Summary
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.
Abstract
הפיתוח וההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה (AR) באמצעות מיקרוביוטה הקשורה לגופי מים מתוקים הוא דאגה בריאותית עולמית מרכזית. במחקר הנוכחי, דגימות מים מתוקים נאספו ונותחו ביחס למגוון החיידקים הכולל ולגנים של AR (ARGs) תוך שימוש הן בטכניקות קונבנציונליות מבוססות תרבית והן בגישה מטגנומית בלתי תלויה בתרבית בתפוקה גבוהה. מאמר זה מציג פרוטוקול שיטתי לספירה של החיידקים הכוללים והעמידים לאנטיביוטיקה מדגימות מים מתוקים ולקביעת עמידות פנוטיפית וגנוטיפית במבודדים הניתנים לתרבות. יתר על כן, אנו מדווחים על שימוש באנליזה מטא-גנומית שלמה של סך הדנ"א המטגנומי המופק מדגימת המים המתוקים לצורך זיהוי מגוון החיידקים הכולל, כולל חיידקים שאינם ניתנים לתרבות, וזיהוי המאגר הכולל של ARGs שונים (התנגדות) בגוף המים. בעקבות הפרוטוקולים המפורטים האלה, ראינו עומס חיידקים גבוה עמיד לאנטיביוטיקה בטווח של 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL. רוב המבודדים היו עמידים לאנטיביוטיקה הנפוצה שנבדקה, כולל cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, ו ciprofloxacin, עם מספר אינדקסים של עמידות לאנטיביוטיקה (MAR) של ≥0.2, מה שמעיד על רמות גבוהות של עמידות בבידודים. ריצוף 16S rRNA זיהה פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, כגון דלקת ריאות קלבסיאלה, וחיידקים אופורטוניסטיים, כגון Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., ו- Aeromonas spp. האפיון המולקולרי של המבודדים הראה נוכחות של ARGs שונים, כגון blaTEM, blaCTX-M (β-לקטאמים), aadA, aac (6')-Ib (אמינוגליקוזידים) ו-dfr1 (טרימתופרימים), אשר אושרה גם על ידי ניתוח הדנ"א המטגנומי כולו. שכיחות גבוהה של קידוד ARGs אחרים עבור משאבות שטף אנטיביוטיקה-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, הגן כלורמפניקול אצטילטרנספראז catB10, ואת גן עמידות rifampicin rphB-זוהה גם בדנ"א המטגנומי. בעזרת הפרוטוקולים שנדונו במחקר זה, אישרנו את נוכחותם של חיידקי MAR הנישאים במים עם תכונות פנוטיפיות וגנוטיפיות מגוונות של AR. לפיכך, ניתוח דנ"א מטגנומי שלם יכול לשמש כטכניקה משלימה לטכניקות קונבנציונליות המבוססות על תרביות כדי לקבוע את מצב ה-AR הכולל של גוף מים.
Introduction
עמידות מיקרוביאלית (AMR) זוהתה כאחת הבעיות העולמיות הדחופות ביותר. ההתפתחות המהירה של AMR והתפשטותו העולמית הם אחד האיומים הגדולים ביותר על בריאות האדם ועל הכלכלה העולמית במונחים של עלויות הבריאות הכרוכות בו1. שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה הובילו לעלייה ב-AR. זה הודגש על ידי מגיפת COVID-19, שבמהלכה הטיפול בזיהומים משניים הקשורים, במקרים רבים, נפגע מאוד בגלל AMR בחולים שנפגעו2. מלבד השימוש הישיר/שימוש לרעה באנטיביוטיקה על ידי בני אדם, שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה בחקלאות ובגידול בעלי חיים והזרמתן הבלתי הולמת לסביבה, כולל גופי מים, הם דאגה מרכזית3. עלייתן של תכונות עמידות חדשות ועמידות רב-ממדית בחיידקים מדגישה בדחיפות את הצורך בהבנה טובה יותר של הגורמים המובילים להתפתחות AR והפצתו. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מרובים, שלעתים קרובות נושאים גנים מרובים של AR (ARGs) על אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, יכולים להעביר את גני העמידות האלה למיקרואורגניזמים שאינם עמידים, כולל פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, ובכך להוביל להופעתם של חיידקי-על שאינם ניתנים לריפוי אפילו עם אנטיביוטיקה של מוצא אחרון4. החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה המרובים האלה, אם הם נמצאים במערכות אקולוגיות של מים, יכולים להיכנס ישירות למעי האנושי באמצעות צריכת מזונות מזוהמים על בסיס מים, כגון דגים, סרטנים ורכיכות. מחקרים קודמים הראו כי התפשטות חיידקי AR במערכות מים טבעיות יכולה להגיע גם לאספקת מים אחרת, כולל מי שתייה, ובכך יכולה להיכנס לשרשרת המזון האנושית 5,6,7.
מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול מקיף תוך שימוש בשילוב של טכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי שלם) כדי לקבל מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים בגוף מים במומבאי, הודו. באופן קונבנציונלי, נעשה שימוש בטכניקות מבוססות תרבית כדי לחקור את מגוון החיידקים בגופי מים. מכיוון שמיקרואורגניזמים תרבותיים מהווים רק אחוז קטן מכלל המיקרוביוטה בכל נישה, כדי להבין טוב יותר את המצב הכללי של מגוון החיידקים ואת תכונות העמידות השונות הנפוצות בכל דגימה, יש להשתמש בטכניקות שונות המבוססות על תרבית ובלתי תלויות בתרבית במקביל. טכניקה אחת חזקה ואמינה כזו, שאינה תלויה בתרבות, היא ניתוח דנ"א מטגנומי שלם. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה שימשה בהצלחה במחקרים שונים על מגוון חיידקים או על ביאורים פונקציונליים של ARGsשונים 8,9. טכניקה זו משתמשת במטגנום (החומר הגנטי הכולל בדגימה) כחומר המוצא לניתוחים שונים, ולכן היא בלתי תלויה בתרבית. הפרוטוקולים במחקר הנוכחי יכולים לשמש לניתוח דנ"א מטגנומי שלם כדי לקבל מידע על מגוון החיידקים הכולל ועל ARGs (התנגדות) שונים בדגימות מים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. איסוף ועיבוד דגימות
- איסוף דגימות
- אסוף את הנפח המתאים של דגימת המים במיכלי דגימה סטריליים, וודא שלא יותר מ-3/4 מהמיכל ימולא.
- להעביר את הדגימות למעבדה בתנאים אספטיים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף ומיד לעבד אותם.
- עיבוד דוגמאות
- מסננים באופן אספטי את דגימת המים דרך בד מוסלין סטרילי כדי להסיר כל חומר חלקיקי.
- לבצע דילולים סדרתיים מתאימים של המים המסוננים לניתוח נוסף.
