 °C à 80 tr/min pendant la nuit.
    2. Resuspendre en prenant 100-150 μL de la culture cultivée pendant la nuit (environ, DO 600 = 1,8-2,0) dans 2 mL de milieu de bouillon frais non sélectif Luria-Bertani et incuber pendant 2-4 h (jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,4-0,5).
    3. Diluer cette suspension de culture fraîchement cultivée en utilisant une solution saline stérile à 0,85 % de telle sorte que la densité de la culture soit égale à 0,5 McFarland standard (approximativement,OD 600 = 0,1), ce qui correspond à peu près à 1-2 × 108 cellules/mL.
    4. Mélangez délicatement la suspension bactérienne pour une répartition uniforme des cellules.
    5. Utiliser la suspension ci-dessus dans les 15 minutes suivant la dilution.
  2. Inoculation des plaques de gélose
    1. Préparer les plaques de gélose Mueller-Hinton (MHA) pour effectuer l’AST en mélangeant 38 g de MHA dans 1 000 ml d’eau bidistillée et dissoudre le mélange par chauffage. Autoclaver le mélange dissous à 121 °C, 15 psi pendant 15 min.
    2. S’assurer que la profondeur de MHA dans les plaques est de 4 mm (25 mL de milieu par plaque).
    3. Simultanément, retirez les disques antibiotiques du congélateur et réchauffez-les à température ambiante.
      NOTE: Les disques antibiotiques doivent être décongelés progressivement en décongelant d’abord les disques à 4 ° C et plus tard à température ambiante pour réduire tout risque potentiel de condensation sur les disques, ce qui peut affecter ultérieurement la zone d’inhibition (ZOI).
    4. Dans des conditions aseptiques, tremper un coton-tige stérile dans l’inoculum préparé à l’étape 4.1 et retirer l’excès de suspension pour éviter la surinoculation des plaques.
    5. Répartir la culture uniformément sur les plaques, en commençant par le haut de la plaque MHA et en allant et venant d’un bord à l’autre. Tournez la plaque de 60° pendant l’écouvillonnage.
  3. Application des disques antibiotiques
    1. À l’aide de pinces stérilisées à la flamme, transférer de manière aseptique les disques antibiotiques sur les plaques de MHA inoculées et appuyer doucement sur les disques pour assurer un contact complet avec l’agar-agar.
      NOTE: Cette procédure doit être effectuée dans les 15 minutes suivant l’inoculation de la culture sur les plaques.
    2. Placer le nombre approprié de disques antibiotiques sur la plaque de gélose en tenant compte de l’organisme, de l’antibiotique utilisé et de la taille de la plaque pour éviter le chevauchement des zones d’inhibition.
      NOTE: Quatre à cinq disques peuvent être logés sur une plaque circulaire de 90 mm.
  4. Incubation des plaques
    1. Dans les 15 minutes suivant l’application des disques antibiotiques, inverser les plaques et incuber à 37 °C pendant la nuit.
  5. Interprétation des résultats
    1. Mesurer le diamètre ZOI en millimètres (mm) et interpréter en fonction des valeurs de point d’arrêt données par EUCAST11. Voir les deux exemples donnés ci-dessous.
      1. Le point de rupture du diamètre de la zone (mm) pour un disque antibiotique à base de ciprofloxacine (5 μg) pour les entérobactéries est S ≥ 25 et R < 22, ce qui signifie qu’il est considéré comme sensible (S) si ZOI ≥ 25 mm, alors qu’il est résistant (R) si ZOI < 22 mm. Si le diamètre du ZOI se situe entre 22 et 25, l’isolat est considéré comme intermédiaire (I).
      2. Le point de rupture du diamètre de la zone (mm) pour un disque antibiotique chloramphénicol (30 μg) pour Staphylococcus spp. est S ≥ 18 et R < 18, ce qui signifie qu’il est considéré comme sensible si ZOI ≥ 18 mm, alors qu’il est résistant si ZOI < 18 mm.
    2. Déterminer l’indice de résistance multiple aux antibiotiques (PMA) en trouvant le rapport entre le nombre d’antibiotiques auxquels l’isolat est résistant et le nombre total d’antibiotiques auxquels l’isolat est exposé.
      NOTA : Pour le contrôle de la qualité, E. coli ATCC 25922 et S. Aureus Les souches ATCC 29213 sont utilisées comme souches de référence conformément au protocole de l’étape 4.

5. Détection par PCR des gènes de résistance aux antibiotiques dans les isolats

  1. Utiliser un protocole PCR standard pour l’identification des ARG dans les isolats. Préparez le modèle d’ADN en utilisant le protocole donné à l’étape 3.1.
    NOTE: Les conditions de cycle PCR utilisées dans cette étude étaient de 94 °C pendant 10 min, suivies de 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, d’un recuit pendant 30 s à la température appropriée (normalisée pour chaque jeu d’amorces), d’une extension à 72 °C pendant 40 s et d’une extension finale à 72 °C pendant 5 min. Le mélange réactionnel est décrit dans le tableau 4. La liste des ARG, des amorces et des températures de recuit est donnée dans le tableau 5.
  2. Pour résoudre, visualiser et vérifier la pureté des amplicons, suivez les étapes 3.2.3-3.2.10.

6. Analyse de l’ADN métagénomique entier pour l’identification de la diversité bactérienne totale et la détection des ARG dans le métagénome

  1. Extraction de l’ADN total (métagénome) de l’échantillon d’eau
    1. Extraire l’ADN métagénomique des échantillons d’eau filtrée.
      REMARQUE : Dans la présente étude, l’ADN métagénomique (ADN total) a été extrait des échantillons d’eau filtrée à l’aide de la trousse d’isolement de l’ADN référencée conformément au protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    2. Vérifiez la qualité de l’ADN en chargeant 3 μL de l’ADN métagénomique extrait sur un gel d’agarose à 0,8% et faites fonctionner le gel à 80-110 V pendant environ 30 minutes.
    3. Vérifiez la présence d’une seule bande intacte.
    4. Vérifiez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluoromètre.
  2. Détermination de la diversité bactérienne et détection des ARG par séquençage de l’ADN métagénomique entier
    1. Préparation de la bibliothèque et amplification PCR :
      1. Préparez une bibliothèque de séquençage d’extrémités appariées à l’aide du kit de préparation de la bibliothèque d’ADN référencé (voir le tableau des matériaux).
      2. Préparez l’ADN pour la ligature de l’adaptateur en prenant 200 ng d’ADN et en le cisaillant mécaniquement en fragments plus petits, suivi d’une étape continue de réparation finale dans laquelle un « A » est ajouté aux extrémités 3'.
      3. Selon la plate-forme utilisée pour le séquençage, ligaturez des adaptateurs spécifiques aux deux extrémités des fragments d’ADN.
        REMARQUE : des séquences cruciales pour lier des bibliothèques à double code-barres à une cellule de flux pour le séquençage sont présentes dans ces cartes. Cela permet l’amplification par PCR des fragments ligaturés par adaptateur et la liaison des amorces de séquençage standard.
      4. Pour vérifier la qualité et la quantité, analysez la bibliothèque amplifiée à l’aide d’une puce à ADN haute sensibilité selon les instructions du fabricant.
    2. Génération et séquençage des clusters :
      1. Chargez la bibliothèque amplifiée sur la plate-forme de séquençage appropriée pour la génération de cluster et le séquençage ultérieur.
        REMARQUE: Les molécules de la bibliothèque se lient aux oligos adaptateurs complémentaires sur la cellule d’écoulement d’extrémité appariée. Pendant le séquençage, les brins avant sont sélectivement clivés après la resynthèse du brin inverse. Ce brin inverse copié est ensuite séquencé à partir de l’extrémité opposée du fragment.
    3. Analyse bioinformatique :
      1. Générez des échafaudages à partir des données de haute qualité à l’aide de la plate-forme appropriée.
      2. Soumettre ces échafaudages à une analyse bioinformatique pour la classification taxonomique et l’identification des ARG.
        REMARQUE: Le flux de travail pour l’analyse de l’ADN métagénomique complet pour l’identification de la diversité bactérienne totale et la détection des ARG dans le métagénome est donné à la figure 1. Un schéma de traitement de la méthodologie complète décrite dans le manuscrit est donné à la figure 2.

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Representative Results

Charge bactérienne totale et nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques (EI)
Le dénombrement de la charge bactérienne totale a été effectué en étalant des dilutions de 10−4 à 10−6 fois des échantillons d’eau sur gélose R2A, milieu modifié. Pour le dénombrement du nombre de bactéries AR, des dilutions de 10−3 à 10−6 fois ont été réparties sur des plaques de milieu contenant des antibiotiques (figure 3). Le nombre total de bactéries et les AR ont été calculés en UFC/mL, et toutes les expériences de placage ont été effectuées en double. Conformément aux protocoles ci-dessus, la présente étude a montré que le nombre total de bactéries était de 3,0 × 109 UFC/mL. La charge bactérienne en AR s’est avérée élevée, de l’ordre de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC/ml (tableau 6).

Identification de bactéries cultivables par séquençage du gène de l’ARNr 16S
L’ADN brut de chaque isolat a été utilisé comme modèle pour effectuer une PCR spécifique au gène de l’ARNr 16S. Sur un total de 15 isolats AR séquencés, 10 appartenaient à la famille des Enterobacteriaceae, la plupart étant Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. Bactéries opportunistes rares telles que Comamonas spp. appartenant à la famille Comamonadaceae, Micrococcus spp. et Arthrobacter spp. appartenant à la famille des Micrococcaceae et Aeromonas spp. appartenant à la famille des Aeromonadaceae ont également été identifiés à partir de l’échantillon d’eau (tableau 7).