2. הערכה של עומס החיידקים הכולל וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה
- קביעת העומס החיידקי הכולל
- יש להשהות 18.12 גרם של R2A Agar, אבקה מעובדת ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, ולהמיס את התערובת על ידי חימום. Autoclave את התערובת מומסת ב 121 °C, 15 psi במשך 20 דקות. הכן R2A Agar, צלחות מותאמות על ידי מזיגת הכמות המתאימה של תערובת autoclaved לתוך צלחות פטרי סטריליות (למשל, להוסיף כ 20 מ"ל של מדיום סטרילי autoclaved לצלחת פטרי סטרילית 90 מ"מ).
- מפזרים באופן שווה 100 μL של דילולים מתאימים של דגימת המים המסוננים על R2A Agar, צלחת שונה ברגע שהמדיום מתמצק. בצע את הניסוי בכפילות.
- דגירה של כל הלוחות הנ"ל ב 35-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות (לשנות את הטמפרטורה ואת זמן הדגירה בהתאם למדיה המשמשת לבידוד).
- בטא את העומס החיידקי הכולל במונחים של יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL) באמצעות משוואה (1):
(1)
- קביעת ספירת חיידקי AR
- בצע את השלבים 2.1.1-2.1.4. עם זאת, במקום R2A Agar, צלחות מעובדות, השתמש R2A Agar, צלחות מותאמות בתוספת בנפרד עם חמש אנטיביוטיקות שונות, כלומר cefotaxime (3 מיקרוגרם / מ"ל), ciprofloxacin (0.5 מיקרוגרם / מ"ל), אריתרומיצין (20 מיקרוגרם / מ"ל), kanamycin (15 מיקרוגרם / מ"ל) ו vancomycin (3 מיקרוגרם / מ"ל).
- הוסף את האנטיביוטיקה בנפרד לתוך צינורות המכילים 20 מ"ל של R2A Agar מותך סטרילי, שונה (עם הטמפרטורה של R2A Agar מותך, שונה ב ≤40 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את הריכוז האנטיביוטי הסופי כאמור בשלב 2.2.1.
- מערבלים לערבוב אחיד ויוצקים על צלחות פטרי סטריליות לפני שהאגר מתמצק. בצע את הניסוי בכפילות.
- דגירה של כל הלוחות הנ"ל ב 35-37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (אם משתמשים במדיה אחרת, הטמפרטורה וזמן הדגירה עשויים להשתנות).
- לצורך בקרת איכות ובדיקת יעילות האנטיביוטיקה, יש למרוח 100 μL של תרחיפים חיידקיים של זני Escherichia coli ATCC 25922 ו-Staphylococcus aureus ATCC 29213 על גבי R2A Agar המכילים אנטיביוטיקה בהתאמה, צלחות מותאמות (ודא שצפיפות התרבית הטרייה המשמשת לחיסון היא OD = 0.5 ב-600 ננומטר).
- קבע את ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה במונחים של CFU/mL כמתואר בשלב 2.1.4.
- מלאי גליצרול של המבודדים
- בחר מושבות AR מובחנות מבחינה מורפולוגית.
- להשעות מושבה בודדת בודדת ב-2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, אם נבחרה מושבה מתוך צלחת המכילה cefotaxime, לחסן את המושבה משלב 2.3.1 במרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל cefotaxime בריכוזו המתאים).
- לדגום את הצינורות המחוסנים ב 37 מעלות צלזיוס ב 80 סל"ד עד OD600 מגיע 0.5.
- הכינו מלאי גליצרול של המבודדים על ידי ערבוב 750 μL של מתלי התרבית משלב 2.3.3 ל-250 μL של 100% גליצרול סטרילי בתנאים אספטיים.
- יש לאחסן את מלאי הגליצרול בטמפרטורה של 80°C- עד לניתוח נוסף.
הערה: להחייאת התרביות ממניות הגליצרול, הפשירו את מלאי הגליצרול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לחסן לולאה של מלאי זה לתוך 2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה ולאפשר לגדול.
(1)3. זיהוי חיידקים הניתנים להתרבות על ידי ריצוף גנים 16S rRNA
- הכנת תבנית דנ"א מהמבודדים ל-PCR
הערה: הפרוטוקול המתואר להכנת תבנית דנ"א עבור PCR לבידוד דנ"א גולמי מהחיידק ניתן על ידי Carlson et al.10.- בעזרת קיסם סטרילי, קחו מושבה אחת, מבודדת וטהורה של המבודד הגדל על צלחת פטרי. להשעות את מושבת החיידקים ב 100 μL של מים סטריליים מזוקקים פעמיים בצינור microcentrifuge סטרילי להרתיח במשך 10 דקות.
- צנטריפוגה את המתלים ב 10,000 × גרם למשך 2 דקות כדי לזרוק את הפסולת, ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי טרי לשימוש כתבנית DNA גולמי.
- הגברה ממוקדת של PCR של אזור V3 בגן 16S rRNA וריצוף
- הכן 40 μL של תערובת התגובה בצינור PCR להגברת PCR, כאמור בטבלה 1.
הערה: הכנת הדנ"א צריכה להתבצע על גוש קרח תוך מזעור הסיכוי לזיהום (ללבוש כפפות בעת הטיפול בריאגנטים, ולנקות את משטח העבודה ביסודיות עם 70% אתנול). - הנח את הצינור בבלוק התרמי, והפעל את התוכנית המתאימה במחזור התרמי PCR. ראו טבלה 2 עבור תנאי מחזור ה-PCR המתוקננים ומידע הפריימר להגברה של אזורי V3 של הגנים 16S rRNA.
- לפתרון אמפליקונים והדמיה, לבצע אלקטרופורזה ג'ל agarose (AGE). יש לערבב 10 μL של מוצר ה-PCR המוגבר ו-2 μL של מאגר העמסת ג'ל 6x (טבלה 3), ולהעמיס תערובת זו לתוך בארות על 1.5% ג'ל אגרוז (להמיס 1.5 גרם של אבקת אגרוז ב-100 מ"ל של 1x TAE buffer [טבלה 3]) המכיל 5 μL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד (EtBr) לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל EtBr ב-100 מ"ל של ג'ל האגרוז.
אזהרה: EtBr הוא חומר מסרטן רב עוצמה. יש ללבוש את הכפפות בכל עת בעת הטיפול ב- EtBr ובג'לים המכילים EtBr. - הוסף סולם DNA להערכת גודל האמפליקונים.
- בצע אלקטרופורזה של הג'ל בחיץ טנק TAE ב 80-100 V.
- לאחר שצבע המעקב פועל 3/4 מהג'ל, עצרו את האלקטרופורזה, ודמיינו את רצועות האמפליקון מתחת לטרנסילומינטור UV.
- השתמש במוצר PCR (amplicon) לריצוף גנים 16S rRNA כדי לזהות את המבודד.
- כימות האמפליקון על ידי הכפפתו לאנליזה ספקטרופוטומטרית באמצעות משוואה (2).
(2) - כדי לבדוק את טוהר הדנ"א, חשב את היחס בין A260/A280.
הערה: באופן אידיאלי, מספר זה צריך להיות מעל 1.5, ועדיף, בין 1.8 ל 2.0. - כדי לזהות את המבודדים, השווה את הרצפים המתקבלים עם מסדי נתונים של רצפים באמצעות כלי חיפוש יישור מתאים.