Détection de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries cultivables à l’aide de tests de sensibilité aux antibiotiques
Le profil de résistance aux antibiotiques des isolats identifiés ci-dessus a été généré en effectuant AST à l’aide de la méthode de diffusion discale (figure 4). Sur les 15 isolats testés, 8 avaient un indice de MAR de ≥0,2, ce qui indique un degré élevé de résistance. De plus, de nombreux isolats présentaient des profils de corésistance (résistance au même ensemble d’antibiotiques). Cependant, des isolats comme Comamonas spp. et Arthrobacter spp. n’ont montré de résistance à aucun des antibiotiques testés (tableau 8).

Détection et identification des gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries cultivables
Au total, 10 isolats d’AR ont été dépistés pour détecter la présence d’ARG par PCR. L’ARG le plus répandu dans les isolats cultivables était blaTEM codant pour la β-lactamase, suivi du gène de résistance aux aminosides aadA. D’autres ARG amplifiés étaient blaCTX-M, dfr1 et aac(6')-Ib conférant une résistance aux β-lactamines, au triméthoprime et aux aminoglycosides, respectivement. Les résultats représentatifs de l’amplification des ARG sont présentés à la figure 5. Pour la plupart des isolats identifiés, la résistance phénotypique (AST) a été confirmée au niveau moléculaire par profilage génotypique des EI basé sur la PCR.

Identification de la diversité bactérienne totale dans l’ADN métagénomique
Pour vérifier la présence de toutes les bactéries possibles (cultivables et non cultivables) et identifier leurs abondances relatives, une analyse métagénomique de l’ADN pour la diversité bactérienne totale a été effectuée. En utilisant l’approche de séquençage de nouvelle génération à haut débit (HT-NGS), ~96,94% du total des lectures de séquence ont été obtenues, ce qui a entraîné une couverture élevée. Une annotation taxonomique a été effectuée pour classer les lectures en différents groupes taxonomiques du phylum au niveau du genre (Figure 6 et Figure 7). Un total de 50 phylums ont pu être identifiés dans le métagénome, ce qui indique la grande diversité bactérienne dans l’échantillon d’eau. Les protéobactéries étaient le phylum le plus dominant, composé des classes Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria et Gammaproteobacteria. Au niveau de l’ordre, Burkholderiales était l’ordre le plus répandu, appartenant à la classe des Betaproteobacteria. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium et Comamonas étaient quelques-uns des genres abondants trouvés dans l’échantillon d’eau.

Détection des ARG à partir de l’ADN métagénomique
Pour comprendre le pool total d’ARG dans le métagénome de l’échantillon d’eau, un séquençage métagénomique complet a été effectué, suivi de l’identification des ARG à l’aide d’outils bioinformatiques appropriés. L’approche métagénomique garantit que les ARG présents dans les microorganismes cultivables et non cultivables de l’échantillon sont détectés. Une variété de gènes conférant une résistance aux β-lactamines (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylcosides (AAC(6')-34); quinolones (qnrS6, qnrVC5); pompes d’efflux d’antibiotiques-résistance-nodulation-division cellulaire (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), cassette de liaison à l’ATP (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) et superfamille facilitatrice majeure (MFS) (abaQ); dihydrofolate réductase résistante au triméthoprime (dfrD, dfrA20); la rifampicine phosphotransférase (rphB); et la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) (catB10) ont été détectées dans le métagénome. Les ARG détectés par PCR dans les isolats cultivables (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) ont également été détectés par séquençage métagénomique entier, confirmant ainsi leur présence dans l’échantillon d’eau. Les résultats représentatifs des ARG identifiés dans le métagénome à l’aide de l’analyse de l’ADN métagénomique entier sont présentés dans le tableau 9.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail pour l’analyse de l’ADN métagénomique entier. Le flux de travail par étapes pour l’identification de la diversité bactérienne totale et la détection des ARG à partir du métagénome est présenté. Les étapes globales comprennent la préparation, l’amplification et l’identification de l’ADN métagénomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de traitement de la méthodologie complète. Le flux de travail par étapes de la méthodologie utilisée dans la présente étude. Une combinaison de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture est utilisée pour obtenir des informations complètes sur la diversité bactérienne et l’identité des ARG présents dans l’échantillon d’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images représentatives de colonies isolées sur gélose R2A contenant des antibiotiques, plaques modifiées. Échantillons d’eau plaqués sur gélose R2A contenant du céfotaxime (3 μg/mL), plaques modifiées. L’échantillon a été dilué en série et plaqué en double A1, A2: 10−4; B1, B2 : 10−5; C1, C2: 10−6. Après la période d’incubation appropriée, les colonies isolées étaient visibles sur les plaques B1, B2, C1 et C2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Test de sensibilité aux antibiotiques par la méthode de diffusion discale. Images représentatives de l’AST par la méthode de diffusion discale pour un isolat d’Escherichia coli. L’AST a été réalisée en double A1, A2 : CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Les diamètres des ZOI ont été mesurés en millimètres (mm). Pour déterminer si l’isolat est résistant ou sensible à l’antibiotique utilisé, le ZOI a été comparé aux derniers tableaux EUCAST. Abréviations : AST = test de sensibilité aux antibiotiques; CTX = céfotaxime; IPM = imipénème; C = chloramphénicol; CIP = ciprofloxacine; LE = lévofloxacine; TGC = tigécycline; AMP = ampicilline; GEN = gentamicine; TR = triméthoprime; N = néomycine; K = kanamycine; CTR = ceftriaxone; ZOI = zone d’inhibition; EUCAST = Comité européen sur les tests de sensibilité aux antibiotiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Amplification par PCR des gènes de résistance aux antibiotiques provenant de bactéries cultivables. L’électrophorèse sur gel d’agarose post-PCR a été réalisée pour la visualisation de bandes amplifiées afin de vérifier la présence d’ARG dans les isolats. Des bandes séparées d’amplicons PCR peuvent être vues sur le gel. La taille des amplicons PCR individuels est comparée à un marqueur ADN approprié. Voie L1 : échelle d’ADN de 100 pb ; Voies 1-5: 1: dfr1 (425 pb); Voie 2: blaTEM (310 pb); Voie 3 : blaCTX-M (500 pb); Voie 4: aac(6')-Ib (395 bp); Voie 5: aadA (624 pb). Abréviation : ARG = gènes de résistance aux antibiotiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Classification taxonomique pour les niveaux de phylum et de classe. (A) Diagramme à barres montrant la distribution de l’abondance taxonomique au niveau du phylum du métagénome bactérien dans l’échantillon d’eau. Au total, 50 phylums bactériens ont été identifiés par l’analyse métagénomique. Les 12 premiers phylums dominants de bactéries sont montrés. (B) Diagramme à barres montrant la distribution de l’abondance taxonomique au niveau de la classe du métagénome bactérien dans l’échantillon d’eau. Au total, 50 classes bactériennes ont été identifiées par l’analyse métagénomique. Les 15 premières classes dominantes de bactéries sont représentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Classification taxonomique pour les niveaux de l’ordre et du genre. (A) Diagramme à barres montrant la distribution de l’abondance taxonomique au niveau de l’ordre du métagénome bactérien dans l’échantillon d’eau. Au total, 50 ordres bactériens ont été identifiés par l’analyse métagénomique. Les 14 premiers ordres dominants de bactéries sont représentés sur la figure. (B) Diagramme à barres montrant la distribution de l’abondance taxonomique au niveau du genre du métagénome bactérien dans l’échantillon d’eau. Au total, 50 genres bactériens ont été identifiés par l’analyse métagénomique. Les 15 premiers genres dominants de bactéries sont représentés sur la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Réactifs PCR Volume (μL)
2x Taq Master Mix 20
Amorce avant (10 pico mole) 1.5
Amorce inversée (10 pico mole) 1.5
Modèle d’ADN brut 1.5
Eau de biologie moléculaire stérile 15.5
Volume total 40

Tableau 1 : Constituants du mélange principal PCR. La composition du mélange réactionnel de divers réactifs PCR.

Direction Séquence d’amorce 5' – 3' Conditions de PCR Nombre de cycles
En avant GGAGGCAGCAGTAAGGAAT 94 °C pendant 10 min 1
Dénaturation à 94 °C pendant 30 s 35
Recuit à 50 °C pendant 30 s
Extension à 72 °C pendant 40 s
Inverse CTACCGGGGTATCTAATCC Extension finale à 72 °C pendant 5 min 1

Tableau 2 : Conditions du cycle de PCR pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S. Les conditions du cycle de PCR requises pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S sont montrées. Les étapes comprennent une étape initiale de dénaturation, suivie de 35 cycles de dénaturation, de recuit et d’extension, et d’une dernière étape d’extension.

6x gel de chargement
Contenu Quantité
Bleu de bromophénol 25 mg
85% Glycérol 7,06 mL
Eau Milli-Q 2,94 mL
Volume total 10 mL
50x Tris-acétate-EDTA (TAE) composition de tampon stock
Contenu Quantité
Base de Tris 242 g dans 700 mL d’eau bidistillée
Acide acétique glacial (GAA) 57,1 mL
0,5 M (EDTA) pH 8,0 100 mL
Ajuster le pH à 8,5 et compléter le volume à 1000 mL avec de l’eau bidistillée
Pour 1x TAE : 20 mL de tampon TAE 50x + 980 mL d’eau bidistillée

Tableau 3 : Composition du tampon de chargement de gel 6x et du tampon stock 50x Tris-acétate-EDTA. Le tampon de chargement de gel 6x est mélangé avec l’échantillon à exécuter sur électrophorèse sur gel d’agarose. Il contient du bleu de bromophénol comme colorant de suivi. Le glycérol augmente la densité de l’échantillon chargé pour un chargement approprié dans les puits. La composition des différents réactifs nécessaires à la préparation du tampon stock 50xTAE est également indiquée. Le tampon TAE est l’un des tampons les plus couramment utilisés pour l’AGE, et il maintient le pH à 8,5 et permet la migration de l’ADN amplifié pendant l’AGE. Abréviations : TAE = Tris-acétate-EDTA; AGE = électrophorèse sur gel d’agarose.