- הכן 40 μL של תערובת התגובה בצינור PCR להגברת PCR, כאמור בטבלה 1.
(2)4. איתור עמידות לאנטיביוטיקה במבודדים באמצעות בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה
הערה: פרוטוקול זה מתאר את השיטה לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי דיפוזיה של דיסק. נעשה שימוש בדיסקי האנטיביוטיקה הבאים: cefotaxime (5 מיקרוגרם), אמפיצילין (10 מיקרוגרם), לבופלוקסצין (5 מיקרוגרם), כלוראמפניקול (30 מיקרוגרם), טיגציקלין (15 מיקרוגרם), צפטריקסון (30 מיקרוגרם), אימיפנם (10 מיקרוגרם), גנטמיצין (10 מיקרוגרם), נאומיצין (10 מיקרוגרם), טרימתופרים (5 מיקרוגרם) וציפרופלוקסצין (5 מיקרוגרם).
- הכנת האינוקולום ל- AST
- לחסן באופן אספטי מושבת AR יחידה, מבודדת ומטוהרת באמצעות לולאה סטרילית ב-2 מ"ל של מדיום סטרילי לא סלקטיבי, כגון מרק לוריא-ברטני (ללא כל אנטיביוטיקה), ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-80 סל"ד למשך הלילה.
- יש להשהות את השימוש ב-100-150 מיקרוליטר של התרבית שגדלה בן לילה (בערך, OD 600 = 1.8-2.0) ב-2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני טרי ולא סלקטיבי ולדגור במשך 2-4 שעות (עד שה-OD600 מגיע ל-0.4-0.5).
- לדלל את מתלה התרבית הטרי הזה באמצעות תמיסת מלח סטרילית של 0.85% כך שצפיפות התרבית שווה לתקן מקפרלנד 0.5 (בערך, OD600 = 0.1), אשר מתאים בערך ל 1-2 × 108 תאים / מ"ל.
- ערבבו בעדינות את תרחיף החיידקים לחלוקת תאים אחידה.
- השתמש במתלה הנ"ל תוך 15 דקות מרגע הדילול.
- חיסון צלחות האגר
- הכינו צלחות מולר-הינטון אגר (MHA) לביצוע ה-AST על ידי ערבוב 38 גרם של MHA ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, והמיסו את התערובת על ידי חימום. Autoclave את התערובת מומסת ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך 15 דקות.
- ודא כי עומק MHA בצלחות הוא 4 מ"מ (25 מ"ל של בינוני לכל צלחת).
- במקביל, מוציאים את דיסקיות האנטיביוטיקה מהמקפיא ומחממות אותן לטמפרטורת החדר.
הערה: יש להפשיר בהדרגה את הדיסקים האנטיביוטיים על ידי הפשרה ראשונית של הדיסקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומאוחר יותר בטמפרטורת החדר כדי להפחית כל סכנה פוטנציאלית של עיבוי על הדיסקים, אשר עלולה להשפיע לאחר מכן על אזור העיכוב (ZOI). - בתנאים אספטיים, טבלו צמר גפן סטרילי לתוך האינוקולום שהוכן בשלב 4.1, והסירו את עודפי ההשעיה כדי למנוע חיסון יתר של הצלחות.
- פזרו את התרבית באופן שווה על הצלחות, החל מהחלק העליון של צלחת ה-MHA והמשיכו קדימה ואחורה מקצה לקצה. סובבו את הצלחת ב-60° תוך כדי התנדנדות.
- יישום הדיסקים האנטיביוטיים
- בעזרת מלקחיים מעוקרים בלהבה, מעבירים באופן אספטי את הדיסקים האנטיביוטיים על לוחות ה-MHA המחוסנים, ולוחצים בעדינות על הדיסקים כדי להבטיח מגע מלא עם האגר.
הערה: הליך זה צריך להיעשות תוך 15 דקות מחיסון התרבית על הצלחות. - מקם את המספר המתאים של דיסקים אנטיביוטיים על צלחת אגר על ידי התחשבות האורגניזם, האנטיביוטיקה בשימוש, ואת גודל הצלחת כדי למנוע חפיפה של אזורי העיכוב.
הערה: ניתן לאכלס ארבעה עד חמישה דיסקים על לוח עגול בקוטר 90 מ"מ.
- בעזרת מלקחיים מעוקרים בלהבה, מעבירים באופן אספטי את הדיסקים האנטיביוטיים על לוחות ה-MHA המחוסנים, ולוחצים בעדינות על הדיסקים כדי להבטיח מגע מלא עם האגר.
- דגירה של הצלחות
- תוך 15 דקות מיישום הדיסקים האנטיביוטיים, הופכים את הצלחות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- פרשנות התוצאות
- מודדים את קוטר ה-ZOI במילימטרים (מ"מ), ומפרשים לפי ערכי נקודת השבירה שניתנו על ידי EUCAST11. ראה את שתי הדוגמאות המובאות להלן.
- נקודת השבירה בקוטר האזור (מ"מ) עבור דיסק אנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין (5 מיקרוגרם) עבור Enterobacterales היא S ≥ 25 ו- R < 22, כלומר היא נחשבת רגישה (S) אם ZOI ≥ 25 מ"מ, בעוד שהיא עמידה (R) אם ZOI < 22 מ"מ. אם קוטר ה-ZOI נופל בין 22 ל-25, המבודד נחשב לבינוני (I).
- נקודת השבירה בקוטר האזור (מ"מ) עבור דיסק אנטיביוטי כלורמפניקול (30 מיקרוגרם) עבור סטפילוקוקוס spp. היא S ≥ 18 ו- R < 18, כלומר היא נחשבת רגישה אם ZOI ≥ 18 מ"מ, בעוד שהיא עמידה אם ZOI < 18 מ"מ.
- קבע את מדד עמידות לאנטיביוטיקה מרובה (MAR) על ידי מציאת היחס בין מספר האנטיביוטיקה שאליה עמיד המבודד למספר הכולל של האנטיביוטיקה שאליה נחשף המבודד.
הערה: עבור בקרת איכות, E. coli ATCC 25922 ו - S. אוראוס ATCC 29213 משמשים כזני ייחוס בהתאם לפרוטוקול כמו בשלב 4.
- מודדים את קוטר ה-ZOI במילימטרים (מ"מ), ומפרשים לפי ערכי נקודת השבירה שניתנו על ידי EUCAST11. ראה את שתי הדוגמאות המובאות להלן.
5. זיהוי מבוסס PCR של גנים עמידים לאנטיביוטיקה במבודדים
- השתמש בפרוטוקול PCR סטנדרטי לזיהוי ARGs במבודדים. הכן את תבנית הדנ"א באמצעות הפרוטוקול שניתן בשלב 3.1.