Réactifs PCR Volume (μL)
2x Taq Master Mix 5
Amorce avant (10 pico mole) 0.5
Amorce inversée (10 pico mole) 0.5
Modèle d’ADN brut 1.5
Eau stérile de qualité biologie moléculaire 2.5
Volume total 10

Tableau 4 : Composition du mélange principal de PCR pour l’identification des ARG. Composition du mélange réactionnel de divers réactifs PCR nécessaires à la réalisation de l’expérience PCR.

Sr. Non. Gène cible Résistance à Amorce Séquence d’amorce (5'-3') Taille de l’amplicon (pb) Température de recuit (°C) Références
1 DFR Un Triméthoprime En avant TGGTAGCTATATC
GAAGAATGGAGT		 425 59 Racewicz et coll., 19
Inverse TATGTTAGAGGCG
AAGTCTTGGGTA
2 blaTEM β – lactamines En avant GCACGAGTGGG
TTACATCGA		 310 60 Gebreyes, Thakur20
Inverse GGTCCTCCGAT
CGTTGTCAG
3 blaCTX-M β – lactamines En avant CGATGGGACG
ATGTCACTG		 500 52 Li et coll. 21
Inverse CGGCTTTCTG
CCTTAGGTT
4 aac(6')-Ib Aminosides En avant TATGAGTGGC
TAAATCGAT		 395 50 Akers et coll. 22
Inverse CCCGCTTTCT
CGTAGCA
5 AAD Un Aminosides En avant ACCGTAAGGC
TTGATGAAACA		 624 58 Ciesielczuk 23
Inverse GCCGACTACC
TTGGTGATCTC

Tableau 5 : Amorces pour la PCR des ARG dans les bactéries cultivables. Les différents ARG utilisés dans la présente étude ainsi que leurs séquences d’amorce respectives sont présentés. La taille attendue de l’amplicon est donnée en paires de bases. La température de recuit de chaque jeu d’apprêts est également mentionnée.

Antibiotique  Concentration d’antibiotique (μg/mL) UFC/ml
- - 3,0 x 109
CTX (en anglais seulement) 3 4,5 x 107
CIP 0.5 3,2 x 108
K 15 9,6 x 105
E 20 1,6 x 108
VA 3 1,2 x 109

Tableau 6 : Nombre total de bactéries résistantes aux antibiotiques. Cinq antibiotiques ont été utilisés pour l’isolement initial des bactéries résistantes aux antibiotiques de l’échantillon d’eau. Le nombre total de bactéries (sans antibiotiques) et le nombre de bactéries AR sont présentés en termes d’unités formant des colonies par millilitre (UFC/mL). Abréviations : AR = résistant aux antibiotiques; UFC = unités formant colonies; CTX = céfotaxime; CIP = ciprofloxacine; K = kanamycine; E = érythromycine; VA = vancomycine.

Isoler le code Micro-organismes Famille
1 Escherichia coli Entérobactéries
2 Escherichia coli Entérobactéries
3 Escherichia coli Entérobactéries
4 Escherichia coli Entérobactéries
5 Escherichia coli Entérobactéries
6 Escherichia coli Entérobactéries
7 Klebsiella pneumoniae Entérobactéries
8 Klebsiella pneumoniae Entérobactéries
9 Klebsiella pneumoniae Entérobactéries
10 Klebsiella pneumoniae Entérobactéries
11 Comamonas spp. Comamonadaceae
12 Comamonas spp. Comamonadaceae
13 Micrococcus spp. Micrococcaceae
14 Arthrobacter spp. Micrococcaceae
15 Aeromonas spp. Aeromonadaceae

Tableau 7 : Identification des isolats résistants aux antibiotiques par séquençage du gène de l’ARNr 16S. La PCR de colonie a été réalisée pour chaque isolat à l’aide d’amorces spécifiques au gène de l’ARNr 16S. Les amplicons obtenus ont ensuite été séquencés et identifiés à l’aide d’outils bioinformatiques appropriés.