הערה: תנאי מחזור ה-PCR ששימשו במחקר זה היו 94 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, חישול במשך 30 שניות בטמפרטורה המתאימה (כפי שנקבע עבור כל ערכת פריימר), הארכה ב-72 °C למשך 40 שניות, והארכה סופית ב-72 °C למשך 5 דקות. תערובת התגובה מתוארת בטבלה 4. רשימת ה-ARGs, הפריימרים וטמפרטורות החישול מופיעה בטבלה 5. - כדי לפתור, לדמיין ולבדוק את טוהר האמפליקונים, בצע את השלבים 3.2.3-3.2.10.
6. ניתוח דנ"א מטגנומי שלם לזיהוי מגוון החיידקים הכולל וזיהוי ARGs במטגנום
- מיצוי הדנ"א הכולל (מטגנום) מדגימת המים
- חלצו את הדנ"א המטגנומי מדגימות המים המסוננים.
הערה: במחקר הנוכחי, הדנ"א המטגנומי (סך הדנ"א) הופק מדגימות המים המסוננים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א המוזכרת בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת החומרים). - בדוק את איכות הדנ"א על ידי טעינת 3 μL של הדנ"א המטגנומי המופק על ג'ל אגרוז של 0.8%, והפעל את הג'ל ב-80-110 וולט למשך כ-30 דקות.
- בדוק את נוכחותה של רצועה שלמה אחת.
- בדוק את ריכוז הדנ"א באמצעות פלואורומטר.
- חלצו את הדנ"א המטגנומי מדגימות המים המסוננים.
- קביעת מגוון חיידקים וזיהוי ARGs באמצעות ריצוף DNA מטאגנומי שלם
- הכנת ספרייה והגברת PCR:
- הכינו ספריית ריצוף צמודה באמצעות ערכת ההכנה של ספריית הדנ"א שאליה יש הפניה (ראו טבלת חומרים).
- הכן את הדנ"א לקשירת מתאם על ידי לקיחת 200 ננוגרם של דנ"א והטיה מכנית שלו למקטעים קטנים יותר, ולאחר מכן שלב רציף של תיקון קצה שבו "A" מתווסף לקצוות 3 '.
- בהתאם לפלטפורמה המשמשת לריצוף, ליגייט מתאמים ספציפיים לשני הקצוות של מקטעי הדנ"א.
הערה: רצפים חיוניים לקשירת ספריות עם ברקוד כפול לתא זרימה לצורך ריצוף נמצאים במתאמים אלה. זה מאפשר הגברה PCR של שברים קשירה מתאם וקשירת פריימרים ריצוף סטנדרטיים. - כדי לבדוק את האיכות והכמות, נתחו את הספרייה המוגברת באמצעות שבב DNA בעל רגישות גבוהה בהתאם להוראות היצרן.
- יצירת אשכולות וריצוף:
- טען את הספרייה המוגברת על פלטפורמת הריצוף המתאימה ליצירת אשכולות ולריצוף שלאחר מכן.
הערה: מולקולות הספרייה נקשרות לאוליגוס המתאם המשלים בתא הזרימה הזוגי. במהלך הרצף, הגדילים הקדמיים נבקעים באופן סלקטיבי לאחר סינתזה מחדש של הגדיל ההפוך. גדיל הפוך מועתק זה מרוצף מהקצה הנגדי של הקטע.
- טען את הספרייה המוגברת על פלטפורמת הריצוף המתאימה ליצירת אשכולות ולריצוף שלאחר מכן.
- ניתוח ביואינפורמטי:
- צור פיגומים מהנתונים האיכותיים באמצעות הפלטפורמה המתאימה.
- הכפיף פיגומים אלה לניתוח ביואינפורמטיקה לצורך סיווג טקסונומי וזיהוי של ה- ARGs.
הערה: תהליך העבודה של כל ניתוח הדנ"א המטגנומי לזיהוי המגוון הכולל של החיידקים ולזיהוי ה-ARGs במטגנום ניתן באיור 1. גיליון זרימה של המתודולוגיה המלאה המתוארת בכתב היד מובא באיור 2.
- הכנת ספרייה והגברת PCR:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סך כל עומס החיידקים וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה (AR)
הספירה של עומס החיידקים הכולל בוצעה על ידי פיזור 10−4 עד 10−6 דילולים של דגימות המים על R2A Agar, מדיום שונה. לצורך הספירה של ספירת חיידקי ה-AR, 10−3 עד 10−6 דילולים של פי 6 הופצו על לוחות מדיה המכילים אנטיביוטיקה (איור 3). ספירת החיידקים הכוללת וה-AR חושבה כ-CFU/mL, וכל ניסויי הציפוי בוצעו בשכפול. בעקבות הפרוטוקולים הנ"ל, המחקר הנוכחי הראה כי ספירת החיידקים הכוללת היא 3.0 × 109 CFU/mL. נמצא כי עומס חיידקי ה-AR גבוה, בטווח של 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL (טבלה 6).
זיהוי חיידקים מתרבים על ידי ריצוף rRNAgene 16S
דנ"א גולמי מכל בידוד שימש כתבנית לביצוע PCR ספציפי לגן 16S rRNA. בסך הכל 15 מבודדי AR שרצפו, 10 שייכים למשפחת Enterobacteriaceae, כאשר רובם היו Escherichia coli ו- Klebsiella pneumoniae. חיידקים אופורטוניסטיים נדירים כגון Comamonas spp. השייכים למשפחה Comamonadaceae, Micrococcus spp. ו- Arthrobacter spp. השייכים למשפחה Micrococcaceae, ו- Aeromonas spp. השייכים למשפחה Aeromonadaceae זוהו גם מדגימת המים (טבלה 7).
איתור עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים הניתנים להתרבות באמצעות בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה
פרופיל העמידות לאנטיביוטיקה של המבודדים שזוהו לעיל נוצר על-ידי ביצוע AST בשיטת דיפוזיית הדיסק (איור 4). מתוך 15 המבודדים שנבדקו, ל-8 היה מדד MAR של ≥0.2, מה שמעיד על רמה גבוהה של התנגדות. יתר על כן, רבים מהמבודדים הראו פרופילי עמידות משותפת (עמידות לאותה קבוצה של אנטיביוטיקה). עם זאת, מבודדים כמו Comamonas spp. ו-Arthrobacter spp. לא הראו עמידות לאף אחת מהאנטיביוטיקה שנבדקו (טבלה 8).
איתור וזיהוי גנים של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים הניתנים להתרבות
בסך הכל נבדקו 10 מבודדי AR לנוכחות של ARGs באמצעות PCR. ה-ARG הנפוץ ביותר במבודדים הניתנים להתרבות היה קידוד blaTEM ל-β-לקטמאז, ואחריו גן העמידות לאמינוגליקוזידים aadA. ARGs מוגברים אחרים היו blaCTX-M, dfr1 ו-aac(6')-Ib המעניקים עמידות ל-β-לקטמים, טרימתופרים ואמינוגליקוזידים, בהתאמה. התוצאות המייצגות של ההגברה של ה-ARGs מוצגות באיור 5. עבור רוב המבודדים שזוהו, עמידות פנוטיפית (AST) אושרה ברמה המולקולרית באמצעות פרופיל AR גנוטיפי מבוסס PCR.
זיהוי המגוון החיידקי הכולל בדנ"א המטגנומי
כדי לבדוק את נוכחותם של כל החיידקים האפשריים (הן תרבותיים והן שאינם ניתנים לתרבות) ולזהות את השפע היחסי שלהם, בוצע ניתוח DNA מטגנומי עבור מגוון החיידקים הכולל. באמצעות גישת הריצוף של הדור הבא (HT-NGS) בתפוקה גבוהה, התקבלו ~96.94% מכלל קריאות הרצף, וכתוצאה מכך כיסוי גבוה. ביאור טקסונומי בוצע כדי לסווג את הקריאות לקבוצות טקסונומיות שונות מהגוף ועד לרמת הסוג (איור 6 ואיור 7). ניתן לזהות בסך הכל 50 phyla במטגנום, מה שמעיד על מגוון החיידקים הגבוה בדגימת המים. פרוטאובקטריה הייתה הגוף הדומיננטי ביותר, המורכב ממחלקות אלפאפרוטאובקטריה, בטאפרוטאובקטריה וגמפרוטאובקטריה. ברמת הסדר, בורקהולדריאלס היה הסדר הנפוץ ביותר, השייך למעמד הבטאפרוטאובקטריה. פסאודומונס, אצינטובקטריום, פדובקטר, פרוסקובקטריום, לימנוביטנס, פלבובקטריום וקומונס היו חלק מהסוגים השופעים שנמצאו בדגימת המים.
זיהוי של ARGs מהדנ"א המטגנומי
כדי להבין את המאגר הכולל של ARGs במטגנום של דגימת המים, בוצע ריצוף מטגנומי שלם, ואחריו זיהוי של ARGs באמצעות כלי ביואינפורמטיקה מתאימים. הגישה המטגנומית מבטיחה כי ה-ARGs הנמצאים הן במיקרואורגניזמים הניתנים להתרבות והן במיקרואורגניזמים שאינם ניתנים להתרבות בדגימה יזוהו. מגוון גנים המעניקים עמידות ל-β-לקטמים (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); אמינוגילקוזידים (AAC(6')-34); קווינולונים (qnrS6, qnrVC5); משאבות שטף אנטיביוטיות-התנגדות-חלוקת תאים (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), קלטת קושרת ATP (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA), ומשפחת-על מנחה ראשית (MFS) (abaQ); דיהידרופולאט רדוקטאז עמיד לטרימתופרים (dfrD, dfrA20); ריפאמפין פוספוטרנספראז (rphB); וכלורמפניקול אצטילטרנספראז (CAT) (catB10) זוהו במטגנום. ה-ARGs שזוהו באמצעות PCR במבודדים הניתנים להתרבות (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) זוהו גם על ידי ריצוף מטגנומי שלם, ובכך אישרו את נוכחותם בדגימת המים. התוצאות המייצגות של ה-ARGs שזוהו במטגנום באמצעות ניתוח דנ"א מטא-גנומי שלם ניתנות בטבלה 9.
איור 1: זרימת עבודה לניתוח דנ"א מטגנומי שלם. מוצגת זרימת העבודה המפורטת לזיהוי מגוון החיידקים הכולל ולזיהוי ה- ARGs מהמטא-גנום. השלבים הכוללים כוללים הכנה מטגנומית של דנ"א, הגברה וזיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: גיליון זרימה של המתודולוגיה המלאה. זרימת העבודה המדורגת של המתודולוגיה המשמשת במחקר הנוכחי. שילוב של טכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית משמש לקבלת מידע מלא על מגוון החיידקים וזהות ה-ARGs הנמצאים בדגימת המים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תמונות מייצגות של מושבות מבודדות על R2A Agar המכיל אנטיביוטיקה, לוחות מותאמים. דגימות מים מצופות על cefotaxime (3 מיקרוגרם / מ"ל) - המכיל R2A אגר, צלחות מעובדות. הדגימה דוללה באופן סדרתי וצוותה בכפול-A1, A2: 10−4; ב1, ב2: 10−5; ג1, ג2: 10−6. לאחר תקופת הדגירה המתאימה, המושבות המבודדות נראו על לוחות B1, B2, C1 ו- C2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה בשיטת דיפוזיית הדיסק. תמונות מייצגות של AST בשיטת דיפוזיית הדיסק עבור מבודד Escherichia coli . AST בוצע כפול-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. הקטרים של ה-ZOIs נמדדו במילימטרים (מ"מ). כדי לפרש אם המבודד עמיד או רגיש לאנטיביוטיקה שבה נעשה שימוש, ה-ZOI הושווה לטבלאות EUCAST האחרונות. קיצורים: AST = בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה; CTX = cefotaxime; IPM = imipenem; C = כלוראמפניקול; CIP = ציפרופלוקסצין; LE = levofloxacin; TGC = טיגציקלין; AMP = אמפיצילין; GEN = גנטמיצין; TR = טרימתופרים; N = ניאומיצין; K = קנאמיצין; CTR = ceftriaxone; ZOI = אזור של עיכוב; EUCAST = הוועדה האירופית לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הגברת PCR של גנים עמידים לאנטיביוטיקה מחיידקים הניתנים לתרבות. אלקטרופורזה ג'ל Agarose לאחר PCR בוצע עבור הדמיה של להקות מוגברות כדי לבדוק את נוכחותם של ARGs במבודדים. ניתן לראות רצועות מופרדות של אמפליקונים PCR על הג'ל. גודלם של אמפליקוני ה-PCR הבודדים מושווה לסמן DNA מתאים. נתיב L1: סולם DNA של 100 bp; נתיבים 1-5: 1: dfr1 (425 bp); נתיב 2: blaTEM (310 כ"ס); נתיב 3: blaCTX-M (500 כ"ס); נתיב 4: aac(6')-Ib ( 395 bp); נתיב 5: aadA (624 bp). קיצור: ARGs = גנים עמידים לאנטיביוטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: סיווג טקסונומי עבור רמות הגוף והמעמדות . (A) תרשים עמודות המציג את התפלגות השפע הטקסונומי ברמת הגוף של המטגנום החיידקי בדגימת המים. בסך הכל זוהו 50 חיידקים phyla על ידי ניתוח מטגנומי. 12 הפילה הדומיננטית הראשונה של חיידקים מוצגים. (B) תרשים עמודות המציג את התפלגות השפע הטקסונומי ברמת המחלקה של המטגנום החיידקי בדגימת המים. בסך הכל זוהו 50 סוגי חיידקים על ידי הניתוח המטגנומי. 15 הסוגים הדומיננטיים הראשונים של חיידקים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: סיווג טקסונומי עבור סדר ורמות הסוג . (A) תרשים עמודות המציג את התפלגות השפע הטקסונומי ברמת הסדר של המטגנום החיידקי בדגימת המים. בסך הכל זוהו 50 הזמנות חיידקים על ידי הניתוח המטגנומי. 14 הסדרים הדומיננטיים הראשונים של חיידקים מוצגים באיור. (B) תרשים עמודות המציג את התפלגות השפע הטקסונומי ברמת הסוג של המטגנום החיידקי בדגימת המים. בסך הכל זוהו 50 סוגי חיידקים על ידי הניתוח המטגנומי. 15 הסוגים הדומיננטיים הראשונים של חיידקים מוצגים באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| ריאגנטים PCR | נפח (μL) |
| 2x טאק מאסטר מיקס | 20 |
| פריימר קדמי (10 פיקו שומה) | 1.5 |
| פריימר הפוך (10 פיקו שומה) | 1.5 |
| תבנית דנ"א גולמי | 1.5 |
| מים לביולוגיה מולקולרית סטרילית | 15.5 |
| נפח כולל | 40 |
טבלה 1: מרכיבי מאסטרמיקס PCR. הרכב תערובת התגובה של ריאגנטים שונים PCR.