N° d’isolat Isoler CTX (en anglais seulement) AMPÈRE LE C TGC CTR IPM GEN N TR CIP MARS Indice MAR
1 Escherichia coli 13R 0R 0R 28S 23S 11R 39S Années 20 18S 0R 0R 6 0.5
2 Escherichia coli 31S 0R 12R 29S 23S 32S 37S 19S 16S 0R 14R 4 0.4
3 Escherichia coli 14R 0R 14R 14R 21S 10R 34S 17S 11R 24S 16R 7 0.6
4 Escherichia coli 28S 13R 18R 26S 21S 28S 32S 16R 11R 24S 19R 5 0.4
5 Escherichia coli 11R 0R 12R 26S 21S 10R 31S 17S 16S 22S 11R 5 0.4
6 Escherichia coli 27S 0R 12R 12R 22S Années 30 32S 19S 11R 0R 14R 6 0.5
7 Klebsiella pneumoniae 28S 0R 17R 27S 22S Années 30 32S 18S 22S 0R 16R 4 0.4
8 Klebsiella pneumoniae 29S 11R 26S 24S 22S Années 30 28S 17S 16S 24S 23S 1 0.1
9 Klebsiella pneumoniae 29S 13R 25S 24S 22S 28S 29S 18S 17S 24S 25S 1 0.1
10 Klebsiella pneumoniae 33S 14S 26S 28S 22S 31S 32S 19S Années 20 24S 29S 0 0
11 Comamonas spp. - - - 23S - - 37S - - - - 0 0
12 Comamonas spp. - - - 27S - - 42S - - - - 0 0
13 Micrococcus spp. 25S 17R 24S 32S 22S 34S 28S Années 20 - 21S 26S 1 0.1
14 Arthrobacter spp. 45S 57S 28S 26S 34S 27S 39S 26S - 28S 28S 0 0
15 Aeromonas spp. - - 20R - - - - - - - 20R 2 1

Tableau 8 : Phénotype de résistance aux antibiotiques des isolats bactériens analysés par AST. La résistance phénotypique des isolats a été analysée à l’aide de la méthode de diffusion discale. Les chiffres indiquent le ZOI en millimètres (mm). Pour l’indice MAR, les chiffres indiquent le nombre total d’antibiotiques auxquels un isolat est résistant. Abréviations : AST = test de sensibilité aux antibiotiques; CTX = céfotaxime; AMP = ampicilline; LE = lévofloxacine; C = chloramphénicol; TGC = tigécycline; CTR = ceftriaxone; IPM = imipénème; GEN = gentamicine; N = néomycine; TR = triméthoprime; CIP = ciprofloxacine; R = résistant; S = sensible; MAR = résistance multiple aux antibiotiques; ZOI = zone d’inhibition.

FAMILLE DE GÈNES AMR GÈNE(S)
Bêta-lactamase SMB SMB-1
bêta-lactamase de type ampC ampC1
VIM bêta-lactamase VIM-20
CcrA bêta-lactamase ccrA
NmcA bêta-lactamase nmcR
ARL bêta-lactamase ARL-1
blaZ bêta-lactamase blaZ
blaTEM bêta-lactamase blaTEM*
blaCTX bêta-lactamase blaCTX
CAA(6') aac(6')-Ib, aac(6')-34
FOURMI(3'') aadA
Protéine de résistance aux quinolones (QNR) qnrS6, qnrVC5
résistance à la division cellulaire de nodulation (RND) pompe à efflux antibiotique evgA, mtrA, mdtA, acrD
Pompe à efflux antibiotique à cassette de liaison à l’ATP (ABC) oleC, macB, patA, bcrA
pompe à efflux antibiotique de la superfamille des facilitateurs majeurs (MFS) abaQ
Dihydrofolate réductase résistante au triméthoprime DFR dfr1, dfrD, dfrA20
rifampicine phosphotransférase rphB
protéines apparentées au pyrophosphate d’undécaprényle bcrC
PBP2 résistant à la méthicilline mecD
vanJ protéine membranaire vanJ
Protéine de protection ribosomique résistante à la tétracycline tetT
chloramphénicol acétyltransférase (CAT) catB10
ARN méthyltransférase ribosomique Erm 23S ERM(37)
Groupe de gènes de résistance aux glycopeptides vanRB, vanRE, vanRD
MCR phosphoéthanolamine transférase MCR-9
Sul résistant aux sulfamides SUL3
*Des gènes soulignés ont également été détectés dans les micro-organismes cultivables

Tableau 9 : ARG identifiés à l’aide d’une analyse de l’ADN métagénomique entier. Le métagénome total de l’échantillon d’eau a été utilisé pour le séquençage métagénomique entier, et les séquences obtenues ont été annotées à l’aide de la base de données ARG appropriée. Les résultats représentatifs de certains des ARG importants identifiés dans l’ADN métagénomique sont présentés. Les gènes soulignés ont également été détectés dans les micro-organismes cultivables. Abréviation : ARG = gène résistant aux antibiotiques.

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Discussion

La collecte et le traitement des échantillons jouent un rôle important et peuvent avoir une incidence sur les résultats et l’interprétation de l’étude. Par conséquent, pour exclure la variabilité des échantillons, il est important d’effectuer un échantillonnage à plusieurs endroits de la masse d’eau douce étudiée. Le maintien de conditions environnementales aseptiques appropriées lors de la manipulation de tels échantillons peut prévenir la contamination. En outre, pour éviter toute modification de la composition bactérienne susceptible d’influer sur la qualité et la quantité des acides nucléiques extraits, les conditions de transit doivent être maintenues à 4 °C, avec un laps de temps minimal entre le point de prélèvement de l’échantillon et le traitement ultérieur. Plusieurs études ont mis en évidence que cette période intermédiaire entre le prélèvement et le traitement des échantillons peut donner des résultats variables au cours des étapes ultérieures de l’analyse si elle n’est pas effectuée avec soin12,13.

L’utilisation d’une gamme de dilutions pour le placage garantit que les colonies ne s’agglutinent pas et qu’il n’y a pas trop peu de colonies à compter. Il est nécessaire d’effectuer les expériences en double pour tenir compte des variations de l’UFC/ml qui pourraient survenir en raison d’erreurs de pipetage ou de manipulation. De plus, des plaques de contrôle sont maintenues pour chaque expérience afin de s’assurer que les antibiotiques utilisés fonctionnent efficacement et que les résultats faussement positifs sont éliminés. Par conséquent, les plaques de contrôle ne doivent pas avoir de croissance visible de colonie. Cela indique l’efficacité des antibiotiques utilisés.

Au cours de l’AST, la densité de culture de l’inoculum et l’épaisseur de la plaque de gélose peuvent influencer le diamètre de la ZOI et, par conséquent, l’interprétation des résultats. Par conséquent, il faut veiller à ce que ces deux facteurs restent uniformes lors de l’exécution des expériences AST. L’aspect le plus critique est le nombre de cellules bactériennes présentes dans l’inoculum. En général, 1 × 10 8-2 × 108 UFC/mL de cellules sont utilisés comme inoculum, ce qui est égal à la norme McFarland de 0,514. Cette concentration de l’inoculum doit être maintenue constante pour éviter toute variation des résultats. Toute concentration supérieure ou inférieure à la concentration requise doit être diluée à l’aide d’une solution saline stérile et utilisée immédiatement pour l’inoculation dans les 15 minutes. Lors de l’étalement de l’inoculum sur les plaques de gélose, il faut prendre soin d’éviter une quantité excessive d’inoculum. L’excès d’inoculum peut être éliminé en appuyant sur l’écouvillon sur les côtés du tube de suspension bactérienne avant de l’inoculer à la plaque MHA. Tout écart par rapport à la procédure AST standard peut avoir un impact significatif sur les données obtenues à partir de ces protocoles11,15. Une étude antérieure a montré qu’une valeur d’indice MAR de ≥0,2 indique une résistance élevée dans les isolats16. Étant donné que l’interprétation des résultats de l’AST est basée sur l’ZOI, il faut éviter la sous-inoculation ou la surinoculation de la culture.

Pour la PCR, le mélange principal doit être préparé sur un bloc de glace afin de minimiser les risques de dégradation des ingrédients et de perte d’activité de l’enzyme. Le port de gants lors de la mise en place de la réaction minimise les risques de contamination externe17. La tension pendant l’AGE ne doit pas être trop élevée, car cela peut entraîner un effet de chauffage et une dégradation des échantillons chargés. L’exécution de l’AGE à une tension optimale garantit que les bandes sont bien séparées et nettes sans aucun effet de traînée ou de maculage.

Des études menées au cours des dernières décennies ont démontré l’utilisation du séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S pour l’identification de différents micro-organismes. Pour le séquençage du gène de l’ARNr 16S, le choix de la méthode d’extraction de l’ADN modèle peut provoquer des biais qui, à leur tour, peuvent affecter l’analyse en aval. Les bactéries à Gram positif ont une paroi cellulaire peptidoglycane épaisse qui peut rendre difficile l’extraction de l’acide nucléique. Par conséquent, le choix de la méthode d’extraction doit être tel qu’elle capture efficacement tous les types d’ADN microbien. La méthode d’ébullition traditionnelle pour extraire l’ADN brut du modèle est l’une de ces méthodes efficaces pour extraire le contenu de la cellule, réduisant ainsi les biais dans les résultats.