| כיוון | רצף פריימרים 5' – 3' | תנאי PCR | לא. של מחזורים |
| קדימה | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות | 1 |
| דנטורציה ב-94°C למשך 30 שניות | 35 | ||
| חישול ב-50°C למשך 30 שניות | |||
| הארכה ב-72°C למשך 40 שניות | |||
| הפוך | CTACCGGGTATCTAATCC | הארכה סופית ב-72°C למשך 5 דקות | 1 |
טבלה 2: תנאי מחזור PCR להגברה של הגן 16S rRNA. תנאי מחזור ה-PCR הנדרשים להגברת גנים של 16S rRNA מוצגים. השלבים כוללים שלב דנטורציה ראשוני, ואחריו 35 מחזורים של דנטורציה, חישול והרחבה, ושלב הארכה סופי.
| 6x ג'ל העמסה | |
| תוכן | כמות |
| ברומופנול כחול | 25 מ"ג |
| 85% גליצרול | 7.06 מ"ל |
| מים מילי-קיו | 2.94 מ"ל |
| נפח כולל | 10 מ"ל |
| 50x טריס-אצטט-EDTA (TAE) הרכב מאגר מניות | |
| תוכן | כמות |
| בסיס טריס | 242 גרם ב-700 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים |
| חומצה אצטית קרחונית (GAA) | 57.1 מ"ל |
| 0.5 מ' (EDTA) pH 8.0 | 100 מ"ל |
| כוונן את ה- pH ל- 8.5 והשלם את הנפח ל- 1000 מ"ל עם מים מזוקקים כפולים | |
| עבור TAE אחד: 20 מ"ל של 50x TAE buffer + 980 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים | |
טבלה 3: הרכב של מאגר העמסת ג'ל 6x ומאגר מלאי 50x Tris-acetate-EDTA. חיץ העמסת הג'ל 6x מעורבב עם הדגימה שיש להפעיל על אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. הוא מכיל ברומופנול כחול כצבע המעקב. גליצרול מגדיל את צפיפות הדגימה הנטענת לצורך העמסה נכונה לתוך הבארות. הרכב הריאגנטים השונים הנדרשים להכנת מאגר המניות 50xTAE מוצג גם הוא. מאגר TAE הוא אחד המאגרים הנפוצים ביותר המשמשים עבור AGE, והוא שומר על ה- pH ב- 8.5 ומאפשר נדידה של דנ"א מוגבר במהלך AGE. קיצורים: TAE = טריס-אצטט-EDTA; AGE = אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.
| ריאגנטים PCR | נפח (μL) |
| 2x טאק מאסטר מיקס | 5 |
| פריימר קדמי (10 פיקו שומה) | 0.5 |
| פריימר הפוך (10 פיקו שומה) | 0.5 |
| תבנית דנ"א גולמי | 1.5 |
| מים סטריליים ברמה של ביולוגיה מולקולרית | 2.5 |
| נפח כולל | 10 |
טבלה 4: הרכב מאסטרמיקס PCR לזיהוי ARGs. הרכב תערובת התגובה של ריאגנטים שונים של PCR הנדרשים לביצוע ניסוי ה- PCR.
| לא. | גן מטרה | התנגדות ל | תחל | רצף פריימרים (5'-3') | גודל אמפליקון (bp) | טמפרטורת חישול (°C) | הפניות | ||||
| 1 | DFR A | טרימתופרים | קדימה | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | רצ'ביץ' ואח', 19 | ||||
| הפוך | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – לקטאמים | קדימה | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | גברייס, תאקור20 | ||||
| הפוך | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – לקטאמים | קדימה | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | לי ואח' 21 | ||||
| הפוך | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | אמינוגליקוזידים | קדימה | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| הפוך | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | AAD A | אמינוגליקוזידים | קדימה | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | צ'יזיילצ'וק 23 | ||||
| הפוך | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
טבלה 5: פריימרים ל-PCR של ARGs בחיידקים הניתנים לתרבות. מוצגים ה-ARGs השונים המשמשים במחקר הנוכחי יחד עם רצפי הפריימרים המתאימים שלהם. הגודל הצפוי של האמפליקון נתון בזוגות בסיסים. מוזכרת גם טמפרטורת החישול של כל קבוצת פריימרים.
| אנטיביוטי | ריכוז אנטיביוטיקה (מיקרוגרם/מ"ל) | CFU/מ"ל |
| - | - | 3.0 x 109 |
| CTX | 3 | 4.5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3.2 x 108 |
| K | 15 | 9.6 x 105 |
| E | 20 | 1.6 x 108 |
| וירג'יניה | 3 | 1.2 x 109 |
טבלה 6: סך כל ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה. חמש אנטיביוטיקות שימשו לבידוד הראשוני של החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה מדגימת המים. ספירת החיידקים הכוללת (ללא אנטיביוטיקה) וספירת חיידקי ה-AR מוצגת במונחים של יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL). קיצורים: AR = עמיד לאנטיביוטיקה; CFU = יחידות יוצרות מושבה; CTX = cefotaxime; CIP = ציפרופלוקסצין; K = קנאמיצין; E = אריתרומיצין; VA = vancomycin.
| קוד בידוד | מיקרואורגניזמים | משפחה |
| 1 | Escherichia coli | אנטרובקטריה |
| 2 | Escherichia coli | אנטרובקטריה |
| 3 | Escherichia coli | אנטרובקטריה |
| 4 | Escherichia coli | אנטרובקטריה |
| 5 | Escherichia coli | אנטרובקטריה |
| 6 | Escherichia coli | אנטרובקטריה |
| 7 | קלבסיאלה דלקת ריאות | אנטרובקטריה |
| 8 | קלבסיאלה דלקת ריאות | אנטרובקטריה |
| 9 | קלבסיאלה דלקת ריאות | אנטרובקטריה |
| 10 | קלבסיאלה דלקת ריאות | אנטרובקטריה |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | מיקרוקוקוס spp. | מיקרוקוקאצאה |
| 14 | ארתרובקטריה spp. | מיקרוקוקאצאה |
| 15 | Aeromonas spp. | אירומונאדאצאה |
טבלה 7: זיהוי מבודדים עמידים לאנטיביוטיקה על ידי ריצוף גנים 16S rRNA. מושבת PCR בוצעה עבור כל מבודד באמצעות 16S rRNA פריימרים ספציפיים לגן. האמפליקונים שהתקבלו רוצפו וזוהו באמצעות כלים ביואינפורמטיים מתאימים.