Pour comprendre la communauté bactérienne complète du plan d’eau, la technique de séquençage de nouvelle génération à haut débit (HT-NGS) a été utilisée dans cette étude. L’analyse de l’ADN métagénomique entier permet l’étude du métagénome entier d’un échantillon donné. Les techniques basées sur la culture donnent principalement un comptage aérobie de la charge bactérienne, indiquant la qualité microbiologique d’un échantillon. Cependant, les micro-organismes cultivables ne constituent que 1% du total des micro-organismes. La microflore restante, qui comprend une gamme variée d’espèces, y compris les anaérobies, est mal caractérisée et souvent ignorée. Ces micro-organismes peuvent porter des traits AR. De plus, les microorganismes commensales sont un réservoir de gènes AR qui peuvent être transmis à des agents pathogènes via divers événements d’échange génétique18. Beaucoup de ces commensaux ne sont pas cultivables et peuvent être étudiés par une approche métagénomique impliquant HT-NGS, fournissant une plus grande couverture pour l’identification de diverses microflores dans n’importe quel échantillon. À l’aide d’une analyse métagénomique, un profil détaillé des taxons bactériens a été obtenu, qui complétait les données cultivables. De plus, de telles approches complémentaires peuvent donner une idée de l’état global des EI de la masse d’eau à l’étude.

Dans la présente étude, en utilisant une combinaison de techniques métagénomiques conventionnelles basées sur la culture et non basées sur la culture, nous avons pu identifier la diversité bactérienne totale, différentes bactéries résistantes aux antibiotiques et le pool total d’ARG d’origine hydrique. La méthodologie décrite dans cette étude peut être reproduite et personnalisée pour l’identification des agents pathogènes AR dans toute autre source d’eau - eau côtière, eau naturelle et eau potable artificielle. Il peut également être utilisé pour suivre la transmission des agents pathogènes nosocomiales d’origine hydrique et pour surveiller les infections nosocomiales en milieu hospitalier et clinique par le biais de sources d’eau telles que les éviers, les toilettes, les baignoires et les humidificateurs. Cela facilitera la surveillance de la RAM et l’identification des points chauds de RAM à base d’eau.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts contradictoires à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions financières du programme DST-PURSE (Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence) de l’Université de Mumbai. Devika Ghadigaonkar a travaillé en tant que Project Fellow dans le cadre de ce programme. L’aide technique fournie par Harshali Shinde, chercheur principal au sein du Conseil de recherche en sciences et en génie du Département des sciences et de la technologie (DST-SERB) Projet no: CRG/2018/003624, est reconnue.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 bp DNA ladder Himedia MBT049-50LN For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix HiMedia MBT061-50R For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator GS-192, Gayatri Scientific NA For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer HiMedia ML015-1ML Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder Himedia MB229-50G For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc HiMedia SD002 For performing AST
Autoclave Equitron NA Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies NA To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet IMSET IMSET BSC-Class II Type B2 Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc HiMedia SD295E-5VL For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder HiMedia TC352-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc HiMedia SD065 For performing AST
Centrifuge Minispin Eppendorf Minispin Plus-5453 Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc HiMedia SD006-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc HiMedia SD060-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder HiMedia TC447-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter Quest NA For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator BTL41 Allied Scientific NA For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)  Haier DW40L, Haier Biomedicals For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NA Paired-end sequencing library preparation
EDTA HiMedia GRM1195-100G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus TechResource 15 cm gel casting tray For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis 
Electrophoresis Power pack with electrodes Genei NA For running the AGE 
Erythromycin antibiotic disc HiMedia SD222-5VL For performing AST
Erythromycin antibiotic powder HiMedia CMS528-1G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder HiMedia TC024-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922     HiMedia 0335X-1 Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide HiMedia MB071-1G Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer Qubit 2.0 NA For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System BioRad Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc HiMedia SD170-5x50DS For performing AST
Glacial Acetic Acid HiMedia AS119-500ML For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol HiMedia GRM1027-500ML For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc HiMedia SD073 For performing AST
Kaiju Database NA NA For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc HiMedia SD017-5x50DS For performing AST
Kanamycin antibiotic powder HiMedia MB105-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc HiMedia SD216-5VL For performing AST
Luria Bertani broth Himedia M1245-500G For enrichment of cultures
McFarland Standards Himedia R092-1No To compare density of culture suspension
Molecular Biology water HiMedia TCL018-500ML For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)  HiMedia M173-500G For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc HiMedia SD731-5x50DS For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz  Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers  Xcelris NA For PCR amplication 
R2A Agar, Modified HiMedia M1743 For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation CLC Genomics Workbench 6.0 NA For generation of scaffolds
Sequencer Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) NA Sequencing of amplified library
Sodium Chloride  HiMedia TC046-500G For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit Xcelgen NA For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 HiMedia 0365P Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level 
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) NA NA For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc HiMedia SD278 For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc HiMedia SD039-5x50DS For performing AST
Tris base HiMedia TC072-500G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder HiMedia CMS217 For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance Mettler Toledo ME204 Mettler Toledo Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA - Not Applicable

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References

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Sciences de l’environnement numéro 193
Isolement et identification de bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques
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Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation … More

Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes. J. Vis. Exp. (193), e63934, doi:10.3791/63934 (2023).

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