| לבודד לא. | לבודד | CTX | המגבר | לה | C | TGC | CTR | IPM | דור | N | ת"ר | CIP | מרץ | מדד MAR | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0ר | 0ר | 28 שניות | 23 שניות | 11R | 39 שניות | שנות ה-20 | 18 שניות | 0ר | 0ר | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31 שניות | 0ר | 12ר | 29 שניות | 23 שניות | 32 שניות | 37 שניות | 19 שניות | 16 שניות | 0ר | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0ר | 14R | 14R | 21 שניות | 10ר | 34 שניות | 17 שניות | 11R | 24 שניות | 16ר | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28 שניות | 13R | 18R | 26 שניות | 21 שניות | 28 שניות | 32 שניות | 16ר | 11R | 24 שניות | 19ר | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0ר | 12ר | 26 שניות | 21 שניות | 10ר | 31 שניות | 17 שניות | 16 שניות | 22 שניות | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27 שניות | 0ר | 12ר | 12ר | 22 שניות | שנות ה-30 | 32 שניות | 19 שניות | 11R | 0ר | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | קלבסיאלה דלקת ריאות | 28 שניות | 0ר | 17ר | 27 שניות | 22 שניות | שנות ה-30 | 32 שניות | 18 שניות | 22 שניות | 0ר | 16ר | 4 | 0.4 | ||
| 8 | קלבסיאלה דלקת ריאות | 29 שניות | 11R | 26 שניות | 24 שניות | 22 שניות | שנות ה-30 | 28 שניות | 17 שניות | 16 שניות | 24 שניות | 23 שניות | 1 | 0.1 | ||
| 9 | קלבסיאלה דלקת ריאות | 29 שניות | 13R | 25 שניות | 24 שניות | 22 שניות | 28 שניות | 29 שניות | 18 שניות | 17 שניות | 24 שניות | 25 שניות | 1 | 0.1 | ||
| 10 | קלבסיאלה דלקת ריאות | 33 שניות | 14 שניות | 26 שניות | 28 שניות | 22 שניות | 31 שניות | 32 שניות | 19 שניות | שנות ה-20 | 24 שניות | 29 שניות | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23 שניות | - | - | 37 שניות | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27 שניות | - | - | 42 שניות | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | מיקרוקוקוס spp. | 25 שניות | 17ר | 24 שניות | 32 שניות | 22 שניות | 34 שניות | 28 שניות | שנות ה-20 | - | 21 שניות | 26 שניות | 1 | 0.1 | ||
| 14 | ארתרובקטריה spp. | 45 שניות | 57 שניות | 28 שניות | 26 שניות | 34 שניות | 27 שניות | 39 שניות | 26 שניות | - | 28 שניות | 28 שניות | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
טבלה 8: פנוטיפ עמידות לאנטיביוטיקה של חיידקי החיידקים המבודדים שנותחו על-ידי AST. ההתנגדות הפנוטיפית במבודדים נותחה בשיטת דיפוזיית הדיסק. המספרים מציינים את ה-ZOI במילימטרים (מ"מ). עבור מדד MAR, המספרים מציינים את המספר הכולל של אנטיביוטיקה שאליה עמיד מבודד. קיצורים: AST = בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה; CTX = cefotaxime; AMP = אמפיצילין; LE = levofloxacin; C = כלוראמפניקול; TGC = טיגציקלין; CTR = ceftriaxone; IPM = imipenem; GEN = גנטמיצין; N = ניאומיצין; TR = טרימתופרים; CIP = ציפרופלוקסצין; R = עמיד; S = רגיש; MAR = עמידות לאנטיביוטיקה מרובה; ZOI = אזור העיכוב.
| משפחת גנים AMR | גנים(ים) |
| SMB בטא-לקטמאז | SMB-1 |
| בטא-לקטמאז מסוג AmpC | ampC1 |
| VIM בטא-לקטמאז | VIM-20 |
| CcrA בטא-לקטמאז | ccrA |
| NmcA בטא-לקטמאז | nmcR |
| ARL בטא-לקטמאז | ארל-1 |
| blaZ בטא-לקטמאז | blaZ |
| blaTEM בטא-לקטמאז | blaTEM* |
| blaCTX בטא-לקטמאז | blaCTX |
| AAC('6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| נמלה(3'') | aadA |
| חלבון עמידות קווינולון (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| התנגדות-nodulation-חלוקת תאים (RND) משאבת שטף אנטיביוטיקה | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| משאבת שטף אנטיביוטיקה מחייבת ATP (ABC) | oleC, macB, patA, bcrA |
| משפחת-על מנחה עיקרית (MFS) משאבת שטף אנטיביוטיקה | abaQ |
| דיהידרופולאט רדוקטאז עמיד לטרימתופרים DFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| ריפאמפין פוספוטרנספראז | rphB |
| חלבונים הקשורים לאונדקפרניל פירופוספט | bcrC |
| PBP2 עמיד בפני מתיצילין | mecD |
| חלבון ממברנת vanJ | ואן ג'יי |
| חלבון הגנה ריבוזומלי עמיד לטטרציקלין | tetT |
| כלוראמפניקול אצטילטרנספראז (CAT) | catB10 |
| Erm 23S RNA ריבוזומלי מתיל-טרנספראז | erm(37) |
| אשכול גנים העמידים לגליקופפטידים | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR פוספוטאנולמין טרנספראז | MCR-9 |
| סולפונאמיד עמיד בפני סול | סול3 |
| *גנים עם קו תחתון זוהו גם במיקרואורגניזמים הניתנים להתרבות | |
טבלה 9: ARGs שזוהו באמצעות ניתוח דנ"א מטגנומי שלם. המטא-גנום הכולל של דגימת המים שימש לריצוף מטגנומי שלם, והרצפים שהתקבלו הובאו באמצעות מסד הנתונים המתאים של ARG. התוצאות המייצגות של כמה מה-ARGs החשובים שזוהו בדנ"א המטגנומי מוצגות. הגנים המסומנים בקו תחתון זוהו גם במיקרואורגניזמים הניתנים לתרבות. קיצור: ARG = גן עמיד לאנטיביוטיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איסוף הדגימות ועיבודן ממלאים תפקיד משמעותי ועשויים להשפיע על התוצאות והפרשנות של המחקר. לפיכך, כדי לשלול שונות בדגימות, חשוב לבצע דיגום במספר מוקדים של גוף המים המתוקים הנחקרים. שמירה על תנאי סביבה אספטיים נאותים בעת טיפול בדגימות כאלה יכולה למנוע זיהום. יתר על כן, כדי למנוע שינויים בהרכב החיידקים שעשויים להשפיע על האיכות והכמות של חומצות גרעין שחולצו, יש לשמור על תנאי המעבר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עם פער זמן מינימלי מנקודת איסוף הדגימה ועד לעיבוד הבא. מספר מחקרים הדגישו כי תקופת ביניים זו בין איסוף הדגימה לעיבודה יכולה לתת תוצאות משתנות בשלבים מאוחרים יותר של הניתוח אם לא תיעשה בזהירות12,13.
שימוש במגוון דילולים לציפוי מבטיח שהמושבות לא יתקבצו יחד וגם אין מעט מדי מושבות לספור. ביצוע הניסויים בשכפול נחוץ כדי לקחת בחשבון וריאציות ב-CFU/mL שעלולות להיווצר עקב שגיאות פיפטציה/טיפול. יתר על כן, לוחות בקרה נשמרים עבור כל ניסוי כדי להבטיח כי אנטיביוטיקה בשימוש פועלים ביעילות וכי תוצאות חיוביות כוזבות מסולקים. לפיכך, לוחות הבקרה לא צריכים להיות בעלי צמיחת מושבה נראית לעין. זה מצביע על היעילות של אנטיביוטיקה בשימוש.
במהלך AST, צפיפות תרבית inoculum ואת עובי של צלחת אגר יכול להשפיע על קוטר ZOI, ולכן, את הפרשנות של התוצאות. לכן, יש להקפיד לשמור על שני גורמים אלה אחידים בעת ביצוע ניסויי AST. ההיבט הקריטי ביותר הוא מספר תאי החיידקים הנמצאים באינוקולום. באופן כללי, 1 × 10 8-2 × 108 CFU/mL של תאים משמשים כאינוקולום, השווה לתקן מקפרלנד0.5 14. ריכוז זה של inoculum חייב להישמר קבוע כדי למנוע כל וריאציה בתוצאות. כל ריכוז גבוה או נמוך מהריכוז הנדרש חייב להיות מדולל בעזרת מלח סטרילי ולהשתמש בו מיד לחיסון תוך 15 דקות. בעת הפצת inoculum על צלחות אגר, יש להקפיד כדי למנוע כמות מופרזת של inoculum. ניתן להסיר עודפי אינוקולום על ידי לחיצה על המטוש בצידי צינור התרחיף החיידקי לפני חיסונו לצלחת MHA. כל סטייה מהליך AST הסטנדרטי יכולה להשפיע באופן משמעותי על הנתונים המתקבלים מפרוטוקוליםכאלה 11,15. מחקר קודם הראה כי ערך מדד MAR של ≥0.2 מצביע על התנגדות גבוהה במבודדים16. מכיוון שהפרשנות של תוצאות ה- AST מבוססת על ה- ZOI, יש להימנע מחיסון חסר או חיסון יתר של התרבית.
עבור ה-PCR, יש להכין את המאסטרמיקס על גוש קרח כדי למזער את הסיכוי להתפרקות המרכיבים ולאובדן הפעילות של האנזים. לבישת כפפות בעת הגדרת התגובה ממזערת את הסיכוי לזיהום חיצוני17. המתח במהלך ה- AGE לא צריך להיות גבוה מדי, שכן זה עלול להוביל לאפקט חימום והשפלה של הדגימות הטעונות. ביצוע ה- AGE במתח אופטימלי מבטיח שהרצועות מופרדות היטב וחדות ללא כל אפקט גרירה או מריחה.
מחקרים שבוצעו בעשורים האחרונים הדגימו את השימוש בריצוף אמפליקון של הגן 16S rRNA לזיהוי מיקרואורגניזמים שונים. עבור ריצוף גנים של 16S rRNA, בחירת השיטה להפקת הדנ"א של התבנית עלולה לגרום להטיות, אשר בתורן עשויות להשפיע על הניתוח במורד הזרם. לחיידקים גראם חיוביים יש דופן תא פפטידוגליקן עבה שיכולה להקשות על מיצוי חומצת הגרעין. לכן, הבחירה של שיטת המיצוי צריכה להיות כזו שהיא לוכדת ביעילות את כל סוגי הדנ"א המיקרוביאלי. שיטת הרתיחה המסורתית לחילוץ דנ"א תבנית גולמי היא שיטה יעילה כזו לחילוץ תוכן התא, ובכך להפחית הטיות בתוצאות.
כדי להבין את קהילת החיידקים המלאה של גוף המים, נעשה שימוש בטכניקת ריצוף מהדור הבא (HT-NGS) בעלת תפוקה גבוהה במחקר זה. ניתוח דנ"א מטאגנומי שלם מאפשר לחקור את כל המטא-גנום של דגימה נתונה. טכניקות מבוססות תרבית נותנות בעיקר ספירה אירובית של עומס החיידקים, מה שמעיד על האיכות המיקרוביולוגית של הדגימה. עם זאת, מיקרואורגניזמים תרבותיים מהווים רק 1% מכלל המיקרואורגניזמים. המיקרופלורה הנותרת, הכוללת מגוון רחב של מינים, כולל אנארובים, מאופיינת בצורה גרועה ולעתים קרובות מתעלמים ממנה. מיקרואורגניזמים אלה עשויים לשאת תכונות AR. יתר על כן, מיקרואורגניזמים קומנסליים הם מאגר של גנים AR שיכולים להיות מועברים לפתוגנים באמצעות אירועי חילופי גנטיים שונים18. רבים מהקומנסלים הללו אינם ניתנים לתרבות וניתן לחקור אותם על ידי גישה מטגנומית הכוללת HT-NGS, המספקת כיסוי גדול יותר לזיהוי מיקרופלורה מגוונת בכל דגימה. באמצעות ניתוח מטגנומי התקבל פרופיל מפורט של הטקסה החיידקית, אשר השלים את הנתונים הניתנים לתרבות. יתר על כן, גישות משלימות כאלה יכולות לספק מושג על מצב ה-AR הכולל של גוף המים הנחקר.
במחקר הנוכחי, תוך שימוש בשילוב של טכניקות מטגנומיות קונבנציונליות המבוססות על תרביות וטכניקות שאינן מבוססות על תרבית, הצלחנו לזהות את המגוון הכולל של החיידקים, חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה שונים ואת המאגר הכולל של ARGs הנישאים במים. המתודולוגיה המתוארת במחקר זה ניתנת לשכפול והתאמה אישית לזיהוי פתוגנים של AR בכל מקור מים אחר - מי חוף, מים טבעיים ומי שתייה מעשה ידי אדם. זה יכול לשמש גם למעקב אחר העברת פתוגנים נוסוקומיאליים הנישאים במים ולניטור זיהומים הקשורים לבתי חולים במסגרות בית חולים ומרפאות באמצעות מקורות מים כגון כיורים, שירותים, אמבטיות ומכשירי אדים. זה יעזור במעקב אחר AMR וזיהוי נקודות חמות מבוססות מים של AMR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקים כספיים מהמחלקה למדע וטכנולוגיה - קידום מחקר אוניברסיטאי ומצוינות מדעית (DST-PURSE) של אוניברסיטת מומבאי. דוויקה גדיגאונקר עבדה כעמיתת פרויקט במסגרת התוכנית. העזרה הטכנית שניתנה על ידי Harshali Shinde, עמית מחקר בכיר תחת המחלקה למדע וטכנולוגיה-מדע והנדסה מחקר המועצה למחקר (DST-SERB) פרויקט מספר: CRG/2018/003624, היא מוכרת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B.
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
